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利用單個發(fā)光粒子的光的波長特性的光分析裝置和光分析方法

文檔序號:5939995閱讀:180來源:國知局
專利名稱:利用單個發(fā)光粒子的光的波長特性的光分析裝置和光分析方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種光分析裝置和方法,能夠使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)等可檢測來自溶液中的微小區(qū)域的光的光學(xué)系統(tǒng)檢測來自分散或溶解在溶液中的原子、分子或它們的聚合體(以下將它們稱為“粒子”)、例如蛋白質(zhì)、肽、核酸、脂質(zhì)、糖鏈、氨基酸或它們的聚合體等生物體分子、病毒、細胞等粒子狀的對象物、或非生物學(xué)粒子的光,來獲取在分析或解析它們的狀態(tài)(相互作用、結(jié)合/離解狀態(tài)等)時有用的信息,更詳細地說,涉及一種能夠使用如上所述的光學(xué)系統(tǒng)個別檢測來自單個發(fā)光的粒子的光并進行各種光分析的裝置和方法。此外,在本說明書中,發(fā)出光的粒子(以下稱為“發(fā)光粒子”)可以是其自身發(fā)出光的粒子以及附加了任意的發(fā)光標識或發(fā)光探針的粒子中的任意一個,從發(fā)光粒子發(fā)出的光可以是熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光等。
背景技術(shù)
由于近年來的光計量技術(shù)的發(fā)展,使用共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和還能夠進行光子計數(shù)(單光子檢測)的超高靈敏度的光檢測技術(shù),能夠檢測/測量單光子或熒光單分子水平的微弱光。因此,提出了各種使用這樣的微弱光的計量技術(shù)對生物體分子等的特性、分子間相互作用或結(jié)合/離解反應(yīng)進行檢測的裝置或方法。例如,在熒光相關(guān)光譜分析(Fluorescence Corr elation Spectroscopy:FCS。例如參照專利文獻 1-3、非專利文獻 1-3)中,利用激光共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光子計數(shù)技術(shù),測量來自出入樣本溶液中的微小區(qū)域(被稱為顯微鏡的激光會聚到的焦點區(qū)域-共焦區(qū)組織)內(nèi)的熒光分子或被進行了熒光標識的分子(熒光分子等)的熒光強度,根據(jù)由進行該測量得到的熒光強度的自相關(guān)函數(shù)的值所確定的熒光分子等在微小區(qū)域內(nèi)的平均滯留時間(平移擴散時間)和滯留的分子的個數(shù)的平均值,來獲取熒光分子等的運動的速度或大小、濃度之類的信息,或檢測分子的構(gòu)造或大小的變化、分子的結(jié)合/離解反應(yīng)或分散/聚合之類的各種現(xiàn)象。另外,在熒光強度分布分析(Fluorescence-1ntensity Distribution Analysis:FIDA。例如專利文獻 4、非專利文獻4)、光子計數(shù)直方圖(Photon Counting Histogram:PCH。例如專利文獻5)中,生成與FCS同樣地計量出的出入共焦區(qū)組織內(nèi)的熒光分子等的熒光強度的直方圖,使統(tǒng)計性的模型公式擬合該直方圖的分布,由此估算熒光分子等的固有的亮度的平均值和滯留在共焦區(qū)組織內(nèi)的分子的個數(shù)的平均值,根據(jù)這些信息估計分子的構(gòu)造或大小的變化、結(jié)合/離解狀態(tài)、分散/聚合狀態(tài)等。另外,除此以外,在專利文獻6、7中,提出了根據(jù)利用共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)計量出的樣本溶液的熒光信號的時間經(jīng)過來檢測熒光性物質(zhì)的方法。專利文獻8提出了一種信號運算處理技術(shù),其用于使用光子計數(shù)技術(shù)計量來自流通于流式細胞儀的熒光微粒子或固定在基板上的熒光微粒子的微弱光,來檢測流體中或基板上的熒光微粒子的存在。特別是,根據(jù)FCS、FIDA等使用了利用共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光子計數(shù)技術(shù)的微小區(qū)域的熒光測量技術(shù)的方法,進行測量所需要的樣本與以前相比可以是極低濃度且極微量(在一次測量中使用的量至多為幾十uL左右),測量時間也大幅縮短(在一次測量中多次反復(fù)進行秒級時間的計量)。因而,期待這些技術(shù)特別是在對醫(yī)學(xué)、生物學(xué)的研究開發(fā)領(lǐng)域中經(jīng)常使用的稀少或昂貴的樣本進行分析的情況下,或在疾病的臨床診斷、生理活性物質(zhì)的篩選等檢體數(shù)多的情況下,成為與以前的生物化學(xué)方法相比能夠廉價或迅速地執(zhí)行實驗或檢查的強力工具。專利文獻1:日本特開2005-098876專利文獻2:日本特開2008-292371專利文獻3:日本特開2009-281831專利文獻4:專利第4023523號專利文獻5:國際公開2008-080417專利文獻6:日本特開2007-20565專利文獻7:日本特開2008-116440專利文獻8:日本特開平4-337446號公報非專利文獻1:金城政孝、蛋白質(zhì)核酸酶Vol.44、N0.9、1431-1438頁1999年非專利文獻2:F.J.Meyer-Alms> 突光相關(guān)譜(Fluorescence CorrelationSpectroscopy)、R.Rigler 編、Springer、柏林、2000 年、204-224 頁非專利文獻3:加藤則子及其他4名、遺傳醫(yī)學(xué)、Vol.6、N0.2,271-277頁非專利文獻4:卡斯柯(Kask)及`其他3名、美國科學(xué)學(xué)院紀要、1999年、96卷、13756-13761 頁(P.Kask, K.Palo, D.Ullmann, K.Gall PNAS96, 13756-13761(1999))

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題在上述的FCS、FIDA等使用了共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光子計數(shù)技術(shù)的光學(xué)分析技術(shù)中,所計量的光是從熒光單分子或多分子發(fā)出的光,但在該光的解析中,執(zhí)行按時間序列測量出的熒光強度數(shù)據(jù)的自相關(guān)函數(shù)的運算或?qū)χ狈綀D擬合之類的熒光強度的波動的計算等統(tǒng)計性的處理,并非個別地參照或分析來自各個熒光分子等的光的信號。即,在這些光分析技術(shù)中,對來自多個熒光分子等的光的信號統(tǒng)計性地進行處理,針對熒光分子等檢測統(tǒng)計平均性的特性。因而,為了在這些光分析技術(shù)中得到統(tǒng)計上有意義的結(jié)果,樣本溶液中的作為觀測對象的熒光分子等的濃度或數(shù)密度需要是在平衡狀態(tài)下在一次秒級長度的計量時間內(nèi)能夠進行統(tǒng)計性處理的個數(shù)的熒光分子等出入微小區(qū)域內(nèi)的水平,優(yōu)選的是在微小區(qū)域內(nèi)始終存在一個左右的熒光分子等的水平。實際上,共焦區(qū)組織的體積為IfL左右,因此,在上述的光分析技術(shù)中使用的樣本溶液中的熒光分子等的濃度典型地是InM左右或其以上,在大幅低于InM時,產(chǎn)生在共焦區(qū)組織內(nèi)不存在熒光分子等的時間而無法得到統(tǒng)計上有意義的分析結(jié)果。另一方面,在專利文獻6 8所記載的熒光分子等的檢測方法中,不包括熒光強度的波動的統(tǒng)計性的運算處理,即使樣本溶液中的熒光分子等小于InM也能夠?qū)晒夥肿拥冗M行檢測,但無法達成定量地計算出在溶液中隨機運動的熒光分子等的濃度或數(shù)密度之類的內(nèi)容。因此,本申請的申請人在日本特愿2010-044714和PCT/JP2011/53481中,提出了基于以下的新原理的光分析技術(shù),即能夠定量地觀測作為觀測對象的發(fā)光粒子的濃度或數(shù)密度低于利用FCS、FIDA等包含統(tǒng)計性處理的光分析技術(shù)進行處理的水平的樣本溶液中的發(fā)光粒子的狀態(tài)或特性。在所述新的光分析技術(shù)中,如果清楚地進行描述,則與FCS、FIDA等同樣地,在使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)等能夠檢測來自溶液中的微小區(qū)域的光的光學(xué)系統(tǒng)的情況下,一邊使作為光的檢測區(qū)域的微小區(qū)域(以下稱為“光檢測區(qū)域”)的位置在樣本溶液內(nèi)移動、即一邊通過光檢測區(qū)域?qū)颖救芤簝?nèi)進行掃描,一邊在光檢測區(qū)域中包含在樣本溶液中分散且隨機地運動的發(fā)光粒子時檢測從該發(fā)光粒子發(fā)出的光,由此,能夠?qū)颖救芤褐械陌l(fā)光粒子逐個地進行個別檢測,來獲取與發(fā)光粒子的計數(shù)、樣本溶液中的發(fā)光粒子的濃度或數(shù)密度有關(guān)的信息。根據(jù)該新的光分析技術(shù)(以下稱為“掃描分子計數(shù)法”),與FCS、FIDA等光分析技術(shù)同樣地,進行測量所需的樣本可以是微量的(例如幾十μ L左右),另外,測量時間短,并且與FCS、FIDA等光分析技術(shù)的情況相比,能夠檢測更低濃度或數(shù)密度的發(fā)光粒子的存在,定量地檢測其濃度、數(shù)密度或其它特性。另外,一般來說對發(fā)光粒子或作為觀測對象的粒子附加的發(fā)光標識分別具有固有的發(fā)光波長特性(發(fā)光光譜),因此如果以捕捉各發(fā)光粒子或發(fā)光標識的發(fā)光波長特性的特征的方式對來自發(fā)光粒子或發(fā)光標識的光進行檢測,則能夠識別發(fā)光粒子或發(fā)光標識的種類。因而,在上述掃描分子計數(shù)法中,如果以能夠檢測發(fā)光粒子的發(fā)光波長特性的特征的方式對來自發(fā)光粒子的光進行檢測,則能夠識別被個別檢測出的各個單個發(fā)光粒子的種類,這一點是有利的。這樣,本發(fā)明的主要課題在于,為了進一步擴展在上述的日本特愿2010-044714以及PCT/JP2011/53481中提出的新的光分析技術(shù),而特別提供一種通過對檢測出的單個發(fā)光粒子的發(fā)光波長特性的特征進行檢測而能夠識別單個發(fā)光粒子的種類的新的光分析裝置和方法。用于解決問題的方案根據(jù)本發(fā)明,通過以下的裝置達成上述的課題,該裝置是一種光分析裝置,其使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)檢測來自在樣本溶液中分散且隨機運動的發(fā)光粒子的光并進行分析,該光分析裝 置的特征在于,包括:光檢測區(qū)域移動部,其通過變更顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的光路,使光學(xué)系統(tǒng)的光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動;光檢測部,其檢測來自光檢測區(qū)域的光的多個波長頻帶的成分的強度;以及信號處理部,其在一邊使光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動一邊由光檢測部檢測出的光的多個波長頻帶的成分的強度中個別檢測來自各個發(fā)光粒子的光的信號,根據(jù)檢測出的發(fā)光粒子的光的信號的多個波長頻帶的成分的強度來識別檢測出的發(fā)光粒子的種類。在所述結(jié)構(gòu)中,“在樣本溶液中分散且隨機運動的發(fā)光粒子”是指在樣本溶液中分散或溶解的原子、分子或它們的聚合體等發(fā)出光的粒子,只要是不固定在基板等上而在溶液中自由地進行布朗運動的粒子,就可以是任意的粒子。所述發(fā)光粒子典型地是熒光性粒子,但也可以是通過磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光等而發(fā)出光的粒子。共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的“光檢測區(qū)域”是指在這些顯微鏡中檢測光的微小區(qū)域,在從物鏡提供照明光的情況下,相當于該照明光會聚到的區(qū)域(在共焦顯微鏡中,特別地根據(jù)物鏡和針孔之間的位置關(guān)系來確定。在發(fā)光粒子不通過照明光而進行發(fā)光的情況下、例如在是通過化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光進行發(fā)光的粒子的情況下,在顯微鏡下不需要照明光。)。此外,在本說明書中,在稱為“信號”時,只要沒有特別限定,是指表示來自發(fā)光粒子的光的信號。
在上述本發(fā)明的裝置中,與掃描分子計數(shù)法同樣地,在基本的結(jié)構(gòu)中一邊使光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動、即一邊通過光檢測區(qū)域?qū)颖救芤簝?nèi)進行掃描,一邊依次進行來自光檢測區(qū)域的光的檢測。這樣,在移動的光檢測區(qū)域包含隨機運動的發(fā)光粒子時,檢測出來自發(fā)光粒子的光,由此檢測出一個發(fā)光粒子的存在。在所述結(jié)構(gòu)中,本發(fā)明特別地測量來自光檢測區(qū)域的光中的多個波長頻帶的成分的強度。如已經(jīng)記述的那樣,發(fā)光粒子或?qū)ψ鳛橛^測對象的粒子付加的發(fā)光標識分別具有固有的發(fā)光波長特性,如果參照所發(fā)出的光中的多個波長頻帶的成分的強度則能夠掌握所述發(fā)光波長特性的特征,因此能夠根據(jù)如上述那樣測量出的多個波長頻帶的成分的強度來識別并確定各個發(fā)光粒子的種類。這樣,根據(jù)所述結(jié)構(gòu),如果發(fā)光粒子進入光檢測區(qū)域的移動路徑,則能夠根據(jù)其發(fā)光波長特性的特征來個別識別發(fā)光粒子或發(fā)光標識的種類,而且,即使在樣本溶液中的發(fā)光粒子濃度低于通過FCS、FIDA等光分析技術(shù)獲得良好的測量結(jié)果所需要的水平的情況下,也能夠進行這樣的發(fā)光粒子的檢測及其種類的識別,在這一點上是有利的。在上述結(jié)構(gòu)中,更具體地說,通過參照多個波長頻帶的成分的強度的分布比例或強度之比,能夠識別發(fā)光粒子的種類。因此,在一個實施方式中,信號處理部也可以構(gòu)成為根據(jù)發(fā)光粒子的光的信號的多個波長頻帶的成分的強度之比來識別發(fā)光粒子的種類。此外,從光檢測中的波長選擇、信號處理的容易性方面考慮,要檢測的波長頻帶少是有利的,因此上述本發(fā)明的裝置典型地可以構(gòu)成為光檢測部檢測來自光檢測區(qū)域的光的兩個波長頻帶的成分的強度,信號處理部根據(jù)兩個波長頻帶的成分的強度之比來識別發(fā)光粒子的種類。要檢測的波長頻帶可以考慮作為觀測對象的發(fā)光粒子或發(fā)光標識的發(fā)光波長特性、檢測靈敏度等來適當?shù)剡x擇以能夠盡可能 顯著地掌握發(fā)光波長特性的特征。另外,特別是在發(fā)光粒子是通過激勵光的照射而發(fā)光的粒子的情況下,在裝置中設(shè)置用于向光檢測區(qū)域照射激勵光的光照射部時,在該情況下可以是光照射部照射一個波長頻帶的激勵光,光檢測部對通過所述一個波長頻帶的激勵光的照射而發(fā)出的來自光檢測區(qū)域的光的多個波長頻帶的成分的強度進行檢測。通常在共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)中進行光的測量時,裝置被設(shè)定成針對一個波長頻帶的激勵光的照射來檢測一個波長頻帶的光,在對多個種類的發(fā)光粒子的光的種類進行識別并且對該光進行測量的情況下,執(zhí)行多個波長頻帶的激勵光的照射。在這種情況下,使波長頻帶互不相同的激勵光的聚光區(qū)域一致以及調(diào)整多個波長頻帶的激勵光的強度的均衡是比較困難的,因而基于多個波長頻帶的成分的強度決定表示發(fā)光粒子的發(fā)光波長特性的特征的值的處理變得繁雜(需要用于對激勵光的聚光區(qū)域的位置偏移進行校正的處理、用于對激勵光的強度的均衡進行校正的處理等。)。然而,如果激勵光是一個波長頻帶的光,則能夠使表示發(fā)光粒子的發(fā)光波長特性的特征的值的決定處理變得簡單,從而是有利的。另外,在照射一個波長頻帶的激勵光的情況下,依賴于發(fā)光粒子的激勵波長特性而有可能發(fā)光強度變得比較低,但是在本發(fā)明的情況下,由于參照發(fā)光粒子的發(fā)光波長特性的特征(更具體地說,發(fā)光粒子的光中的多個波長頻帶的成分的強度的分布比例)來識別發(fā)光粒子的種類,因此應(yīng)該理解為如果能夠保證各個成分的強度的分布比例的精確度,則強度的絕對值下降不會成為問題。關(guān)于上述的本發(fā)明的結(jié)構(gòu)中的光檢測區(qū)域的位置的移動,可以根據(jù)發(fā)光粒子的特性或樣本溶液中的數(shù)密度或濃度適當?shù)刈兏鼧颖救芤簝?nèi)的光檢測區(qū)域的位置的移動速度。特別是當光檢測區(qū)域的移動速度變快時,從一個發(fā)光粒子所能得到的光量降低,因此優(yōu)選的是適當?shù)刈兏鈾z測區(qū)域的移動速度,使得能夠高精確度或高靈敏度地計量來自一個發(fā)光粒子的光。并且,關(guān)于上述的光檢測區(qū)域的位置的移動,優(yōu)選的是將樣本溶液內(nèi)的光檢測區(qū)域的位置的移動速度設(shè)定得比發(fā)光粒子的擴散移動速度(由布朗運動造成的粒子的平均移動速度)高。如上述說明的那樣,在本發(fā)明的裝置中,對從光檢測區(qū)域所包含的一個發(fā)光粒子發(fā)出的光進行檢測來個別檢測發(fā)光粒子。然而,發(fā)光粒子由于在溶液中進行布朗運動而隨機地移動,在多次出入光檢測區(qū)域的情況下,有可能從一個發(fā)光粒子多次檢測出(表示其存在的)信號,難以使檢測出的信號與一個發(fā)光粒子的存在對應(yīng)起來。因此,如上所述,將光檢測區(qū)域的移動速度設(shè)定得比發(fā)光粒子的擴散移動速度高,由此能夠使一個發(fā)光粒子與一個信號相對應(yīng)。此外,擴散移動速度因發(fā)光粒子的不同而變化,因此如上所述,優(yōu)選的是根據(jù)發(fā)光粒子的特性適當?shù)刈兏鈾z測區(qū)域的移動速度。可以通過任意的方式進行光學(xué)系統(tǒng)的光路的變更以移動光檢測區(qū)域的位置。例如可以使用在激光掃描型光學(xué)顯微鏡中采用的檢電鏡變更光路來變更光檢測區(qū)域的位置??梢匀我獾卦O(shè)定光檢測區(qū)域的位置的移動路徑,例如可以從圓形、橢圓形、矩形、直線以及曲線中選擇。此外,在本發(fā)明中,構(gòu)成為變更光學(xué)系統(tǒng)的光路使光檢測區(qū)域的位置移動,由此光檢測區(qū)域的移動迅速并且在樣本溶液中實質(zhì)上不發(fā)生機械振動、流體動力的作用,因此樣本溶液中的發(fā)光粒子不會受到動力作用的影響,能夠在(沒有偽像的狀態(tài)且)穩(wěn)定的狀態(tài)下進行光的計量(例如在使樣本流動的情況下,難以始終賦以一樣的流速并且裝置結(jié)構(gòu)復(fù)雜,另外所需要的樣本量大幅增加并且由于流動所造成的流體動力的作用而溶液中的發(fā)光粒子或其它物質(zhì)有可能改質(zhì)或改性。)。而且,不需要使樣本溶液流通的結(jié)構(gòu),因此能夠與FCS等的情況同樣地以微量(IyL 幾十μ L左右)的樣本溶液進行計量和分析。另外,在實施方式中,本發(fā)明的光分析裝置可以對信號處理部個別檢測出的發(fā)光粒子的信號的個數(shù)進行計數(shù)來對在光檢測區(qū)域的位置移動過程中所檢測出的發(fā)光粒子的個數(shù)進行計數(shù)。由此,能夠按發(fā)光粒子的種類獲取關(guān)于發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度的信息。根據(jù)上述本發(fā)明的裝 置,能夠?qū)崿F(xiàn)一邊使光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動一邊以能夠識別發(fā)光粒子的種類的 方式檢測各個發(fā)光粒子的光的新的光分析方法。因而,根據(jù)本發(fā)明,提供一種光分析方法,其使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)檢測來自在樣本溶液中分散且隨機地運動的發(fā)光粒子的光并進行分析,該光分析方法的特征在于,包括以下步驟:通過變更顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的光路以使光學(xué)系統(tǒng)的光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動;一邊使光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動,一邊檢測來自光檢測區(qū)域的光的多個波長頻帶的成分的強度;以及在檢測出的光的多個波長頻帶的成分的強度中個別檢測來自各個發(fā)光粒子的光的信號,根據(jù)檢測出的發(fā)光粒子的光的信號的多個波長頻帶的成分的強度來識別發(fā)光粒子的種類。在上述方法中,也可以根據(jù)發(fā)光粒子的光的信號的多個波長頻帶的成分的強度之比來識別發(fā)光粒子的種類,特別是可以檢測來自光檢測區(qū)域的光的兩個波長頻帶的成分的強度,根據(jù)所述兩個波長頻帶的成分的強度之比來識別發(fā)光粒子的種類。另外,在發(fā)光粒子是通過一個波長頻帶的激勵光的照射而進行發(fā)光的粒子的情況下,執(zhí)行向光檢測區(qū)域照射所述一個波長頻帶的激勵光的步驟,在光檢測步驟中,可以檢測通過激勵光的照射而發(fā)出的來自光檢測區(qū)域的光的多個波長頻帶的成分的強度。并且,在上述方法中,也可以包括以下步驟:對個別檢測出的來自發(fā)光粒子的光信號的個數(shù)進行計數(shù)來對在光檢測區(qū)域的位置移動過程中檢測出的發(fā)光粒子的個數(shù)進行計數(shù);和/或根據(jù)檢測出的發(fā)光粒子的個數(shù)來確定樣本溶液中的發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度。另外,在變更光學(xué)系統(tǒng)的光路以使光檢測區(qū)域的位置移動的步驟中,可以使光檢測區(qū)域的位置以規(guī)定的速度或比發(fā)光粒子的擴散移動速度快的速度移動,可以根據(jù)發(fā)光粒子的特性或樣本溶液中的數(shù)密度或濃度來設(shè)定光檢測區(qū)域的位置的移動速度。應(yīng)該理解為本發(fā)明的光分析技術(shù)典型地用于分析或解析蛋白質(zhì)、肽、核酸、月旨質(zhì)、糖鏈、氨基酸或它們的聚合體等生物體分子、病毒、細胞等粒子狀的生物學(xué)對象物在溶液中的狀態(tài)的用途,但也可以用于分析或解析非生物學(xué)的粒子(例如原子、分子、膠束(micelles)、金屬膠體等)在溶液中的狀態(tài),這樣的情況也屬于本發(fā)明的范圍。發(fā)明的效果總之,根據(jù)本發(fā)明,在一種掃描分子計數(shù)法中,通過在共焦顯微鏡或多光子顯微鏡下利用其光檢測區(qū)域在樣本溶液中進行掃描來個別檢測發(fā)光粒子的存在,通過以能夠掌握該發(fā)光粒子的發(fā)光波長特性的特征的方式檢測發(fā)光粒子的光,能夠識別各個發(fā)光粒子的種類。根據(jù)所述本發(fā)明的結(jié)構(gòu),即使多個種類的發(fā)光粒子混合存在于樣本溶液中,也能夠確定各個發(fā)光粒子的種類,因此能夠得到多個種類的粒子等混合存在的系統(tǒng)中的與各粒子的狀態(tài)、數(shù)密度或濃度有關(guān)的信息,并且能夠根據(jù)它們的變化檢測并分析粒子的結(jié)合/離解反應(yīng)或分散/聚合之類的各種現(xiàn)象。另外,在本發(fā)明中,由于個別檢測發(fā)光粒子并進行其種類的識別,因此即使是在樣本溶液中濃度相對較低且其光在以前的方法中埋沒于來自其它發(fā)光粒子的光的發(fā)光粒子,也能夠檢測出,能夠觀測該發(fā)光粒子的存在。也期待將所述特征應(yīng)用于反應(yīng)率比較低的反應(yīng)的產(chǎn)物、數(shù)量相對較少的中間產(chǎn)物的檢測。本發(fā)明的其它目的以及優(yōu)點通過以下的本發(fā)明的優(yōu)選實施方式的說明將變得清


圖1的(A)是實現(xiàn)本發(fā)明的光分析技術(shù)的光分析裝置的內(nèi)部構(gòu)造的示意圖。圖1的(B)是共焦區(qū)組織(共焦顯微鏡的觀察區(qū)域)的示意圖。圖1的(C)是變更反射鏡7的朝向使光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動的機構(gòu)的示意圖。圖2的㈧、⑶分別是說明構(gòu)成本發(fā)明的光分析技術(shù)的一部分的掃描分子計數(shù)法中的光檢測的原理的示意圖和所計量的光強度的時間變化的示意圖。圖2的(C)是說明依照本發(fā)明能夠通過檢測多個波長頻帶的光成分的強度來根據(jù)發(fā)光粒子的發(fā)光波長特性的差異識別其種類的原理的圖。上圖示出了各種具有互不相同的發(fā)光波長特性的發(fā)光粒子α、β、Y、δ的發(fā)光波長特性(發(fā)光光譜)(實線曲線圖)以及分開進行檢測的多個波長頻帶的范圍(觀測窗-橫軸之下的附加為有chi ch5的四角框)。下圖的直方圖表分別示意性地示出了發(fā)光粒子α、β、Y、δ信號中的在各觀測窗中被檢測出的光的強度。圖2的(D)是說明在檢測兩個波長頻帶的光成分的情況下能夠識別發(fā)光粒子的種類的情形的、與圖2的(C)相同的圖。圖3是以流程圖的形式表示依照本發(fā)明執(zhí)行的光檢測/分析的處理過程的圖。圖4的(A)、(B)分別是表示發(fā)光粒子一邊進行布朗運動一邊橫穿光檢測區(qū)域時以及在由于以比發(fā)光粒子的擴散移動速度快的速度使樣本溶液內(nèi)的光檢測區(qū)域的位置移動而發(fā)光粒子橫穿光檢測區(qū)域時的粒子的運動方式的模型圖。圖4的(C)是說明用于依照掃描分子計數(shù)法根據(jù)計量出的時序光強度數(shù)據(jù)(光子計數(shù)的時間變化)檢測發(fā)光粒子的存在的處理過程中的檢測信號的信號處理過程的例子的圖。圖5示出計量出的光子計數(shù)數(shù)據(jù)的實測例子(直方圖表)、對數(shù)據(jù)進行平滑處理而得到的曲線(虛線)以及在脈沖存在區(qū)域中進行擬合得到的高斯函數(shù)(實線)。在圖中,附加為“噪聲”的信號作為噪聲或異物的信號而被忽略。圖6的(A)是關(guān)于包含熒光色素ATT0565的溶液和包含熒光色素ATT0590的溶液,相對于依照本發(fā)明檢測出的各個發(fā)光粒子的第一波長頻帶的光強度(光子計數(shù))Ichl繪制第二波長頻帶的光強度(光子計數(shù))Ich2得到的圖。在圖中,各點為一個發(fā)光粒子的強度。圖6的(B)示出了熒光色素ATT0565和熒光色素ATT0590的兩個波長頻帶的光強度之比Ichl/Ich2的平均值(直方圖表)和標準偏差(誤差條(error bar))。圖7是在以往的計算熒光強度的波動的光分析技術(shù)中獲得的光子計數(shù)(光強度)的時間變化的例子,(A)是樣本內(nèi)的粒子的濃度為能夠提供充分的計量精確度的程度的情況,⑶是樣本內(nèi)的粒子的濃度大幅地低于⑷的情況的情況。附圖標記說明1:光分析裝置(共焦顯微鏡);2:光源;3:單模光纖(single-mode opticalfiber) ;4:準直透鏡;5:分色鏡;6、7、11:反射鏡;8:物鏡;9:微板;10:皿(樣本溶液容器);12:聚光鏡(condenser lens) ;13:針孔;14a、b:屏障濾波器(barrier filter) ;14x:檢測光用分色鏡;15:多模光纖(mult1-mode optical fiber) ;16a、b:光檢測器;17:反射鏡偏轉(zhuǎn)器;17a:臺位置變更裝置;18:計算機。
具體實施方式
下面,詳細說明本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。光分析裝置的結(jié)構(gòu)本發(fā)明能夠通過如下的光分析裝置來實現(xiàn):在基本結(jié)構(gòu)中組合如圖1的(A)示意性地例示那樣能夠執(zhí)行FCS、FIDA等的共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光檢測器而成。參照圖1的(A),光分析裝置I由光學(xué)系統(tǒng)2 17以及用于控制光學(xué)系統(tǒng)的各部分的動作并且獲取并解析數(shù)據(jù)的計算機18構(gòu)成。光分析裝置I的光學(xué)系統(tǒng)可以與通常的共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)相同,在此,使從光源2發(fā)射并在單模光纖3內(nèi)傳播的激光(Ex)在光纖的出射端成為以由固有的NA決定的角度發(fā)散的光而被發(fā)射,通過準直器4成為平行光,被分色鏡5、反射鏡6、7反射,入射到物鏡8。典型地是在物鏡8的上方配置有微板9,該微板9上排列有注入了 I μ L 幾十μ L的樣本溶液的樣本容器或皿10,從物鏡8射出的激光在樣本容器或皿10內(nèi)的樣本溶液中形成焦點,形成光強度強的區(qū)域(激勵區(qū)域)。作為觀測對象物的發(fā)光粒子、典型地是附加有熒光色素等發(fā)光標識的分子分散或溶解于樣本溶液中,當發(fā)光粒子進入到激勵區(qū)域時,在其間發(fā)光粒子被激勵而釋放出光。所釋放的光(Em)通過物鏡8、分色鏡5,被反射鏡11反射而在聚光鏡12聚光,通過針孔13。此外,如本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的那樣,針孔13配置在與物鏡8的焦點位置共軛的位置處,由此僅從如圖1的(B)示意性地表示的從激光的焦點區(qū)域、即激勵區(qū)域內(nèi)發(fā)出的光通過針孔13,來自焦點面以外的光被遮斷。圖1的(B)所例示的激光的焦點區(qū)域通常是具有IfL IOfL左右的有效體積的本光分析裝置中的光檢測區(qū)域,被稱為共焦區(qū)組織。在共焦區(qū)組織中,典型地是光強度以區(qū)域中心為頂點的高斯型分布或洛侖茲型分布,其有效體積是以光強度為Ι/e2的面為邊界的大致橢圓球體的體積。這樣,通過了針孔13的光在分色鏡14x中被分割為多個波長頻帶(圖中被分割為兩個波長頻帶,但是也可以是兩個以上。),使分割后的光的成分分別透過對應(yīng)的屏障濾波器14a、14b,在此只特定波長頻帶的光成分被選擇,之后被導(dǎo)入到多模光纖15,到達對應(yīng)的光檢測器16a、16b (在圖中,裝備有兩個光檢測器,但是可以與波長頻帶的個數(shù)相應(yīng)地裝備光檢測器,使它們分別接收一個檢測波長頻帶的成分。)。根據(jù)該結(jié)構(gòu),在圖1的(A)的裝置中,來自光檢測區(qū)域的光的多個波長頻帶的成分分開且同時被檢測到,能夠捕捉發(fā)光粒子的發(fā)光波長特性的特征。光檢測器16a、16b將依次到來的光的強度轉(zhuǎn)換為按時間序列的電信號后發(fā)送到計算機18,這樣以后面要說明的方式進行用于光分析的處理。作為光檢測器16a、16b,優(yōu)選的是使用能夠在光子計數(shù)中使用的超高靈敏度的光檢測器,由此,能夠檢測來自一個發(fā)光粒子的光、例如來自一個或多個熒光色素分子的微弱光。另外,在上述的光分析裝置的光學(xué)系統(tǒng)中,還設(shè)置有用于變更光學(xué)系統(tǒng)的光路來通過光檢測區(qū)域掃描樣本溶液內(nèi)、即使焦點區(qū)域(即,光檢測區(qū)域)的位置在樣本溶液內(nèi)移動的機構(gòu)。作為所述的用于使光檢測區(qū)域的位置移動的機構(gòu),例如圖1的(C)示意性地例示的那樣,可以采用變更 反射鏡7的朝向的反射鏡偏轉(zhuǎn)器17。所述反射鏡偏轉(zhuǎn)器17可以與在通常的激光掃描型顯微鏡中裝備的檢電鏡裝置相同。另外,為了實現(xiàn)所期望的光檢測區(qū)域的位置的移動圖案,在計算機18的控制下與光檢測器16所進行的光檢測協(xié)作來驅(qū)動反射鏡偏轉(zhuǎn)器17??梢詮膱A形、橢圓形、矩形、直線、曲線或它們的組合中任意地選擇光檢測區(qū)域的位置的移動路徑(可以設(shè)為能夠在計算機18的程序中選擇各種移動圖案。)。此夕卜,雖然沒有圖示,但也可以通過使物鏡8上下移動來使光檢測區(qū)域的位置在上下方向上移動。如上所述,根據(jù)不是移動樣本溶液而是變更光學(xué)系統(tǒng)的光路使光檢測區(qū)域的位置移動的結(jié)構(gòu),在樣本溶液內(nèi)不會實質(zhì)地產(chǎn)生機械振動、流體動力的作用,能夠排除動力作用對觀測對象物的影響,實現(xiàn)穩(wěn)定的計量。此外,作為追加的結(jié)構(gòu),也可以在顯微鏡的臺(未圖示)上設(shè)置用于移動微板9的水平方向位置的臺位置變更裝置17a以變更所觀察的皿10。可以由計算機18控制臺位置變更裝置17a的動作。在發(fā)光粒子通過多光子吸收而發(fā)光的情況下,上述光學(xué)系統(tǒng)被用作多光子顯微鏡。在這種情況下,只在激勵光的焦點區(qū)域(光檢測區(qū)域)釋放光,因此可以去除針孔13。在發(fā)光粒子通過磷光而發(fā)光的情況下,能夠直接使用上述的共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)。另外,在發(fā)光粒子不通過激勵光而通過化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光現(xiàn)象發(fā)光的情況下,可以省略用于生成激勵光的光學(xué)系統(tǒng)2 5。并且,可以在光分析裝置I中如圖示那樣設(shè)置多個激勵光源2,可以設(shè)為能夠根據(jù)激勵發(fā)光粒子的光的波長而適當?shù)剡x擇激勵光的波長。優(yōu)選的是暫時照射的激勵光是一個波長頻帶的光,但是也可以根據(jù)實驗條件而暫時將多個波長頻帶的光用作激勵光。本發(fā)明的原理如“發(fā)明內(nèi)容” 一欄所記載的那樣,根據(jù)本發(fā)明的光分析技術(shù),如果清楚地進行描述則如下,即,“掃描分子計數(shù)法” 一邊使共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動一邊檢測在樣本溶液中分散的發(fā)光粒子被包含在光檢測區(qū)域內(nèi)時所釋放出的光來個別地檢測發(fā)光粒子的存在,在該“掃描分子計數(shù)法”中,個別地計量發(fā)光粒子的光的多個波長頻帶的成分,并嘗試檢測發(fā)光粒子的發(fā)光波長特性的特征。根據(jù)所述的結(jié)構(gòu),能夠根據(jù)個別檢測出的發(fā)光粒子的發(fā)光波長特性的特征來識別發(fā)光粒子的種類,因此能夠在多個種類的發(fā)光粒子混合存在的系統(tǒng)中檢測各個種類的發(fā)光粒子的存在、檢測各種發(fā)光粒子的存在比(濃度比)、獲取各種發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度等信息。下面,對掃描分子計數(shù)法和本發(fā)明的發(fā)光波長特性的特征的檢測原理進行說明。1.掃描分子計數(shù)法的原理FCS等光譜分析技術(shù)與現(xiàn)有的生物化學(xué)的分析技術(shù)相比,其優(yōu)點在于所需要的樣本量極少且能夠迅速地執(zhí)行檢查。然而,在FCS等光譜分析技術(shù)中,在原理上,根據(jù)熒光強度的波動來估算發(fā)光粒子的特性,因此為了得到高精確度的測量結(jié)果,要求如圖7的(A)示意性地描繪的那樣樣本溶液中的發(fā)光粒子的濃度或數(shù)密度為在熒光強度的計量中在光檢測區(qū)域CV內(nèi)始終存在一個左右的發(fā)光粒子的水平,如該圖的右側(cè)所示那樣在計量時間中始終檢測到有意義的光強度(光子計數(shù))。如果發(fā)光粒子的濃度或數(shù)密度低于該水平,例如圖7的(B)所描繪的那樣在發(fā)光粒子只是偶爾進入到光檢測區(qū)域CV內(nèi)的水平的情況下,如該圖的右側(cè)所例示的那樣,只在計量時間的一部分出現(xiàn)有意義的光強度的信號(光子計數(shù)),難以高精確度地估算光強度的波動。另外,在發(fā)光粒子的濃度與計量中在光檢測區(qū)域內(nèi)始終存在一個左右的發(fā)光粒子的水平相比大幅降低的情況下,在光強度的波動的運算中容易受到背景的影響,且為了得到足夠進行運算的量的有意義的光強度數(shù)據(jù)而計量時間變長。因此,本申請的申請人在日本特愿2010-044714和PCT/JP2011/53481中提出了“掃描分子計數(shù)法”,其基 于以下的新原理:即使在發(fā)光粒子的濃度低于如上所述的在FCS、FIDA等光譜分析技術(shù)中要求的水平的情況下也能夠檢測發(fā)光粒子的特性。作為在掃描分子計數(shù)法中執(zhí)行的處理,如果清楚地描述,則驅(qū)動用于使光檢測區(qū)域的位置移動的機構(gòu)(反射鏡偏轉(zhuǎn)器17)來變更光路,如在圖2的(A)中示意性地描繪的那樣,一邊使光檢測區(qū)域CV的位置在樣本溶液內(nèi)移動、即一邊通過光檢測區(qū)域CV掃描樣本溶液內(nèi),一邊執(zhí)行光檢測。這樣,例如圖2的(A)那樣,在光檢測區(qū)域CV移動的期間(圖中為時間t0 t2),在通過存在一個發(fā)光粒子的區(qū)域時(tl),從發(fā)光粒子釋放出光,如在圖2的(B)中所描繪的那樣,在按時間序列的光強度數(shù)據(jù)上出現(xiàn)有意義的光強度(Em)的脈沖狀的信號。這樣,通過執(zhí)行上述的光檢測區(qū)域CV的位置的移動和光檢測并逐個地檢測其間出現(xiàn)的如圖2的(B)所例示的脈沖狀的信號(有意義的光強度),能夠個別檢測發(fā)光粒子,獲取與發(fā)光粒子的特性有關(guān)的信息。在所述的掃描分子計數(shù)法的原理中,不進行如熒光強度的波動的計算那樣的統(tǒng)計性的運算處理而是逐個地檢測發(fā)光粒子,因此即使在要被觀測的粒子的濃度低至通過FCS、FIDA等無法以足夠的精確度進行分析的程度的樣本溶液中,也能夠獲取與粒子的特性有關(guān)的信息。2.本發(fā)明的發(fā)光粒子的發(fā)光波長特性的特征的檢測原理在上述掃描分子計數(shù)法中,為了檢測發(fā)光粒子或發(fā)光標識的發(fā)光波長特性的特征,在本發(fā)明中特別地將來自光檢測區(qū)域的光分開為多個波長頻帶進行檢測。例如在樣本溶液中存在分別具有在圖2的(C)的上方所例示的那樣的發(fā)光波長特性(發(fā)光光譜)的發(fā)光粒子α、β、Υ、δ的情況下,如果將來自光檢測區(qū)域的光分開為適當個數(shù)的波長頻帶、例如分開為五個觀測窗chi ch5來通過各個光檢測器分別計量各成分,則分別具有發(fā)光波長特性的發(fā)光粒子α、β、Y、δ各自的chi ch5的強度分布如圖2的(C)的下方示意性地描繪的那樣為反映各個發(fā)光波長特性的輪廓的特征而互不相同的分布。因而,如果參照chi ch5的強度分布、例如參照各觀測窗中的強度之比Idll:1^2:1dl3:1dl4:1dl5,則可知各個發(fā)光粒子是具有哪個發(fā)光波長特性的粒子,從而能夠識別發(fā)光粒子的種類。例如在某發(fā)光粒子的信號的chi ch5的強度的分布是圖2的(C)的下方的附加為“ Y ”的曲線圖的分布時,能夠識別為該發(fā)光粒子的種類是具有Y的發(fā)光波長特性的粒子。此外,觀測窗的個數(shù)、即個別檢測的波長頻帶數(shù)越多,越是能夠詳細地檢測各發(fā)光粒子的發(fā)光波長特性的特征,但是裝置I的對檢測光進行分割的部分的光學(xué)系統(tǒng)(分色鏡14x、屏障濾波器14a、14b等)的結(jié)構(gòu)變得復(fù)雜,調(diào)整麻煩增加并且各觀測窗中的強度減少,可能使測量出的各個強度值的精確度變差。因此,優(yōu)選的是可以如圖2的(D)那樣將觀測窗的個數(shù)設(shè)為兩個,調(diào)節(jié)各觀測窗的檢測波長頻帶使得能夠在兩個觀測窗的強度分布中適當?shù)胤从掣靼l(fā)光粒子的發(fā)光波長特性的特征,根據(jù)這兩個觀測窗中的強度的均衡實現(xiàn)作為觀測對象的發(fā)光粒子的按種類的區(qū)別。在這種情況下,可以根據(jù)兩個觀測窗的強度比
U、Ichi/Ich2等進行發(fā)光粒子的種類的識別。處理操作討稈在利用圖1的(A)所例示的光分析裝置I的本發(fā)明的光分析的實施方式中,具體地說執(zhí)行以下的過程:(I)包含發(fā)光粒子的樣本溶液的制備過程,(2)樣本溶液的光強度的測量處理過程,以及(3)測量出的光強度的分析處理過程。圖3示出用流程圖的形式表示的本實施方式中的處理過程。 (I)制備樣本溶液在本發(fā)明的光分析技術(shù)中,作為觀測對象的粒子只要是溶解的分子等在樣本溶液中分散并在溶液中隨機運動的粒子,就可以是任意的,例如可以是蛋白質(zhì)、肽、核酸、脂質(zhì)、糖鏈、氨基酸或它們的聚合體等生物體分子、病毒、細胞、或金屬膠體、其它非生物學(xué)粒子等(樣本溶液典型地是水溶液,但并不限于此,可以是有機溶劑之類的其它任意的液體。)。另夕卜,作為觀測對象的粒子可以是其自身發(fā)光的粒子,或者,也可以是以任意方式附加了發(fā)光標識(突光分子、磷光分子、化學(xué)/生物發(fā)光分子)的粒子。(2)測量樣本溶液的光強度在本實施方式的掃描分子計數(shù)法的光強度的測量處理過程中,一邊驅(qū)動反射鏡偏轉(zhuǎn)器17進行光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)的移動(樣本溶液內(nèi)的掃描)一邊進行光強度的測量(圖3的步驟100)。在操作處理中,典型地是在向微板9的皿10注入樣本溶液并載置在顯微鏡的臺上后,當使用者向計算機18輸入開始測量的指示時,計算機18依照存儲在存儲裝置(未圖示)中的程序(為了使光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動而變更光路的過程、向光檢測區(qū)域照射激勵光的過程(僅在需要的情況下)以及在光檢測區(qū)域的位置的移動中檢測來自光檢測區(qū)域的光的過程),開始進行樣本溶液內(nèi)的光檢測區(qū)域處的激勵光的照射(僅在需要的情況下)和光強度的計量。在開始計量時,首先在依照計算機18的程序的處理動作的控制下,從光源2射出樣本溶液中的發(fā)光粒子的激勵波長的光,并且反射鏡偏轉(zhuǎn)器17驅(qū)動反射鏡7 (檢電鏡),在皿10內(nèi)執(zhí)行光檢測區(qū)域的位置的移動,與此同時,光檢測器16a、16b分別將依次接收到的光轉(zhuǎn)換為電信號并發(fā)送到計算機18,計算機18按照任意的方式根據(jù)所發(fā)送的信號生成按時間序列的光強度數(shù)據(jù)并保存。典型地是光檢測器16a、16b是能夠檢測一個光子的到來的超高靈敏度光檢測器,因此,光的檢測是以在規(guī)定時間內(nèi)每隔規(guī)定的單位時間(BIN TIME)、例如每隔10 μ s依次計量來到光檢測器的光子的個數(shù)的方式執(zhí)行的光子計數(shù),按時間序列的光強度的數(shù)據(jù)可以是按時間序列的光子計數(shù)數(shù)據(jù)。關(guān)于光檢測區(qū)域的位置的移動速度,在掃描分子計數(shù)法中,為了定量地高精確度地執(zhí)行基于計量出的按時間序列的光強度數(shù)據(jù)的發(fā)光粒子的個別檢測,優(yōu)選的是將光強度的計量過程中光檢測區(qū)域的位置的移動速度設(shè)定為比發(fā)光粒子的隨機運動、即布朗運動的移動速度快的值。在光檢測區(qū)域的位置的移動速度比因粒子的布朗運動而進行的移動慢的情況下,如圖4的(A)示意性地描繪的那樣,粒子在區(qū)域內(nèi)隨機地移動,由此,光強度隨機地變化(光檢測區(qū)域的激勵光強度以區(qū)域的中心為頂點向外方降低),難以確定與各個發(fā)光粒子對應(yīng)的有意義的光強度的變化(表示來自發(fā)光粒子的光的信號)。因此,優(yōu)選的是如圖4的(B)所描繪的那樣,將光檢測區(qū)域的位置的移動速度設(shè)定得比粒子的布朗運動的平均移動速度(擴散移動速度)快,使得粒子大致直線地橫穿光檢測區(qū)域CV,由此在按時間序列的光強度數(shù)據(jù)中與各個粒子對應(yīng)的光強度的變化的輪廓是與圖4的(C)的最上部所例示的那樣的激勵光強度分布大致相同的吊鐘狀,從而能夠容易地確定各個發(fā)光粒子與光強度之間的對應(yīng)。具體地說,具有擴散系數(shù)D的發(fā)光粒子由于布朗運動而通過半徑r的光檢測區(qū)域(共焦區(qū)組織)時所需要的時間△ τ根據(jù)以下的平均平方位移的關(guān)系式,(2r)2=6DX Δ τ...(I)成為Λ τ =(2r)2/6D …(2)因此,發(fā)光粒子因布朗運動而移動的速度(擴散移動速度)Vdif大致為Vdif=2r/ Δ τ =3D/r...(3)。因此,光檢測區(qū)域的位置的移動速度可以參照所述Vdif設(shè)定為比其充分快的值。例如在預(yù)想發(fā)光粒子的擴散系數(shù)是D=2.0X l(rlclm2/s左右的情況下,在r為0.62 μ m左右時,Vdif為1.0X 10_3m/s,因此,可以將光檢測區(qū)域的位置的移動速度設(shè)定為其10倍以上的15mm/s。此外,在發(fā)光粒子的擴散系數(shù)未知的情況下,可以設(shè)定各種光檢測區(qū)域的位置的移動速度,反復(fù)執(zhí)行用于找到使光強度的變化的輪廓為預(yù)想的輪廓(典型地是與激勵光強度分布大致相同)的條件的預(yù)備實驗,來確定適合的光檢測區(qū)域的位置的移動速度。(3)分析光強度在通過上述的處理得到樣本溶液中的發(fā)光粒子的按時間序列的光強度數(shù)據(jù)時,在計算機18中,通過依照存儲在存儲裝置中的程序的處理,來執(zhí)行光強度數(shù)據(jù)上的與來自發(fā)光粒子的光對應(yīng)的信號的檢測以及各發(fā)光粒子的種類的識別。(i)檢測與發(fā)光粒 子對應(yīng)的信號在按時間序列的光強度數(shù)據(jù)中,在一個發(fā)光粒子通過光檢測區(qū)域時的軌跡如圖4的(B)所示那樣是大致直線狀的情況下,與該粒子對應(yīng)的信號中的光強度的變化具有反映(由光學(xué)系統(tǒng)決定的)光檢測區(qū)域內(nèi)的光強度分布的大致吊鐘狀的輪廓(參照圖4的(C)的最上部)。因而,在掃描分子計數(shù)法中,基本上可以在超過適當設(shè)定的閾值的光強度所持續(xù)的時間寬度處于規(guī)定的范圍內(nèi)時,判定為具有該光強度的輪廓的信號與一個粒子通過光檢測區(qū)域的情況對應(yīng),進行一個發(fā)光粒子的檢測。而且,超過閾值的光強度所持續(xù)的時間寬度不在規(guī)定的范圍內(nèi)的信號被判定為噪聲或異物的信號。另外,在能夠?qū)⒐鈾z測區(qū)域的光強度分布假定為高斯分布時,即I=AXexp (~2t2/a2) …⑷在使式(4)擬合有意義的光強度的輪廓(能夠明確地判斷為不是背景的輪廓)而計算出的強度A和寬度a處于規(guī)定的范圍內(nèi)時,可以將該光強度的輪廓判定為與一個粒子通過光檢測區(qū)域的情況對應(yīng),進行一個發(fā)光粒子的檢測(強度A和寬度a處于規(guī)定的范圍外的信號被判定為噪聲或異物的信號,可以在其后的分析等中忽略。)。作為根據(jù)時序光強度數(shù)據(jù)進行發(fā)光粒子的統(tǒng)一的檢測的處理方法的一個例子,首先對時序光強度數(shù)據(jù)(圖4的(C)、最上部“檢測結(jié)果(未處理)”)進行平滑(平滑化)處理(圖3的步驟110、圖4的(C)的中上部“平滑”)。發(fā)光粒子所發(fā)出的光是概率性地釋放的,在微小的時間內(nèi)可能產(chǎn)生數(shù)據(jù)值的缺失,因此通過所述平滑處理,能夠忽略如上所述的數(shù)據(jù)值的缺失。例如可以通過移動平均法進行平滑處理。此外,也可以根據(jù)獲取光強度數(shù)據(jù)時的光檢測區(qū)域的位置的移動速度(掃描速度)、BIN ΜΕ來適當?shù)卦O(shè)定執(zhí)行平滑處理時的參數(shù)、例如在移動平均法中進行一次平均的數(shù)據(jù)個數(shù)、移動平均的次數(shù)等。接著,在平滑處理后的時序光強度數(shù)據(jù)中,為了檢測有意義的脈沖狀信號(以下稱為“脈沖信號”)所存在的時間區(qū)域(脈沖存在區(qū)域),對平滑處理后的時序光強度數(shù)據(jù)的時間計算一次微分值(步驟120)。時序光強度數(shù)據(jù)的時間微分值如圖4的(C)的中下部“時間微分”所例示的那樣,在信號值的變化時刻值的變化變大,因此通過參照所述時間微分值,能夠有利地確定有意義的信號的起點和終點。然后,在時序光強度數(shù)據(jù)上,依次檢測有意義的脈沖信號,判斷檢測出的信號是否是與發(fā)光粒子對應(yīng)的信號。具體地說,首先在時序光強度數(shù)據(jù)的按時間序列的時間微分值數(shù)據(jù)上,依次參照時間微分值來搜索并確定一個脈沖信號的起點和終點,確定脈沖存在區(qū)域(步驟130)。在確定了一個脈沖存在區(qū)域時,針對該脈沖存在區(qū)域中的平滑后的時序光強度數(shù)據(jù)進行吊鐘型函數(shù)的擬合(圖4的(C)的下部的“吊鐘型函數(shù)擬合”),計算吊鐘型函數(shù)的脈沖的峰值(最大值)的強度Ipeak、脈沖寬度(半峰全寬)Wpeak、擬合時的(最小二乘法的)相關(guān)系數(shù)等參數(shù)(步驟140)。此外,擬合的吊鐘型函數(shù)典型地是高斯函數(shù),但也可以是洛侖茲型函數(shù)。而且,判斷計算出的吊鐘型函數(shù)的參數(shù)是否處于針對一個發(fā)光粒子通過光檢測區(qū)域時被檢測出的脈沖信號所描繪的吊鐘型輪廓的參數(shù)所設(shè)想的范圍內(nèi),即判斷脈沖的峰值強度、脈沖寬度、相關(guān)系數(shù)是否分別處于規(guī)定范圍內(nèi)等(步驟150)。這樣,如圖5的左邊所示那樣,將被判定為計算出的吊鐘型函數(shù)的參數(shù)處于針對與一個發(fā)光粒子對應(yīng)的信號設(shè)想的范圍內(nèi)的信號判定為是與一個發(fā)光粒子對應(yīng)的信號,由此檢測出一個發(fā)光粒子。另一方面,如圖5的右邊所示那樣,計算出的吊鐘型函數(shù)的參數(shù)不在設(shè)想的范圍內(nèi)的脈沖信號作為噪聲而被忽略。可以在多個檢測波長頻帶成分各自的時序光強度數(shù)據(jù)的整個區(qū)域中反復(fù)執(zhí)行上述步驟130 150的處理中的脈沖信號的搜索和判斷(步驟160)。另外,在本實施方式的情況下,一個發(fā)光粒 子的光出現(xiàn)在多個檢測波長頻帶的時序光強度數(shù)據(jù)中,因此各發(fā)光粒子的信號由多個檢測波長頻帶的時序光強度數(shù)據(jù)中的信號的組構(gòu)成。關(guān)于該點,如從圖2的(C)或(D)的下圖理解的那樣,既存在一個發(fā)光粒子的光在多個檢測波長頻帶的時序光強度數(shù)據(jù)中都出現(xiàn)的情況,也存在一個發(fā)光粒子的光僅在它們中的某一個中出現(xiàn)的情況。因而,發(fā)光粒子的信號在多個檢測波長頻帶的時序光強度數(shù)據(jù)中的至少一個中出現(xiàn)的情況下,可以設(shè)為在該信號出現(xiàn)的時間內(nèi)在其它的檢測波長頻帶的時序光強度數(shù)據(jù)中存在發(fā)光粒子的信號來進行處理??梢酝ㄟ^參照脈沖存在區(qū)域的時間值來進行多個檢測波長頻帶成分的時序光強度數(shù)據(jù)上的信號的對應(yīng)。另外,作為其它的方式,可以設(shè)為對多個檢測波長頻帶成分中的一個檢測波長頻帶成分,在其時序光強度數(shù)據(jù)上檢測發(fā)光粒子的信號,設(shè)為在被檢測出的這些信號的產(chǎn)生時間內(nèi)在其它的檢測波長頻帶成分的時序光強度數(shù)據(jù)上也存在發(fā)光粒子的信號來進行處理。此外,根據(jù)時序光強度數(shù)據(jù)個別檢測發(fā)光粒子的信號的處理不限于上述的過程,可以通過任意的方法執(zhí)行。(ii)各發(fā)光粒子的光強度比計算以及種類的識別(圖3的步驟170、180)這樣,當在多個檢測波長頻帶各自的時序光強度數(shù)據(jù)中檢測發(fā)光粒子的信號時,針對每個發(fā)光粒子,參照多個檢測波長頻帶的光強度,根據(jù)它們的分布來判斷發(fā)光粒子的種類。作為各成分的光強度,可以采用在步驟130 160中檢測出的發(fā)光粒子的信號的峰值強度、光子計數(shù)的累積值、或者擬合的吊鐘型函數(shù)的時間積分值等。例如在如圖2的(C)那樣檢測波長頻帶為三個以上時,可以參照它們的強度比、(IdllAo): (Ich2/1): (Ieh3/1):...,根據(jù)其比的分布來識別發(fā)光粒子的種類(1是多個檢測波長頻帶的成分的強度的總和。)。另外,在如圖2的⑶那樣檢測波長頻帶是兩個時,也可以計算它們的強度比的值IdllAdl2,根據(jù)其計算值識別發(fā)光粒子的種類。而且,關(guān)于多個檢測波長頻帶的成分的強度比預(yù)先已知的發(fā)光粒子,能夠根據(jù)上述計算出的強度比來進行其種類的同定。并且,也可以對檢測出的發(fā)光粒子的信號的個數(shù)進行計數(shù)來確定發(fā)光粒子的個數(shù)(發(fā)光粒子的計數(shù))。在這種情況下,在本發(fā)明中,由于能夠識別發(fā)光粒子的種類,因此可以按每個種類確定發(fā)光粒子的個數(shù)。并且,如果通過任意的方法估算出光檢測區(qū)域通過的區(qū)域的總體積,則根據(jù)其體積值和發(fā)光粒子的個數(shù)來確定樣本溶液中的發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度。也可以根據(jù)激勵光或檢測光的波長、透鏡的數(shù)值孔徑、光學(xué)系統(tǒng)的調(diào)整狀態(tài)來在理論上估算光檢測區(qū)域通過的區(qū)域的總體`積,但是可以通過實驗,例如針對發(fā)光粒子的濃度已知的溶液(對比溶液),以與要檢查的樣本溶液的測量相同的條件進行上述已說明的光強度的測量、發(fā)光粒子的檢測以及計數(shù),根據(jù)由此檢測出的發(fā)光粒子的個數(shù)和對比溶液的發(fā)光粒子的濃度來進行確定。具體地說,例如對于發(fā)光粒子的濃度C的對比溶液,當設(shè)對比溶液的發(fā)光粒子的檢測數(shù)為N時,光檢測區(qū)域通過的區(qū)域的總體積Vt能夠通過下式給出。Vt=N/C …(5)另外,可以作為對比溶液而準備發(fā)光粒子的多個不同濃度的溶液,對各個溶液分別執(zhí)行測量,采用計算出的Vt的平均值作為光檢測區(qū)域通過的區(qū)域的總體積vt。而且,當提供了 Vt時,發(fā)光粒子的計數(shù)結(jié)果為η的樣本溶液的發(fā)光粒子的濃度C能夠通過下式給出。c=n/Vt...(6)此外,光檢測區(qū)域的體積、光檢測區(qū)域通過的區(qū)域的總體積可以不通過上述的方法而通過任意的方法、例如利用FCS、FIDA等給出。另外,在本實施方式的光分析裝置中,關(guān)于所設(shè)想的光檢測區(qū)域的移動圖案,可以將各種標準的發(fā)光粒子的濃度C與發(fā)光粒子的個數(shù)N的關(guān)系(式(5))的信息預(yù)先存儲到計算機18的存儲裝置中,以使裝置的使用者在實施光分析時能夠適當利用所存儲的關(guān)系的信息。此外,在本發(fā)明中,能夠識別發(fā)光粒子的種類,因此能夠按發(fā)光粒子的每個種類確定數(shù)密度或濃度。這樣,根據(jù)上述的本發(fā)明,在通過光檢測區(qū)域在樣本溶液中進行掃描來個別檢測發(fā)光粒子的掃描分子計數(shù)法中,在多個檢測波長頻帶中個別檢測發(fā)光粒子的光,通過參照反映出該發(fā)光粒子的發(fā)光波長特性的特征的強度分布或強度之比,能夠識別檢測出的各發(fā)光粒子的種類。為了驗證上述已說明的本發(fā)明的有效性而進行了如下的實驗。此外,應(yīng)該理解為下面的實施例是例示本發(fā)明的有效性而并非限定本發(fā)明的范圍。實施例1通過本發(fā)明驗證了能夠在掃描分子計數(shù)法中識別發(fā)光粒子的種類。作為樣本溶液,分別制備出將熒光色素ATT0565 (熒光波長峰值592nm)、ATT0590(熒光波長峰值624nm)以濃度為IOOpM的方式溶解于磷酸緩沖液(包含
0.05%Tween20)中所得到的溶液(以下稱為ATT0565溶液、ATT0590溶液)。在光測量中,作為光分析裝置,使用具備共焦熒光顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光子計數(shù)系統(tǒng)的單分子熒光測量裝置MF-20(奧林巴斯株式會社),依照在上述的“(2)測量樣本溶液的光強度”中說明的方式,針對上述各個樣本溶液獲取到時序光強度數(shù)據(jù)(光子計數(shù)數(shù)據(jù))。這時,激勵光使用500 μ W的543nm的激光,使用帶通濾波器測量大約565nm_595nm的波長頻帶的光(第一波長頻帶-chi)和660nm-710nm的波長頻帶(第二波長頻帶_ch2)的光,對各個波長頻帶生成時序光強度數(shù)據(jù)。使樣本溶液中的光檢測區(qū)域以15mm/秒的移動速度移動。另外,將BINTIME設(shè)為10 μ秒、將測量時間 設(shè)為2秒鐘。在測量光強度之后,依照上述的“(3) (i)與發(fā)光粒子對應(yīng)的信號的檢測”中所記載的處理過程,針對在ch2中獲取到的時序光強度數(shù)據(jù)實施平滑處理,在被平滑后的數(shù)據(jù)中確定脈沖信號的起點和終點,之后通過最小二乘法使高斯函數(shù)擬合各脈沖信號,確定(高斯函數(shù)中的)峰值強度、脈沖寬度(半峰全寬)、相關(guān)系數(shù)。然后,只將滿足下述的條件的脈沖信號判定為與發(fā)光粒子對應(yīng)的信號,20 μ s〈脈沖寬度〈400 μ S峰值強度>1.0 [pc/10 μ s] …(A)相關(guān)系數(shù)>0.95,另一方面,將不滿足上述條件的脈沖信號作為噪聲而忽略。接著,估算ch2的時序光強度數(shù)據(jù)上被判斷為發(fā)光粒子的信號的信號產(chǎn)生期間(脈沖存在區(qū)域)的、chi的時序光強度數(shù)據(jù)上的光子計數(shù)的累積值以及ch2的時序光強度數(shù)據(jù)上的光子計數(shù)的累積值,分別作為發(fā)光粒子的信號的chi的強度值Ichl、ch2的強度值Ich2。圖6的(A)是對于ATT0565溶液和ATT0590溶液的各溶液相對于通過上述的光測量和信號檢測處理檢測出的各個發(fā)光粒子的信號的chi的強度Ichl繪制ch2的強度Ich2而得到的圖。如從圖中理解的那樣,ATT0565的分布(白圓)和ATT0590的分布(黑方塊)分別分布在大致直線上,并且,兩個分布是相互分離的。該情形示出強度比Ichl/Ich2是反映各個熒光色素的發(fā)光波長特性的特征的發(fā)光粒子的種類所固有的值,根據(jù)強度比能夠辨別種類。圖6的(B)示出ATT0565的強度比Ichl/Ich2和ATT0590的強度比Ichl/Ich2的各自平均值(直方圖表)和標準偏差(誤差條),如從該圖理解的那樣,示出了以下內(nèi)容:ATT0565的強度比的平均值和ATT0590的強度比的平均值是有意義且不同的,并且ATT0565的強度比的誤差條和ATT0590的強度比的誤差條不重復(fù),因此ATT0565的信號和ATT0590的信號能夠相互識別出。這樣,如從上述實施例的結(jié)果理解的那樣,根據(jù)上述的本發(fā)明,在掃描分子計數(shù)法中個別地計量多個檢測波長頻帶的成分,通過參照反映出發(fā)光粒子的發(fā)光波長特性的特征的多個檢測波長頻帶的成分的強度比,能夠根據(jù)檢測出的發(fā)光粒子的種類來區(qū)分發(fā)光粒子的信號,由此,能夠識別出各發(fā)光粒子的種類。特別地,本發(fā)明通過個別地檢測發(fā)光粒子的信號,能夠識別各發(fā)光粒子的種類,因此即使樣本溶液中的發(fā)光粒子的濃度低于FCS等光分析技術(shù)所要求的濃度范圍,也能夠進行發(fā)光粒子的檢測,所述特征在對醫(yī)學(xué)、生物學(xué)的研究開發(fā)領(lǐng)域中經(jīng)常使用的稀少 或昂貴的樣本進行分析的情況下是有利的。另外,根據(jù)本發(fā)明,由于在掃描分子計數(shù)法中能夠識別發(fā)光粒子的種類,因此期待擴大掃描分子計數(shù)法的應(yīng)用范圍。
權(quán)利要求
1.一種光分析裝置,其使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)檢測來自在樣本溶液中分散且隨機運動的發(fā)光粒子的光并進行分析,該光分析裝置的特征在于,包括: 光檢測區(qū)域移動部,其通過變更上述光學(xué)系統(tǒng)的光路,使上述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測區(qū)域的位置在上述樣本溶液內(nèi)移動; 光檢測部,其檢測來自上述光檢測區(qū)域的光的多個波長頻帶的成分的強度;以及 信號處理部,其在一邊使上述光檢測區(qū)域的位置在上述樣本溶液內(nèi)移動一邊由上述光檢測部檢測出的光的多個波長頻帶的成分的強度中個別檢測來自各個上述發(fā)光粒子的光的信號,根據(jù)檢測出的上述發(fā)光粒子的光的信號的多個波長頻帶的成分的強度來識別上述發(fā)光粒子的種類。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的光分析裝置,其特征在于, 上述信號處理部根據(jù)上述發(fā)光粒子的光的信號的多個波長頻帶的成分的強度之比來識別上述發(fā)光粒子的種類。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的光分析裝置,其特征在于, 上述光檢測部檢測來自上述光檢測區(qū)域的光的兩個波長頻帶的成分的強度,上述信號處理部根據(jù)上述兩個波長頻帶的成分的強度之比來識別上述發(fā)光粒子的種類。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的光分析裝置,其特征在于, 還包括光照射部,該光照射部向上述光檢測區(qū)域照射一個波長頻帶的激勵光,上述發(fā)光粒子是通過上述一個波長頻帶的激勵光的照射而發(fā)光的粒子,上述光檢測部對通過上述一個波長頻帶的激勵光的照射而發(fā)出的來自上述光檢測區(qū)域的光的多個波長頻帶的成分的強度進行檢測。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述 的光分析裝置,其特征在于, 上述信號處理部對個別檢測出的上述發(fā)光粒子的光的信號的個數(shù)進行計數(shù)來對在上述光檢測區(qū)域的位置移動過程中檢測出的上述發(fā)光粒子的個數(shù)進行計數(shù)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中的任一項所述的光分析裝置,其特征在于, 上述光檢測區(qū)域移動部以比上述發(fā)光粒子的擴散移動速度快的速度移動上述光檢測區(qū)域的位置。
7.一種光分析方法,其使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)檢測來自在樣本溶液中分散且隨機地運動的發(fā)光粒子的光并進行分析,該光分析方法的特征在于,包括以下步驟: 通過變更上述光學(xué)系統(tǒng)的光路來使上述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測區(qū)域的位置在上述樣本溶液內(nèi)移動; 一邊使上述光檢測區(qū)域的位置在上述樣本溶液內(nèi)移動一邊檢測來自上述光檢測區(qū)域的光的多個波長頻帶的成分的強度;以及 在檢測出的上述光的多個波長頻帶的成分的強度中個別檢測來自各個上述發(fā)光粒子的光的信號,根據(jù)檢測出的上述發(fā)光粒子的光的信號的多個波長頻帶的成分的強度來識別上述發(fā)光粒子的種類。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的光分析方法,其特征在于, 根據(jù)上述發(fā)光粒子的光的信號的多個波長頻帶的成分的強度之比來識別上述發(fā)光粒子的種類。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的光分析方法,其特征在于, 檢測來自上述光檢測區(qū)域的光的兩個波長頻帶的成分的強度,根據(jù)上述兩個波長頻帶的成分的強度之比來識別上述發(fā)光粒子的種類。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的光分析方法,其特征在于, 還包括向上述光檢測區(qū)域照射一個波長頻帶的激勵光的步驟,其中,上述發(fā)光粒子是通過上述一個波長頻帶的激勵光的照射而發(fā)光的粒子,對通過上述一個波長頻帶的激勵光的照射而發(fā)出的來自上述光檢測區(qū)域的光的多個波長頻帶的成分的強度進行檢測。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的光分析方法,其特征在于, 還包括以下步驟:對個別檢測出的上述發(fā)光粒子的光的信號的個數(shù)進行計數(shù)來對在上述光檢測區(qū)域的位置移動過程中檢測出的上述發(fā)光粒子的個數(shù)進行計數(shù)。
12.根據(jù)權(quán)利要求7至11中的任一項所述的光分析方法,其特征在于, 在移動上述光檢測區(qū)域的位置的步驟中,以比上述發(fā)光粒子的擴散移動速度快的速度移動上述光檢測區(qū)域的位置 。
全文摘要
按照本發(fā)明的使用利用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡進行光計量的掃描分子計數(shù)法對來自發(fā)光粒子的光進行檢測并分析的技術(shù)的特征在于,一邊通過變更顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的光路來使光學(xué)系統(tǒng)的光檢測區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動,一邊檢測來自光檢測區(qū)域的光的多個波長頻帶的成分的強度,在檢測出的光的多個波長頻帶的成分的強度中個別地檢測來自各個發(fā)光粒子的光的信號,根據(jù)檢測出的發(fā)光粒子的光的信號的多個波長頻帶的成分的強度來識別發(fā)光粒子的種類。
文檔編號G01N21/64GK103229042SQ20118005702
公開日2013年7月31日 申請日期2011年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月25日
發(fā)明者葉梨拓哉, 田邊哲也, 山口光城 申請人:奧林巴斯株式會社
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