專利名稱：通過確定焦谷氨酸修飾的mcp-1診斷炎性疾病的方法和谷氨酰胺?；h(huán)化酶抑制劑的篩 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用生物學(xué)樣品中N-末端焦谷氨酸修飾的MCP-1 (MCP-lNlpE) :MCP-I總濃度的比率作為生物標(biāo)記監(jiān)測炎性疾病或炎性相關(guān)疾病的治療的方法，進(jìn)一步涉及確定生物學(xué)樣品中N-末端焦谷氨酸修飾的MCP-I相關(guān)于MCP-I總濃度的比例的新方法。本發(fā)明還提供了用于篩選谷氨酰胺酰基環(huán)化酶(glutaminyl cyclase) (QC)抑制劑或者測量谷氨酰胺?；h(huán)化酶(QC)抑制劑的效力的診斷試劑盒及方法。
背景技術(shù)：
趨化性細(xì)胞因子(趨化因子)是吸引和激活白細(xì)胞的蛋白質(zhì)并且被認(rèn)為在炎癥中起重要作用。趨化因子通過N-末端半胱氨酸殘基的表觀被分為4個(gè)家族(C-、CC-、CXC-和CX3C-趨化因子)。CC-趨化因子(又名β-趨化因子)優(yōu)先吸引單核細(xì)胞至炎癥部位。單核細(xì)胞浸潤被認(rèn)為是一些疾病病癥中的關(guān)鍵事件(Gerard，C. and Rollins，B. J. (2001)Nat. Tmmunol 2,108-115;Bhatia, M. , et al., (2005)Pancreatology. 5, 132-144;Kitamoto,S. , Egashira, K. , and Takeshita, A. (2003) J Pharmacol Sci. 91，192-196)。MCP-1 (單核細(xì)胞趨化蛋白-I，CCL2)是趨化因子CC家族成員。在這個(gè)家族中，距氨基末端最近的2個(gè)半胱氨酸彼此相鄰(因此稱作C-C蛋白)。與許多其它CC趨化因子一樣，MCP-I基因位于人類17號(hào)染色體上。結(jié)合MCP-I的細(xì)胞表面受體是CCR2和CCR5。已發(fā)現(xiàn)4 種不同的人類 MCP MCP-1 (CCL2)、MCP-2 (CCL8)、MCP-3 (CCL7)和MCP-4 (CCL13) ο MCP被認(rèn)為是CC趨化因子的亞家族。所有MCP均展示優(yōu)先吸引單核細(xì)胞但是在它們的表達(dá)水平及趨化潛力中顯示差異(Luini，W.，et al.，(1994)Cytokine 6, 28-31;Uguccioni, Μ. , et al. , (1995)Eur J Tmmunol 25,64-68)Berkhout, etal.，(1997)JBC0以下示出人類MCP-I的氨基酸序列人類MCP-1 (CCL2) (UniProtKB/Swiss-Prot P13500)蛋白質(zhì)(信號(hào)序列黑體23aa;成熟MCP_l:76aa)SEQ ID NO: IMKVSAALLCLLLIAATFIPQGLAQPDAINAPVTCCYNFTNRKISVQ RLASYRRITSSKCPKEAVIFKTIVAKEICADPKQKffVQDSMDHLDKQTQT PKT與其是趨化因子β家族成員一致，MCP-I已示出在體外以亞納摩爾濃度化學(xué)吸引及激活單核細(xì)胞。升高的MCP-I表達(dá)已在各種涉及單核細(xì)胞積累和激活的病理學(xué)病癥中檢測到，包括一些炎性和非炎性疾病狀態(tài)，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、哮喘、肥胖和遲發(fā)型超敏反應(yīng)。一些研究已經(jīng)特別揭示MCP-I在如下疾病發(fā)展中的關(guān)鍵作用動(dòng)脈粥樣硬化(Gu，L.，et al. , (1998)Mol. Cell 2, 275-281; Gosling, J. , et al. , (1999) J Clin.Invest 103, 773-778);類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Gong, J. H. , et al. , (1997) J Exp. Med186, 131-137;Ogata, H. , et al. , (1997) J Pathol. 182, 106-114);胰腺炎(Bhatia, M. , etal., (2005)Am. J Physiol Gastrointest. Liver Physiol 288，G1259-G1265);阿爾茨海默病(Yamamoto, Μ. , et al. , (2005) Am. J Pathol. 166，1475-1485);肺纖維化(Inoshima, I. , et al. , (2004)Am. J Physiol Lung Cell Mol. Physiol 286，L1038-L1044);腎纖維化(Wada, T.，et al.，(2004) J Am. Soc. Nephrol. 15，940-948)以及移植物排斥(Saiura, A.，et al.，(2004)Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 24，1886-1890)。 另夕卜，MCP-I 可能也在妊娠中毒中起作用(Katabuchi, H. , et al. , (2003) Med ElectronMicrosc. 36，253-262)，有助于與高胰島素血癥和肥胖相關(guān)的病理，包括II型糖尿病(Sartipy, P. and Loskutoff, P. J. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 100, 7265-70),作為腫瘤發(fā)展(0hta，M.，et al. , (2003) Int. J Oncol. 22, 773-778;Li, S. , et al. ,(2005) JExp. Med 202，617-624)、神經(jīng)性疼痛(White, F. A. , et al. , (2005)Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. A102, 14092-7，Jung et al. J Neurochem. 104，254-63)和艾滋病(Park, I. ff.，Wang, J.F. , and Groopman, J. E. (2001)Blood 97,352-358;Co11, B. , et al., (2006)Cytokine34, 51-55)中的旁分泌因子。MCP-1的成熟形式由谷氨酰胺?；h(huán)化酶(QC)翻譯后修飾以具有N-末端焦谷氨酸(pGlu)殘基(Proost, P. et al. (1996) J Leukocyte Biol. 59，67-74)。谷氨酰胺?；h(huán)化酶(QC，EC 2. 3. 2. 5)催化N-末端谷氨酰胺酰殘基的分子內(nèi)環(huán)化成為焦谷氨酸(5-氧代-脯氨酸，pGlu，pE)，釋放氨，以及催化N-末端谷氨酰殘基的分子內(nèi)環(huán)化成為焦谷氨酸，釋放水(Fischer, W. H. and Spiess, J. (1987). Proc Natl Acad Sci US A 84:3628-32, Golololov, M.Y.,et al. (1994)Arch. Biochem. Biophys. 309, 300-7) N-末端pGlu修飾使得蛋白質(zhì)抗氨基肽酶的N-末端降解，這非常重要，因?yàn)镸CP-I的趨化能力由其 N-末端介導(dǎo)(Van Damme, J. , et al. , (1999) Chem Tmmunol 72,42-56)。MCP-1 N-末端(殘基1-9)的人工延伸或降解導(dǎo)致功能的急劇降低或喪失，盡管MCP-I仍然與其受體(CCR2)結(jié)合(Proost, P. , etal. , (1998)，J Immunol 160, 4034-4041; Zhang, Y.J. , et al. , 1994, J Biol. Chem269, 15918-15924; Masure, S. , et al. , 1995, JInterferon Cytokine Res.15,955-963;Hemmerich, S. , et al. , (1999)Biochemistry38，13013-13025，Gong and Clark-Lewis (1995) J. Exp. Med. 181,631-40)。由于MCP-1在一些疾病病癥中的顯著作用，抗MCP-1策略的開發(fā)和應(yīng)用需要強(qiáng)有力工具，以用于診斷、預(yù)后和靶調(diào)節(jié)生物標(biāo)記用途。如上所述，引人注目的證據(jù)指向MCP-I在阿爾茨海默病(AD)中的作用(Xia，M.Q. and Hyman, B. Τ. (1999) J Neurovirol. 5，32-41)。MCP-1 在衰老斑和在反應(yīng)性小神經(jīng)膠質(zhì)、CNS的定居巨噬細(xì)胞中的存在已經(jīng)在患有AD的患者腦中觀測到(Ishizuka，K.，etal., (1997)Psychiatry Clin.Neurosci.51,135-138.Stimulation of monocytesand microglia with Amyloid-β protein (A β) induces chemokine secretion invitro (Meda, L. , et al., (1996)J Immunol 157，1213-1218;Szczepanik, A. M.，etal. , (2001) J NeuroimmunoI. 113,49-62)并且Αβ (1-42)腦室內(nèi)浸潤到小鼠海馬中顯著增加體內(nèi)MCP-1。另外，Αβ沉積吸引和激活小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞并且使它們產(chǎn)生炎性介質(zhì)如MCP-1，MCP-1接著導(dǎo)致反饋以誘導(dǎo)進(jìn)一步的趨化、激活和組織損傷。在Αβ沉積部位，激活的小神經(jīng)膠質(zhì)也吞曬Αβ肽,導(dǎo)致放大的激活(Rogers, J. and Lue, L. F. (2001)Neurochem.Int. 39, 333_340)。
在AD的3xTg小鼠模型中檢查趨化因子表達(dá)揭示了神經(jīng)元炎癥在斑形成之前，以及MCP-I被上調(diào)11倍。另外，MCP-I的上調(diào)似乎與第一個(gè)細(xì)胞內(nèi)Αβ沉積的發(fā)生相關(guān)(Janelsins, M. C. , et al. , (2005) J Neuroinf lammation. 2，23) qAD 的 Tg2575 小鼠模型與過表達(dá)MCP-I的小鼠模型的雜交育種顯示與單轉(zhuǎn)基因Tg2576同窩出生仔畜相比，示出在A β沉積周圍的增加的小神經(jīng)膠質(zhì)積累，并且這個(gè)積累伴有增加量的擴(kuò)散斑(Yamamoto，Μ.，etal. (2005) Am. J Pathol. 166，1475-1485)。MCP-I水平在AD患者及顯示輕度認(rèn)知損害(MCI)患者的CSF中增加(Galimberti, D.，et al.，(2006) Arch. Neurol. 63，538-543)。另外，MCP-I 顯示在具有MCI 和早期 AD 的患者血清中水平增加(Clerici, F. , et al. , (2006) Neurobiol. Aging27， 1763-1768)。粥樣硬化病變限制或阻礙冠狀動(dòng)脈血流，是缺血性心臟病相關(guān)死亡率的主要原因，導(dǎo)致每年500，000-600, 000例死亡。在1996年在美國有超過550，000個(gè)患者及在世界范圍內(nèi)有超過945,000個(gè)患者進(jìn)行了經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動(dòng)脈成形術(shù)(PTCA)以打開阻塞的動(dòng)脈·(Lemaitre et al.，1996)。這項(xiàng)技術(shù)的一個(gè)主要限制是PTCA后血管閉塞問題，在PTCA后立即發(fā)生(急性閉塞)和長期(再狹窄):30%的具有次全部損害(subtotal lesions)的患者和50%的具有慢性全部損害的患者在成形術(shù)后會(huì)發(fā)生再狹窄。另外，再狹窄是經(jīng)歷隱靜脈旁路移植術(shù)的患者中的顯著問題。急性閉塞的機(jī)理似乎涉及若干因素并且可能來自血管回彈(vascular recoil),導(dǎo)致動(dòng)脈閉塞和/或血小板沿新打開的血管的損傷長度沉積，隨后形成纖維蛋白/紅細(xì)胞血栓。血管成形術(shù)后再狹窄是一種更逐漸的過程并且涉及亞臨界血栓的初始形成，伴有從粘附的血小板釋放細(xì)胞衍生生長因子，隨后內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞增殖及炎性細(xì)胞局部浸潤，促使血管增生。重要的是注意到血栓、細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移和炎癥之中的多個(gè)過程每個(gè)均看起來促使所述再狹窄過程。在美國，30-50%再狹窄率意味著120，000-200，000個(gè)美國患者處于再狹窄風(fēng)險(xiǎn)中。如果僅80%的這些患者選擇重復(fù)血管成形術(shù)(剩余20%選擇冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù))，這增加了剩余20%的冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)的費(fèi)用，再狹窄的總費(fèi)用很容易達(dá)到幾十億美元。因此，成功預(yù)防再狹窄不僅可以帶來顯著治療益處而且顯著節(jié)約衛(wèi)生保健成本。盡管不清楚升高的MCP-I表達(dá)是否是上述疾病的原因或結(jié)果，但是在一些動(dòng)物模型中獲得了應(yīng)用MCP-I中和抗體或MCP-I受體(CCR2)拮抗劑的治療益處。在這種情況中，重要的是注意到缺失N-末端區(qū)域的氨基酸1-8完全消除了MCP-I激動(dòng)劑受體活性，清楚表明氨基末端區(qū)域?qū)τ谑荏w激活是關(guān)鍵的(Gong，J.-H.and Clark-Lewis, I. (1995) J Exp. Med. 161 631-40, Van Damme, J. , et al. , (1999) ChemImmuno172, 42-56)。另外，直至殘基9的任何N-末端MCP-I截短均產(chǎn)生具有MCP-I受體拮抗活性的分子。所有現(xiàn)有監(jiān)測MCP-I水平的測定不能區(qū)分NlpE MCP-UNlQ MCP-I和相繼N-末端截短的分子。因此它們不反映由全長MCP-I對(duì)合適受體(CCL2、CCL5)的實(shí)際激動(dòng)劑刺激程度與拮抗性有效的N-末端截短的或完全失活的MCP-I分子的水平的關(guān)系。在體液內(nèi)，僅可檢測到全長MCP-I的N-末端焦谷氨酰修飾的種類。原因是N-末端未修飾分子被定居遍在的氨基肽酶二肽基氨基肽酶4(DP4、DPP4、DPPIV、⑶26)和氨基肽酶P (APP、X-脯氨酰氨基肽酶)快速N-末端降解，分別釋放N-末端二肽Gln-PiO或者氨基酸谷氨酰胺。因此其結(jié)論是，建立展示活性CCR2受體激動(dòng)性MCP-I分子的真實(shí)水平的測定提供了益處，能改善診斷應(yīng)用，監(jiān)測治療方法及開發(fā)與可能涉及MCP-I的疾病或者干擾有關(guān)的QC抑制劑。 谷氨酰胺?；h(huán)化酶(QC，EC 2. 3. 2. 5)催化N-末端谷氨酰胺殘基的分子內(nèi)環(huán)化成為焦谷氨酸(pyroglutamate, pGlu, pE),釋放氨。QC首先由Messer在1963年從熱帶植物番木瓜(Carica papaya)的膠乳中分離(Messer, M. 1963Nature 4874,1299)。24年后，相應(yīng)的酶活性在動(dòng)物腦垂體中發(fā)現(xiàn)(Busby，W. H. J. et al. 1987 J BiolChem 262,8532-8536;Fischer, ff. H. and Spiess,J.1987Proc Natl Acad Sci U S A84，3628-3632)。對(duì)于哺乳動(dòng)物QC，由QC將Gln轉(zhuǎn)化為pGlu可以在TRH和GnRH前體中示出(Busby，W. H. J. et al. 1987 J Biol Chem 262, 8532-8536; Fischer, ff. H. andSpiess, J. 1987 Proc Natl Acad Sci USA 84,3628-3632)。另外，QC 的初始定位實(shí)驗(yàn)揭示與其在牛腦垂體中的推測的催化產(chǎn)物的共定位，進(jìn)一步改善在肽激素合成中的推測功能(Bockers, T. M. et al. 1995 J Neuroendocrinol 7,445-453)。相反。植物 QC 的生理學(xué)功能不太清楚。在來自番木瓜的酶的情況中，推測了在抗病原微生物的植物防御中的作用(ElMoussaoui, A. et al. 2001 Cell Mol Life Sci 58,556-570)。來自其它植物的推測的 QC最近通過序列比較而鑒別(Dahl, S. ff. et al. 2000 Protein Expr Purif 20,27-36)。但是這些酶的生理學(xué)功能尚不明確。植物和動(dòng)物中已知的QC顯示顯示出對(duì)底物的N-末端位置的L-谷氨酰胺的嚴(yán)格特異性并且發(fā)現(xiàn)它們的動(dòng)力學(xué)行為遵守Michaelis-Menten方程(Pohl，T. et al. 1991Proc Natl Acad Sci USA 88,10059-10063;Consalvo, A. P. et al.1988 Anal Biochem175，131-138;Gololobov, Μ· Y. et al. 1996 Biol Chem Hoppe Seyler 377,395-398)。但是，將來自番木瓜的QC和來自哺乳動(dòng)物的高度保守的QC的一級(jí)結(jié)構(gòu)相比并不揭示任何序列同源性(Dahl, S. ff. et al. 2000 Protein Expr Purif 20,27-36)。盡管植物 QC 似乎屬于新的酶家族(Dahl, S. W. et al. 2000 Protein Expr Purif 20，27-36)，但是發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物QC與細(xì)菌氨基肽酶具有顯著序列同源性(Bateman, R. C. et al. 2001 Biochemistry40，11246-11250)，導(dǎo)致來自植物和動(dòng)物的QC具有不同的進(jìn)化起源的結(jié)論。最近，已示出重組人類QC以及來自腦提取物的QC活性催化N-末端谷氨酰胺?；肮劝彼岘h(huán)化。最驚人的發(fā)現(xiàn)是環(huán)化酶催化的Glul-轉(zhuǎn)化在大約pH6. O是有利的，而Glnl-轉(zhuǎn)化為pGlu衍生物發(fā)生在大約8. O的pH最佳值。因?yàn)閜Glu-Αβ -相關(guān)肽的形成可以通過重組人類QC和來自豬腦垂體提取物的QC活性的抑制而抑制，酶QC是用于治療阿爾茨海默病的藥物開發(fā)中的靶。QC的抑制劑也可以用作QC同工酶的抑制劑，它們?cè)赪02004/098625、WO2004/098591、W0 2005/039548和WO 2005/075436中描述，這些文獻(xiàn)全文援引加入本文，特別是關(guān)于抑制劑的結(jié)構(gòu)、它們的用途及它們的生產(chǎn)。用于檢測和定量N-末端焦谷氨酸修飾的趨化因子的MCP-lNlpE特異性抗體在國際專利申請(qǐng)PCT/EP2009/060757中描述。本發(fā)明人現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)測量樣品中與MCP-I總濃度相關(guān)的N-末端焦谷氨酸修飾的MCP-I的比例提供了一種有效方法，用于診斷或監(jiān)測炎性疾病或者炎性相關(guān)疾病。發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了診斷或監(jiān)測炎性疾病或炎性相關(guān)疾病的方法，其包括確定生物學(xué)樣品中N-末端焦谷氨酸修飾的MCP-I相對(duì)于MCP-I總濃度的比例。根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供了確定谷氨酰胺?；h(huán)化酶(QC)抑制劑在生物學(xué)樣品內(nèi)以及作為應(yīng)用QC抑制劑的治療中谷氨酰胺?；h(huán)化酶(QC)抑制的替代標(biāo)記(surrogate marker)的效力的方法。根據(jù)本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供了確定生物學(xué)樣品中N-末端焦谷氨酸修飾的MCP-I相對(duì)于MCP-I總濃度的比例的方法，其包括下述步驟 (a)確定生物學(xué)樣品中N-末端焦谷氨酸修飾的MCP-I的第一濃度(Ca)；(b)確定所述生物學(xué)樣品中總MCP-I的第二濃度(Cd);和(c)確定ca/cd的比率,其中第一濃度(Ca)值除以第二濃度(Cd)值。附圖簡述圖I :來自不同物種的成熟MCP-1 (CCL2)蛋白的序列對(duì)比。序列對(duì)比是用http://www. ch. embnet. org/software/Clustalff. html 提供的 CLUSTAL W(I. 83)多序列對(duì)比算法進(jìn)行。這些序列是人類人類MCP-1 SEQ ID NO: I，chimp :黑猩猩MCP-1 SEQ IDNO: 2, oran :蘇門答臘猩猩(Sumatran orang-utan) MCP-1 SEQ ID NO: 3, macac Macacafascicularis (食蟹猴)MCP-1 SEQ ID N0:4，犬Canis familiar is MCP-1 SEQ ID N0:5,豬Sus scrofa MCP-1，SEQ ID N0:6,牛Bos taurus MCP-1，SEQ ID N0:7,馬EquuscabalIus MCP-1, SEQ ID N0:8,小鼠Mus musculus MCP-1, SEQ ID N0:9,大鼠Rattusnorvegicus MCP-1, SEQ ID NO:10。圖2 :四種人類MCP的對(duì)比。序列對(duì)比用http://www. ch. embnet.org/software/Clustalff. html 提供的 CLUSTAL W(1.83)多序列對(duì)比算法進(jìn)行。這些序列是MCP-I:人類 MCP-1 (CCL2, SCYA2, MCAF, SMC-CF, GDCF-2, HCll SEQ ID NO: I, MCP-2:人類 MCP-2 (CCL8, SCYA8, HC14)，SEQ ID NO: 11 ；MCP-3:人類 MCP-3 (CCL7, SCYA7, NC28, FIC, MARC)，SEQ ID NO:12 ；MCP-4:人類MCP-4 (CCL13, SCYA13, NCC-1, CKblO), SEQ ID NO: 13。黑體 N-末端殘基表示信號(hào)序列，其在成熟趨化因子中被去除。箭頭標(biāo)記由谷氨酰胺?；h(huán)化酶催化形成焦谷氨酰衍生物的新生N-末端谷氨酰胺殘基。圖3 :顯示攜帶N-末端谷氨酰胺酰殘基的MCP-I (1-76)與重組人類DP4保溫24小時(shí)。DP4裂解產(chǎn)物在O分鐘、15分鐘、30分鐘、I小時(shí)、4小時(shí)和24小時(shí)后用Maldi-TOF質(zhì)譜分析。圖4 :顯示攜帶N-末端焦谷氨酰(5-氧代-L-脯氨酰)殘基的MCP-I (1-76)與重組人類DP4保溫24小時(shí)。為了將N-末端谷氨酰胺環(huán)化成焦谷氨酸，MCP-I在測定開始之前與重組人類QC保溫3小時(shí)。裂解在O分鐘、15分鐘、30分鐘、I小時(shí)、4小時(shí)和24小時(shí)后用Maldi-TOF質(zhì)譜分析。圖5 :示出攜帶N-末端谷氨酰胺酰殘基的人類MCP-I (1-76)被重組人類氨基肽酶P裂解24小時(shí)。APP裂解產(chǎn)物在O分鐘、15分鐘、30分鐘、I小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)和24小時(shí)后用Maldi-TOF質(zhì)譜分析。
圖6 :示出攜帶N-末端焦谷氨酰(5-氧代-L-脯氨酰)殘基的人類MCP-1 (1-76)被重組人類氨基肽酶P裂解24小時(shí)。N-末端焦谷氨酸形成通過在測定前將MCP-I與重組人類QC保溫3小時(shí)實(shí)現(xiàn)。APP裂解在O分鐘、15分鐘、30分鐘、I小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)和24小時(shí)后用Maldi-TOF質(zhì)譜分析。圖7 :示出攜帶N-末端谷氨酰胺酰殘基(A)或者焦谷氨酰(5-氧代-L-脯氨酰)殘基(B)的人類MCP-I (1-76)在人類血清中分別降解7和24小時(shí)。為了將N-末端谷氨酰胺殘基環(huán)化成焦谷氨酸，MCP-I在測定開始之前與重組人類QC保溫3小時(shí)。另外，Gln1-MCP-I在人類血清中在9. 6μ M DP4抑制劑異亮氨酰-Thiazolidide (Ρ32/98)存在下保溫24小時(shí)(C)。對(duì)于Gln1-MCP-I,裂解產(chǎn)物在O分鐘、10分鐘、30分鐘、I小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)、5小時(shí)和7小時(shí)后分析，對(duì)于PGIu1-MCP-I，裂解產(chǎn)物在O分鐘、30分鐘、I小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)、5小時(shí)、7小時(shí)和24小時(shí)后分析，對(duì)于Gln1-MCP-I與異亮氨酰-Thiazolidide組合，裂解產(chǎn)物在O分鐘、I小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)、5小時(shí)、7小時(shí)和24小時(shí)后分析，分析使用Maldi-TOF質(zhì)譜進(jìn)行。圖8 :示出攜帶N-末端谷氨酰胺酰(A)或焦谷氨酰(5-氧代-L-脯氨酰)殘基(B)的人類MCP-2(l-76)由重組人類DP4降解24小時(shí)。為了將N-末端谷氨酰胺環(huán)化成焦谷氨酸，MCP-2在測定開始之前與重組人類QC保溫3小時(shí)。DP4裂解產(chǎn)物在O分鐘、15分鐘、30分鐘、I小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)和24小時(shí)后用Maldi-TOF質(zhì)譜分析。圖9 :示出攜帶N-末端谷氨酰胺酰(A)或焦谷氨酰(5-氧代-L-脯氨酰)殘基(B)的人類MCP-3(l-76)由重組人類DP4降解24小時(shí)。為了將N-末端谷氨酰胺環(huán)化成焦谷氨酸，MCP-3在測定開始之前與重組人類QC保溫3小時(shí)。DP4裂解產(chǎn)物在O分鐘、15分鐘、30分鐘、I小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)和24小時(shí)后用Maldi-TOF質(zhì)譜分析。

圖10 :示出攜帶N-末端谷氨酰胺酰(A)或焦谷氨酰(5-氧代-L-脯氨酰)殘基(B)的人類MCP-4(l-75)由重組人類DP4裂解4小時(shí)。為了將N-末端谷氨酰胺環(huán)化成焦谷氨 酸，MCP-4在測定開始之前與重組人類QC保溫3小時(shí)。DP4裂解產(chǎn)物在O分鐘、15分鐘、30分鐘、I小時(shí)、2小時(shí)和4小時(shí)后用Maldi-TOF質(zhì)譜分析。圖11 :示出起自N-末端谷氨酰胺的人類N-末端MCP-1 (Glnl-MCP-I)相比于具有N-末端焦谷氨酸的人類MCP-1 (pGlul-MCP-1)對(duì)人類THP-I單核細(xì)胞的趨化能力(A)，起自N-末端谷氨酰胺的人類N-末端MCP-2(Glnl-MCP-2)相比于具有N-末端焦谷氨酸的人類MCP-2 (pGlul-MCP-2)對(duì)人類THP-I單核細(xì)胞的趨化能力(B)，起自N-末端谷氨酰胺的人類N-末端MCP-3(Glnl-MCP-3)相比于具有N-末端焦谷氨酸的人類MCP-3 (pGlul-MCP-3)對(duì)人類THP-I單核細(xì)胞的趨化能力(C)，以及起自N-末端谷氨酰胺的人類N-末端MCP-4(Glnl-MCP-4)相比于具有N-末端焦谷氨酸的人類MCP-4(pGlul-MCP-4)對(duì)人類THP-I單核細(xì)胞的趨化能力(D)。圖12 :顯示人類MCP-I對(duì)人類THP-I單核細(xì)胞的趨化能力的分析，其是與人類重組DP4在存在(Gld-MCP-l+QC+DP^和不存在(Glr^-MCP-l+DPAQC介導(dǎo)的pGlu形成的情況下保溫。另外，示出了 QC抑制劑-1-(3-(1Η-咪唑-I-基)丙基)-3-(3，4_ 二甲氧基苯基)硫脲鹽酸鹽(QCI) (10 μ Μ)對(duì)N-末端pGlu殘基形成的影響，及隨后的DP4裂解(Gln1-MCP-l+QC+QCI+DP4)。
圖13 :顯示起自N-末端谷氨酰胺的全長人類MCP-1 (A)、MCP-3⑶、MCP_2 (C)和MCP-4(D)相比于它們各自DP4裂解產(chǎn)物對(duì)人類THP-I單核細(xì)胞的趨化能力。圖14 :用于基于在450nm/540nm測量的吸收值確定A :總hMCP_l和B hMCP-1 NlpE濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)于兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線,使用在大腸桿菌中產(chǎn)生的重組hMCP-1 NlpE0標(biāo)準(zhǔn)曲線是通過 4-Parameter-Logistic-Fit :y=(A2+(Al_A2)/ (1+(χ/χ0) 'p)從測量的吸收數(shù)據(jù)計(jì)算的。圖15 :在總 hMCP-1 夾心 ELISA 中 hMCP-lNlpE 和 hMCP-1 的檢測比較。圖16 :在用OSM和ILl β刺激后由NHDF對(duì)總hMCP_l和hMCP-ΙΝΙρΕ的時(shí)間依賴性表達(dá)。圖17 :在用 0SM+IL1 β 刺激及施加 QCI 后由 NHDF 對(duì) A :總 hMCP-Ι 和 B hMCP-lNlpE 的時(shí)間依賴性表達(dá)。C :hMCP-lNlpE/hMCP-l的比率。圖18 :A :在用TNFa+ILlii刺激及施加不同QCI濃度后由A549細(xì)胞表達(dá)的總hMCP-Ι 和 hMCP-lNlpE。B hMCP-lNlpE/hMCP-l 的比率。圖19 :用于確定小鼠MCP-I的標(biāo)準(zhǔn)曲線；基于在450nm/540nm測量的吸收值的A 總mMCPl濃度和B mMCP-lNlpE濃度。對(duì)于兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，使用在大腸桿菌中產(chǎn)生的重組小鼠 MCP-lNlpE。標(biāo)準(zhǔn)曲線是通過 4-Parameter-Logistic-Fit: y= (A2+ (A1-A2) / (1+ (x/xQ) 'p)從測量的吸收數(shù)據(jù)計(jì)算的。圖 20 :在總 mMCP-1 夾心 ELISA 中 mMCP-lNlpE 和 mMCP-1 的檢測比較。圖21 A :在用10ng/ml LPS刺激及施加不同QCI濃度后由RAW 264. 7細(xì)胞表達(dá)的總 mMCP-1 和 mMCP-lNlpE。B mMCP-lNlpE/mMCP-l 的比率。圖22 :在用10ng/ml LPS刺激及施加不同QCI后在RAW 264.7細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)上清中如下的Western印跡信號(hào)A mMCP-lNlpE和B 總mMCP-1。C 由ELISA確定的mMCP-lNlpE 濃度。圖23 A :在用硫代乙醇酸鹽刺激和施加不同QCI濃度后在小鼠腹腔灌洗液中總mMCP-1和mMCP-lNlpE的量。B =FACS分析在用抗7/4和Ly6G抗體在腹腔灌洗液中進(jìn)行雙重單核細(xì)胞染色后的熒光事件。圖24 :用于確定小鼠MCP-lNlpE的標(biāo)準(zhǔn)曲線；A :由MCP-lNlpE抗體克隆348/2C9對(duì)mMCP-lNlpE的檢測，B :由生物素化MCP-lNlpE抗體克隆348/2C9對(duì)mMCP-lNlpE的檢測。對(duì)于兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，使用在大腸桿菌中產(chǎn)生的重組小鼠MCP-lNlpE ο 標(biāo)準(zhǔn)曲線是通過 4-Parameter-Logistic-Fit: y= (A2+ (A1-A2) / (1+ (χ/X0) ~ρ)從測量的吸收數(shù)據(jù)計(jì)算的。圖25 :等溫滴定量熱法測定針對(duì)抗原h(huán)MCP-1 (1-38)的抗MCP-lNlpE抗體(A MCP-1 NlpE 抗體 348/2C9 及 B :生物素化 MCP-lNlpE 抗體 348/2C9)。圖26 :經(jīng)ELISA測量來自10個(gè)健康志愿者的CSF和血清樣品中人類MCP-1和人類 MCP-lNlpE。序列表簡述表I :序列表
權(quán)利要求
1.診斷或監(jiān)測炎性疾病或炎性相關(guān)疾病或其對(duì)治療的應(yīng)答的方法，包括確定生物學(xué)樣品中N-末端焦谷氨酸修飾的MCP-I相對(duì)于MCP-I總濃度的比例。
2.權(quán)利要求I的方法，其中所述確定包括如下步驟 (a)確定生物學(xué)樣品中N-末端焦谷氨酸修飾的MCP-I的第一濃度(Ca)； (b)確定所述生物學(xué)樣品中總MCP-I的第二濃度(Cd);及 (c)確定ca/cd的比率，其中第一濃度(Ca)的值除以第二濃度(Cd)的值。
3.權(quán)利要求2的方法，其中ca/cd比率是50%,70%或85%。
4.權(quán)利要求2的方法，其中步驟(a)包括 i)將生物學(xué)樣品與特異于MCP-I的捕獲抗體接觸， )施加特異于N-末端焦谷氨酸修飾的MCP-I的檢測抗體， iii)檢測所得的免疫復(fù)合物，及 iv)定量捕獲的N-末端焦谷氨酸修飾的MCP-I復(fù)合物。
5.權(quán)利要求4的方法，其中特異于N-末端焦谷氨酸修飾的MCP-I的檢測抗體包括由選自下組的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的單克隆抗體 348/1D4 (保藏號(hào) DSM ACC 2905); 348/2C9 (保藏號(hào) DSM ACC 2906); 332/4B8 (保藏號(hào) DSM ACC 2907);和 332/4F8 (保藏號(hào) DSM ACC 2908)。
6.權(quán)利要求5的方法，其中特異于N-末端焦谷氨酸修飾的MCP-I的檢測抗體包括由選自348/2C9 (保藏號(hào)DSM ACC 2906)的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的單克隆抗體。
7.權(quán)利要求2的方法，其中步驟(b)包括 i)將生物學(xué)樣品與特異于MCP-I的捕獲抗體接觸， ii)施加特異于MCP-I的檢測抗體， iii)檢測所得的免疫復(fù)合物，及 iv)定量捕獲的MCP-I復(fù)合物。
8.權(quán)利要求7的方法，其中特異于MCP-I的捕獲抗體包括 多克隆抗血清山羊抗 hMCPl-AF(R&D Systems, Minneapolis, USA)兔多克隆抗 MCP-I 抗體 abl8072 (Abeam, Cambridge, UK);兔多克隆抗 MCP-1 抗體 ab9669 (Abeam, Cambridge, UK);兔多克隆抗 MCP-1 抗體 abl8072 (Abeam, Cambridge, UK);山羊 MCP-1 抗體(C-17) : sc-1304 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA);多克隆抗血清兔抗 mJE (Peprotech, Hamburg, Germany);兔多克隆抗 mMCP-1 抗體 ab9899 (Abeam, Cambridge, UK); 兔多克隆抗 MCP-1 抗體 ab7202 (Abeam, Cambridge, UK);和 大鼠單克隆 MCP-1 抗體(JJ5):sc-74215(Santa Cruz Biotechnology, SantaCruz, USA)。
9.權(quán)利要求8的方法，其中特異于MCP-1的捕獲抗體包括多克隆抗血清山羊抗hMCPl-AFο
10.權(quán)利要求7的方法，其中特異于MCP-I的檢測抗體包括小鼠抗 hMCP-1 (Peprotech, Hamburg, Germany); 小鼠單克隆抗 MCP-1 抗體 abl7715 (Abeam, Cambridge, UK);小鼠單克隆 MCP-1 抗體 sc-32819 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA);抗小鼠 MCP-1 (R&D Systems, Minneapolis, MN USA);倉鼠單克隆 MCP-1 抗體 ab21397 (Abeam, Cambridge, UK); 大鼠單克隆 MCP-1 抗體 ab8101 (Abeam, Cambridge, UK);和 大鼠單克隆 MCP-1 抗體(JJ5):sc-74215(Santa Cruz Biotechnology, SantaCruz, USA)。
11.權(quán)利要求4-10任一項(xiàng)的方法，其中復(fù)合物的檢測通過使用與每個(gè)檢測抗體特異性反應(yīng)的二抗進(jìn)行。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述二抗是抗小鼠抗體或抗兔抗體。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述二抗是抗小鼠抗體。
14.權(quán)利要求11-13任一項(xiàng)的方法，其中所述二抗是被標(biāo)記的。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述二抗是用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的。
16.權(quán)利要求4-15任一項(xiàng)的方法，其中定量檢測的免疫復(fù)合物。
17.權(quán)利要求4-16任一項(xiàng)的方法，其中捕獲的復(fù)合物用選自下組的定量手段定量ELISA，如間接ELISA、夾心ELISA、競爭性ELISA、反向ELISA、酶聯(lián)免疫吸附斑點(diǎn)測定；流式細(xì)胞術(shù)；多重測定系統(tǒng)；免疫組織化學(xué)；免疫沉淀；及Western印跡分析。
18.權(quán)利要求17的方法，其中用夾心ELISA作為定量手段定量捕獲的復(fù)合物。
19.權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)的用途或方法，其中生物學(xué)樣品選自血液、血清、尿、腦脊液(CSF)、血漿、淋巴、唾液、汗液、胸膜液、滑液、眼淚、膽汁和胰腺分泌物。
20.權(quán)利要求19的方法，其中生物學(xué)樣品是血清。
21.確定谷氨酰胺?；h(huán)化酶(QC)抑制劑在生物學(xué)樣品內(nèi)的效力以及作為應(yīng)用QC抑制劑的治療中谷氨酰胺酰基環(huán)化酶(QC)抑制的替代標(biāo)記的效力的方法。
22.確定生物學(xué)樣品中N-末端焦谷氨酸修飾的MCP-I相對(duì)于MCP-I總濃度的比例的方法，包括如下步驟 (a)確定生物學(xué)樣品中N-末端焦谷氨酸修飾的MCP-I的第一濃度(Ca)； (b)確定所述生物學(xué)樣品中總MCP-I的第二濃度(Cd);及 (c)確定ca/cd的比率，其中第一濃度(Ca)的值除以第二濃度(Cd)的值。
23.篩選谷氨酰胺?；h(huán)化酶(QC)抑制劑的方法，包括如下步驟 (a)保溫包含MCP-I和谷氨酰胺酰基環(huán)化酶(QC)的對(duì)照樣品以及確定N-末端焦谷氨酸修飾的MCP-I相對(duì)于MCP-I總濃度的比例； (b)將具有包含MCP-I和谷氨酰胺?；h(huán)化酶(QC)的混合物的對(duì)照樣品與谷氨酰胺?；h(huán)化酶(QC)抑制劑一起保溫及確定N-末端焦谷氨酸修飾的MCP-I相對(duì)于MCP-I總濃度的比例； 從而步驟(b)中N-末端焦谷氨酸修飾的MCP-I:總MCP-I的比率相對(duì)于步驟(a)中的降低指示谷氨酰胺?；h(huán)化酶抑制。
24.測量谷氨酰胺?；h(huán)化酶(QC)抑制劑的效力的方法，包括將谷氨酰胺?；h(huán)化酶(QC)抑制劑與包含MCP-I和谷氨酰胺酰基環(huán)化酶(QC)的混合物保溫，及確定N-末端焦谷氨酸修飾的MCP-I相對(duì)于MCP-I總濃度的比例。
25.用于診斷炎性疾病或炎性相關(guān)疾病的試劑盒，其包括特異于N-末端焦谷氨酸修飾的MCP-I的捕獲抗體，特異于MCP-I的捕獲抗體，以及根據(jù)權(quán)利要求1-20任一項(xiàng)的方法使用所述試劑盒的說明。
26.—種在患有、懷疑患有或有傾向患有炎性疾病或炎性相關(guān)疾病的對(duì)象中監(jiān)測治療的效力的方法，包括根據(jù)權(quán)利要求1-20任一項(xiàng)所述確定在來自測試對(duì)象的生物學(xué)樣品中N-末端焦谷氨酸修飾的MCP-I相對(duì)于MCP-I總濃度的比例。
27.權(quán)利要求1-20或26任一項(xiàng)所述的診斷或監(jiān)測方法，其包括確定在兩或多種場合從測試對(duì)象取出的生物學(xué)樣品中N-末端焦谷氨酸修飾的MCP-I相對(duì)于MCP-I總濃度的比例。
28.權(quán)利要求27所述的診斷或監(jiān)測方法，其包括比較在兩或多種場合取出的生物學(xué)樣品中N-末端焦谷氨酸修飾的MCP-I相對(duì)于MCP-I總濃度的比例。
29.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的用途、方法或試劑盒，其中炎性疾病或炎性相關(guān)疾病選自神經(jīng)變性疾病、慢性和急性炎癥、纖維化、癌癥、代謝疾病、與高胰島素血癥和肥胖相關(guān)的其它炎性疾病或病理。
30.權(quán)利要求29的用途、方法或試劑盒，用于檢測和診斷動(dòng)脈粥樣硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘、遲發(fā)型超敏反應(yīng)、胰腺炎、阿爾茨海默病、肺纖維化、腎纖維化、妊娠中毒、移植物排斥、神經(jīng)性疼痛、糖尿病腎病、結(jié)腸炎、中風(fēng)、AIDS和腫瘤。
31.權(quán)利要求29或30的用途、方法或試劑盒，用于檢測和診斷阿爾茨海默病、動(dòng)脈粥樣硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、再狹窄和胰腺炎。
32.權(quán)利要求29-31任一項(xiàng)的用途、方法或試劑盒，用于檢測和診斷阿爾茨海默病或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
全文摘要
本發(fā)明涉及用生物學(xué)樣品中的N-末端焦谷氨酸修飾的MCP-1(MCP-1N1pE)∶MCP-1總濃度的比率作為生物標(biāo)記監(jiān)測炎性疾病或炎性相關(guān)疾病的治療的方法，進(jìn)一步涉及確定生物學(xué)樣品中N-末端焦谷氨酸修飾的MCP-1相對(duì)于MCP-1總濃度的比例的新方法。本發(fā)明還提供了診斷試劑盒和篩選谷氨酰胺?；h(huán)化酶(QC)抑制劑或測量谷氨酰胺?；h(huán)化酶(QC)抑制劑效力的方法。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102947705SQ201180009956
公開日2013年2月27日 申請(qǐng)日期2011年2月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月18日
發(fā)明者H·辛尼斯, M·克萊因施密特, K·甘斯, J-U·拉費(fèi)爾德, H-U·德穆特, N·陶特 申請(qǐng)人:前體生物藥物股份公司