專利名稱：一種氣液接觸式卷煙全煙氣暴露下的細胞毒性檢測方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種氣液接觸式卷煙全煙氣暴露下的細胞毒性檢測方法，屬于卷煙煙氣安全性評價技術(shù)領域。
背景技術(shù)：
用于煙草毒理學評價的全煙氣暴露方法研究，由于其在模擬人體內(nèi)環(huán)境、能夠?qū)崿F(xiàn)多個相關檢測終點、在線即時檢測原始全煙氣等方面所具有的不可替代的優(yōu)勢，引起了世界各煙草公司和分析檢測實驗室的廣泛關注，一些煙草公司已經(jīng)對該暴露方法進行了深入系統(tǒng)的研究。目前，有關卷煙全煙氣體外暴露下方法已有專利公開。公開專利1(申請?zhí)?200810230659. 0)是一種卷煙主流煙氣的細胞毒性測試方法，主要的暴露裝置是細胞培養(yǎng)瓶，通過將經(jīng)潔凈空氣稀釋的卷煙主流煙氣導入細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)進行細胞的煙氣暴露，此暴露方式中煙氣和細胞并不完全處于氣液交界面處，會有部分煙氣留在培養(yǎng)液中并繼續(xù)和細胞接觸。公開專利2(申請?zhí)?01110025480. 是一種卷煙全煙氣染毒的細胞毒性測試方法，主要的暴露裝置是插入式細胞培養(yǎng)皿，通過使培養(yǎng)的細胞處于煙氣和培養(yǎng)液的氣-液交界面以達到細胞與卷煙煙氣暴露的目的。這兩個專利涉及的方法均是將貼壁狀態(tài)的細胞處于氣-液交界面上，讓煙氣直接地部分或者完全接觸細胞以達到卷煙全煙氣暴露的目的。授權(quán)專利(專利號201120063251. 6)是一種用于卷煙全煙氣暴露的裝置，由其上設有煙氣出口的卷煙全煙氣暴露瓶及置于全煙氣暴露瓶中的煙氣導入管塞組成，其中煙氣導入管塞由煙氣入口、潔凈空氣入口、煙氣與空氣混合腔、稀釋后煙氣輸送通路構(gòu)成，通過不同流速的潔凈空氣稀釋達到煙氣暴露量的控制。該暴露裝置易與吸煙機連接。與上述第1和第2兩件專利中暴露裝置的氣液交界面處暴露原理不同的是，授權(quán)專利(專利號 ZL201120063251. 6)的暴露裝置是基于氣液接觸原理而設計，使用的是處于懸浮狀態(tài)的細胞。目前，關于卷煙全煙氣暴露的細胞毒性試驗研究已有報道。但經(jīng)文獻檢索，未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明內(nèi)容相同文獻的公開報道。參考文獻[1]Aufderheide M,Mohr U. AmodifiedcULTEX system for the direct exposure ofbacteria to inhalable substances[J]. Exp Toxic Pathol, 2004, 55 :451-454.[2]Aufderheide M, Ritter D, Knebel Jff, et al. Amethod for in vitro analysisof the biological activity of complex mixtures such as sidestream cigarette smoke[J]. Exp Toxic Pathol,2001 ；53 :141-152.[3]盧斌斌，RyaN Μ, Lynne W，等.3種不同焦油卷煙煙氣的細胞毒性比較[J].煙草科技，2007，12 :38-41.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種氣液接觸式卷煙全煙氣暴露下的細胞毒性檢測方法， 為卷煙煙氣安全性評價提供技術(shù)支持。本發(fā)明涉及的中國倉鼠卵巢細胞(Chinese Hamster Ovary Cell，CHO細胞)為實驗室常規(guī)實驗用細胞，從國內(nèi)外的細胞保藏機構(gòu)購買得到。本發(fā)明使用的裝置為“一種用于卷煙全煙氣暴露的裝置ZL201120063251. 6”。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)步驟實現(xiàn)a.按常規(guī)方法傳代培養(yǎng)CHO細胞，并制備CHO細胞懸浮液，細胞濃度是 (5-10) X IO4個/mL，并將之分裝至ZL201120063251. 6的全煙氣暴露瓶內(nèi)，IOmL/瓶；b.將全煙氣暴露瓶置于37°C恒溫水浴鍋內(nèi)，并和潔凈空氣瓶及直線型吸煙機連接；c.在吸煙機控制面板上按照國標GB/T 16450設定卷煙抽吸參數(shù)；d.按c步驟設定的卷煙參數(shù)進行卷煙的抽吸，再經(jīng)流速為O-lOOOmL/min的潔凈空氣稀釋的卷煙全煙氣的暴露，暴露時間均是5min;暴露完畢，取下全煙氣暴露瓶，進行中性紅細胞毒性試驗或MTT細胞毒性試驗；e.細胞毒性檢測(1)中性紅細胞毒性試驗將暴露完畢的細胞懸浮液轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，lOOOrpm/min轉(zhuǎn)速下離心5-lOmin ；移除上清液，加入新鮮的常規(guī)生長培養(yǎng)基10mL，制成細胞懸浮液，并將之接種至96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，置于(X)2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)Mh，后按常規(guī)方法進行中性紅細胞毒性試驗；(2) MTT細胞毒性試驗按步驟e. (1)的操作將CHO細胞懸浮液種植96孔細胞培養(yǎng)板，置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)Mh，后按常規(guī)方法進行MTT細胞毒性試驗；f.結(jié)果分析該暴露方式下，煙氣暴露量和細胞毒性的劑量反應關系按以下步驟分析(1)全煙氣的稀釋倍數(shù)=(煙氣流速+潔凈空氣流速)/煙氣流速；(2)在直線型吸煙機上分析單支受試卷煙的煙氣總粒相物TPM量和抽吸口數(shù)，則每口的TPM量=單支卷煙的TPM量/單支卷煙的抽吸口數(shù)；暴露時間5min時的抽吸口數(shù)是 6 口，則IOmL的細胞懸浮液暴露5min時的煙氣暴露量=單支卷煙的TPM量/單支卷煙的抽吸口數(shù) X6 口 /IOmL ；(3)根據(jù)上述公式分析煙氣暴露量和細胞毒性間的劑量反應關系，細胞毒性的大小用細胞抑制率CI表示
權(quán)利要求
1. 一種氣液接觸式卷煙全煙氣暴露下的細胞毒性檢測方法，其特征在于該方法的步驟如下a.按常規(guī)方法傳代培養(yǎng)CHO細胞，并制備CHO細胞懸浮液，細胞濃度是(5-10)X IO4個 /mL，并將之分裝至專利號為ZL201120063251. 6的全煙氣暴露瓶內(nèi)，IOmL/瓶；b.將全煙氣暴露瓶置于37°C恒溫水浴鍋內(nèi)，并和潔凈空氣瓶及直線型吸煙機連接；c.在吸煙機控制面板上按照國標GB/T16450設定卷煙抽吸參數(shù)；d.按c步驟設定的卷煙參數(shù)進行卷煙的抽吸，再經(jīng)流速為O-lOOOmL/min的潔凈空氣稀釋的卷煙全煙氣的暴露，暴露時間均是5min;暴露完畢，取下全煙氣暴露瓶，進行中性紅細胞毒性試驗或MTT細胞毒性試驗；e.細胞毒性檢測(1)中性紅細胞毒性試驗將暴露完畢的細胞懸浮液轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，lOOOrpm/min轉(zhuǎn)速下離心5-lOmin ；移除上清液，加入新鮮的常規(guī)生長培養(yǎng)基10mL，制成細胞懸浮液，并將之接種至96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，置于(X)2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)Mh，后按常規(guī)方法進行中性紅細胞毒性試驗；(2)MTT細胞毒性試驗按步驟e. (1)的操作將CHO細胞懸浮液種植96孔細胞培養(yǎng)板，置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 24h,后按常規(guī)方法進行MTT細胞毒性試驗；f.結(jié)果分析該暴露方式下，煙氣暴露量和細胞毒性的劑量反應關系按以下步驟分析(1)全煙氣的稀釋倍數(shù)=(煙氣流速+潔凈空氣流速)/煙氣流速；(2)在直線型吸煙機上分析單支受試卷煙的煙氣總粒相物TPM量和抽吸口數(shù)，則每口的TPM量=單支卷煙的TPM量/單支卷煙的抽吸口數(shù)；暴露時間5min時的抽吸口數(shù)是6 口， 則IOmL的細胞懸浮液暴露5min時的煙氣暴露量=單支卷煙的TPM量/單支卷煙的抽吸口數(shù) X6 □ /IOmL ；(3)根據(jù)上述公式分析煙氣暴露量和細胞毒性間的劑量反應關系，細胞毒性的大小用細胞抑制率CI表示。
全文摘要
一種氣液接觸式卷煙全煙氣暴露下的細胞毒性檢測方法，屬于卷煙煙氣安全性評價技術(shù)領域。本發(fā)明檢測方法首先設定卷煙抽吸參數(shù)進行卷煙的抽吸，煙氣經(jīng)流速為0-1000mL/min的潔凈空氣稀釋，稀釋的卷煙全煙氣進入專利號為ZL201120063251.6的全煙氣暴露瓶內(nèi)，和瓶中的懸浮細胞進行接觸暴露，暴露時間均是5min；暴露后按常規(guī)方法進行中性紅細胞毒性試驗或MTT細胞毒性試驗；煙氣暴露量和細胞毒性的劑量反應關系按以下式分析全煙氣的稀釋倍數(shù)＝(煙氣流速+潔凈空氣流速)/煙氣流速；10mL的細胞懸浮液暴露5min時的煙氣暴露量＝單支卷煙的TPM量/單支卷煙的抽吸口數(shù)×6口/10mL；細胞毒性的大小用細胞抑制率CI表示。本發(fā)明具有簡單易行，成本低，為卷煙煙氣安全性評價提供技術(shù)支持的優(yōu)點。
文檔編號G01N33/00GK102495183SQ20111042350
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月16日
發(fā)明者周嵐, 夭建華, 李雪梅, 管瑩, 米其利, 繆明明 申請人:云南煙草科學研究院