專利名稱：一種生物免疫傳感器及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一項分析檢測技術(shù)，涉及到納米材料的合成以及檢測應(yīng)用，特別是涉及一種用于檢測食品致病微生物的生物免疫傳感器及其檢測方法。
背景技術(shù)：
食品安全問題一直是一個全球性的問題，是各國政府和人民群眾最為關(guān)心的問題，它關(guān)系到消費者健康和安全。雖然各國政府都采取了相應(yīng)的措施來控制和檢測食源性致病菌，并以立法的形式來確保食品的安全，但由于天然的食物源生產(chǎn)的全球化、新的食品生產(chǎn)工藝的應(yīng)用、人們飲食習(xí)慣的改變等各種因素在一定程度上降低了食品的安全性。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報道，病原微生物引起的食源性疾病是影響食品安全的最主要的因素之一，這主要是指食品原料或食品被有害的細(xì)菌、真菌、病毒、和寄生蟲等污染。常見的食源性致病菌有以下幾種1.金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌屬于葡萄球菌屬，無芽胞、鞭毛，大多數(shù)無莢膜，革蘭氏染色陽性。 在自然界中無處不在，空氣、水、灰塵及人和動物的排泄物中都可找到。因而，食品受其污染的機(jī)會很多。金黃色葡萄球菌是人類化膿感染中最常見的病原菌，可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染。2.單核細(xì)胞增生李斯特氏菌單核細(xì)胞增生李斯特氏菌屬于李斯特氏菌屬，是一種人畜共患病的病原菌。感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細(xì)胞增多。它廣泛存在于自然界中，該菌在4°C的環(huán)境中仍然可以生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一。3.沙門氏菌沙門氏菌屬于腸桿菌科，嗜溫性細(xì)菌，在常溫、中性PH、低鹽和高水活度條件下生長最佳。最易感人群是年幼兒童、虛弱者、年長老人、免疫缺陷者等。4.副溶血性弧菌副溶血性弧菌屬于弧菌屬中致病菌之一，是近20年才被發(fā)現(xiàn)和重視的，其主要污染的食品有魚類和貝類，主要能引起胃腸炎，常出現(xiàn)惡心、腹瀉、腹部痙攣、嘔吐、頭痛等癥狀。細(xì)菌性食物中毒每年的罹患人次數(shù)均位于食源性疾病的前列，對人群健康造成嚴(yán)重危害，因此，提高細(xì)菌性食物中毒的原因查明率，不僅有利于對細(xì)菌性食物中毒具體案例的調(diào)查處理和對重癥患者的搶救治療，而且對分析研究該地區(qū)細(xì)菌性食物中毒的發(fā)病率， 針對性地采取有效措施，最大限度地預(yù)防和控制細(xì)菌性食物中毒的發(fā)生具有極為重要的意義。當(dāng)前對副溶血弧菌的檢測方法有如下幾種技術(shù)1.常規(guī)檢驗技術(shù)目前細(xì)菌性食物中毒的檢驗仍以傳統(tǒng)培養(yǎng)法為主，如霍亂弧菌的檢測就以細(xì)菌培養(yǎng)作為“金標(biāo)準(zhǔn)”。2.免疫血清方法主要是采用單克隆抗體或多克隆抗體，利用抗原抗體特異性反應(yīng)，并結(jié)合生物化學(xué)或物理學(xué)方法而建立的免疫學(xué)檢測方法。主要有瓊脂擴(kuò)散法、免疫熒光標(biāo)記技術(shù)、反相乳膠凝集試驗、ELISA等。其中免疫熒光標(biāo)記技術(shù)是用熒光素標(biāo)記已知抗原(或抗體)，再與特異性的抗體(或抗原)結(jié)合而產(chǎn)生熒光。3.分子生物學(xué)方法包括基因探針、PCR技術(shù)和生物芯片檢測技術(shù)?；蛱结樖抢肈NA堿基互補(bǔ)原理，從基因水平對細(xì)菌、病毒等進(jìn)行檢測和鑒定。 具有很高的特異性，并且達(dá)到了相當(dāng)?shù)拿舾行?。PCR技術(shù)可將極微量的靶DNA特異地擴(kuò)增上百萬倍，從而大大增強(qiáng)了對DNA分子的分析和檢測能力。PCR法因其特異性強(qiáng)、敏感度高，反應(yīng)快速，被應(yīng)用于細(xì)菌的快速診斷。生物芯片檢測技術(shù)的出現(xiàn)，為在分子水平快速鑒別致病菌提供了可能。選擇同一基因片段可同時進(jìn)行多種致病菌的鑒別。經(jīng)調(diào)研國內(nèi)外已有一些納米器件的專利，關(guān)于納米氣體傳感器件的專利主要有 2003年哈爾濱市衛(wèi)生防疫站王世平申報發(fā)明的食品衛(wèi)生微生物檢測試劑盒，該試劑盒為一長方體、由無色無味透明材料制成的塑料盒，由盒體、盒蓋及發(fā)酵瓶、吸管組成，盒體內(nèi)含有四個菌落計數(shù)池、六個乳糖蛋白胨發(fā)酵池和兩個致病菌增菌池，盒蓋是保護(hù)盒內(nèi)的檢測試劑清潔、不受污染、水分不揮發(fā)，與其配套使用的還有三個發(fā)酵瓶和一個吸管，是根據(jù)食品衛(wèi)生國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789-84設(shè)計的集菌落計數(shù)、大腸菌群、致病菌增菌為一體的簡單、實用、 價廉的一種配套實用的檢測用具。2004年，美國專利(United States Patent 6180335)食品污染物檢測設(shè)備與技術(shù)，該納米傳感系統(tǒng)提出了利用抗體與抗原的特異性作用去檢測致病菌。該設(shè)備包含三部分預(yù)濾器，附有目標(biāo)抗體的免疫吸附劑層和免疫吸附劑層相連的電極。該系統(tǒng)最終通過標(biāo)簽的吸附量而得以對污染物的檢測。免疫生物傳感器是利用抗原與抗體之間存在特異性互補(bǔ)結(jié)構(gòu)的特性而制得的新型生物傳感器，由細(xì)胞識別(即傳感感受器表面抗原一抗體的特異性反應(yīng))和信號轉(zhuǎn)換 (感受由特異性結(jié)合導(dǎo)致的光學(xué)的、分光鏡的或電的參數(shù)變化)這兩個部分組成。由于免疫傳感器具有分析靈敏度高、特異性強(qiáng)、使用簡便等優(yōu)點，目前它已廣泛應(yīng)用到臨床診斷、微生物檢測、環(huán)境監(jiān)測及食品分析等諸多領(lǐng)域。綜上所述，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的食品微生物檢測技術(shù)被研制出來，但食源性致病菌的傳統(tǒng)檢測方法除操作繁瑣外，檢驗時間也較長，一般需要5-7天的培養(yǎng)鑒定時間，時間上不能滿足快速檢測的要求。再者，細(xì)菌的鑒定是一項既耗時又復(fù)雜的工作，例如檢測空腸彎曲菌要用15種培養(yǎng)基，20多個大小步驟，操作非常復(fù)雜。而且細(xì)菌的生化特征相對的不穩(wěn)定性也給細(xì)菌的鑒定帶來了很大的困難和不確定性，同時由于某些生化試劑、血清等質(zhì)量不穩(wěn)定特異性不好等因素，經(jīng)常鑒定的結(jié)果不準(zhǔn)確。目前國內(nèi)外常用的細(xì)菌鑒定卡如API，盡管質(zhì)量穩(wěn)定，但鑒定時人為影響因素較多，往往不同的操作者結(jié)果不一，細(xì)菌的自動鑒定儀器重現(xiàn)性較好，但由于只是局限在幾個生化反應(yīng)，相似的菌株間鑒別特別困難，檢出效率低。我國對于食源性疾病的病原檢測、鑒定手段仍停留在培養(yǎng)、血清和生化水平，在相當(dāng)大的程度上限制了對食品的快速檢測鑒定能力，因此有必要建立起食源性致病菌的高通量、快速、準(zhǔn)確的監(jiān)測體系，利用抗原抗體免疫結(jié)合的新型生物傳感器來檢測食源性致病菌，以確保在相對較短的時間內(nèi)正確判定食品的安全性，這是有效地預(yù)防和控制食源性疾病的重要前提和基礎(chǔ)。只有這樣才能在一定程度上提前消除由于食品中的致病菌所造成的危害，提高食源性疾病的檢測和控制能力。

發(fā)明內(nèi)容
針對背景技術(shù)中食源性致病菌檢測方法的不足，本發(fā)明提出一種新型無標(biāo)記的用于致病菌檢測的生物傳感器來實時檢測致病菌的存在；通過此方法制備的生物傳感器可在復(fù)雜環(huán)境中對副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、李斯特氏菌等致病細(xì)菌的快速檢測方法。為了實現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用如下技術(shù)方案生物免疫傳感器，其特征在于所述的生物免疫傳感器將生物學(xué)免疫技術(shù)和納米技術(shù)完美有機(jī)結(jié)合，利用抗體和抗原之間特異性的免疫化學(xué)反應(yīng)原理來實現(xiàn)食品中致病菌電信號檢測的新型傳感技術(shù)。所述的生物免疫傳感器的檢測方法，其特征在于包括以下步驟(1)稱取 5gCNT，加入 55-65mL，2. Omo 1/L 的 HCl，超聲處理 3. 5-4. 5h，用微孔濾膜過濾，然后采用雙蒸水反復(fù)洗滌至中性，95-105 下干燥成粉末待用，采用硝酸回流法對 MWCNT進(jìn)行羧基化處理，具體方法為將3gMWCNTs至于在4M的硝酸中，然后在加熱攪拌的條件下冷凝回流Mh，回流結(jié)束后用孔徑為0. 2微米的微孔濾膜過濾，并用二次水反復(fù)洗滌，至其PH值為中性為止，所得產(chǎn)物于真空干燥箱中在55-65°C下干燥15-20h待用，將羧化的CNT在石英研缽中研磨成粉末，稱取1. Og于100°C干燥50-70min，去除物理吸附水，冷卻后，加入到IOOmL 二氯甲烷中，超聲9-1 Imin,之后，再加入0. 5gAPTMS，于氮氣環(huán)境下攪拌回流反應(yīng)過夜，然后，過濾出固體物質(zhì)后，分別用二硫化碳、四氫吠喃和乙醇洗滌三次，以除去多余的有機(jī)物，再將制得的沉淀物質(zhì)在58-62°C真空環(huán)境下干燥3. 5-4.證，得黑色的巰基修飾的碳納米管(MWCNT-SH)備用；(2)金納米顆粒的制備采用檸檬酸鈉還原氯金酸法實現(xiàn)，在潔凈的三口燒瓶中加入90-110mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 01 %的氯金酸溶液，在冷凝回流條件下加熱至沸騰，快速加入 2. 5-3. 5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %檸檬酸鈉溶液，30min后停止加熱，然后采用一次性離心管對產(chǎn)物進(jìn)行離心14-16min，控制離心管的轉(zhuǎn)速12000rpm，洗滌一次；(3)量取IOOml粒徑為15nm的金溶膠于反應(yīng)器中，并攪拌，隨后稱取MWCNT-SH 0. Ig加入，常溫攪拌反應(yīng)3. 5-4. 5h，之后離心、洗滌，再經(jīng)真空常溫干燥，稱量，備用；(4)稱取0. Olmg Au-MWCNT雜合材料，加入Iml水中，超聲50_70min，取1 μ 1懸濁液滴于20 μ M間距的梳狀電極表面，室溫下干燥，然后置于管式爐中在280-320°C、高純Ar 氣保護(hù)條件下燒結(jié)25-35min，制備好的Au-MWCNT修飾的電極在固定電壓IV的條件下測量其電流信號；(5)把電極置于IXPBS稀釋10倍的免疫血清溶液中吸附抗體，過夜，把電極取出， 用雙蒸水輕輕漂洗3-4次；(6)用的牛血清白蛋白和l^WTween 20作為封閉液，封閉免疫血清修飾的電極2-3h，于室溫下干燥，制備得到免疫電極，然后測電流信號；(7)把制備好的免疫電極置于5ng/ml的抗原蛋白溶液中培育過夜，然后取出用雙蒸水輕輕漂洗3-4次，于室溫下干燥，再次測量抗體抗原反應(yīng)后的電流信號，即實現(xiàn)了抗原的檢測。所述的生物免疫傳感器，其特征在于所述的生物免疫傳感器可以檢測副溶血弧菌、沙門氏菌、李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌食品致病微生物。本發(fā)明的有益效果(1)該發(fā)明提出了準(zhǔn)確、快速的分析方法由于免除了 PCR擴(kuò)增、標(biāo)記物的檢測、或配對DNA的提取等所花費的時間，本方法直接利用抗體和抗原之間特異性的免疫化學(xué)反應(yīng)原理，進(jìn)行電信號的測量，在幾分鐘內(nèi)能準(zhǔn)確檢測出致病菌。(2)本發(fā)明廉價、便攜、易于推廣該傳感器我們初步估算批量生產(chǎn)每個低于1. 5元人民幣，價格低廉，且無需特殊設(shè)備；整個裝置估計不超過10千克，數(shù)字化、智能化，便于非專業(yè)人員的使用，易于推廣，從而為數(shù)以萬計中小型食品生產(chǎn)和加工企業(yè)或部分家庭提供一種新的食品安全的檢測途徑。該項技術(shù)是集納米技術(shù)、生化、食品、儀表、電子、軟件等方面的技術(shù)，是很先進(jìn)的食品致病菌快速檢測方法，具有較高的技術(shù)含量和推廣應(yīng)用價值。該項技術(shù)可廣泛應(yīng)用于乳制品、飲料、焙烤食品、休閑食品、糖果、兒童食品、保食品、酒類、豆制品等食品生產(chǎn)企業(yè)以及各級食品檢測中心、食品流通管理部門、衛(wèi)生執(zhí)法檢測機(jī)構(gòu)，也可推廣到海關(guān)、污水處理及水質(zhì)檢測等。


圖1本發(fā)明中所采用的梳狀電極，圖中1為梳狀電極。圖2本發(fā)明制備的金納米顆粒。圖3表示本發(fā)明中對MWCNTs進(jìn)行功能化處理的具體實施步驟為先氧化，然后巰基化。圖4本發(fā)明中所制備的MWCNTs的金納米顆粒的透射電子顯微鏡圖。圖5是本發(fā)明中所制備的MWCNTs的金納米顆粒的電子能譜圖。圖6是本發(fā)明中所制備的MWCNTs-Au的紫外吸收光譜圖。圖7是本發(fā)明中所制備的MWCNTs-Au在梳狀電極上鋪展后的掃描電鏡圖。圖8所制備的傳感器的微弱信號的信號采集與處理圖。圖9功能化的MWCNTs結(jié)合金納米顆粒后與抗體抗原之間的反應(yīng)示意10本發(fā)明的工藝流程圖。圖11在干態(tài)條件下采用本發(fā)明對副溶血弧菌的檢測的數(shù)據(jù)處理圖。圖12BSA封閉的Au-MWCNT修飾電極對5ng抗原的響應(yīng)
具體實施例方式實施例1 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明再做進(jìn)一步說明1、主要溶液配制20 X PBS緩沖液配制
權(quán)利要求
1.一種生物免疫傳感器，其特征在于所述的生物免疫傳感器將生物學(xué)免疫技術(shù)和納米技術(shù)完美有機(jī)結(jié)合，利用抗體和抗原之間特異性的免疫化學(xué)反應(yīng)原理來實現(xiàn)食品中致病菌電信號檢測的新型傳感技術(shù)。
2.一種如權(quán)利要求1所述的生物免疫傳感器的檢測方法，其特征在于包括以下步驟(1)稱取5gCNT，加入55-65mL, 2. Omol/L的HC1，超聲處理3. 5-4. 5h，用微孔濾膜過濾，然后采用雙蒸水反復(fù)洗滌至中性，95-105°C下干燥成粉末待用，采用硝酸回流法對 MWCNT進(jìn)行羧基化處理，具體方法為將3g MWCNTs至于在4M的硝酸中，然后在加熱攪拌的條件下冷凝回流Mh，回流結(jié)束后用孔徑為0. 2微米的微孔濾膜過濾，并用二次水反復(fù)洗滌，至其PH值為中性為止，所得產(chǎn)物于真空干燥箱中在55-65°C下干燥15-20h待用，將羧化的CNT在石英研缽中研磨成粉末，稱取1. Og于100°C干燥50-70min，去除物理吸附水，冷卻后，加入到IOOmL 二氯甲烷中，超聲9-llmin，之后，再加入0. 5g APTMS，于氮氣環(huán)境下攪拌回流反應(yīng)過夜，然后，過濾出固體物質(zhì)后，分別用二硫化碳、四氫吠喃和乙醇洗滌三次，以除去多余的有機(jī)物，再將制得的沉淀物質(zhì)在58-62°C真空環(huán)境下干燥3. 5-4. 5h，得黑色的巰基修飾的碳納米管(MWCNT-SH)備用；(2)金納米顆粒的制備采用檸檬酸鈉還原氯金酸法實現(xiàn)，在潔凈的三口燒瓶中加入 90-110 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%的氯金酸溶液，在冷凝回流條件下加熱至沸騰，快速加入 2. 5-3. 5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%檸檬酸鈉溶液，30min后停止加熱，然后采用一次性離心管對產(chǎn)物進(jìn)行離心14-16min，控制離心管的轉(zhuǎn)速12000 rpm，洗滌一次；(3)量取IOOml粒徑為15nm的金溶膠于反應(yīng)器中，并攪拌，隨后稱取MWCNT-SH0. Ig加入，常溫攪拌反應(yīng)3. 5-4.證，之后離心、洗滌，再經(jīng)真空常溫干燥，稱量，備用；(4)稱取0.Olmg Au-MWCNT雜合材料，加入Iml水中，超聲50_70min，取1 μ 1懸濁液滴于20 μ M間距的梳狀電極表面，室溫下干燥，然后置于管式爐中在觀0-3201、高純Ar氣保護(hù)條件下燒結(jié)25-35min，制備好的Au-MWCNT修飾的電極在固定電壓IV的條件下測量其電流信號；(5)把電極置于1XPBS稀釋10倍的免疫血清溶液中吸附抗體，過夜，把電極取出，用雙蒸水輕輕漂洗3-4次；(6)用1%的牛血清白蛋白和1%的Tween20作為封閉液，封閉免疫血清修飾的電極 2_3h，于室溫下干燥，制備得到免疫電極，然后測電流信號；(7)把制備好的免疫電極置于5ng/ml的抗原蛋白溶液中培育過夜，然后取出用雙蒸水輕輕漂洗3-4次，于室溫下干燥，再次測量抗體抗原反應(yīng)后的電流信號，即實現(xiàn)了抗原的檢測。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物免疫傳感器，其特征在于所述的生物免疫傳感器可以檢測副溶血弧菌、沙門氏菌、李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌食品致病微生物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生物免疫傳感器及其檢測方法，其主要是通過抗體和抗原之間特異性的免疫化學(xué)反應(yīng)原理來實現(xiàn)食品中致病菌電信號檢測的新型傳感技術(shù)，本發(fā)明方法是準(zhǔn)確、快速；而且本發(fā)明產(chǎn)品廉價、便攜、易于推廣。
文檔編號G01N33/569GK102539754SQ201110300528
公開日2012年7月4日 申請日期2011年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月29日
發(fā)明者劉洪林, 劉錦淮, 李民強(qiáng), 楊良保 申請人:中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院