專利名稱：一種檢測前列腺癌的elisa試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測試劑盒，具體而言，涉及一種能快速、有效的檢測出前列腺癌的ELISA試劑盒。
背景技術(shù)：
近年來隨著人們生活水平的提高，人口結(jié)構(gòu)的老齡化、飲食結(jié)構(gòu)的改變，前列腺癌(prostate cancer, PCa)的發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢，并且發(fā)病年齡日趨年輕化。流行病學數(shù)據(jù)顯示，中國前列腺癌發(fā)病率從1993年的1. 71人/10萬男性人口增加到2005 年的7. 9人/10萬男性人口，而且在以每年10%的速度攀升，成為威脅男性健康的主要因素[ALVAREZA, LOKESHWAR V B.Bladder cancer biomarkers current developments and future implementation. Curr Opin Urol, 2007,17(5) :341-346.]。由于 PCa 發(fā)病機理復雜、易惡化轉(zhuǎn)移，大多數(shù)診斷時已是進展期或晚期，最終轉(zhuǎn)變?yōu)樾奂に胤且蕾囆蚉Ca，臨床缺少有效的治療方法。因此，進行PCa的篩查，早期診斷和治療，成為提升男性生殖健康的關(guān)鍵點。臨床早期診斷方法主要是通過前列腺特異性抗原(prostate specific antigen, PSA)篩查，截至目前PSA是最為成熟和廣泛的血清腫瘤標志物，然而近年來發(fā)現(xiàn)PSA存在著明顯缺陷在前列腺增生、前列腺炎、尿路感染、導尿、前列腺按摩以及膀胱鏡檢均可導致PSA升高，有較大的重疊，且檢測受多因素影響。當PSA水平位于4 lOng/ml時，鑒別良性前列腺增生和前列腺癌困難。由此可見PSA僅對前列腺組織有特異性，但對前列腺癌特異性極低，其升高僅能提示前列腺癌的可能性。在美國經(jīng)直腸超聲引導穿刺活檢證實約 1/3PSA篩查結(jié)果為假陽性。更有研究表明PSA與前列腺癌的關(guān)聯(lián)性已經(jīng)大大下降[Na YQ, Li M. Attach importance to the research of criterion of treatment in prostate cancer. Nat Med J China,2005,85 :3169. Stamey TA,Caldwell M,McNeal JE,et al. The prostate specific antigen era in the United States is over for prostate cancer what happened in the last 20years ？ J Urol, 2004，172 :1297-1301.]。鑒于上述現(xiàn)狀，人們著力尋找更有效的新的腫瘤標記物的探索工作始終未曾停止，相關(guān)蛋白、基因、酶等在前列腺癌組織中的表達逐漸被人們重視。為此，不斷有學者提出各種腫瘤標志物，試圖尋找敏感性、特異性更高的生物標志物。本發(fā)明依據(jù)實驗研究，篩選出了同時多個指標進行前列腺癌的檢測，從而大大提高了前列腺癌的診斷率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種檢測前列腺癌的ELISA試劑盒，包括抗人ArmexinA〗抗體、抗人GRP78抗體、辣根過氧化物酶底物緩沖液、蛋白標準品ArmexinA〗與GRP78。本發(fā)明所述的抗人ArmexinA〗抗體和抗人GRP78抗體為辣根過氧化物酶標記的抗體。
本發(fā)明所述的辣根過氧化物酶底物緩沖液為TMB、H2O2和磷酸檸檬酸底物緩沖液的所組成溶液。本發(fā)明的ELISA試劑盒可以應用于前列腺癌的臨床檢測。本發(fā)明所要解決的問題是，提供一種特異性的快速檢測前列腺癌的試劑盒，以及對應的方法和應用。本發(fā)明采用雙向電泳方法比較了前列腺增生細胞BPH-1、雄激素依賴性前列腺癌細胞LNCaP及雄激素非依賴性前列腺癌細胞PC-3三種細胞蛋白的組成。并通過質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫檢索鎖定了 2個差異蛋白Annexin A2 (SEQ ID NO 1)和GRP78 (SEQ ID NO 2)。本發(fā)明通過Western Blotting方法檢測了 BPH_l、LNCaP和PC-3細胞中GRP78和 Annexin A2蛋白的表達，結(jié)果顯示GRP78在PC-3中缺失表達，Annexin A2在PC-3特異性表達。本發(fā)明還公開了所述試劑盒的組裝方法與使用方法。


圖1正常良性前列腺增生細胞系BPH-I的雙向電泳圖固相膠條等點聚焦及12% SDS-PAGE分離顯示的蛋白成分。圖2前列腺癌雄激素非依賴性細胞系PC-3的雙向電泳圖固相膠條等點聚焦及 12% SDS-PAGE分離顯示的蛋白成分。圖3前列腺癌雄激素依賴性細胞系LNCaP的雙向電泳圖固相膠條等點聚焦及12% SDS-PAGE分離顯示的蛋白成分。圖4Western Blotting檢測三種細胞GRP78的表達Lane M 分子量標準；LaneB BPH-I細胞；Lane L =LNCaP細胞；Lane P :PC_3細胞；箭頭示被抗GRP78抗體識別的蛋白條
市ο圖5 :GRP78蛋白Western Blotting檢測各細胞NMPs吸光度值1為BPH-1細胞； 2為LNCaP細胞；3為PC-3細胞。圖6 =Western Blotting檢測三種細胞Annexin A2的表達Lane M 分子量標準； Lane B :BPH_1細胞；Lane L LNCaP細胞；Lane P :PC_3細胞；箭頭示被抗GRP78抗體識別的蛋白條帶。圖 7 =Annexin A2 蛋白 Western Blotting 檢測各細胞 NMPs 吸光度值。1 為 BPH-1 細胞；2為LNCaP細胞；3為PC-3細胞
具體實施方案實施例一腫瘤標志物的篩選一.實驗材料與設(shè)備1.主要實驗材料BPH-I細胞、LNCaP細胞、PC_3細胞購于北京協(xié)和醫(yī)學院細胞中心；RPMI-1640培養(yǎng)基GIBC0公司；胎牛血清GIBC0公司；青霉素、鏈霉素=Hyclone公司；胰蛋白酶GIBC0 公司；25cm2培養(yǎng)瓶、75cm2培養(yǎng)瓶=Corning公司；15ml離心管=Corning公司；5ml、10ml 吸管=Corning公司；過氧核糖核酸酶I (DNAI)上海生物工程有限公司；氧化核苷復合物(VRC)、Leupetin, Aprotinin 北京天恩澤基因有限公司；固相pH梯度膠條(Immobiline DryStrip, pH 3_10L，24cm) :GE 公司；蛋白酶混合抑制劑(Protease Inhibitor Cocktail SetIII) :Calbiochem公司；PVDF膜Millipore公司；堿性磷酸酶標記羊抗兔LaminA/C抗體購自Pierce公司；兔抗人AnnexinA2多克隆抗體(sc-9061)抗體購自Santa Cruz公司；兔抗人GRP78多克隆抗體(sc-13968)均購自Santa Cruz公司；羊抗兔Mucinl單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；SDS-6H分子量標志購自Sigma公司；預染蛋白質(zhì)分子量標志fermentas原產(chǎn)；尿素、硫脲、瓊脂糖、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、IPG buffer (pH 3-10)、蛋白定量試劑盒(2D Quant Kit)、2_D Clean-Up Kit 均購自 Pharmacia 生物技術(shù)公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、TX-100、SDS購自Sigma公司；CHAPS、二硫蘇糖醇(DTT)、碘代乙酰胺、過硫酸銨、TEMED購自Merck公司；BCIP、NBT購自Bicmol公司；其余試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。2、主要實驗儀器等電聚膠電泳儀(IPGphor Isoelectric Focusing System) Amersham Pharmacia Biotec公司產(chǎn)品；Power PAC 3000型電泳儀、Minigel電泳槽及電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)Bio_Rad公司產(chǎn)品；組織勻漿器(Ultra-turrax T25 型)德國 Janke&Kunkel-IKA-Labortechnik 公司產(chǎn)品；pH計(pH211型)HANNA公司產(chǎn)品；分光光度儀(756MC型)上海精密科學儀器有限公司產(chǎn)品；超凈臺北京半導體一廠產(chǎn)品；培養(yǎng)箱=Thermo公司；小型臺式離心機(TGL-16G型)上海醫(yī)用儀器廠產(chǎn)品；小型臺式冷凍離心機(1K15型)為Sigma公司；恒溫水浴箱北京市長風儀器儀表公司產(chǎn)品；高壓滅菌鍋上海醫(yī)用儀器廠；小型反轉(zhuǎn)搖床(MutiliTube-Rotator) :Barnstead 公司；平轉(zhuǎn)搖床(Orbital Shaker 51300) Cloe-Parmer公司；全自動化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)北京賽智公司；常規(guī)外科手術(shù)器械購自北京王府井醫(yī)藥公司。二.實驗方法及操作步驟1.前列腺癌細胞系培養(yǎng)與收集1)細胞復蘇取出保存于液氮或_80°C冰箱的細胞，將含有細胞的凍存管迅速放入37 42°C的水浴中，輕搖使之融化；用少量含10% GIBCO胎牛血清1640培養(yǎng)基輕輕懸起細胞，轉(zhuǎn)移到離心管里；IOOOrpm離心，棄上清；加入5ml含10% GIBCO胎牛血清1640培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)瓶中，于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每一至兩天更換新鮮培養(yǎng)液一次。2)細胞傳代先用PBS清洗細胞2 3遍，而后用0. 25%胰酶(含0. 02% EDTA)消化細胞約 1-3分鐘，使之皺縮變?yōu)閳A形；用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基輕輕懸起細胞，轉(zhuǎn)移到離心管里；IOOOrpm離心，棄上清；加入IOml含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，按1 2 1 4 分入細胞培養(yǎng)瓶中，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每一至兩天更換新鮮培養(yǎng)液一次。3)細胞凍存需凍存的細胞在前一天換為新鮮培養(yǎng)基；先用PBS清洗細胞2 3遍，而后用 0. 25%胰酶(含0.02%EDTA)消化細胞約1_3分鐘，使之皺縮變?yōu)閳A形；用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基輕輕懸起細胞，轉(zhuǎn)移到離心管里；IOOOrpm離心，棄上清；加入3_5ml凍存液(10%二甲基亞砜、20 % GIBCO胎牛血清和70 %的完全培養(yǎng)基)，重懸后放入凍存管中，4°C放置15分鐘，-20°C放置60分鐘后轉(zhuǎn)入_80°C，如需長期保存可再轉(zhuǎn)入液氮中。2.前列腺癌細胞系蛋白組分的提取1)將收集的細胞用PBS洗2次，4 °C離心5min (IOOOg)去上清，加入含0.5% Triton-XlOO的細胞骨架CSK100提取液，0°C放置lOmin，4°C離心IOmin (IOOOg)，去上清，細胞膜系統(tǒng)、細胞質(zhì)隨之去除；2)加入含 0. 5% TritonX-IOO 的細胞骨架提取液 CSK50『10mM PIPES PH6. 8、 3mM MgCl2,50mM NaCl、300mM 蔗糖、4mM 氧化核苷復合物(VRC)、3 μ g/mlLeupetin、3 μ g/ml Aprotinin、1. 2mM PMSF抽提液，洗滌兩次，4°C離心5min (IOOOg)，去除上清液，細胞質(zhì)中的
微絲、微管等蛋白被去除；3)然后加入以CSK50配制的消化液(含300_500U/ml的DNase I)室溫消化 30min ；4)最后加入lmol/L硫酸銨至終濃度0. 25mol/L，室溫15min，4°C離心(IOOOg)，去上清，除去細胞中的DNA和組蛋白，剩余不溶性沉淀即為蛋白成分；5)用CSK50洗一次，4°C離心(IOOOg) 5min，吸出上清，剩余些溶液吹散樣品，將懸液移入已稱重的1. 5mlEP管中，離心(IOOOg) 5min，吸去上清，稱重；6)按1 5 (M/V)比例向蛋白沉淀中加入裂解緩沖液『7mol/L尿素、2mol/L硫尿』 溶解，冰浴超聲30-45min后，4°C離心(12000g) 30min,收集上清，在_80°C儲存?zhèn)溆谩?.蛋白質(zhì)樣品除鹽處理使用Amersham公司的2D clean-up試劑盒進行蛋白質(zhì)提取后的純化處理；1)取出樣品100 μ 1，加入100 μ 1沉淀劑，渦旋混勻，在冰上孵育15min ；2)在蛋白和沉淀劑混合物中加入ΙΟΟμΙ共沉淀劑，簡單渦旋混勻。以至少 12，OOOg速度離心5min，去除上清，并在簡單離心后以移液槍除去剩余上清，至無可見的液體；3)在沉淀頂端加上40 μ 1共沉淀劑，冰浴放置5min ；4)以至少12，OOOg速度離心5min，移去上清；5)吸取25μ 1去離子水加在每個蛋白沉淀顆粒上，渦旋振蕩5-lOs，將沉淀打散但不溶解；6)加入_20°C預冷的洗液Iml和wash additive 5 μ 1，充分混勻使之完全打散；7)-20°C放置至少30min，每IOmin渦旋振蕩20 30s，以至少12，OOOg速度離心 5min ；
8)棄除上清，可見蛋白沉淀，在空氣中簡單晾干，不超過5min ；9)溶漲液復溶。4.蛋白質(zhì)含量的測定用Amersham公司的2D Quant Kit定量試劑盒對提取的細胞內(nèi)總蛋白質(zhì)進行定量1)準備工作液B液80 μ 1+Α液8ml，配成工作顯色劑；2)按照下表逐一加入BSA標準液和樣品于2. 0ml Eppendorf管中；3)表1 蛋白標準品加樣表
6管號1 23 4 56 7(樣品)
加樣量(ド1) 0 510 15 20 25 10
蛋白量 0 10 20 30 40 50 (ドg)4)分別于每管中加入500 U 1沉淀劑，簡單混勻，室溫孵育2 ;3min ；5)分別于每管中加入500 U 1共沉淀劑，使用渦旋或顛倒簡單混勻；6)至少以12，OOOg離心5min，管底可見沉淀蛋白，棄去上清。并于簡短離心后用 移液器除去管底上清，至管中無可見液體存在；7)分別于每管加入100 U 1銅溶液和400 U 1去離子水。確保充分渦旋以溶解沉淀 的蛋白，使之徹底完全重懸；8)分別于每管中加入Iml工作液，立即顛倒混勻，室溫孵育15 20min ；9)在加入工作液之后40min之內(nèi)讀取480nm處吸光值；10)繪制標準曲線，確定樣品中蛋白質(zhì)濃度。5. SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)1)所需溶液12%分離膠
權(quán)利要求
1.一種檢測前列腺癌的ELISA試劑盒，包括抗AnnexinA2抗體、抗GRP78抗體、辣根過氧化物酶底物緩沖液、蛋白標準品ArmexinA〗與GRP78。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測前列腺癌的ELISA試劑盒，其特征在于，所述的抗人 AnnexinA2抗體和抗人GRP78抗體為辣根過氧化物酶標記的抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測前列腺癌的ELISA試劑盒，其特征在于，所述的辣根過氧化物酶底物緩沖液為tmb、H》2和磷酸檸檬酸底物緩沖液所組成的溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測前列腺癌的ELISA試劑盒，其特征在于，所述的ELISA試劑盒可以應用于前列腺癌的臨床檢測。
全文摘要
本發(fā)明采用雙向電泳方法比較了前列腺增生細胞BPH-1、雄激素依賴性前列腺癌細胞LNCaP及雄激素非依賴性前列腺癌細胞PC-3三種細胞蛋白的組成。通過經(jīng)質(zhì)譜分析及數(shù)據(jù)庫檢索，確定2個差異蛋白GRP78和Annexin A2。通過Western Blotting檢測上述三種細胞中2個差異蛋白的表達。最終確定GRP78和Annexin A2作為檢測前列腺癌的標志蛋白，并公開了檢測前列腺癌ELISA試劑盒的制備和使用方法。
文檔編號G01N33/68GK102375061SQ20111027897
公開日2012年3月14日 申請日期2011年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月20日
發(fā)明者于和鳴, 周越, 孫鐵成, 寧麗峰, 王慧萍, 辛玲 申請人:國家人口計生委科學技術(shù)研究所