專利名稱：白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
流式液相陣列(又稱流式微球陣列)是能保證信息質(zhì)量和提供相對(duì)高通量的分子探測(cè)平臺(tái)，與其技術(shù)原理相同的液相芯片技術(shù)是美國(guó)FDA2001年批準(zhǔn)的首個(gè)臨床型陣列分析技術(shù)。流式液相陣列中，微球錨定的捕獲分子(抗體或核酸探針)捕獲靶點(diǎn)分子，熒光標(biāo)記的報(bào)道分子(抗體或核酸探針)報(bào)道靶點(diǎn)分子，一種或幾種不同濃度熒光編碼的微球組建陣列即可進(jìn)行多參數(shù)并行分析。陣列解碼常用生物醫(yī)學(xué)工程儀器流式細(xì)胞儀或?qū)Ｓ靡合嘈酒瑑x。流式液相陣列具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、數(shù)據(jù)圖像化及多任務(wù)定量的顯著優(yōu)點(diǎn)。流式液相陣列已廣泛應(yīng)用于分子診斷、藥物發(fā)現(xiàn)、檢驗(yàn)檢疫、免疫技術(shù)和細(xì)胞學(xué)等領(lǐng)域。以熒光編碼微球和核酸探針構(gòu)建的流式液相陣列可以實(shí)施白血病診斷和微小殘留病監(jiān)測(cè)；基于流式液相陣列的分子結(jié)合分析能夠同步篩選配基競(jìng)爭(zhēng)性和ATP競(jìng)爭(zhēng)性受體酪氨酸激酶拮抗劑，“敲除”藥物抵抗先導(dǎo)物，避免放射法污染，可以快速、準(zhǔn)確、有效地發(fā)現(xiàn)抗腫瘤先導(dǎo)藥物；此外探測(cè)細(xì)胞信號(hào)通路傳導(dǎo)的流式液相陣列也見(jiàn)諸報(bào)道。相比其它生物分子檢測(cè)手段，基于熒光編碼微球的流式液相陣列和液相芯片具有下述突出優(yōu)點(diǎn)(1)相對(duì)高通量。可以并行檢測(cè)多個(gè)參數(shù)；(2)靈敏度高。檢測(cè)下限約為10pg/mL;(3)微量檢測(cè)。所需樣本少，特別是臨床檢驗(yàn)只需幾微升血液樣品，即可快速完成多個(gè)并行臨床參數(shù)檢測(cè)。白血病存在因染色體畸變而產(chǎn)生的融合基因和融合蛋白，異常染色體、融合基因和融合蛋白分別是白血病細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)特異性標(biāo)志。目前白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白表達(dá)水平常用的檢測(cè)方法為逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)、定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative Polymerase Chain Reaction，Q-PCR)、細(xì)胞遺傳學(xué)、熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)和單群微球流式分析。研究表明，RT-PCR技術(shù)簡(jiǎn)易，但檢測(cè)的是mRNA 逆轉(zhuǎn)錄cDNA拷貝，易受反應(yīng)條件影響，產(chǎn)生假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果；Q-PCR檢測(cè)敏感性超過(guò) ΙΟ"4,達(dá)到10_5分子水平緩解標(biāo)準(zhǔn)，但只有管家基因mRNA拷貝數(shù)高于2. 5x10s,結(jié)果才有效； 染色體核型分析數(shù)目少，定量困難；非流式FISH技術(shù)3%左右的假陽(yáng)性率過(guò)高，不適用于白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白表達(dá)檢測(cè)；白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白的單群微球流式分析方法變異系數(shù)大。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有檢測(cè)方法的不足，本發(fā)明提供了一種白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列檢測(cè)方法，可以快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白含量。術(shù)語(yǔ)說(shuō)明FITC 異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)；Alexa Fluor 488熒光一種熒光染料的商品名稱，本領(lǐng)域公知產(chǎn)品；
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Sulfo-NHS =N 一羥基硫代琥珀酰亞胺；EDC:碳二亞胺；MES 2-(N- 0 !^ ) Z.WM, 2- (N-Morpholino) ethanesulfonic acid hydrate, 簡(jiǎn)稱MESPBS 磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline, PBS)；ΡΕ:藻紅蛋白(Phycoerythrin, ΡΕ)；PBS-2% BSA 溶液含 2%牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA)的磷酸鹽緩7中液(phosphate-buffered saline, PBS)；AEBSF :4- -氨乙基)苯磺酰氟鹽酸鹽，4_ Q-Aminoethyl) benzenesulfonyl fluoride hydrochloride,簡(jiǎn)稱 AEBSF ；wella :a 孑L ；wellb :b 孑L ；wellc :c 孑L ；HBSS，s 液=Hank‘ s 平衡鹽溶液，Hank，s balanced salt solution，簡(jiǎn)稱 HBSS，s液。本發(fā)明的技術(shù)方案如下白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列檢測(cè)方法，包括兩種濃度FITC或兩種濃度Alexa Fluor 488熒光標(biāo)記的微球、融合蛋白捕獲抗體、融合蛋白報(bào)道抗體、同型對(duì)照抗體、PE熒光標(biāo)記的二抗、緩沖液和流式細(xì)胞儀檢測(cè)，其特點(diǎn)在于以包被融合蛋白捕獲抗體的一種濃度的FITC或Alexa Fluor 488熒光標(biāo)記的微球工、包被同型對(duì)照抗體的另一種濃度的FITC或Alexa Fluor 488熒光標(biāo)記的微球2組建檢測(cè)白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列，流式細(xì)胞儀檢測(cè)陣列所得微球的PE熒光強(qiáng)度與微球2的PE熒光強(qiáng)度的二者比值為融合蛋白表達(dá)值。白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列檢測(cè)方法，包括步驟如下(1)利用現(xiàn)有技術(shù)抽提白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白；備用。(2) 二元流式液相陣列的組建10000 100000個(gè)一種濃度的FITC或Alexa Fluor 488熒光標(biāo)記的微球工加入到96孔微孔濾膜板wella中，10000 100000個(gè)另一種濃度FITC或Alexa Fluor 488熒光標(biāo)記的微球2加入到96孔微孔濾膜板wellb中，用200 μ L MES緩沖液(ρΗ 6. 0)洗滌微球工和微球2各2次，真空抽濾收集微球；wella 和 wellb 孔中分別加入含 0.0001 0. Olg Sulfo-NHS 和 0. 0001 0. Olg EDC的200 μ L的MES緩沖液(ρΗ 6. 0)，混勻、室溫、振蕩、避光孵育20分鐘；wella,wellb孔中的微球、微球2分別用200 μ L PBS緩沖液(ρΗ 7. 2)洗滌2次， 真空抽濾收集微球；含微球工的wella孔中加入1 50 μ g融合蛋白捕獲抗體，含微球2的 wellb孔中加入1 50 μ g同型對(duì)照抗體，wella和wellb孔再分別加入PBS緩沖液(ρΗ 7. 2) 補(bǔ)充體積至200 μ L并混勻，避光、4°C孵育2小時(shí)；(3)白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列檢測(cè)，選自下列方案之一方案1 將步驟(1)制備的0. 5 50 μ L白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白抽提液加入到96孔微孔濾膜板well。孔中，再將步驟( 制備的包被抗體的微球1、微球2各1000 10000個(gè)混合并加入到well?？字?，加入PBS-2% BSA溶液補(bǔ)足體積至150 μ L，混勻，室溫、避光孵育 1小時(shí)；將所得微球洗滌2次并重懸于100 μ L的PBS-2% BSA溶液中，再加入0. 1 10 μ g 融合蛋白報(bào)道抗體，混勻，避光、室溫孵育1小時(shí)；將所得微球洗滌2次并重懸于100μ L的 PBS-2% BSA溶液中，加入0. 1 10 μ gPE熒光標(biāo)記的二抗，混勻，避光、室溫孵育30分鐘；將所得微球洗滌2次并重懸于100 μ L鞘液中，流式細(xì)胞儀以FITC或Alexa Fluor 488 versus PE點(diǎn)圖檢測(cè)微球工和微球2的PE熒光強(qiáng)度。方案2 將步驟(1)制備的0. 5 50 μ L白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白抽提液加入到96 孔微孔濾膜板well?？字校賹⒉襟E⑵制備的包被抗體的微球1、微球2各1000 10000 個(gè)混合并加入到well。孔中，加入0. 1 IOyg PE熒光標(biāo)記的融合蛋白報(bào)道抗體，加入 PBS-2% BSA溶液補(bǔ)足體積至150 μ L，混勻、室溫、避光孵育2小時(shí)；將所得微球洗滌2次并重懸于100 μ L鞘液中，流式細(xì)胞儀FITC或Alexa Fluor 488 versus PE點(diǎn)圖檢測(cè)微球和微球2 WPE熒光強(qiáng)度。(4)按以下公式計(jì)算得白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白定量數(shù)據(jù)白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白表達(dá)值=微球工的PE熒光強(qiáng)度+微球2的PE熒光強(qiáng)度， 或微球2的PE熒光強(qiáng)度+微球工的PE熒光強(qiáng)度。上述步驟(1)中所述融合蛋白提取自白血病患者細(xì)胞、白血病細(xì)胞系、白血病細(xì)胞株的細(xì)胞質(zhì)中或/和細(xì)胞核中的融合蛋白。上述步驟O)中所用微球的平均直徑均為1 10微米，同時(shí)含有氨基和羧基集團(tuán)。標(biāo)記微球的熒光濃度范圍為0. 1 1000 μ g/mL ；標(biāo)記微球i和微球2的熒光兩種濃度之差為4-2500倍。上述步驟O)中所述融合蛋白捕獲抗體是一種能夠特異性識(shí)別融合蛋白表位的抗體。依據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，具體選自可識(shí)別融合蛋白的C端或N端的抗體。本發(fā)明以實(shí)施例1中anti-PML作為優(yōu)選的白血病細(xì)胞M4融合蛋白PML-RARa捕獲抗體，以實(shí)施例2中anti-BCR作為優(yōu)選的白血病細(xì)胞K562融合蛋白BCR-ABL捕獲抗體，詳見(jiàn)Chan H. Ε. H. , Jilani I. , Chang R. , Albitar Μ. Detection of Chromosome Translocations by Bead-Based Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology, 2007, 378 :Monoclonal Antibodies :Methods and Protocols. Edited by :M. Albitar.上述步驟(3)中所述融合蛋白報(bào)道抗體是一種能夠特異性識(shí)別融合蛋白另一個(gè)表位的抗體。依據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，具體選自可識(shí)別融合蛋白的N端(捕獲抗體識(shí)別C端)或C 端(捕獲抗體識(shí)別N端)的抗體。本發(fā)明以實(shí)施例1中anti-RARa作為優(yōu)選的白血病細(xì)胞NB4融合蛋白PML-RARa報(bào)道抗體，以anti_ABL抗體作為優(yōu)選的白血病細(xì)胞K562融合蛋白 BCR-ABL 報(bào)道抗體，詳見(jiàn)Chan H. Ε. H.，Jilani I.，Chang R.，Albitar Μ. Detection of Chromosome Translocations by Bead-Based Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology,2007,378 :Monoclonal Antibodies :Methods and Protocols. Edited by: M. Albitar.上述步驟(3)中所述PE熒光標(biāo)記的二抗是一種能夠識(shí)別融合蛋白報(bào)道抗體的標(biāo)記PE熒光的抗體。本發(fā)明以實(shí)施例1中PE熒光標(biāo)記的抗RAR α抗體的抗體作為優(yōu)選的可識(shí)別白血病細(xì)胞NB4融合蛋白PML-RAR α報(bào)道抗體的抗體，詳見(jiàn)=Chan H. Ε. H.，Jilani I.，Chang R.，Albitar M. Detection of Chromosome Translocations by Bead-Based Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology，2007，378 :Monoclonal Antibodies :Methods and Protocols. Edited by :M. Albitar.上述步驟(4)中所述微球i的PE熒光強(qiáng)度、微球2的PE熒光強(qiáng)度是指流式細(xì)胞儀測(cè)定的PE熒光染料的算術(shù)平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity,MFI)或PE熒光 ^ 14WHm^i^^ft^fS. (geo mean fluorescence intensity)。上述步驟(1)白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白抽提可采用現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明優(yōu)選如下白血病細(xì)胞收集后，計(jì)數(shù)，用冷的PBS緩沖液洗滌白血病細(xì)胞系一次，1200 2000 轉(zhuǎn)/分鐘離心3 10分鐘，除去上清液，收集1 5X IO6個(gè)細(xì)胞，手指用力彈散細(xì)胞，加入含10 IOOmMAEBSF的ImL PBS緩沖液預(yù)處理細(xì)胞，渦旋振蕩器振蕩細(xì)胞10秒，冰上反應(yīng) 15分鐘；離心收集細(xì)胞，使用現(xiàn)有商品化細(xì)胞蛋白抽提試劑盒提取細(xì)胞內(nèi)融合蛋白，-70°C 凍存，用于所述步驟(3)的流式液相陣列檢測(cè)。在本發(fā)明中，所述的微球、微球2是使用兩種不同的濃度FITC或Alexa Fluor 488 熒光標(biāo)記。標(biāo)記微球的熒光染料兩種濃度之差約為4-2500倍。所述的微球材料為聚苯乙烯、聚苯乙烯共聚物，在微球材料內(nèi)部或表面攜帶氨基基團(tuán)和羧基基團(tuán)的微球，或者是在所述的微球材料內(nèi)部和表面均攜帶氨基基團(tuán)和羧基基團(tuán)的微球。優(yōu)選的，所述的微球是4 10微米直徑、氨基化和羧基化的聚苯乙烯微球。本發(fā)明所述的熒光標(biāo)記的微球可以通過(guò)市場(chǎng)購(gòu)買，也可以使用常規(guī)方法制備，例如以下方法單分散法制備熒光標(biāo)記的、氨基化和羧基化聚苯乙烯微球，步驟如下在帶有攪拌裝置、通氮?dú)馊芤旱娜跓恐?，加入穩(wěn)定劑和溶劑，升溫并攪拌成無(wú)顆粒均相體系，再加入引發(fā)劑、單體、帶有氨基基團(tuán)(-NH2)的有機(jī)化合物、帶有羧基基團(tuán) (-C00H)的有機(jī)化合物、熒光染料和交聯(lián)劑，保持溫度、氮?dú)鈿夥蘸蛿嚢杷俣?，聚?-72小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，將聚合得到的樣品用離心機(jī)分離，棄去上層清液，然后洗滌下層微球，再離心，如此反復(fù)3次洗滌，干燥微球，收集樣品并存貯在IOOmL棕色瓶中。詳見(jiàn) 馮愛(ài)玲，吳道澄，吳紅，楊青艷.熒光素三元共聚納米微粒的合成及其熒光性質(zhì).第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005 36 ) :325-329o本發(fā)明的上述方法，使用二元流式液相陣列，可實(shí)現(xiàn)白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白的檢測(cè)。本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案如下(1)白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白抽提細(xì)胞收集后，計(jì)數(shù)，用冷的PBS緩沖液洗滌白血病細(xì)胞系一次，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，除去上清液，收集1. 25 X IO6個(gè)細(xì)胞，手指用力彈散細(xì)胞，加入含60mM AEBSF的ImL PBS緩沖液預(yù)處理細(xì)胞，渦旋振蕩器振蕩細(xì)胞10秒， 冰上反應(yīng)15分鐘，離心收集細(xì)胞，使用現(xiàn)有商品化細(xì)胞蛋白抽提試劑盒抽提細(xì)胞內(nèi)融合蛋白，-70°C凍存，用于后面的液相陣列檢測(cè)。所述的融合蛋白選自白血病細(xì)胞NB4融合蛋白PML-RAR α，白血病細(xì)胞Κ562融合蛋白 BCR-ABL。(2) 二元流式液相陣列的組建
微球i是濃度2. 5 500 μ g/mL的FITC或Alexa Fluor 488熒光標(biāo)記的直徑1 10微米、氨基化和羧基化的聚苯乙烯微球，微球2是濃度0. 2 10 μ g/mL的FITC或Alexa Fluor 488熒光標(biāo)記的直徑1 10微米、氨基化和羧基化的聚苯乙烯微球，或微球工是濃度 0. 2 10 μ g/mL的FITC或Alexa Fluor 488熒光標(biāo)記的直徑1 10微米、氨基化和羧基化的聚苯乙烯微球，微球2是濃度2. 5 500 μ g/mL的FITC或Alexa Fluor 488熒光標(biāo)記的直徑1 10微米、氨基化和羧基化的聚苯乙烯微球；標(biāo)記微球工和微球2的熒光染料兩種濃度之差為12. 5-50倍；20000個(gè)微球i加入到96孔微孔濾膜板wella中，20000個(gè)微球2加入到96孔微孔濾膜板wellb中，200μ L MES緩沖液(ρΗ 6.0)洗滌微球工和微球2各2次，真空抽濾收集微球；含微球的wella和wellb孔中再分別加入含0. OOlg Sulfo-NHS和0. OOlg EDC的 200 μ L MES緩沖液(ρΗ 6. 0)，混勻，室溫、振蕩、避光孵育20分鐘；再將微球工、微球2分別用200 μ L PBS緩沖液(ρΗ 7.2)洗滌2次，真空抽濾收集微球；含微球工的wella孔中加入 20 yg融合蛋白捕獲抗體，含微球2的wellb孔中加入20 μ g同型對(duì)照抗體，wella和wellb 孔再分別加入PBS緩沖液(ρΗ 7. 2)補(bǔ)充體積至200yL并混勻，避光、4°C孵育2小時(shí)；(3)白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列檢測(cè)方案1 將步驟(1)制備的50 μ L融合蛋白抽提液加入到96孔微孔濾膜板well。 孔中，再將步驟⑵制備的包被抗體的微球、微球2各5000個(gè)混合并加入到well?？字校尤隤BS-2% BSA溶液補(bǔ)足體積至150 μ L，混勻，室溫、避光孵育1小時(shí)；微球洗滌2次并重懸于100 μ L的PBS-2% BSA溶液中，再加入0. 25 μ g融合蛋白報(bào)道抗體，混勻，避光室溫孵育1小時(shí)；微球洗滌并重懸于100 μ L的PBS-2% BSA溶液中，加入2. 5 μ g PE熒光標(biāo)記的二抗，混勻，避光、室溫孵育30分鐘；微球洗滌2次并重懸于100μ L鞘液中，流式細(xì)胞儀以 FITC或Alexa Fluor 488 versus PE點(diǎn)圖檢測(cè)微球和微球2的PE熒光強(qiáng)度。方案2 將步驟(1)制備的50 μ L融合蛋白抽提液加入到96孔微孔濾膜板well。 孔中，再將步驟⑵制備的包被抗體的微球、微球2各5000個(gè)混合并加入到well。孔中，加入0. 25 μ g PE熒光標(biāo)記的融合蛋白報(bào)道抗體，加入PBS-2% BSA溶液補(bǔ)足體積至150 μ L， 混勻、室溫、避光孵育2小時(shí)；微球洗滌2次并重懸于100 μ L鞘液中，流式細(xì)胞儀以FITC或 Alexa Fluor 488 vers PE點(diǎn)圖檢測(cè)微球和微球2PE熒光強(qiáng)度。(4)按以下公式計(jì)算得白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白定量數(shù)據(jù)白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白表達(dá)值=微球工的PE熒光強(qiáng)度+微球2的PE熒光強(qiáng)度， 或微球2的PE熒光強(qiáng)度+微球工的PE熒光強(qiáng)度。本發(fā)明白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列檢測(cè)方法，以包被融合蛋白捕獲抗體的一種濃度FITC或Alexa Fluor 488熒光標(biāo)記的微球工、包被同型對(duì)照抗體的另一種濃度FITC或Alexa Fluor 488熒光標(biāo)記的微球2組建檢測(cè)白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列，微球工、微球2、融合蛋白、報(bào)道抗體和/或PE熒光標(biāo)記的二抗共孵育后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)二元流式液相陣列，融合蛋白表達(dá)值表示為微球工的PE熒光強(qiáng)度與微球2的 PE熒光強(qiáng)度二者的比值，該方法能夠應(yīng)用于白血病病理、分子診斷和抗白血病藥物發(fā)現(xiàn)等生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。本發(fā)明的白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列檢測(cè)方法能夠有效消除系統(tǒng)誤差，具有快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。


圖1是FITC熒光標(biāo)記的二元流式液相陣列流式點(diǎn)圖，上方微球包被anti-PML捕獲抗體，下方微球包被同型對(duì)照抗體；圖2是白血病NB4細(xì)胞系融合蛋白PML-RAR α的二元流式液相陣列流式檢測(cè)點(diǎn)圖， 白血病細(xì)胞M4融合蛋白PML-RARa表達(dá)值=微球i (上方)的PE熒光強(qiáng)度+微球2 (下方)的PE熒光強(qiáng)度。
具體實(shí)施例方式下面給出本發(fā)明的實(shí)施例，這是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中使用的熒光標(biāo)記的微球工和微球2是按現(xiàn)有技術(shù)制備的，其中，微球是5. 4 微米氨基化和羧基化聚苯乙烯微球，制備方法參見(jiàn)馮愛(ài)玲，吳道澄，吳紅，楊青艷.熒光素三元共聚納米微粒的合成及其熒光性質(zhì).第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005 ;26 (4) :325-3四。利用本發(fā)明人在先申請(qǐng)專利文件進(jìn)行微球FITC熒光標(biāo)記，參見(jiàn)CN101846676A —種氨基化微球的熒光編碼方法，申請(qǐng)?zhí)?01010166375. 7。實(shí)施例中使用的anti-PML、anti-RAR α及其同型對(duì)照抗體為Santa cruz biotechnology公司產(chǎn)品，anti-BCR、anti-ABL及其同型對(duì)照抗體同樣為Santa cruz biotechnology公司產(chǎn)品；NB4細(xì)胞系、K562細(xì)胞系和HL-60細(xì)胞系由浙江大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤中心提供，流式細(xì)胞儀為BD Bioscience公司產(chǎn)品。實(shí)施例1、白血病細(xì)胞NB4融合蛋白PML-RAR α的二元流式液相陣列檢測(cè)方法(1)正常人血液中單個(gè)核細(xì)胞的收集取新鮮的抗凝樣本血樣，與HBSS’s液1 1 混勻后，小心加于細(xì)胞分離液的液面上，以1500轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，此時(shí)離心管中由上至下細(xì)胞分四層，收集第二層細(xì)胞，細(xì)胞沉淀用HBSS’ s液反復(fù)洗滌2次即得所需細(xì)胞。(2)白血病細(xì)胞NB4內(nèi)融合蛋白PML-RARa的抽提NB4細(xì)胞、K562細(xì)胞、HL-60細(xì)胞和正常人單個(gè)核細(xì)胞收集后，計(jì)數(shù)，用冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞一次，2000轉(zhuǎn)/分鐘、3分鐘離心，除去上清液收集細(xì)胞；將M4細(xì)胞與步驟(1)收集的正常人單個(gè)核細(xì)胞混合，M4細(xì)胞所占百分比分別為0.01%、0. 1%、1%、10%和100% ；收集約1.25X 106個(gè)混合細(xì)胞，移液槍盡可能吸取上清，手指用力彈散細(xì)胞，各加入含60mM AEBSF的ImL PBS緩沖液預(yù)處理細(xì)胞，渦旋振蕩器振蕩細(xì)胞10秒，冰上反應(yīng)15分鐘，離心收集細(xì)胞，取細(xì)胞核蛋白提取試劑盒中45 μ L冰的細(xì)胞質(zhì)蛋白提取液至細(xì)胞離心管中，混勻細(xì)胞，渦旋振蕩器振蕩15秒，將離心管冰上孵育10分鐘，加入5 μ L酶抑制劑，渦旋振蕩器振蕩15秒混勻，室溫反應(yīng)10分鐘， 然后冰上孵育1分鐘，15000轉(zhuǎn)/分鐘、4°C離心5分鐘；沉淀重懸于50 μ L細(xì)胞核蛋白提取液，再加入2. 5μ L蛋白酶抑制劑，渦旋振蕩器振蕩15秒，將離心管置于冰上孵育，每隔10 分鐘振蕩混勻一次，共孵育40分鐘，15000轉(zhuǎn)/分鐘、4°C離心5分鐘，立即吸取上清至一預(yù)冷的離心管中，即為細(xì)胞核蛋白抽提液，-70°C凍存，用于后續(xù)的二元流式液相陣列檢測(cè)。(3)檢測(cè)白血病細(xì)胞NB4內(nèi)融合蛋白PML-RARa的二元流式液相陣列的組建(圖 1)微球i按CN101846676A實(shí)施例1中2. 5 μ g/mL FITC熒光標(biāo)記方法制備，微球2按 CN101846676A實(shí)施例1中0. 2 μ g/mL FITC熒光標(biāo)記制備。
10
20000個(gè)微球i加入到96孔微孔濾膜板wella中，20000個(gè)微球2加入到96孔微孔濾膜板wellb中，200μ L MES緩沖液(ρΗ 6.0)洗滌微球工和微球2各2次，真空抽濾收集微球；含微球的wella和wellb孔中再分別加入含0. OOlg Sulfo-NHS和0. OOlg EDC的 200 μ L MES緩沖液(ρΗ 6. 0)，混勻、室溫、振蕩、避光孵育20分鐘；再將微球工、微球2分別用200 μ L PBS緩沖液(ρΗ 7.2)洗滌2次，真空抽濾收集微球；含微球工的wella孔中加入 20 yg anti-PML抗體，含微球2 Wwellb孔中加入20yg同型對(duì)照抗體，WeIljnweIl1^L 再分別加入PBS緩沖液(ρΗ 7. 2)補(bǔ)充體積至200yL并混勻，避光、4°C孵育2小時(shí)；(4)白血病細(xì)胞NB4內(nèi)融合蛋白PML-RARa的二元流式液相陣列的檢測(cè)(圖2): 將步驟⑵制備的50 μ L細(xì)胞核蛋白抽提液加入到96孔微孔濾膜板well?？字?，再將步驟 (3)制備的包被抗體的微球i、微球2各5000個(gè)混合并加入到well?？字校尤隤BS_2% BSA 溶液補(bǔ)足體積至150 μ L，混勻、室溫、避光孵育1小時(shí)；微球洗滌2次并重懸于100 μ L的 PBS-2% BSA溶液中，再加入0. 25 μ g anti-RARa抗體，混勻、避光室溫孵育1小時(shí)；微球洗滌并重懸于IOOyL的PBS-2% BSA溶液中，加入2. 5 μ g PE熒光標(biāo)記的二抗，混勻、避光室溫孵育30分鐘；微球洗滌2次并重懸于100 μ L鞘液中，流式細(xì)胞儀以FITC vers PE點(diǎn)圖檢測(cè)微球工和微球2的PE熒光強(qiáng)度。(5)按以下公式計(jì)算得白血病細(xì)胞NB4內(nèi)融合蛋白PML-RARa定量數(shù)據(jù)白血病細(xì)胞NB4內(nèi)融合蛋白PML-RAR α表達(dá)值=微球i的PE熒光強(qiáng)度+微球2的 PE熒光強(qiáng)度。(6)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制log M4細(xì)胞濃度vers log PML-RARα融合蛋白表達(dá)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算分析靈敏度。本實(shí)施例的二元流式液相陣列檢測(cè)中，50μ L正常人單個(gè)核細(xì)胞核蛋白提取液的微球工的PE熒光強(qiáng)度與微球2的PE熒光強(qiáng)度的比值為1. 31 士0. 07 (平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)， 50 μ L白血病細(xì)胞M4核蛋白提取液的微球工熒光強(qiáng)度與微球2的PE熒光強(qiáng)度的比值為56. 08 士 6. 66 (平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)，融合蛋白PML-RARa表達(dá)值以其劑量依賴方式增加， 分析靈敏度以(空白值均數(shù)+3x標(biāo)準(zhǔn)差)帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算為0.65% (M4細(xì)胞數(shù)百分比)，未能在K562或HL-60細(xì)胞中檢測(cè)到PML-RAR α融合蛋白。實(shí)施例2、本實(shí)施例中的微球和微球熒光編碼同實(shí)施例1。白血病細(xì)胞K562融合蛋白BCR-ABL的二元流式液相陣列檢測(cè)方法，步驟如下(1)正常人血液中單個(gè)核細(xì)胞的收集取新鮮的抗凝樣本血樣，與HBSS’s液1 1 混勻后，小心加于細(xì)胞分離液的液面上，以1500轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，此時(shí)離心管中由上至下細(xì)胞分四層。收集第二層細(xì)胞，細(xì)胞沉淀用HBSS’ s液反復(fù)洗滌2次即得所需細(xì)胞。(2)白血病細(xì)胞K562內(nèi)融合蛋白BCR-ABL的提取K562細(xì)胞、NB4細(xì)胞、HL-60細(xì)胞和正常人單個(gè)核細(xì)胞收集后，計(jì)數(shù)，用冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞一次，2000轉(zhuǎn)/分鐘、3分鐘離心，除去上清液收集細(xì)胞；Κ562細(xì)胞與步驟(1)收集的正常人單個(gè)核細(xì)胞混合，Κ562細(xì)胞所占百分比分別為0.01%、0. 1%、1%、10%和100% ；收集約1.25Χ106個(gè)混合細(xì)胞，移液槍盡可能吸取上清，手指用力彈散細(xì)胞，各加入含60mM AEBSF的ImL PBS緩沖液預(yù)處理細(xì)胞，渦旋振蕩器振蕩細(xì)胞10秒，冰上反應(yīng)15分鐘；離心收集細(xì)胞，加入全細(xì)胞蛋白提取試劑盒中50 μ L冰的RIPA裂解液，渦旋振蕩器振蕩15秒，將離心管冰上孵育10分鐘，15000 轉(zhuǎn)/分鐘、4°C離心5分鐘，立即吸取上清至一預(yù)冷的離心管中，即為抽提得到的全細(xì)胞蛋
11白，"70 V凍存，用于后面的二元流式液相陣列檢測(cè)。(3)檢測(cè)白血病細(xì)胞K562內(nèi)融合蛋白BCR-ABL的二元流式液相陣列的組建微球i按CN101846676A實(shí)施例1中2. 5 μ g/mL FITC熒光標(biāo)記方法制備，微球2按 CN101846676A實(shí)施例1中0. 2 μ g/mL FITC熒光標(biāo)記制備。20000個(gè)微球i加入到96孔微孔濾膜板wella中，20000個(gè)微球2加入到96孔微孔濾膜板wellb中，200μ L MES緩沖液(ρΗ 6.0)洗滌微球工和微球2各2次，真空抽濾收集微球；含微球的wella和wellb孔中再分別加入含0. OOlg Sulfo-NHS和0. OOlg EDC的 200 μ L MES緩沖液(ρΗ 6. 0)，混勻，室溫、振蕩、避光孵育20分鐘；再將微球工、微球2分別用200 μ L PBS緩沖液(ρΗ 7.2)洗滌2次，真空抽濾收集微球；含微球工的wella孔中加入 20 yg anti-BCR抗體，含微球2 Wwellb孔中加入20yg同型對(duì)照抗體，恥1込和Well1^L 再分別加入PBS緩沖液(ρΗ 7. 2)補(bǔ)充體積至200yL并混勻，避光、4°C孵育2小時(shí)；(4)白血病細(xì)胞K562內(nèi)融合蛋白BCR-ABL的二元流式液相陣列檢測(cè)將步驟(2) 制備的50 μ L融合蛋白抽提液加入到96孔微孔濾膜板well。孔中，再將步驟(3)制備的包被抗體的微球、微球2各5000個(gè)混合并加入到well。孔中，加入0. 25 μ g PE熒光標(biāo)記的 anti-ABL抗體，加入PBS_2% BSA溶液補(bǔ)足體積至150 μ L，混勻、室溫、避光孵育2小時(shí)；微球洗滌2次并重懸于100 μ L鞘液中，流式細(xì)胞儀以FITC vers PE點(diǎn)圖檢測(cè)微球i和微球 2PE熒光強(qiáng)度。(5)按以下公式計(jì)算得白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白定量數(shù)據(jù)白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白表達(dá)值=微球工WPE熒光強(qiáng)度+微球2 WPE熒光強(qiáng)度。(6)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制log K562細(xì)胞濃度vers log BCR-ABL融合蛋白表達(dá)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算分析靈敏度。本實(shí)施例的二元流式液相陣列檢測(cè)中，50μ L正常人單個(gè)核細(xì)胞蛋白抽提液的微球工WPE熒光強(qiáng)度與微球2 WPE熒光強(qiáng)度的比值為1. 士 0. 09(平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)， 50 μ L白血病細(xì)胞Κ562蛋白抽提液的微球工的PE熒光強(qiáng)度與微球2的PE熒光強(qiáng)度的比值為62. 15 士 5. 97 (平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)，融合蛋白BCR-ABL表達(dá)值以其劑量依賴方式增加，分析靈敏度以(空白值均數(shù)+3x標(biāo)準(zhǔn)差)帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算為為0.51% (K562細(xì)胞數(shù)百分比)，未能在NB4或HL-60細(xì)胞中檢測(cè)到BCR-ABL融合蛋白。
權(quán)利要求
1.白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列檢測(cè)方法，包括兩種濃度FITC或兩種濃度Alexa Fluor 488熒光標(biāo)記的微球、融合蛋白捕獲抗體、融合蛋白報(bào)道抗體、同型對(duì)照抗體、PE熒光標(biāo)記的二抗、緩沖液和流式細(xì)胞儀檢測(cè)，其特點(diǎn)在于以包被融合蛋白捕獲抗體的一種濃度的FITC或Alexa Fluor 488熒光標(biāo)記的微球、包被同型對(duì)照抗體的另一種濃度的FITC或Alexa Fluor 488熒光標(biāo)記的微球2組建檢測(cè)白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列，流式細(xì)胞儀檢測(cè)陣列所得微球的PE熒光強(qiáng)度與微球2的PE熒光強(qiáng)度的二者比值為融合蛋白表達(dá)值。
2.如權(quán)利要求1所述的白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列檢測(cè)方法，包括步驟如下(1)利用現(xiàn)有技術(shù)抽提白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白；(2)二元流式液相陣列的組建10000 100000個(gè)一種濃度的FITC或Alexa Fluor 488熒光標(biāo)記的微球加入到96 孔微孔濾膜板wella中，10000 100000個(gè)另一種濃度的FITC或Alexa Fluor 488熒光標(biāo)記的微球2加入到96孔微孔濾膜板Wellb中，200 μ L MES緩沖液(ρΗ 6. 0)洗滌微球工和微球2各2次，真空抽濾收集微球；含微球的wella和wellb孔中再分別加入含0. 0001 0. Olg Sulfo-NHS和0. 0001 0. Olg EDC的200 μ LMES緩沖液(ρΗ 6. 0)，混勻、室溫、振蕩、避光孵育20分鐘；再將微球工、微球2分別用200 μ L PBS緩沖液(ρΗ 7. 2)洗滌2次，真空抽濾收集微球；含微球工的wella孔中加入1 50 μ g融合蛋白捕獲抗體，含微球2的wellb孔中加入1 50 μ g同型對(duì)照抗體，wella和wellb孔再分別加入PBS緩沖液(pH7. 2)補(bǔ)充體積至200μ L并混勻，避光、4°C孵育2小時(shí)；得包被融合蛋白捕獲抗體的微球工和包被同型對(duì)照抗體的微球2;(3)白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列檢測(cè)，選自下列方案之一方案1 將步驟(1)制備的0.5 50 μ L白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白抽提液加入到96孔微孔濾膜板well?？字?，再將步驟( 制備的包被抗體的微球1與微球2各1000 10000個(gè)混合并加入到well。孔中，加入PBS-2% BSA溶液補(bǔ)足體積至150 μ L，混勻、室溫、避光孵育 1小時(shí)；將所得微球洗滌2次并重懸于100 μ L的PBS-2% BSA溶液中，再加入0. 1 10 μ g 融合蛋白報(bào)道抗體，混勻、避光室溫孵育1小時(shí)；將所得微球洗滌2次并重懸于100 μ L的 PBS-2% BSA溶液中，加入0. 1 10 μ g PE熒光標(biāo)記的二抗，混勻、避光室溫孵育30分鐘； 將所得微球洗滌2次并重懸于100 μ L鞘液中，用流式細(xì)胞儀以FITC或Alexa Fluor 488 versus PE點(diǎn)圖檢測(cè)微球工和微球2PE熒光強(qiáng)度；方案2 將步驟(1)制備的0. 5 50 μ L白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白抽提液加入到96孔微孔濾膜板well。孔中，再將步驟( 制備的包被抗體的微球1與微球2各1000 10000個(gè)混合并加入到well。孔中，加入0. 1 IOyg PE熒光標(biāo)記的融合蛋白報(bào)道抗體，加入PBS_2% BSA溶液補(bǔ)足體積至150 μ L，混勻、室溫、避光孵育2小時(shí)；將所得微球洗滌2次并重懸于 100 μ L鞘液中，用流式細(xì)胞儀以FITC或Alexa Fluor 488 vers PE點(diǎn)圖檢測(cè)微球i和微球 2PE熒光強(qiáng)度；(4)按以下公式計(jì)算得白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白定量數(shù)據(jù)白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白表達(dá)值=微球工的PE熒光強(qiáng)度+微球2的PE熒光強(qiáng)度，或微球2的PE熒光強(qiáng)度+微球工的PE熒光強(qiáng)度。
3.如權(quán)利要求1或2所述的白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列檢測(cè)方法，其特征在于所述微球的平均直徑均為1 10微米，F(xiàn)ITC或Alexa Fluor 488熒光染料濃度范圍為0. 1 1000 μ g/mL,熒光染料兩種濃度之差為4-2500倍。
4.如權(quán)利要求1或2所述的白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列檢測(cè)方法，其特征在于步驟O)中所用的捕獲抗體是以anti-PML、anti-BCR分別作為白血病細(xì)胞肌4融合蛋白PML-RARa、白血病細(xì)胞K562融合蛋白BCR-ABL的捕獲抗體。
5.如權(quán)利要求1或2所述的白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列檢測(cè)方法，其特征在于步驟(3)中所用的報(bào)道抗體是以anti-RARa、anti-ABL分別作為白血病細(xì)胞NB4 融合蛋白PML-RARa、白血病細(xì)胞K562融合蛋白BCR-ABL的報(bào)道抗體。
6.如權(quán)利要求1或2所述的白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列檢測(cè)方法，其特征在于所用微球工是一種濃度FITC或Alexa Fluor 488熒光標(biāo)記的微球；所用微球2是另一種濃度FITC或Alexa Fluor 488熒光標(biāo)記的微球；標(biāo)記微球工和微球2的熒光染料兩種濃度之差為4-2500倍。
7.如權(quán)利要求1或2所述的白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列檢測(cè)方法，其特征在于所述微球的材料為聚苯乙烯、聚苯乙烯共聚物之一或組合，在微球材料內(nèi)部或表面攜帶氨基基團(tuán)和羧基基團(tuán)，或者是在所述的微球材料內(nèi)部和表面均攜帶氨基基團(tuán)和羧基基團(tuán)的微球。
8.如權(quán)利要求1或2所述的白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列檢測(cè)方法，其特征在于步驟中白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白表達(dá)值=微球工WPE熒光強(qiáng)度+微球2 WPE 熒光強(qiáng)度，或微球2的PE熒光強(qiáng)度+微球工的PE熒光強(qiáng)度。
9.如權(quán)利要求1或2所述的白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列檢測(cè)方法，其特征在于步驟(4)中所述微球i的PE熒光強(qiáng)度和微球2的PE熒光強(qiáng)度是指流式細(xì)胞儀測(cè)定的PE熒光染料的算術(shù)平均熒光強(qiáng)度或PE熒光染料的幾何平均熒光強(qiáng)度。
10.如權(quán)利要求1或2所述的白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列檢測(cè)方法，其特征在于步驟如下(1)白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白抽提細(xì)胞收集后，計(jì)數(shù)，用冷的PBS緩沖液洗滌白血病細(xì)胞系一次，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，除去上清液，收集1. 25 X IO6個(gè)細(xì)胞，手指用力彈散細(xì)胞，加入含60mM AEBSF的ImL PBS緩沖液預(yù)處理細(xì)胞，渦旋振蕩器振蕩細(xì)胞10秒，冰上反應(yīng) 15分鐘，離心收集細(xì)胞，使用現(xiàn)有商品化細(xì)胞蛋白抽提試劑盒抽提細(xì)胞內(nèi)融合蛋白，-70°C 凍存，用于后面的液相陣列檢測(cè)；(2)二元流式液相陣列的組建微球是濃度2. 5 500 μ g/mL的FITC或Alexa Fluor 488熒光標(biāo)記的直徑1 10 微米、氨基化和羧基化的聚苯乙烯微球，微球2是濃度0. 2 10 μ g/mL的FITC或Alexa Fluor 488熒光標(biāo)記的直徑1 10微米、氨基化和羧基化的聚苯乙烯微球，或微球工是濃度 0. 2 10 μ g/mL的FITC或AlexaFluor 488熒光標(biāo)記的直徑1 10微米、氨基化和羧基化的聚苯乙烯微球，微球2是濃度2. 5 500 μ g/mL的FITC或Alexa Fluor 488熒光標(biāo)記的直徑1 10微米、氨基化和羧基化的聚苯乙烯微球；標(biāo)記微球工和微球2的熒光染料兩種濃度之差為12. 5-50倍；20000個(gè)微球1加入到96孔微孔濾膜板wella中，20000個(gè)微球2加入到96孔微孔濾膜板wellb中，200yL MES緩沖液(pH 6.0)洗滌微球工和微球2各2次，真空抽濾收集微球；含微球的wella*wellb孔中再分別加入含0. OOlg Sulfo-NHS和0. OOlg EDC的200 μ L MES緩沖液(pH 6.0)，混勻，室溫、振蕩、避光孵育20分鐘；再將微球工、微球2分別用200 μ L PBS緩沖液(pH 7. 2)洗滌2次，真空抽濾收集微球；含微球J^wella孔中加入20 μ g融合蛋白捕獲抗體，含微球2的wellb孔中加入20 μ g同型對(duì)照抗體，wella和wellb孔再分別加入PBS緩沖液(pH 7. 2)補(bǔ)充體積至200 μ L并混勻，避光、4°C孵育2小時(shí)；(3)白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列檢測(cè)方案1:將步驟(1)制備的50 μ L融合蛋白抽提液加入到96孔微孔濾膜板well?？字?，再將步驟⑵制備的包被抗體的微球、微球2各5000個(gè)混合并加入到well?？字?，加入 PBS-2% BSA溶液補(bǔ)足體積至150 μ L，混勻、室溫、避光孵育1小時(shí)；微球洗滌2次并重懸于 100 μ L的PBS-2% BSA溶液中，再加入0. 25 μ g融合蛋白報(bào)道抗體，混勻、避光室溫孵育1 小時(shí)；微球洗滌并重懸于100 μ L的PBS-2% BSA溶液中，加入2. 5 μ g PE熒光標(biāo)記的二抗， 混勻、避光室溫孵育30分鐘；微球洗滌2次并重懸于100 μ L鞘液中，流式細(xì)胞儀以FITC或 Alexa Fluor 488 vers PE點(diǎn)圖檢測(cè)微球和微球2的PE熒光強(qiáng)度；方案2 將步驟⑴制備的50yL融合蛋白抽提液加入到96孔微孔濾膜板well。孔中， 再將步驟⑵制備的包被抗體的微球工與微球2各5000個(gè)混合并加入到well?？字?，加入 0.25 yg PE熒光標(biāo)記的融合蛋白報(bào)道抗體，加入PBS-2% BSA溶液補(bǔ)足體積至150 μ L，混勻、室溫、避光孵育2小時(shí)；微球洗滌2次并重懸于100 μ L鞘液中，流式細(xì)胞儀以FITC或 Alexa Fluor 488 vers PE點(diǎn)圖檢測(cè)微球和微球2的PE熒光強(qiáng)度；(4)按以下公式計(jì)算得白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白定量數(shù)據(jù)白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白表達(dá)值=微球工的PE熒光強(qiáng)度+微球2的PE熒光強(qiáng)度，或微球2的PE熒光強(qiáng)度+微球工的PE熒光強(qiáng)度。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列檢測(cè)方法，以包被融合蛋白捕獲抗體的FITC或Alexa Fluor 488熒光標(biāo)記的微球1、包被同型對(duì)照抗體的另一種濃度FITC或Alexa Fluor 488熒光標(biāo)記的微球2組建檢測(cè)白血病細(xì)胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列，微球1、微球2、融合蛋白、報(bào)道抗體和/或PE熒光標(biāo)記的二抗共孵育后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)二元流式液相陣列，融合蛋白表達(dá)值表示為微球1的PE熒光強(qiáng)度與微球2的PE熒光強(qiáng)度的二者比值。該方法能夠應(yīng)用于白血病病理、分子診斷和抗白血病藥物發(fā)現(xiàn)等生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。本發(fā)明的方法能夠有效消除系統(tǒng)誤差，具有快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102353793SQ20111018998
公開(kāi)日2012年2月15日 申請(qǐng)日期2011年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月7日
發(fā)明者蘭文軍, 王哲理, 王海燕, 閆磊 申請(qǐng)人:山東輕工業(yè)學(xué)院