專(zhuān)利名稱(chēng)：丙型肝炎病毒多表位肽負(fù)荷的樹(shù)突狀細(xì)胞治療性疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)，構(gòu)建了丙型肝炎病毒多表位肽負(fù)荷的樹(shù)突狀細(xì)胞治療性疫苗。
背景技術(shù)：
丙型肝炎病毒(HCV)是引起慢性肝病的主要病原體之一，全世界約有HCV感染者 1.7億-2.0億，我國(guó)人群HCV感染率約3.2%，估計(jì)全國(guó)感染者在4000萬(wàn)以上。HCV感染后，約50% -85%轉(zhuǎn)為慢性肝炎，其中20%-30%發(fā)展為肝硬化，部分轉(zhuǎn)為肝細(xì)胞肝癌(HCC)，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康，已成為全球性的、嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問(wèn)題。迄今為止，尚缺乏理想的抗病毒治療措施，干擾素治療也不令人滿(mǎn)意。由于HCV病毒變異率高，以保護(hù)性抗體為主的預(yù)防性 HCV疫苗的研究步履維艱。因此，尋求抗HCV疫苗和有效抗病毒藥物一直是研究的熱點(diǎn)。HCV基因組有9. 6kb，編碼30IOaa的多肽，由結(jié)構(gòu)蛋白(Core、El和E2)和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B )組成。HCV感染后，機(jī)體細(xì)胞模式識(shí)別受體(pattern recognition rec印tors，PRR)感受外來(lái)分子的侵入，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)， 產(chǎn)生I類(lèi)干擾素等固有免疫反應(yīng)，以抵抗病毒的侵襲；同時(shí)通過(guò)DC介導(dǎo)特異性細(xì)胞免疫，清除病毒感染，恢復(fù)細(xì)胞的“健康狀態(tài)”。對(duì)急性HCV感染病人觀察中發(fā)現(xiàn)，如病人能早期出現(xiàn)針對(duì)包膜蛋白的抗體，則有利于病毒清除。早期疫苗研究中也證明了 HCV確實(shí)具有中和抗原表位，用真核載體表達(dá)的重組膜蛋白免疫黑猩猩，可以保護(hù)動(dòng)物免受同株病毒的攻擊。由于HCV中和抗原表位存在于編碼包膜糖蛋白的E區(qū)，而HCV E區(qū)基因高度變異，尤其是E2區(qū)N端存在高變區(qū)(HRV1和HRV2)，從而使機(jī)體產(chǎn)生的中和抗體因抗原變異而缺乏保護(hù)力，不能有效地清除病毒準(zhǔn)種或其它型別病毒株的感染。黑猩猩感染實(shí)驗(yàn)?zāi)芨屑?xì)地觀察初次感染時(shí)不同時(shí)相的免疫反應(yīng)。結(jié)果說(shuō)明CD4+ T細(xì)胞和CD8+ T細(xì)胞均在HCV清除和維持病毒抑制狀態(tài)中發(fā)揮重要作用。由于HCV疫苗研究的必要性和迫切性，自1989年HCV基因獲得克隆以來(lái)，人們一直在致力于疫苗的研究，但是進(jìn)展緩慢。早些時(shí)候，人們注重發(fā)展HCV包膜糖蛋白或多肽亞單位疫苗，同HIV疫苗的研究一樣，由于HCV包膜糖蛋白高度的變異特性，使以產(chǎn)生中和性抗體控制病毒感染和復(fù)制的研究遇到困難。HCV疫苗難以實(shí)現(xiàn)的主要原因歸納為以下三點(diǎn)①HCV基因組變異率較高，病毒準(zhǔn)種多，缺乏保護(hù)性抗體，不能阻止黑猩猩和人類(lèi)恢復(fù)的病人再次感染，傳統(tǒng)的預(yù)防性疫苗的研究遇到困難；②HCV復(fù)制能力差，感染力弱，使體內(nèi)病毒滴度較低，在體外又不易培養(yǎng)，加之對(duì)病毒復(fù)制感染過(guò)程及發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)不夠清楚，而且HCV編碼的不少蛋白質(zhì)，如核心蛋白和NS蛋白還可能與HCV的致癌性有關(guān)，免疫原的選擇以及強(qiáng)度均受到一定的限制；③缺乏理想的體外感染細(xì)胞模型，動(dòng)物模型除黑猩猩外，其他動(dòng)物，即使靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，如狒狒、恒河猴等都不能為HCV所感染，限制了對(duì)疫苗評(píng)價(jià)的研究。近10年來(lái)，HCV疫苗研究的焦點(diǎn)主要集中在核酸疫苗、病毒載體疫苗、重組多表位疫苗以抗原遞呈細(xì)胞為載體DC疫苗等。用帶有抗原基因的載體直接接種，可能由于機(jī)體因素在抗原未能遞呈之前被降解而喪失(或降低)免疫原性，因此，有學(xué)者在體外將抗原或抗原基因?qū)隓C，使抗原表位與DC 上的MHC結(jié)合，呈現(xiàn)在細(xì)胞表面作為DC細(xì)胞疫苗，然后接種，通過(guò)DC遞呈抗原信息給T、B 細(xì)胞，誘導(dǎo)機(jī)體的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)。研究表明，由DC激活的細(xì)胞免疫特別是CTL介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，在機(jī)體抵御惡性腫瘤和傳染性疾病中發(fā)揮著十分重要的作用。在DC細(xì)胞疫苗的研究中，將外源性抗原基因?qū)隓C較常用的方法是應(yīng)用重組的病毒在體外感染DC，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒感染、腺病毒感染和痘苗病毒感染等。復(fù)制缺陷型腺病毒載體和痘苗病毒載體是最常用的兩個(gè)用作疫苗研究的病毒載體，另外還有將HCV基因嵌入HBV表面抗原基因，或與卡介苗(BCG)連接等，均在小鼠中發(fā)現(xiàn)能有效誘導(dǎo)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。近10年來(lái)，隨著對(duì)HCV持續(xù)感染機(jī)制的認(rèn)識(shí)，結(jié)合我們多年的HCV研究工作基礎(chǔ)， 通過(guò)與國(guó)、內(nèi)外學(xué)者交流，提出了 HCV疫苗研究的新理念需要結(jié)合HCV的生物學(xué)特性、感染發(fā)病特征、抗病毒免疫機(jī)制，改變“單純預(yù)防”為“預(yù)防與治療相結(jié)合”，改變“多次接種為多次反復(fù)接種”，發(fā)展能夠誘導(dǎo)出強(qiáng)大的、針對(duì)多個(gè)病毒表位的、持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間的、特異性CD8+ 和CD4+T細(xì)胞反應(yīng)的疫苗研究策略，以誘導(dǎo)持續(xù)免疫應(yīng)答和維持病毒抑制狀態(tài)為“基本目標(biāo)”的HCV疫苗研究的新理念。利用復(fù)制缺陷型腺病毒載體構(gòu)建含HCV核心區(qū)基因的重組腺病毒載體，高效表達(dá)了 HCV核心蛋白，并制備出高滴度的感染性重組腺病毒。利用生物信息學(xué)方法篩選、經(jīng)過(guò)初步驗(yàn)證的HCV多個(gè)CTL表位，構(gòu)建和制備出含GFP標(biāo)簽的HCV 2個(gè)CTL表位的重組腺病毒， 感染人DC，制備多表位DC疫苗，體外與人T細(xì)胞混合培養(yǎng)。結(jié)果表明，構(gòu)建的HCV多CTL表位DC細(xì)胞疫苗能夠促進(jìn)同源T細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)CTL活性，提示重組HCV多表位腺病毒感染的DC可作為DC細(xì)胞疫苗進(jìn)一步研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種丙型肝炎病毒多表位肽負(fù)荷的樹(shù)突狀細(xì)胞治療性疫苗，它具有免疫原性。本發(fā)明的技術(shù)方案是丙型肝炎病毒多表位肽負(fù)荷的樹(shù)突狀細(xì)胞治療性疫苗，其特征是將 CTL 表位 NS4B (1793-1801) SMMAFSAAL 和 P7 (774-782) AAWYIKGRL 用于構(gòu)建重組腺病毒，進(jìn)而采用該病毒感染人樹(shù)突狀細(xì)胞來(lái)制備多表位樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗。所述的重組腺病毒表達(dá)重組腺病毒表達(dá)質(zhì)粒AD-序列1和AD-序列2構(gòu)建由上海合成序列1 in pGH和序列2 in pGH ；序列1為HCV的CTL表位NS4B (1793-1801) SMMAFSAAL和 P7 (774-782) AAWYIKGRL 加上 HCV Th 表位 NS3( 1248-1261 )GYKVLVLNPSVAAT 串聯(lián)，表位中間由促進(jìn)表位提呈的AAY連接，應(yīng)用兼顧pichia酵母偏性密碼子和大腸桿菌偏性密碼子設(shè)計(jì)基因，人工合成HCV CTL雙表位基因串聯(lián)。序列2為陽(yáng)性對(duì)照，包含HCV的CTL 表位 Core (35-44) YLLPRRGPRL, Core (132-140) DLMGYIPLV 和 HCV Th 表位 NS3( 1248-1261) GYKVLVLNPSVAAT ；序列1和2同時(shí)加上GFP和FLAG標(biāo)簽，有利于Western Blot檢測(cè)目的多肽的表達(dá)。所述的樹(shù)突狀細(xì)胞的培養(yǎng)全血來(lái)自于健康供者，經(jīng)Fic0Il-Hypaque密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，按CD14 MicroBeads humanmonocyte kit (MACS)操作說(shuō)明，分離收集⑶14+單核細(xì)胞，細(xì)胞純度達(dá)96. 32% ；用無(wú)血清培養(yǎng)液X-VIV015調(diào)整⑶14+ 單核細(xì)胞密度為IX IO6ceIlsAiL接種于M孔板，5%C02、37°C孵育培養(yǎng)5天，隔日半量換液，并加入GM-CSF(1000U / ml)和IL-4 ( 1000U / ml )，第5天起加入成熟誘導(dǎo)因子 rTNF- α (10ng/mL)、IL-1 β (10 ng/mL)、IL_6 (10 ng/mL)、PGE2 (1 μ g/mL)培養(yǎng) 2 天，即可誘導(dǎo)出成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞。在倒置顯微鏡下觀察，培養(yǎng)1 d后大部分細(xì)胞仍貼壁生長(zhǎng)并成簇排列，呈圓形，細(xì)胞膜光滑無(wú)突起。培養(yǎng)5 d后，細(xì)胞的形態(tài)出現(xiàn)不規(guī)則，懸浮細(xì)胞逐漸增多，細(xì)胞伸出突起。培養(yǎng)7d后，胞體明顯變大，絕大部分細(xì)胞呈半懸浮生長(zhǎng)，可見(jiàn)胞體不規(guī)則增大，胞膜向外伸出樹(shù)枝樣突起。所述樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗的免疫原性檢測(cè)
1、混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)；
2、ELISA檢測(cè)DC上清IL-12p70和混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清IFN-γ ；
3、用LDH釋放法檢測(cè)CTL活性。所述的重組腺病毒構(gòu)建了 HCV多CTL表位肽負(fù)荷的樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)治療性疫苗。本發(fā)明的特點(diǎn)是根據(jù)檢測(cè)結(jié)果證明這種HCV多表位肽負(fù)荷的DC細(xì)胞治療性疫苗，它具有免疫原性。


下面結(jié)合實(shí)施例附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但不做為對(duì)本發(fā)明的限定 圖1是重組質(zhì)粒PAdtrack-CMV/序列1和pAdtrack_CMV/序列2的酶切鑒定1 序列 1，2 序列 2，M :DNA Marker ；
圖2是重組腺病毒感染細(xì)胞； 圖3是普通光鏡和熒光鏡下觀察成熟樹(shù)突狀細(xì)胞； 圖4是序列特異性PCR擴(kuò)增結(jié)果； 圖 5 是 Western Blot 結(jié)果； 圖6是DC表面分子檢測(cè)；
圖7是ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-12p70和混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清IFN- γ的含
量；
圖8是CTL殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1.重組腺病毒表達(dá)
1、重組腺病毒表達(dá)質(zhì)粒AD-序列1和AD-序列2構(gòu)建由Generay Biotech(上海)合成序列 1 in pGH 和序列 2 in pGH。序列 1 為 HCV 的 CTL 表位 NS4B (1793-1801) SMMAFSAAL 和 P7 (774-782) AAffYIKGRL 加上 HCV Th 表位 NS3 (1248-1261) GYKVLVLNPSVAAT 串聯(lián)，表位中間由促進(jìn)表位提呈的AAY連接，應(yīng)用兼顧pichia酵母偏性密碼子和大腸桿菌偏性密碼子設(shè)計(jì)基因，人工合成HCV CTL雙表位基因串聯(lián)。序列2為陽(yáng)性對(duì)照，包含HCV的CTL表位 Core (35-44) YLLPRRGPRL, Core (132-140) DLMGYIPLV 和 HCV Th 表位 NS3 (1248-1261) GYKVLVLNPSVAATo序列1和2同時(shí)加上GFP和FLAG標(biāo)簽，有利于Western Blot檢測(cè)目的多肽的表達(dá)。用限制性?xún)?nèi)切酶BamHI+XhoI雙酶切，回收片段；同時(shí)用BamHI+XhoI酶切 pAdtrack-CMV穿梭載體。取片段與載體在T4 DNA連接酶作用下25°C連接1小時(shí)，取10 μ 1 產(chǎn)物熱休克法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH-5 α，挑取氨芐抗性單克隆接種到氨芐選擇性培養(yǎng)液擴(kuò)增培養(yǎng)。提取質(zhì)粒，酶切鑒定重組質(zhì)粒pAdtrack-CMV/序列1和pAdtrack-CMV/序列2。將構(gòu)建好的pAdtrack-CMV/序列1和pAdtrack_CMV/序列2用I^acI酶切線(xiàn)性化，分別與腺病毒骨架pAdEasy-Ι共轉(zhuǎn)化BJ-5183細(xì)菌進(jìn)行同源重組，氨芐篩選陽(yáng)性克隆得到重組腺病毒表達(dá)質(zhì)粒AD-序歹Ij 1和AD-序歹Ij 2。已知序歹Ij 1為156bp,序列2為159bp，pGH_l為3073bp, pGH-2為3076bp，用限制性?xún)?nèi)切酶BamHI+XhoI雙酶切質(zhì)粒序列1 in pGH和序列2 in pGH， 瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見(jiàn)預(yù)期大小的片段(見(jiàn)圖1)。測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)的目的基因一致。2、重組腺病毒包裝、擴(kuò)增將構(gòu)建好的AD-序列1和AD-序列2用I^cI酶切線(xiàn)性化，用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染細(xì)胞。重組腺病毒感染細(xì)胞后48h，熒光鏡下觀察，可見(jiàn) GFP表達(dá)(見(jiàn)圖2)，由于HCV多CTL表位與GFP為融合表達(dá)，說(shuō)明AD-序列1和AD-序列2 構(gòu)建成功。培養(yǎng)7 10天后，出現(xiàn)細(xì)胞病變，收集細(xì)胞，用DMEM重懸，-80°C和37°C反復(fù)凍融3次，離心收集上清即腺病毒原液。經(jīng)HEK293細(xì)胞擴(kuò)增病毒粗提液，CsCl密度梯度離心純化。噬斑法測(cè)定重組腺病毒滴度AD-序列1和AD-序列2分別為1. 74X IOuiPfuAil和 1. 56X1010pfu/mlo實(shí)施例2.樹(shù)突狀細(xì)胞的培養(yǎng)
1、培養(yǎng)樹(shù)突狀細(xì)胞全血來(lái)自于健康供者，經(jīng)Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，按 CD14 MicroBeads humanmonocyte kit (MACS)操作說(shuō)明，分離收集⑶14+單核細(xì)胞，細(xì)胞純度達(dá)96. 32%。用無(wú)血清培養(yǎng)液X-VIV015調(diào)整⑶14+單核細(xì)胞密度為IX IO6ceIlsAiL接種于M孔板，5%C02、37°C孵育培養(yǎng)5天，隔日半量換液，并加入GM-CSF(1000U / ml)和IL-4 ( 1000U / ml )，第5天起加入成熟誘導(dǎo)因子rTNF-α (lOng/mDaL-Ιβ (10 ng/mL)、IL_6 (10 ng/mL)、PGE2 (1 μ g/mL)培養(yǎng) 2 天，即可誘導(dǎo)出成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞。在倒置顯微鏡下觀察，培養(yǎng)1 d后大部分細(xì)胞仍貼壁生長(zhǎng)并成簇排列，呈圓形，細(xì)胞膜光滑無(wú)突起。培養(yǎng)5 d后，細(xì)胞的形態(tài)出現(xiàn)不規(guī)則，懸浮細(xì)胞逐漸增多，細(xì)胞伸出突起。培養(yǎng)7d后，胞體明顯變大，絕大部分細(xì)胞呈半懸浮生長(zhǎng)，可見(jiàn)胞體不規(guī)則增大，胞膜向外伸出樹(shù)枝樣突起(見(jiàn)圖3)。2、重組腺病毒感染樹(shù)突狀細(xì)胞收集培養(yǎng)到第5天的未成熟DC，PBS液洗2 次，細(xì)胞計(jì)數(shù)，按5X IO5ceIls /孔接種于M孔培養(yǎng)板，每孔體積為100 μ 1。分別加入 250Μ0Ι重組腺病毒，置5%C02、37°C孵箱中，培養(yǎng)池后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，并命名為 AD1-DC, AD2-DC。于感染后4 熒光鏡下觀察細(xì)胞GFP的表達(dá)，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)測(cè)定腺病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染DC的效率為76. 79%。3、RT-PCR檢測(cè)DC細(xì)胞轉(zhuǎn)染的重組HCV多表位抗原基因序列用Trizol提取重組腺病毒感染 24h 后 DC 的總 RNA,取 5μ 1 RNA,用 cDNA Synthesis Kit (Fermentas 公司)反轉(zhuǎn)錄為cDNA,序歹Ij 1上游引物5’ ATGTCAATGATGGCTTTCAGCG3’，序列2上游引物 5，ATGTCATTGTTGCCGCGCAGG3，，序列 1、2 共用下游引物 5，CTACTTATCGTCGTCATCCTTGT 3， (北京奧科生物合成)，PCR反應(yīng)條件95°C 5min;95°C 30s, 52°C 30s, 72°C 45s，;35個(gè)循環(huán)； 72°C 10!^11，并用^)瓊脂糖凝膠鑒定。結(jié)果顯示在150bp處有特異性擴(kuò)增條帶(見(jiàn)圖4)，其大小與目的基因大小相符?！畐estern blot檢測(cè)HCV多表位抗原在DC內(nèi)的表達(dá)用細(xì)胞裂解液裂解重組腺病毒感染4 后的DC，提取總蛋白，取50 g樣品與上樣緩沖液混合，煮沸5 min，進(jìn)行15% SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜。將膜在含5%脫脂奶粉的TBST中室溫下封閉lh，隨后加入小鼠抗FLAG 一抗(Sigma, 1:1000稀釋)，4°C孵育過(guò)夜，TBST搖洗3次，IOmin/次；羊抗小鼠IgG-HRP 二抗(中杉金橋，1 10000稀釋)，室溫孵育lh, TBST搖洗3次，IOmin/次；ECL化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)。結(jié)果可見(jiàn)大小約為IOKD的蛋白，這與預(yù)計(jì)的序列I-FLAG和序列2-FLAG融合蛋白大小一致，表明DC成功表達(dá)出序列1和序列2蛋白(見(jiàn)圖5)。
5、流式細(xì)胞儀分析DC表型變化:分別以APC-HLA-DR、FITC-CD80、PE-CD83， perCP-⑶86Ab標(biāo)記不成熟DC、成熟DC、重組腺病毒感染后DC。具體步驟分別收集DC，調(diào)整細(xì)胞密度為5X IO6Cells / ml,各取50 μ 1，加入1 :20滅活兔血清10 μ 1，4°C封閉lOmin， 分別加入上述Ab，4°C避光30min后，PBS洗2次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果顯示成熟DC和腺病毒感染DC比不成熟DC的表面標(biāo)志表達(dá)明顯升高，腺病毒感染DC的表面標(biāo)志CD83、CD86、 CD80 和 HLA — DR 分別為 76. 87%, 87. 75%, 97. 51%, and 97. 85% (見(jiàn)圖 6)
實(shí)施例3.樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗的免疫原性檢測(cè)
1、混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)收集感染重組腺病毒和未感染重組腺病毒的DC作為刺激細(xì)胞。 刺激細(xì)胞分別以1 X IO3/孔、5 X IO3/孔、1 X IO4/孔接種于96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔； ?、?4-PBMC為效應(yīng)細(xì)胞，每孔加入1 X IO5個(gè)細(xì)胞，同時(shí)設(shè)只加效應(yīng)細(xì)胞為陰性對(duì)照，只加培養(yǎng)液為空白對(duì)照，每孔終體積200μ 1。5%C02、37°C條件下進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)，4天后加入MTS溶液20 μ 1 /孔，繼續(xù)孵育4h，酶聯(lián)免疫分析儀于波長(zhǎng)450nm處檢測(cè)A450值，結(jié)果以3孔均值表示。刺激指數(shù)(Si)=實(shí)驗(yàn)組-空白組/陰性組-空白組。結(jié)果ADl-DC和 AD2-DC組在DC:T為1 10時(shí)刺激指數(shù)分別為6. 806士0. 247和6. 722士0. 328，未感染DC組刺激指數(shù)為3. 167士0. 314，ADl-DC組和AD2-DC組比未感染DC對(duì)T淋巴細(xì)胞的刺激作用明顯增強(qiáng)(P<0. 05)，且隨著刺激細(xì)胞的濃度增加，刺激作用增強(qiáng)(表1)。 表1.混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)CCK-8檢測(cè)結(jié)果( 士s)
注* ADl-DC和成熟DC組相比，T細(xì)胞增殖更明顯，/7 < 0. 05
2,ELISA檢測(cè)DC上清IL-12p70和混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清IFN- y 收集感染前后DC上清，應(yīng)用IL-12 P70ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)重組腺病毒感染前DC，ADl-DC和AD2-DC的培養(yǎng)液上清IL-12p70含量，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，最低檢測(cè)值為31. 2pg/ml，分別為71. 84士 1. 21pg/ ml、193. 83士2. 69pg/ml、168. 71 士2. 78pg/ml(P<0. 05)(圖 7A)。用上述 DC 刺激 T 細(xì)胞，不加 DC的T細(xì)胞做對(duì)照，收集上述混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液上清，應(yīng)用IFN- y ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè) IFN-Y分泌，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，最低檢測(cè)值為31. 2pg/ml。T、DC_T、AD1-DC_T和AD2-DC-T組的上清 IFN-Y 含量分別為 46. 01 士2. 91pg/ml、47. ；35士 1. 98pg/ml、141. 14士2. 74pg/ml、 134. 05士 1. 84pg/ml (Ρ<0· 05)(見(jiàn)圖 7B)。 3、用LDH釋放法檢測(cè)CTL活性將轉(zhuǎn)染FL-J6/JFH轉(zhuǎn)錄本的Huh_7. 5細(xì)胞作為靶細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為104/ml，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加IOOul (IO3細(xì)胞)。復(fù)蘇⑶14-PBMC， 用10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)淋巴細(xì)胞，并添加20ng/mlIL-2，用感染后DC刺激的T淋巴細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞(ADl-DC-L、AD2-DC-L)，未感染DC刺激的T淋巴細(xì)胞(DC-L)和單純淋巴細(xì)胞(L)作為對(duì)照。按效靶比100 1,50 1、25 1接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，同時(shí)設(shè)置靶細(xì)胞自然釋放LDH孔作為陰性對(duì)照和最大釋放LDH孔作為陽(yáng)性對(duì)照，分別設(shè)3個(gè)復(fù)孔， 在5%C02，37°C孵箱共培養(yǎng)6小時(shí)，根據(jù)LDH釋放試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)CTL活性。特異性細(xì)胞殺傷率(%)=(試驗(yàn)組OD值-靶細(xì)胞自然釋放組OD值-效應(yīng)細(xì)胞自然釋放組OD值)/ (靶細(xì)胞最大釋放組OD值-靶細(xì)胞自然釋放組OD值)。檢測(cè)結(jié)果顯示，不同效靶比條件下 ADl-DC-L組和AD2-DC-L組對(duì)Huh7. 5的殺傷率明顯高于DC-L組和L組，其殺傷能力與效應(yīng)細(xì)胞數(shù)量成正比。而且在效靶比為100:1時(shí)，ADl-DC-L組和AD2-DC-L組殺傷率達(dá)到最大， 分別為 35. 99% 和 30. 01%，顯著高于 DC-L 組 15. 07% (P<0. 05)和 L 組 14. 77 % (P<0. 01)， ADl-DC-L組和AD2-DC-L組相比無(wú)明顯差異(P > 0. 05)。提示重組多CTL表位腺病毒感染的DC可誘導(dǎo)特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答(見(jiàn)圖8)。
權(quán)利要求
1.丙型肝炎病毒多表位肽負(fù)荷的樹(shù)突狀細(xì)胞治療性疫苗，其制備方法是由含 GFP標(biāo)簽的HCV 2個(gè)CTL表位的重組腺病毒，感染人DC所獲得，所述2個(gè)CTL表位為 NS4B (1793-1801) SMMAFSAAL和 P7(774-782) AAffYIKGRL0
2.丙型肝炎病毒多表位肽負(fù)荷的樹(shù)突狀細(xì)胞治療性疫苗，其制備方法是由含序列1 的重組腺病毒，感染人DC所獲得。
3.如權(quán)利要求1或2所述的樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗的制備方法。
4.一種重組腺病毒，其含GFP標(biāo)簽的HCV 2個(gè)CTL表位，所述2個(gè)CTL表位為 NS4B(1793-1801) SMMAFSAAL和 P7(774-782) AAffYIKGRL0
5.丙型肝炎病毒多表位肽負(fù)荷的樹(shù)突狀細(xì)胞治療性疫苗，其特征是將CTL表位 NS4B (1793-1801) SMMAFSAAL和P7 (774-782) AAffYIKGRL用于構(gòu)建重組腺病毒，進(jìn)而采用該病毒感染人樹(shù)突狀細(xì)胞來(lái)制備多表位樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的丙型肝炎病毒多表位肽負(fù)荷的樹(shù)突狀細(xì)胞治療性疫苗，其特征是所述的重組腺病毒表達(dá)重組腺病毒表達(dá)質(zhì)粒AD-序列1和AD-序列2構(gòu)建由上海合成序列 1 in pGH和序列 2 in pGH ；序列 1 為 HCV 的 CTL 表位 NS4B (1793-1801) SMMAFSAAL 和 P7 (774-782) AAffYIKGRL 加上 HCV Th 表位 NS3 (1248-1261) GYKVLVLNPSVAAT 串聯(lián)，表位中間由促進(jìn)表位提呈的AAY連接，應(yīng)用兼顧pichia酵母偏性密碼子和大腸桿菌偏性密碼子設(shè)計(jì)基因，人工合成HCV CTL雙表位基因串聯(lián)；序列2為陽(yáng)性對(duì)照，包含HCV的CTL表位 Core (35-44) YLLPRRGPRL, Core (132-140) DLMGYIPLV 和 HCV Th 表位 NS3 (1248-1261) GYKVLVLNPSVAAT ；序列1和2同時(shí)加上GFP和FLAG標(biāo)簽，有利于Western Blot檢測(cè)目的多肽的表達(dá)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的丙型肝炎病毒多表位肽負(fù)荷的樹(shù)突狀細(xì)胞治療性疫苗，其特征是所述的樹(shù)突狀細(xì)胞的培養(yǎng)全血來(lái)自于健康供者，經(jīng)Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，按CD14 MicroBeads humanmonocyte kit (MACS)操作說(shuō)明，分離收集⑶14+單核細(xì)胞，細(xì)胞純度達(dá)96. 32% ；用無(wú)血清培養(yǎng)液X-VIV015調(diào)整⑶14+單核細(xì)胞密度為1 X IO6ceIlsAiL接種于M孔板，5%C02、37°C孵育培養(yǎng)5天，隔日半量換液， 并加入GM-CSF (1000U / ml)和IL-4 ( 1000U / ml )，第5天起加入成熟誘導(dǎo)因子rTNF-α (10ng/mL)、IL-I β (10 ng/mL)、IL-6 (10 ng/mL)、PGE2 (1 μ g/mL)培養(yǎng) 2 天，即可誘導(dǎo)出成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞；在倒置顯微鏡下觀察，培養(yǎng)1 d后大部分細(xì)胞仍貼壁生長(zhǎng)并成簇排列，呈圓形，細(xì)胞膜光滑無(wú)突起；培養(yǎng)5 d后，細(xì)胞的形態(tài)出現(xiàn)不規(guī)則，懸浮細(xì)胞逐漸增多，細(xì)胞伸出突起；培養(yǎng)7d后，胞體明顯變大，絕大部分細(xì)胞呈半懸浮生長(zhǎng)，可見(jiàn)胞體不規(guī)則增大，胞膜向外伸出樹(shù)枝樣突起。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的丙型肝炎病毒多表位肽負(fù)荷的樹(shù)突狀細(xì)胞治療性疫苗，其特征是所述樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗的免疫原性檢測(cè)1)混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)；2)ELISA檢測(cè)DC上清IL-12p70和混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清IFN- γ ；3)用LDH釋放法檢測(cè)CTL活性。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的丙型肝炎病毒多表位肽負(fù)荷的樹(shù)突狀細(xì)胞治療性疫苗，其特征是所述的重組腺病毒構(gòu)建了 HCV多CTL表位肽負(fù)荷的樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)治療性疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及病毒學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)，它構(gòu)建了丙型肝炎病毒多表位肽負(fù)荷的樹(shù)突狀細(xì)胞治療性疫苗，其特征是將CTL表位NS4B(1793-1801)SMMAFSAAL和P7(774-782)AAWYIKGRL用于構(gòu)建重組腺病毒，進(jìn)而采用該病毒感染人樹(shù)突狀細(xì)胞來(lái)制備多表位樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果證明這種HCV多表位肽負(fù)荷的DC細(xì)胞治療性疫苗,它具有免疫原性。
文檔編號(hào)G01N33/576GK102210861SQ201110143410
公開(kāi)日2011年10月12日 申請(qǐng)日期2011年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月13日
發(fā)明者周云, 李端, 潘蕾, 賈戰(zhàn)生 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)