專利名稱：Hplc法同時(shí)測定蓽茇中胡椒堿和蓽茇明寧堿含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及同時(shí)對蓽茇中胡椒堿和蓽茇明寧堿兩種成分的含量測定方法。
背景技術(shù)：
蓽茇為胡椒科Piperaceae胡椒屬Piper植物蓽茇(Piper longum L.)的干燥未成熟的果穗，是中、蒙、藏、維醫(yī)的習(xí)慣用藥，具有溫中散寒，行氣止痛的功能，收載于《中國藥典》(2010年版一部)及《中華人民共和國藥典衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)維吾爾藥分冊》。對于蓽茇的化學(xué)成分研究表明，蓽茇中主要的成分是生物堿及酰胺類成分，此外還含有萜類、揮發(fā)油等其他類成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，蓽茇具有廣泛的藥理活性如抗胃腸道疾病、抗菌消炎、抗氧化等。2010版藥典及有關(guān)文獻(xiàn)選用活性成分胡椒堿為指標(biāo)成分對蓽茇藥材進(jìn)行質(zhì)量控制。但中藥中所含成分復(fù)雜，臨床療效為多種成分的綜合作用，所以確立某一種成分作為中醫(yī)用藥的唯一有效成分有一定的局限性。而同時(shí)選用多個(gè)有效成分作為重要的定量指標(biāo)才能更加真實(shí)的反映重要的內(nèi)在質(zhì)量。根據(jù)多個(gè)有效成分的含量高低來控制藥物質(zhì)量的模式，是現(xiàn)階段對中藥及其復(fù)方的質(zhì)量控制方法研究的熱點(diǎn)之一。蓽茇明寧堿也是蓽茇中的有效成分，具有抗血小板聚集等作用。近年來，蓽茇明寧堿由于其明確的藥理作用受到人們越來越多的關(guān)注。因此，將蓽茇中胡椒堿和蓽茇明寧堿兩種成分同時(shí)作為蓽茇的質(zhì)量控制的指標(biāo)顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種同時(shí)測定植物中胡椒堿和蓽茇明寧堿含量的方法。本發(fā)明提供的方法是將被檢測樣品通過高效液相色譜法進(jìn)行測定的，所述高效液相色譜法的流動相為甲醇和(0. 2-0. 3) % (體積百分含量)的甲酸水溶液組成的混合液，所述甲酸水溶液和所述甲醇的體積比為(32-37) (62-67)。上述甲酸水溶液和甲醇的體積比可為35 65 ；所述甲酸水溶液中甲酸的體積百分含量具體可為0. 25%。上述高效液相色譜法采用的色譜柱為C18 ；流動相的流速為(0. 8-1. 2)mL · mirT1， 優(yōu)選為1. OmL · mirT1 ；檢測波長為343nm ；柱溫為38_42°C，優(yōu)選為40°C ；進(jìn)樣量為8_12ul， 優(yōu)選為IOul。進(jìn)一步，上述植物為蓽茇，所述被檢測樣品為蓽茇提取液。上述蓽茇提取液是通過如下步驟獲得的將蓽茇用提取液超聲提取，所述提取液優(yōu)選為甲醇。上述提取液與蓽茇的比例可為O5-250)ml (0. 05-0· 15) g ；優(yōu)選為(25-250) ml (0. 09-0. 11)；更優(yōu)選為 IOOml 0. Igo上述超聲提取的提取時(shí)間可為8-30分鐘，優(yōu)選是10-30分鐘，更優(yōu)選為10分鐘； 所述超聲提取的功率是40-50kHz，優(yōu)選是45kHz。上述蓽茇是經(jīng)過粉碎處理的，所述粉碎處理是將蓽茇粉碎為過80目篩的蓽茇粉。
上述高效液相色譜法中計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線所用的蓽茇明寧堿對照品的制備方法包括如下步驟1)將蓽茇藥材用乙醇提取，收集濾液，去除乙醇，得到總提取物；2)將所述總提取物用二氯甲烷萃取，收集萃取相，去除二氯甲烷，得到二氯甲烷萃取物；3)將所述二氯甲烷萃取物用體積比為1 1的二氯甲烷-甲醇溶解，用100-200 目硅膠拌樣，經(jīng)硅膠柱色譜，用二氯甲烷洗脫得到0-2000ml的洗脫液作為第一組分和 2000-2500ml的洗脫液作為第二組分，收集第二組分，去除二氯甲烷，干燥后得到干燥物；4)將步驟3)的干燥物溶于甲醇中，在C18柱上用體積比為5 5甲醇-水洗脫得到組分1-組分10共十個(gè)組分，再用體積比為5. 5 4. 5甲醇-水洗脫得到組分11-組分 18共八個(gè)組分，然后用體積比為6 4甲醇-水洗脫得到組分19-組分23，步驟4)中每個(gè)組分200ml，收集組分23，去除甲醇和水，得到蓽茇明寧堿對照品。步驟1)中，所述乙醇提取的次數(shù)為2次；乙醇是體積百分比為85%的乙醇水溶液；所述蓽茇藥材與所述乙醇水溶液的配比是0-4) kg (12-15) L，優(yōu)選是3kg (12-15) L0步驟2~)中，所述二氯甲烷萃取的次數(shù)為3次，所述二氯甲烷與所述總提取物的體積比為5 1。步驟3)中，硅膠柱中的硅膠高60cm，硅膠柱內(nèi)徑4. 0cm。步驟4)中，所述C18柱是經(jīng)體積比為5 5的甲醇-水預(yù)平衡的；C18柱中硅膠高80cm，柱內(nèi)徑1. 5cm。上述的方法在鑒定或控制蓽茇藥材質(zhì)量中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述鑒定或控制蓽茇藥材質(zhì)量優(yōu)選是通過同時(shí)測定胡椒堿和蓽茇明寧堿含量實(shí)現(xiàn)。上述的方法在制備蓽茇明寧堿中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述的方法在同時(shí)測定胡椒堿和蓽茇明寧堿含量中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)驗(yàn)證明超聲法對藥材中胡椒堿和蓽茇明寧堿的提取率最高，且操作時(shí)間相對較短，較為簡單方便，故選擇超聲法為供試品溶液制備的最佳提取方法(表1)。超聲提取 IOmin可將蓽茇藥材中的胡椒堿和蓽茇明寧堿較完全地提取出，為考慮節(jié)省成本，故最終選擇以甲醇超聲提取IOmin為供試品溶液制備最佳提取方法(表2)。IOOmL甲醇可將蓽茇藥材中的胡椒堿和蓽茇明寧堿較完全地提取出，為考慮節(jié)省成本，故最終選擇以IOOmL甲醇超聲提取為供試品溶液制備最佳提取方法(表幻。采用本發(fā)明的HPLC條件以及上述的提取條件后，胡椒堿和蓽茇明寧堿日間精密度的RSD分別為1. 0%和0. 5%，均小于3. 0%，表明精密度良好(表6、7)；胡椒堿和蓽茇明寧堿的RSD分別為1.4%和1.2%，均小于3%。 結(jié)果表明供試品溶液至少在72h內(nèi)穩(wěn)定(表8)；胡椒堿和蓽茇明寧堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)RSD值均為 2.9%，重復(fù)性很好(表10)；胡椒堿的平均回收率和RSD分別為100. 4%和2.5%，蓽茇明寧堿的平均回收率和RSD分別為102. 和2.0%，說明加樣回收率符合要求(表11、12)。因此本實(shí)驗(yàn)首次建立HPLC法同時(shí)測定蓽茇中胡椒堿和蓽茇明寧堿的含量，進(jìn)一步完善了蓽茇的質(zhì)量控制方法，并對不同批號的蓽茇進(jìn)行了含量測定。與以往的胡椒堿外標(biāo)法的方法學(xué)考察模型相比，更符合祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中“多成分”、“多靶點(diǎn)”的思維模式因而更加客觀、科學(xué)。


圖1蓽茇明寧堿1H-NMR圖譜1。
圖2蓽茇明寧堿屮-WR圖譜2。
圖3蓽茇明寧堿13C-NMR圖譜。
圖4胡椒堿標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖5蓽茇明寧堿標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖6胡椒堿和蓽茇明寧堿標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖。
圖7蓽茇藥材供試品浮 液(批號200805)高效液相色譜圖。
圖8蓽茇藥材供試品浮 液(批號200905)高效液相色譜圖。
圖9蓽茇藥材供試品浮 液(批號201005)高效液相色譜圖。
圖10蓽茇藥材供試品:i容液(批號=200810)高效液相色譜圖。
圖11蓽茇藥材供試品3容液(批號=201003)高效液相色譜圖。
圖12蓽茇藥材供試品:i容液(批號=201008)高效液相色譜圖。
圖13蓽茇藥材供試品:i容液(批號=201102)高效液相色譜圖。
圖14蓽茇藥材供試品:i容液(批號=201103)高效液相色譜圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。下述實(shí)施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。AgilentllOO型高效液相色譜儀系列，包括:G1365D DAD(檢測器)，G1311A QuatPump (四元梯度泵)，G1332A (在線真空脫氣機(jī))，G1329A ALS (自動進(jìn)樣器)， G1316AColcom(ftilmff) ,Agilent Chemstation system(工作站)(Agilent Technologies, 美國)；ME235S十萬分之一電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，KQ5200DV型數(shù)控超聲波清洗器(40kHz，昆山市超聲儀器有限公司)；Agilent Eclipse )(DB-C18色譜柱 (250mmX4. 6mm, 5 μ m) (Agilent Technologies公司，美國)胡椒堿標(biāo)準(zhǔn)品(中檢所，批號 0775-200203,純度> 99% )，蓽茇明寧堿標(biāo)準(zhǔn)品(首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院自制，見實(shí)施例 1步驟一和二，純度>99%)，不同批號的蓽茇藥材8批。本發(fā)明中的蓽茇藥材粉(末)是將蓽茇藥材粉碎成過80目篩的蓽茇粉。實(shí)施例1一、蓽茇中提取物的制備蓽茇藥材3kg粉碎后加入15L 85% (體積百分比)乙醇水溶液，加熱回流1.證， 過濾保留濾液，濾渣加入12L 85% (體積百分比)的乙醇水溶液回流1. ，過濾，合并兩次濾液，濃縮得到無醇的濃縮液為1950mL。用濃縮液5倍體積的二氯甲烷萃取三次，回收溶劑后得到二氯甲烷萃取物干燥浸膏約43g。二、蓽茇明寧堿對照品的制備(梯度洗脫)
浸膏用二氯甲烷甲醇(1 1)充分溶解，用100-200目硅膠拌樣，經(jīng)硅膠柱(硅膠高60cm，柱內(nèi)徑4. Ocm)色譜，以二氯甲烷-甲醇(體積比為10 0 9 1 8 2) 梯度洗脫。分為Fr. 1 8八個(gè)部分，其中以二氯甲烷-甲醇10 0洗脫得到Frl(洗脫體積 2000ml)、Fr2 (洗脫體積 500ml)、Fr3 (洗脫體積 1000ml)、Fr4 (洗脫體積 1000ml)；以二氯甲烷-甲醇9 1洗脫得到Fr5(洗脫體積500ml)、Fr6(洗脫體積1000ml)、Fr7(洗脫體積750ml)；以二氯甲烷-甲醇8 2洗脫得到Fr8 (洗脫體積1250ml)，回收溶劑，對其中的 Fr. 2干燥稱重為2. 6g。將Fr. 2溶于少量甲醇中，C18硅膠色譜柱(硅膠高80cm，柱內(nèi)徑1.5cm)經(jīng)甲醇-水(5 5)400mL平衡，濕法加樣，以甲醇-水(體積比為5 5 5. 5 4. 5 6 4 6.5 3. 5)梯度洗脫，收集各濃度梯度洗脫液。按每份200mL接收洗脫流份，分別得流份Fr. 1 38，其中以甲醇-水5 5洗脫得到Frl-FrlO、以甲醇-水5. 5 4. 5洗脫得到Frll-Frl8、以甲醇-水6 4洗脫得到Frl9_Fr24，以甲醇-水6. 5 3. 5洗脫得到 Frf8-Fr38，各流份減壓蒸干溶劑后用少量甲醇溶解。其中Fr. 23為白色固體粉末，經(jīng)檢測為純的單一化合物，對其進(jìn)行核磁波譜測定。波譜數(shù)據(jù)如下=1H-NMR(MeODjOOMHz) δ 6. 11 (1H，d，J = 14. 74Hz)，7. 27 (1H，m)， 6. 79 (1H, m)，6. 82 (1H, m)，7. 07 (1H, d, J = 1. 35Hz)，6. 80 (1H, d, J = 8. 03Hz)，0. 93 (3H, d, J =6. 70Hz)，5. 96 (2H, s)，3. 09 (2H, t, J = 6. 48Hz)，1. 82 (1H, m)，0. 93 (3H, d, J = 6. 70Hz)， 6. 95 (1H, dd, J = 1. 34，8. 03Hz)。13C NMR (MeOD，150MHz) 6 169. 3，123. 9，142. 3，126. 2， 140. 3，132. 6，106. 9，150. 0，109. 6，1244，102. 9,20. 7,30. 0,20. 7,48. 3。見圖 1 3。與文獻(xiàn)對照確定該化合物為蓽茇明寧堿。經(jīng)HPLC檢測其純度為99%，即為蓽茇明寧堿對照品。三、蓽茇藥材提取方法的考察1.提取方法的選擇設(shè)置以下三組實(shí)驗(yàn)來確定最佳的提取方法1)超聲提取法取蓽茇藥材粉末約0. lg，精密稱定，置IOOmL容量瓶中，加入甲醇 IOOmL,密塞，超聲(45kHz)提取30min，放冷，用甲醇補(bǔ)足至刻度，搖勻，用0. 45 μ m微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。2)回流提取法取蓽茇藥材粉末約0. lg，精密稱定，置于IOOmL圓底燒瓶中，加入甲醇IOOmL,稱定重量，加熱回流lh，放冷，再稱重，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻用0. 45 μ m 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。3)索氏提取法取蓽茇藥材粉末約0. lg，精密稱定，置于IOOmL錐形瓶中，加入甲醇IOOmL,冷浸24h后，搖勻，用0. 45 μ m微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。將上述三種不同提取方法所得的供試品進(jìn)行HPLC檢測。以上供試品溶液各進(jìn)樣 10μ L，測定各峰面積值，以峰面積代表其中胡椒堿和蓽茇明寧堿含量。檢測條件是色譜柱Agilent Technologies 公司，Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱 O50mmX4. 6mm，5 μ m)； 流動相甲醇-體積比0. 25%甲酸水溶液(65 35)；流速1. OmL .mirT1 ；檢測波長:343nm ； 柱溫:40°C。表1不同提取方法考察結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種同時(shí)測定植物中胡椒堿和蓽茇明寧堿含量的方法，是將被檢測樣品通過高效液相色譜法進(jìn)行測定的，所述高效液相色譜法的流動相為甲醇和(0.2-0.3)% (體積百分含量)的甲酸水溶液組成的混合液，所述甲酸水溶液和所述甲醇的體積比為 (32-37) (62-67)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述甲酸水溶液和甲醇的體積比為 35 65 ；所述甲酸水溶液中甲酸的體積百分含量為0.25%。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述高效液相色譜法采用的色譜柱為 C18 ；流動相的流速為(0. 8-1. 2)mL · mirT1，優(yōu)選為1. OmL · mirT1 ；檢測波長為343nm ；柱溫為38-42°C，優(yōu)選為40°C ；進(jìn)樣量為8-12ul，優(yōu)選為IOul。
4.如權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述植物為蓽茇，所述被檢測樣品為蓽茇提取液；所述蓽茇提取液是通過如下步驟獲得的將蓽茇用提取液超聲提取，所述提取液優(yōu)選為甲醇。
5.如權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述提取液與蓽茇的比例為(25-250)ml (0. 05-0. 15)g ；優(yōu)選為(25-250)ml (0. 09-0. 11)；更優(yōu)選為 IOOml 0. Ig0
6.如權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述超聲提取的提取時(shí)間為8-30 分鐘，優(yōu)選是10-30分鐘，更優(yōu)選為10分鐘；所述超聲提取的功率是40-50kHz，優(yōu)選是 45kHz ο
7.如權(quán)利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于所述蓽茇是經(jīng)過粉碎處理的，所述粉碎處理是將蓽茇粉碎為過80目篩的蓽茇粉。
8.如權(quán)利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述高效液相色譜法中計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線所用的蓽茇明寧堿對照品的制備方法包括如下步驟1)將蓽茇藥材用乙醇提取，收集濾液，去除乙醇，得到總提取物；2)將所述總提取物用二氯甲烷萃取，收集萃取相，去除二氯甲烷，得到二氯甲烷萃取物；3)將所述二氯甲烷萃取物用體積比為1 1的二氯甲烷-甲醇溶解，用100-200 目硅膠拌樣，經(jīng)硅膠柱色譜，用二氯甲烷洗脫得到0-2000ml的洗脫液作為第一組分和 2000-2500ml的洗脫液作為第二組分，收集第二組分，去除二氯甲烷，干燥后得到干燥物；4)將步驟3)的干燥物溶于甲醇中，在C18柱上用體積比為5 5甲醇-水洗脫得到組分1-組分10共十個(gè)組分，再用體積比為5. 5 4.5甲醇-水洗脫得到組分11-組分18 共八個(gè)組分，然后用體積比為6 4甲醇-水洗脫得到組分19-組分23，步驟4)中每個(gè)組分200ml，收集組分23，去除甲醇和水，得到蓽茇明寧堿對照品。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于步驟1)中，所述乙醇提取的次數(shù)為2次； 乙醇是體積百分比為85%的乙醇水溶液；所述蓽茇藥材與所述乙醇水溶液的配比是(2-4) kg (12-15) L，優(yōu)選是 3kg (12-15) L ；步驟幻中，所述二氯甲烷萃取的次數(shù)為3次，所述二氯甲烷與所述總提取物的體積比為 5 1 ；步驟幻中，硅膠柱中的硅膠高60cm，硅膠柱內(nèi)徑4. Ocm ；步驟4)中，所述C18柱是經(jīng)體積比為5 5的甲醇-水預(yù)平衡的；C18柱中硅膠高80cm，柱內(nèi)徑1. 5cm。
10.權(quán)利要求1-9中所述的方法在控制蓽茇藥材質(zhì)量中或在制備蓽茇明寧堿中或在同時(shí)測定胡椒堿和蓽茇明寧堿含量中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種HPLC法同時(shí)測定蓽茇中胡椒堿和蓽茇明寧堿含量的方法。HPLC的流動相為甲醇和(0.2-0.3)％(體積百分含量)的甲酸水溶液組成的混合液，所述甲酸水溶液和所述甲醇的體積比為(32-37)∶(62-67)。本實(shí)驗(yàn)首次建立HPLC同時(shí)測定蓽茇中胡椒堿和蓽茇明寧堿的含量，進(jìn)一步完善了蓽茇的質(zhì)量控制方法，并對不同批號的蓽茇進(jìn)行了含量測定。與以往的胡椒堿外標(biāo)法的方法學(xué)考察模型相比，更符合祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中“多成分”、“多靶點(diǎn)”的思維模式因而更加客觀、科學(xué)。
文檔編號G01N30/36GK102288712SQ20111011656
公開日2011年12月21日 申請日期2011年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月6日
發(fā)明者劉軍輝, 吳霞, 楊慧, 畢贏, 羅容 申請人:首都醫(yī)科大學(xué)