專(zhuān)利名稱(chēng)：一種可視化快速聯(lián)檢植物病原的方法和抗體芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體為植物病原的檢測(cè)方法和試劑，尤其是可視化快速聯(lián)檢植物病原的方法和抗體芯片。
背景技術(shù)：
植物病害分為侵染性和非侵染性?xún)深?lèi)，其中侵染性病害又主要可分為真菌性、細(xì)菌性、病毒性和線蟲(chóng)性等。植物病害種類(lèi)繁多、傳播途徑廣，可破壞或干擾植物正常的生理機(jī)能，且目前缺少有效防治措施，使得許多重要的病毒病、細(xì)菌病一旦流行，便很難控制，是導(dǎo)致蔬菜、花卉產(chǎn)量和品質(zhì)下降最重要的原因之一。、
目前對(duì)植物病害的檢測(cè)方法主要有生物學(xué)檢測(cè)、電子顯微鏡觀察、血清學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)方法等(Direct-PCR、免疫-PCR、RT-PCR等)。生物學(xué)檢測(cè)又稱(chēng)指示植物檢測(cè)法，該方法是將某種病毒接種特定的指示植物，根據(jù)指示植物表現(xiàn)出的局部或系統(tǒng)癥狀，初步判定病毒的種類(lèi)和歸屬。電子顯微鏡技術(shù)可直接觀察到病害的形態(tài)結(jié)構(gòu)、存在與否等信息，是最直接、最準(zhǔn)確的病原檢測(cè)手段。血清學(xué)檢測(cè)，主要是利用抗原抗體可特異性結(jié)合的原理，利用病原的特異性抗體來(lái)檢測(cè)鑒定病原。分子生物學(xué)檢測(cè)方法主要有核酸分子雜交技術(shù)、dsRNA電泳技術(shù)、PCR技術(shù)等，這些方法均可快速、靈敏、特異性的檢測(cè)病原。但以上這些比較通用的植物病害檢測(cè)方法，都或多或少存在著缺陷生物學(xué)檢測(cè)一般需在溫室中進(jìn)行，全檢測(cè)過(guò)程耗時(shí)較長(zhǎng)；電子顯微鏡觀察一般需負(fù)染色或制作超薄切片，且檢測(cè)鑒定過(guò)程需在電子顯微鏡下進(jìn)行；ELISA等血清學(xué)方法其檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，且每個(gè)反應(yīng)孔只可單獨(dú)檢測(cè)一種病原，在需篩選大量樣品或單個(gè)樣品的多個(gè)病原項(xiàng)目時(shí)，工作量往往相當(dāng)龐大，具有耗時(shí)、費(fèi)力的缺點(diǎn)；分子生物學(xué)方法需要標(biāo)記探針?lè)肿?核酸分子雜交技術(shù))，或提取核酸后進(jìn)一步將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA (RC-PCR)，檢測(cè)過(guò)程中目標(biāo)核酸損失較大，檢測(cè)結(jié)果因?yàn)楹怂犭s交或擴(kuò)增過(guò)程易受植物成分的抑制而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。蛋白質(zhì)芯片是近些年發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)，又稱(chēng)蛋白質(zhì)陣列或蛋白質(zhì)微陣列，最早由德國(guó)科學(xué)家Angelika Lueking于1995年開(kāi)始研究,主要利用抗原與抗體、受體與配體間可特異性結(jié)合的原理，將探針?lè)肿庸潭ㄔ谳d體表面，用于分析被檢樣品液中目的分子信息的技術(shù)。蛋白質(zhì)芯片誕生初期主要被用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究，隨后被逐漸推廣至生物醫(yī)學(xué)相關(guān)領(lǐng)域，而將蛋白質(zhì)芯片(抗體芯片)用于植物病原的檢測(cè)，國(guó)內(nèi)外目前仍未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。蛋白質(zhì)芯片用于植物病原的快速檢測(cè)，具有節(jié)約時(shí)間、節(jié)省抗體、靈敏度高、重復(fù)性好等眾多優(yōu)點(diǎn)，檢測(cè)結(jié)果既可用肉眼直接判定，也可通過(guò)分析灰度后作定量檢測(cè)，推廣應(yīng)用前景廣闊。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種可視化快速聯(lián)檢植物病原的方法。本發(fā)明還提供了可視化快速聯(lián)檢植物病原的抗體芯片。。一種可視化快速聯(lián)檢植物病原的方法，包括以下步驟
(I)將檢測(cè)樣品與抗體芯片雜交孵育I 5hr ;所述的抗體芯片包括固定在基膜上的植物病原捕獲抗體；(2)洗滌后再加入相應(yīng)的植物病原檢測(cè)抗體雜交孵育，繼續(xù)反應(yīng)I 5hr ;(3)洗滌后顯色。所用的植物病原捕獲抗體分別為番爺細(xì)菌性潰瘍病菌(Corynebacteriummichiganense pv. Michiganense, Cmm)、黃瓜花葉病毒(CuCumber mosaic virus, CMV)、鳳果花葉病毒(Pepino mosaic virus, PepMV)、番爺不孕病毒(Tomato aspermy virus,TAV)、番爺黑環(huán)病毒(Tomato black ring virus, TBRV)、番爺花葉病毒(Tomato mosaicvirus, ToMV)、番爺環(huán)斑病毒(Tomato ring spot virus, ToRSV)、煙草環(huán)斑病毒(Tobaccoringspot virus, TRSV)、煙草脆裂病毒(Tobacco rattle virus, TRV)和番爺斑萎病毒(Tomato spotted wild virus, TSWV)捕獲抗體中的至少一種。
以IgG為質(zhì)控對(duì)照。用pH = 7. 2 7. 4、吐溫-20質(zhì)量含量0.01% 0. 1%的磷酸鹽緩沖液洗滌。用pH = 7. 2 7. 4、吐溫-20質(zhì)量含量0. 01% 0. I %、BSA質(zhì)量含量0. 1%
0.5%的磷酸鹽緩沖液稀釋檢測(cè)抗體。檢測(cè)抗體的標(biāo)記物為堿性磷酸酶、辣根過(guò)氧化物酶或生物素等。堿性磷酸酶的顯色底物為5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽和四唑硝基藍(lán)；辣根過(guò)氧化物酶的顯色底物為二氨基聯(lián)苯胺；標(biāo)記物為生物素時(shí)先加入親和素-納米金，再用銀染色。一種可視化快速聯(lián)檢植物病原的抗體芯片，包括基膜及點(diǎn)布在基膜上的植物病原捕獲抗體。所述的植物病原捕獲抗體分別為番茄細(xì)菌性潰瘍病菌、黃瓜花葉病毒、番茄不孕病毒、番茄黑環(huán)病毒、番茄花葉病毒、番茄環(huán)斑病毒、煙草環(huán)斑病毒、煙草脆裂病毒和番茄斑萎病毒捕獲抗體等茄科植物病原捕獲抗體中的至少一種。所述的基膜為硝酸纖維素膜、聚偏氟乙烯膜、玻璃基片、硝酸纖維素涂層的玻璃基 片或聚偏氣乙稀涂層的玻璃基片。將捕獲抗體用濃度為0. 001 0. 5mol/L、pH值7. 0 10. 0的碳酸鹽緩沖液稀釋后點(diǎn)在基膜上并固定，得到上述抗體芯片；稀釋后的捕獲抗體濃度為捕獲抗體濃度為10 120mg/L，優(yōu)選為 20 100mg/L。相對(duì)現(xiàn)行的植物病害檢測(cè)方法，本發(fā)明的抗體芯片和方法能快速同時(shí)檢測(cè)茄科植物多種檢疫性病害，這種抗體芯片和方法所具有的優(yōu)勢(shì)在于(I)既具有與傳統(tǒng)方法同等的單病原檢測(cè)能力，還有傳統(tǒng)方法不具備的一次實(shí)驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)多種病原能力，可在一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)檢測(cè)至少10種植物病原；(2)利用標(biāo)記酶及相應(yīng)的顯色底物(如堿性磷酸酶及相應(yīng)的BCIP/NBT顯色底物等)標(biāo)記檢測(cè)抗體，顯示雜交信號(hào)，結(jié)果既可用肉眼直接判定，也可以普通平板掃描儀直接獲取，進(jìn)一步進(jìn)行灰度分析后，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)病原的半定量檢測(cè)；(3)利用本發(fā)明檢測(cè)植物病害，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定，不易受植物成分的影響而出現(xiàn)假陰性結(jié)果；(4)每次實(shí)驗(yàn)可檢測(cè)的樣品量更大，可有效提高陽(yáng)性檢出率；(5)利用抗體芯片檢測(cè)植物病原，檢測(cè)及獲取信號(hào)過(guò)程只需搖床和平板掃描儀即可，降低了對(duì)貴重儀器的依賴(lài)度，操作簡(jiǎn)便，可在絕大部分實(shí)驗(yàn)室推廣；(6)利用抗體芯片實(shí)現(xiàn)多病原的同時(shí)檢測(cè)，可節(jié)約時(shí)間、節(jié)省抗體，且具有與ELISA等方法同等的靈敏度、特異性、重復(fù)性，檢測(cè)結(jié)果可長(zhǎng)期保存，推廣前景廣闊。


圖I為實(shí)施例I捕獲抗體點(diǎn)樣制備的抗體芯片的陣列排布圖。圖2為實(shí)施例3分別單獨(dú)檢測(cè)10種病原的陽(yáng)性結(jié)果。圖3為實(shí)施例4同時(shí)檢測(cè)多種病原的陽(yáng)性結(jié)果，A為同時(shí)檢測(cè)除TBRV外的9種病原為同時(shí)檢測(cè)10種病原。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)、完整地說(shuō)明實(shí)施例I抗體芯片的制備I、材料與試劑點(diǎn)樣緩沖液碳酸鹽緩沖液，濃度為0. 5mol/L, pH 9.6(配制方法Na2C03 I. 59g，NaHCO3 2. 93g, NaN3 0. 2g, ddH20 IOOOmL)；捕獲抗體抗-番茄細(xì)菌性潰瘍病菌(德國(guó)LOEWE公司，貨號(hào)07063)，抗-黃瓜花葉病毒(蘇格蘭NEOGEN公司，貨號(hào)1016)，抗-鳳果花葉病毒(美國(guó)Agdia公司，貨號(hào)SRA13000)，抗-番茄不孕病毒(蘇格蘭NEOGEN公司，貨號(hào)1187)，抗-番茄黑環(huán)病毒(蘇格蘭NEOGEN公司，貨號(hào)1068)，抗-番茄花葉病毒(美國(guó)Agdia公司，貨號(hào)SRA 35400)，抗-番茄環(huán)斑病毒(蘇格蘭NEOGEN公司，貨號(hào)1233)，抗-煙草環(huán)斑病毒(蘇格蘭NEOGEN公司，貨號(hào)1069),抗-煙草脆裂病毒(蘇格蘭NEOGEN公司，貨號(hào)1161),抗-番爺斑萎病毒(蘇格蘭NEOGEN公司，貨號(hào)1071)；陽(yáng)性質(zhì)控堿性磷酸酶標(biāo)記的抗山羊IgG(碧云天生物技術(shù)研究所，貨號(hào)A0266)；硝酸纖維素膜美國(guó)Millipore公司。2、芯片制備I)抗體稀釋以點(diǎn)樣緩沖液分別將捕獲抗體5倍稀釋?zhuān)瑒t各抗體工作濃度為20mg/L 80mg/L ;同時(shí)以10倍稀釋堿性磷酸酶標(biāo)記的IgG作為陽(yáng)性質(zhì)控；2)基片預(yù)處理點(diǎn)樣前，需以ddH20浸泡硝酸纖維素膜基片20min，室溫中晾干恒定;3)點(diǎn)樣按芯片設(shè)計(jì)示意圖，如圖I所示，分別將針對(duì)10種病原的捕獲抗體抗-番茄細(xì)菌性潰瘍病菌、抗-黃瓜花葉病毒、抗-鳳果花葉病毒、抗-番茄不孕病毒、抗-番茄黑環(huán)病毒、抗-番茄花葉病毒、抗-番茄環(huán)斑病毒、抗-煙草環(huán)斑病毒、抗-煙草脆裂病毒和抗-番茄斑萎病毒依次點(diǎn)在編號(hào)I 10的位置；在P和N的位置分別點(diǎn)陽(yáng)性質(zhì)控、陰性質(zhì)控(點(diǎn)樣緩沖液)。將上述試劑按陣列排布點(diǎn)樣于基片表面，每點(diǎn)0. 2uL,點(diǎn)間距0. 2cm。點(diǎn)樣完畢后，將芯片置于濕盒中37°C固定后，4°C保存，從而制得具同時(shí)檢測(cè)茄科植物10種主要檢疫性病害能力的抗體芯片。實(shí)施例2試劑盒的組裝可同時(shí)檢測(cè)茄科植物主要檢疫性病害的抗體芯片檢測(cè)試劑盒，主要組成如下(I)實(shí)施例I所制備的抗體芯片10張；
(2)檢測(cè)抗體原液實(shí)施例I所述的10種病原相應(yīng)的檢測(cè)抗體原液(與相應(yīng)的捕獲抗體為同一公司產(chǎn)品)各I管；檢測(cè)抗體的標(biāo)記酶為堿性磷酸酶；(3)抗體稀釋緩沖液抗體稀釋液為含0. 2% BSA和0. 05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液(pH = 7. 2 7. 4)，I 瓶；(4)洗滌液含0. 05 %吐溫-20的磷酸鹽緩沖液(pH = 7. 2 7. 4)，I瓶；(5)顯色底物5_溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽、四唑硝基藍(lán)(BCIP/NBT)和I X堿性磷酸酶反應(yīng)緩沖液，I套(購(gòu)自天根生化試劑有限公司)；實(shí)施例3利用抗體芯片檢測(cè)單病原將10種病原的陽(yáng)性對(duì)照液，分別以無(wú)菌PBS稀釋?zhuān)渲瓶贵w芯片的測(cè)試樣品液。以 抗體芯片檢測(cè)I)樣品雜交將配好的測(cè)試樣品，分別與制備好的抗體芯片于室溫下，振蕩(30r/min)孵育雜交2. 5h ；2)洗滌:以 PBST(0. 01mol/L PBS+0. 05% Tween 20)振蕩(80r/min)洗滌三次，每次 Imin ；3)檢測(cè)抗體孵育以含0. 2% BSA的PBST稀釋200倍稀釋檢測(cè)抗體，配制同時(shí)含10種病原的特異性檢測(cè)抗體混合液，加于芯片表面繼續(xù)振蕩反應(yīng)I. 5h ；4)顯色芯片經(jīng)洗滌后，將20 X的5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽、20 X四唑硝基藍(lán)(BCIP、NBT)和IX堿性磷酸酶反應(yīng)緩沖液按I : I : 20的比例配制顯色體系，加于芯片表面室溫平緩搖動(dòng)反應(yīng)20min，反應(yīng)完畢后，將芯片浸入水中終止反應(yīng)，并將芯片晾干保存結(jié)果。單獨(dú)檢測(cè)上述10種病原的結(jié)果如圖2所示。I 10分別為單獨(dú)檢測(cè)Cmm、CMV、 印]\^、了4￥、了81^、1'0]\^、1'01 ￥、了1 ￥、了1^和TSWV的陽(yáng)性結(jié)果。結(jié)果顯示，抗體芯片具有良好的單病原檢測(cè)能力。實(shí)施例4利用抗體芯片同時(shí)檢測(cè)多個(gè)病原項(xiàng)目取10種病原的陽(yáng)性對(duì)照液，以無(wú)菌PBS稀釋后，隨機(jī)混合模擬同時(shí)感染多種病原的植物樣品液。以ELISA法，對(duì)各模擬感染的植物樣品進(jìn)行上述10個(gè)病原項(xiàng)目的篩選。同時(shí)以抗體芯片檢測(cè)I)樣品雜交將配好的測(cè)試樣品，分別與制備好的抗體芯片于室溫下，振蕩(30r/min)孵育雜交2. 5h ；2)洗滌:以 PBST(0. 01mol/L PBS+0. 05% Tween 20)振蕩(80r/min)洗滌三次，每次 Imin ；3)檢測(cè)抗體孵育以含0. 2% BSA的PBST稀釋200倍稀釋檢測(cè)抗體，配制同時(shí)含10種病原的特異性檢測(cè)抗體混合液，加于芯片表面繼續(xù)振蕩反應(yīng)I. 5h ；4)顯色芯片經(jīng)洗滌后，將20 X的5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽、20 X四唑硝基藍(lán)(BCIP、NBT)和IX堿性磷酸酶反應(yīng)緩沖液按I : I : 20的比例配制顯色體系，加于芯片表面室溫平緩搖動(dòng)反應(yīng)20min，反應(yīng)完畢后，將芯片浸入水中終止反應(yīng)，并將芯片晾干保存結(jié)果。檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，A為同時(shí)檢測(cè)除TBRV外的9種病原；B為同時(shí)檢測(cè)10種病原。說(shuō)明本發(fā)明的抗體片具有同時(shí)檢測(cè)上述10種病原的能力。以抗體芯片對(duì)12份模擬感染的樣品累計(jì)共篩選出52項(xiàng)感染，這與ELISA法的檢測(cè)結(jié)果基本一致。實(shí)施例5抗體芯片檢測(cè)實(shí)際種子樣品的應(yīng)用收集24份種子樣品，隨機(jī)抽取12份，分別加入1-4種上述10種病原的陽(yáng)性對(duì)照液，因加入的陽(yáng)性對(duì)照液均由帶病的植物葉片研磨配制而成，故此處認(rèn)為24份樣品中至少有12份為同時(shí)感染兩種病原以上的植物樣品。以ELISA法對(duì)24份樣品分別進(jìn)行10個(gè)病原項(xiàng)目的檢測(cè)，并同時(shí)以抗體芯片檢測(cè)，檢測(cè)步驟同實(shí)施例3。檢測(cè)結(jié)果顯示，抗體芯片不僅具有與ELISA等同的單病原檢測(cè)能力，而且還具有傳統(tǒng)方法所不具有的一次實(shí)驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)多個(gè)病原項(xiàng)目的能力。實(shí)施例2 5中，檢測(cè)抗體的標(biāo)記物可選用辣根過(guò)氧化物酶或生物素，并用相應(yīng)的 顯色底物及染料，結(jié)果相同。實(shí)施例I中的硝酸纖維素膜可用聚偏氟乙烯膜、玻璃基片、硝酸纖維素涂層的玻璃基片或聚偏氟乙烯涂層的玻璃基片代替，效果相同。
權(quán)利要求
1.一種可視化快速聯(lián)檢植物病原的方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)將檢測(cè)樣品與抗體芯片雜交孵育I 5hr;所述的抗體芯片包括固定在基膜上的植物病原捕獲抗體； (2)洗滌后再加入相應(yīng)的植物病原檢測(cè)抗體雜交孵育,繼續(xù)反應(yīng)I 5hr; (3)洗滌后顯色； 所述的植物病原捕獲抗體為番茄細(xì)菌性潰瘍病菌、黃瓜花葉病毒、鳳果花葉病毒、番茄不孕病毒、番茄黑環(huán)病毒、番茄花葉病毒、番茄環(huán)斑病毒、煙草環(huán)斑病毒、煙草脆裂病毒和番茄斑萎病毒捕獲抗體中的至少一種。
2.權(quán)利要求I所述可視化快速聯(lián)檢植物病原的方法，其特征在于，所述檢測(cè)抗體的標(biāo)記物為堿性磷酸酶、辣根過(guò)氧化物酶或生物素。
3.權(quán)利要求I或2所述可視化快速聯(lián)檢植物病原的方法，其特征在于，檢測(cè)抗體的標(biāo)記物為堿性磷酸酶時(shí)，顯色底物為5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽和四唑硝基藍(lán)；標(biāo)記物為辣根過(guò)氧化物酶時(shí)，顯色底物為二氨基聯(lián)苯胺；標(biāo)記物為生物素時(shí)先加入親和素-納米金，再用銀染色。
4.權(quán)利要求I所述可視化快速聯(lián)檢植物病原的方法，其特征在于，以IgG為質(zhì)控對(duì)照。
5.權(quán)利要求I所述可視化快速聯(lián)檢植物病原的方法，其特征在于，用pH= 7. 2 7. 4、吐溫-20質(zhì)量含量0. 01 % 0. I %的磷酸鹽緩沖液洗滌。
6.權(quán)利要求I所述可視化快速聯(lián)檢植物病原的方法，其特征在于，用pH= 7. 2 7. 4、吐溫-20質(zhì)量含量0. 01 % 0. I %、BSA質(zhì)量含量0. I % 0. 5 %的磷酸鹽緩沖液稀釋檢測(cè)抗體。
7.—種可視化快速聯(lián)檢植物病原的方法的抗體芯片，其特征在于，包括基膜及點(diǎn)布在基膜上的茄科植物病原捕獲抗體，所述的茄科植物病原捕獲抗體分別為番茄細(xì)菌性潰瘍病菌、黃瓜花葉病毒、鳳果花葉病毒、番茄不孕病毒、番茄黑環(huán)病毒、番茄花葉病毒、番茄環(huán)斑病毒、煙草環(huán)斑病毒、煙草脆裂病毒和番茄斑萎病毒捕獲抗體中的至少一種。
8.權(quán)利要求7所述可視化快速聯(lián)檢植物病原的方法的抗體芯片，其特征在于，所述的基膜為硝酸纖維素膜、聚偏氟乙烯膜、玻璃基片、硝酸纖維素涂層的玻璃基片或聚偏氟乙烯涂層的玻璃基片。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種可視化快速聯(lián)檢植物病原的方法和抗體芯片，將植物病原捕獲抗體點(diǎn)布在基膜上得到抗體芯片；將檢測(cè)樣品與抗體芯片雜交孵育，洗滌后再加入相應(yīng)的植物病原檢測(cè)抗體，繼續(xù)反應(yīng)，洗滌后顯色。本發(fā)明具有與ELISA等方法同等的靈敏度、特異性、重復(fù)性，還有傳統(tǒng)方法不具備的一次實(shí)驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)多種病原能力。
文檔編號(hào)G01N33/569GK102735836SQ20111008252
公開(kāi)日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2011年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月1日
發(fā)明者劉箐, 熊亮斌 申請(qǐng)人:上海慧耘生物科技有限公司