專利名稱：激光鑷子及微流控對腫瘤微粒體的檢測法及檢測器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對腫瘤微粒體的檢測方法及檢測設(shè)備，尤其涉及一種激光鑷子及微流控對腫瘤微粒體的檢測法及檢測器。
背景技術(shù)：
近幾十年以來，腫瘤發(fā)病率逐年升高，且死亡率居高不下，已成為生命的頭號殺手。肺癌和乳癌的發(fā)病率和病死率在中國和世界上分居首位。目前對腫瘤最棘手問題是如何及早發(fā)現(xiàn)并及時進行規(guī)范治療。儀器檢查如核茲共振、CT及病理切片檢查只能針對比較晚期的患者而且對機體帶來創(chuàng)傷。生化方法如ELISA 法等由于其不穩(wěn)定，敏感性不夠高的原因，這些方法并不適用于腫瘤的早期診斷。腫瘤細胞能產(chǎn)生特異腫瘤微粒體。由細胞內(nèi)的多胞體與細胞膜融合分泌出來，因此帶有雙脂層和很多膜蛋白。它能幫助腫瘤細胞與周圍組織進行交流，從而有利腫瘤細胞的生長和擴散。與腫瘤侵襲性密切相關(guān)。腫瘤微粒體常常含有腫瘤生物標(biāo)志蛋白，因此能成為激光微流控技術(shù)的特異靶物。本發(fā)明結(jié)合激光鑷子與微流控技術(shù)，可以檢測到單個腫瘤微粒體顆粒，與現(xiàn)有檢測技術(shù)相比較，具有高特異性、操作簡單、檢測時間短、靈敏度高、重復(fù)性好、血樣可再檢測等特點，是腫瘤檢測的革命性突破，它可快速、靈敏地檢測早期腫瘤。同時有助于腫瘤致病機理的研究了解，及時跟蹤病情，了解治療進程。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中不能反映腫瘤早期病變的狀況，提供了一種檢測快速、簡便，操作容易，高特異性、高靈敏度，低成本的激光鑷子及微流控對腫瘤微粒體的檢測法及檢測器。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過下述技術(shù)方案得以解決 激光鑷子及微流控對腫瘤微粒體的檢測法，包括下列步驟
步驟a 通過半導(dǎo)體泵浦固態(tài)激光發(fā)射器發(fā)射的400rniTl200nm的近紅外激光束形成不同偏振態(tài)的激光鑷子；
步驟b 用雙光束雙激光鑷子聚焦并捕獲微流控芯片管腔(6)內(nèi)的結(jié)合腫瘤微粒體抗體顆粒物；
步驟c 將經(jīng)過濾后的待測樣品(血清和其它體液)注入微流控芯片管腔(6)內(nèi)與被激光鑷子捕獲的結(jié)合腫瘤微粒體抗體顆粒物混合。步驟d 位置敏感光探測器或其它檢測相關(guān)物理參數(shù)的檢測器檢測微流控芯片管腔(6)中與樣品混合后的結(jié)合腫瘤抗體顆粒物的物理參數(shù)(包括但不局限于以下參數(shù)顆粒物形狀及大小、顆粒物密度、顆粒物折射率、顆粒物散射率、顆粒物介電常數(shù)、顆粒物阻尼系數(shù))的改變；
步驟e 根據(jù)物理參數(shù)的改變對待測樣品中的腫瘤微粒體進行定性及準(zhǔn)確定量。
作為優(yōu)選，所述的步驟b中的腫瘤微粒體抗體的制備方法包括下列步驟
步驟f 用EZ-Link NHS-PEG12-Biotin試劑盒將預(yù)先購買的腫瘤微粒體抗體進行生物素標(biāo)記；所述的EZ-Link NHS-PEG12-Biotin試劑是指可用于對普通蛋白質(zhì)包括抗體進行快速有效的生物素標(biāo)記的試劑，由美國Pierce公司(現(xiàn)為美國Thermo Scientific公司)生產(chǎn)。步驟g 將生物素標(biāo)記的腫瘤微粒體抗體聯(lián)接到有鏈霉親和素聚合物顆粒上，形成結(jié)合腫瘤微粒體抗體顆粒物。作為優(yōu)選，所述的步驟b中的結(jié)合腫瘤微粒體抗體顆粒物的大小為80nm-20um。作為優(yōu)選，所述的步驟b中的微流控芯片的制備方法包括下列步驟
步驟i 利用繪圖軟件繪制微流控芯片掩膜版圖，并使用分辨率為12000dpi的激光打印機打印，在透明膠片上制得光刻掩膜板。步驟j 將玻璃基片置分別置于丙酮、酒精中進行超聲處理，然后置于&H2S04中煮沸，用去離子水沖洗干凈，氮氣吹干，熱烘去除水汽；
步驟k 在清洗完畢的玻璃基片表面甩涂光刻膠，軟烘、曝光、顯影，獲得所需刻蝕掩膜層的圖形，置于130攝氏度的烘箱中進行硬烘；
步驟1 將硬烘后的玻璃基片置于摩爾比為HF NH4F H20為3 6 9的腐蝕液中進行刻蝕；
步驟m 將刻蝕后的玻璃基片打孔，并與另一表面甩涂紫外光學(xué)膠的玻璃基片貼合，形成封閉的微管道和腔體結(jié)構(gòu)，置于強紫外光源下照射，完成固化鍵合。作為優(yōu)選，所述的步驟d中結(jié)合腫瘤微粒體抗體顆粒物的物理參數(shù)為顆粒物形狀及大小、顆粒物密度、顆粒物折射率、顆粒物散射率、顆粒物介電常數(shù)、顆粒物阻尼系數(shù)中的任何一種。激光鑷子及微流控對腫瘤微粒體的檢測器，包括激光器系統(tǒng)、納米定位系統(tǒng)、攝像系統(tǒng)、光學(xué)部件、機械部件、數(shù)據(jù)采集和傳輸系統(tǒng)、自動控制和圖像處理應(yīng)用軟件。作為優(yōu)選，所述的激光器系統(tǒng)為二極管泵浦固態(tài)激光發(fā)射器或光纖激光發(fā)射器 (功率1至5瓦)。作為優(yōu)選，所述的攝像系統(tǒng)為IXON電子倍增電荷耦合器，納米定位系統(tǒng)為納米級可操控反光鏡。作為優(yōu)選，所述的光學(xué)部件包括法拉第隔離器、半波板、透鏡、偏振分束器及位置敏感光探測器。作為優(yōu)選，所述的機械部件包括快門、目鏡控制臺及樣本自動控制臺。本發(fā)明由于采用了以上技術(shù)方案，具有明顯的技術(shù)效果本發(fā)明檢測快速、簡便、 特異，整個檢測過程在幾分鐘內(nèi)便可完成，容易操作；檢測的靈敏度及準(zhǔn)確度非常高，最低檢出限在0. 1皮克/毫升以下；低成本，所需的樣品僅僅幾微升，整個檢測過程幾乎不對環(huán)境造成污染，具有廣闊的市場前景。


圖1為本發(fā)明實施例的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實施例方式下面結(jié)合圖1與具體實施方式
對本發(fā)明做進一步的說明。激光鑷子及微流控對腫瘤微粒體的檢測法，包括下列步驟
步驟a 通過半導(dǎo)體泵浦固態(tài)激光發(fā)射器發(fā)射的400rniTl200nm的近紅外激光束形成不同偏振態(tài)的激光鑷子；
步驟b 用雙光束雙激光鑷子聚焦并捕獲微流控芯片管腔(6)內(nèi)的結(jié)合腫瘤微粒體抗體顆粒物；
步驟c 將過濾后的待測血清注入微流控芯片管腔(6)內(nèi)與被激光鑷子捕獲的結(jié)合腫瘤微粒體抗體顆粒物混合；
步驟d 位置敏感光探測器檢測微流控芯片管腔(6)中與樣品混合后的結(jié)合腫瘤微粒體抗體顆粒物的物理參數(shù)，這些物理參數(shù)包括但不局限于以下參數(shù)顆粒物形狀及大小、顆粒物密度、顆粒物折射率、顆粒物散射率、顆粒物介電常數(shù)、顆粒物阻尼系數(shù)；這些參數(shù)可引起激光鑷子發(fā)生能量的改變，而被兩個位置敏感光探測器所反映。步驟e 根據(jù)這些物理參數(shù)的變化不同或強弱引起的激光鑷子能量的改變，經(jīng)計算機處理可定性和準(zhǔn)確定量血清腫瘤微粒體濃度。其中，結(jié)合腫瘤微粒體抗體顆粒物的制備方法包括下列步驟
步驟f 用EZ-Link NHS-PEG12-Biotin試劑盒對預(yù)先購買的腫瘤微粒體抗體進行生物素標(biāo)記；
步驟g 將生物素標(biāo)記的腫瘤微粒體抗體聯(lián)接到有鏈霉親和素聚合物顆粒上，形成結(jié)合腫瘤微粒體抗體顆粒物。微流控芯片的制備方法包括下列步驟
步驟i 利用繪圖軟件繪制微流控芯片掩膜版圖，并使用分辨率為12000dpi的激光打印機打印，在透明膠片上制得光刻掩膜板。步驟j 將玻璃基片置分別置于丙酮、酒精中進行超聲處理，然后置于濃H 2 S04中煮沸，用去離子水沖洗干凈，氮氣吹干，熱烘去除水汽；
步驟k 在清洗完畢的玻璃基片表面甩涂光刻膠，軟烘、曝光、顯影，獲得所需刻蝕掩膜層的圖形，置于130攝氏度的烘箱中進行硬烘；
步驟1 將硬烘后的玻璃基片置于摩爾比為HF NH4F H20為3 6 9的腐蝕液中進行刻蝕；
步驟m 將刻蝕后的玻璃基片打孔，并與另一表面甩涂紫外光學(xué)膠的玻璃基片貼合，形成封閉的微管道和腔體結(jié)構(gòu)，置于強紫外光源下照射，完成固化鍵合。取5微升血清注入微流控芯片，以層流狀態(tài)分別在芯片上兩通路流動。其中一路與納米級大小的結(jié)合腫瘤微粒體抗體顆粒物混合；而另一路作為對照，與非特異性的結(jié)合腫瘤微粒體抗體顆粒物混合，用攝像頭觀察混合狀況。雙光束雙激光鑷子分別檢測兩通路的混合溶液。血清中腫瘤微粒體與結(jié)合腫瘤微粒體抗體顆粒物發(fā)生聚合，使后者的形狀及大小、顆粒物密度、顆粒物折射率、顆粒物散射率、顆粒物介電常數(shù)、顆粒物阻尼系數(shù)等參數(shù)發(fā)生改變；而對照通路上的非特異性的結(jié)合腫瘤微粒體抗體顆粒物的參數(shù)不會發(fā)生任何改變。這些參數(shù)可引起激光鑷子發(fā)生能量的改變，而被兩個位置敏感光探測器所反映， 根據(jù)這些參數(shù)的變化不同或強弱引起的激光鑷子能量的改變(本實驗?zāi)芰康淖兓秶?8*10_13 30*10_13伏特"2/赫茲之間，而最低能量響應(yīng)值在6*10_13伏特"2/赫茲)，經(jīng)計算機處理可定性和準(zhǔn)確定量血清腫瘤微粒體濃度。本方法對腫瘤微粒體檢測的線性范圍在 0.5皮克/毫升 10皮克/毫升，添加回收率在92% 110%之間，最低檢出限在0. 1皮克/毫升以下。而目前ELISA法對腫瘤標(biāo)志物的檢測水平處于1納克/毫升級別。因此，本發(fā)明具有檢測快速、簡便，容易操作，高特異性，高靈敏度，低成本，樣本可重復(fù)使用等優(yōu)點。實施例2
激光鑷子及微流控對腫瘤微粒體的檢測器，如圖1所示，包括激光器系統(tǒng)1、納米定位系統(tǒng)2、攝像系統(tǒng)3、光學(xué)部件4、機械部件、數(shù)據(jù)采集和傳輸系統(tǒng)、自動控制和圖像處理應(yīng)用軟件。激光器系統(tǒng)1為二極管泵浦固態(tài)激光發(fā)射器或光纖激光發(fā)射器(功率1至5瓦)，攝像系統(tǒng)3為IXON電子倍增電荷耦合器，納米定位系統(tǒng)2為納米級可操控反光鏡，光學(xué)部件 4包括法拉第隔離器41、半波板42、43、透鏡44、偏振分束器45、46、47、48、位置敏感光探測器49、50、微流控芯片管腔6，機械部件包括快門、目鏡控制臺及樣本自動控制臺。用半導(dǎo)體泵浦激光器(diodepumped solid state, DPSS，1064 納米、4W、連續(xù)波模式產(chǎn)生的激光)做為捕獲激光。此近紅外激光束首先穿過法拉第隔離器41 (Faraday isolator)以消除正光路引起的背景反射。激光束通過一塊半波板42 (half wave plate) 轉(zhuǎn)變自身的偏振后，接著進入第一塊偏振分束器45 (polarized beam splitter, PBSl)。 產(chǎn)生的S偏振光被反射去除，同時剩余的P偏振光則通過第二塊半波板43的傳導(dǎo)重新調(diào)整光偏振。調(diào)整后的偏振光束經(jīng)透鏡44后放大，到達最終12毫米平行光束(l/e2)。經(jīng)過兩級放大和聚焦，激光束被第二塊偏振分束器46 (PBS2)分別分束成P和S偏振光。用一對置于目鏡5 (0BJ1)后聚焦共軛平面上可操縱的反射鏡控制S偏振光，產(chǎn)生的兩束光線用偏振分束器47 (PBS3)合并、傳到目鏡5 (0BJ1)后聚焦在微流控芯片管腔6內(nèi)。聚焦后的P和S偏振光分別由一相同目鏡7收集，而后根據(jù)它們各自的偏振狀況再次由偏振分束器48 (PBS4)分裂。分裂后的光束分別由位置靈敏光探測器49 (position sensitive photodector, PSPDl)和位置靈敏光探測器50 (PSPD2)實時檢測。總之，以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所作的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明專利的涵蓋范圍。
權(quán)利要求
1.激光鑷子及微流控對腫瘤微粒體的檢測法，其特征在于包括下列步驟步驟a 通過半導(dǎo)體泵浦固態(tài)激光發(fā)射器發(fā)射的400rniTl200nm的近紅外激光束形成不同偏振態(tài)的激光鑷子；步驟b 用雙光束雙激光鑷子聚焦并捕獲微流控芯片管腔(6)內(nèi)的結(jié)合腫瘤微粒體抗體顆粒物；步驟c 將過濾后的待測樣品注入微流控芯片管腔(6)內(nèi)與被激光鑷子捕獲的結(jié)合腫瘤微粒體抗體顆粒物混合；步驟d 用檢測器檢測微流控芯片管腔(6)中與待測樣品混合而引起的結(jié)合腫瘤微粒體抗體顆粒物的物理參數(shù)的改變；步驟e 根據(jù)物理參數(shù)的改變對待測樣品中的腫瘤微粒體進行定性及準(zhǔn)確定量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的激光鑷子及微流控對腫瘤微粒體的檢測法，其特征在于所述的步驟b中的結(jié)合腫瘤微粒體抗體顆粒物制備方法包括下列步驟步驟f 用EZ-Link NHS-PEG12-Biotin試劑盒對預(yù)先準(zhǔn)備的腫瘤微粒體抗體進行生物素標(biāo)記；步驟g 將經(jīng)過步驟f標(biāo)記的腫瘤微粒體抗體聯(lián)接到有鏈霉親和素聚合物顆粒上，形成結(jié)合腫瘤微粒體抗體顆粒物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的激光鑷子及微流控對腫瘤微粒體的檢測法，其特征在于所述的步驟b中的結(jié)合腫瘤微粒體抗體顆粒物的大小為80nm-20um。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的激光鑷子及微流控對腫瘤微粒體的檢測法，其特征在于所述的步驟b中的微流控芯片的制備方法包括下列步驟步驟i 利用繪圖軟件繪制微流控芯片掩膜版圖，并使用分辨率為12000dpi的激光打印機打印，在透明膠片上制得光刻掩膜板；步驟j 將玻璃基片置分別置于丙酮、酒精中進行超聲處理，然后置于濃H2SO4中煮沸， 用去離子水沖洗干凈，氮氣吹干，熱烘去除水汽；步驟k:在清洗完畢的玻璃基片表面甩涂光刻膠、軟烘、曝光、顯影，獲得所需刻蝕掩膜層的圖形，置于130攝氏度的烘箱中進硬烘；步驟1 將硬烘后的玻璃基片置于摩爾比為HF NH4F H20為3 6 9的腐蝕液中進行刻蝕；步驟m 將刻蝕后的玻璃基片打孔，并與另一表面甩涂紫外光學(xué)膠的玻璃基片貼合，形成封閉的微管道和腔體結(jié)構(gòu)，置于強紫外光源下照射，完成固化鍵合。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用激光鑷子及微流控技術(shù)對腫瘤微粒體的檢測法，其特征在于所述的步驟d中結(jié)合腫瘤微粒體抗體顆粒物的物理參數(shù)包括以下參數(shù)顆粒物形狀及大小、顆粒物密度、顆粒物折射率、顆粒物散射率、顆粒物介電常數(shù)、顆粒物阻尼系數(shù)。
6.激光鑷子及微流控對腫瘤微粒體的檢測器，其特征在于它包括激光器系統(tǒng)(1)、納米定位系統(tǒng)(2)、攝像系統(tǒng)(3)、光學(xué)部件(4)、機械部件、數(shù)據(jù)采集和傳輸系統(tǒng)、自動控制和圖像處理應(yīng)用軟件。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的激光鑷子及微流控對腫瘤微粒體的檢測器，其特征在于所述的激光器系統(tǒng)(1)為二極管泵浦固態(tài)激光發(fā)射器或光纖激光發(fā)射器。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的激光鑷子及微流控對腫瘤微粒體的檢測器，其特征在于所述的攝像系統(tǒng)(3)為IXON電子倍增電荷耦合器或CCD攝像系統(tǒng)，納米定位系統(tǒng)(2)為納米級或微米級可操控反光鏡。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的激光鑷子及微流控對腫瘤微粒體的檢測器，其特征在于所述的光學(xué)部件(4)包括法拉第隔離器(41)、半波板(42、43)、透鏡(44)、偏振分束器(45、46、 47、48 )、位置敏感光探測器(49、50 )、微流控芯片管腔(6 )。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的激光鑷子及微流控對腫瘤微粒體的檢測器，其特征在于 所述的機械部件包括快門、目鏡控制臺及樣本自動控制臺。
全文摘要
本發(fā)明涉及腫瘤微粒體的檢測方法及檢測設(shè)備，尤其涉及并公開了激光鑷子及微流控對腫瘤微粒體的檢測法及檢測器。檢測法，包括產(chǎn)生不同偏振態(tài)的激光鑷子；用雙光束雙激光鑷子聚焦并捕獲微流控芯片管腔內(nèi)結(jié)合腫瘤微粒體抗體顆粒物；將待測樣品與結(jié)合腫瘤微粒體抗體顆粒物混合；用檢測器檢測結(jié)合腫瘤微粒體抗體顆粒物與待測樣品混合前后物理參數(shù)的改變并根據(jù)此改變對待測樣品進行定性及準(zhǔn)確定量。檢測器，包括激光器系統(tǒng)、納米定位系統(tǒng)、攝像系統(tǒng)、光學(xué)部件、機械部件、數(shù)據(jù)采集和傳輸系統(tǒng)、自動控制和圖像處理應(yīng)用軟件。本發(fā)明可以檢測到單個腫瘤微粒體顆粒，具有高特異性、操作簡單、檢測時間短、靈敏度高、重復(fù)性好、血樣可再檢測等特點。
文檔編號G01N33/574GK102230934SQ20111007824
公開日2011年11月2日 申請日期2011年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月30日
發(fā)明者茅涵文, 茅涵斌, 金鋒 申請人:杭州銳光生物技術(shù)有限公司