專利名稱：檢測維生素c工業(yè)混菌發(fā)酵過程中細胞內蛋白質變化方法
技術領域：
本發(fā)明屬于工業(yè)微生物領域，涉及一種檢測維生素C工業(yè)混菌發(fā)酵中細胞內蛋白質變化的方法。
背景技術：
蛋白質是構成細胞的重要組成部分，是生理功能的調控者和執(zhí)行者，是生命現象的直接體現者，對蛋白質結構和功能的研究將直接闡明細胞在不同生長條件下的變化機制。一方面可以對其上游的基因組學信息進行驗證，另一方面又可以對其下游的代謝物研究提供指導。蛋白組學的發(fā)展，主要依托高效的蛋白分離和鑒定技術，二維凝膠電泳是目前最經典的蛋白分離方式，可以在一塊膠上分離幾百甚至上千種蛋白質，同時，質譜技術的發(fā)展使得蛋白鑒定準確度大大提高。基于二維凝膠電泳分離，MALDI-T0F/T0F鑒定蛋白技術的使用，可以從整體水平上檢測細胞在發(fā)酵過程中各種結構蛋白以及功能蛋白的變化水平。維生素C的工業(yè)混菌發(fā)酵是由巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌共同作用完成發(fā)酵的，其內在調控機理尚不明確，這就使優(yōu)化工業(yè)生產過程變得困難，也增加了生產中控制發(fā)酵過程的難度。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是通過高通量的蛋白組學的手段來了解維生素C混菌發(fā)酵過程中的蛋白質變化規(guī)律，進一步揭示兩種菌在發(fā)酵過程中的相互關系，從而彌補現有混菌發(fā)酵過程難于控制的不足，提供一種檢測維生素C工業(yè)混菌發(fā)酵過程中細胞內蛋白質變化方法。本發(fā)明的技術方案概述如下一種檢測維生素C工業(yè)混菌發(fā)酵過程中細胞內蛋白質變化方法，其特征是包括如下步驟(1)對維生素C發(fā)酵過程中所用的巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)和氧化葡糖桿菌(GluconcAacter oxydans)細胞內的蛋白質進行測定①細胞收集及淬滅將所述巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌進行發(fā)酵，在發(fā)酵過程中選3-5個時間點， 所述時間點位于所述發(fā)酵過程的前期、中期和后期，在所述時間點快速取出發(fā)酵液樣品，離心，收集下層的細胞，并用磷酸鹽緩沖液清洗，立即用液氮淬滅，終止代謝反應；用液氮研磨用于破碎細胞，獲得3-5份破碎細胞；②提取細胞內蛋白取步驟①獲得的3-5份破碎細胞100 200mg分別置于離心管中，加入0. 5 2ml 細胞裂解液，混勻，冰上間歇超聲破碎20 50s ；加入5 15 μ L的質量比為2 4 1的 DNase I/RNaseA酶混合溶液，混勻，4°C靜置反應10 30min ；加入5 15 μ L 80 120mM 的苯甲基磺酰氟異丙醇溶液，4°C靜置1 汕；15000rpm離心25 40min ；取上清，加4 6倍體積的_20°C _40°C的丙酮，沉淀12 20h ；離心，棄上清，沉淀用_20°C _40°C的體積濃度為70% -85%的丙酮水溶液洗滌；冷凍干燥備用；③蛋白濃度測定將牛血清蛋白由低濃度到高濃度加入考馬斯亮藍G-250溶液中，測定蛋白在 595nm處的吸光值，建立標準曲線；將步驟②獲得的蛋白分別溶于300 μ L溶脹液中，測定蛋白濃度；并分別按500 1000 μ g分裝，_80°C貯存，所述溶脹液為8mol -L-I尿素，質量濃度為2%的CHAPS，體積百分濃度為0. 5%的IPG buffer，余量為水；④一維等電聚焦電泳采用膠內泡脹上樣法，將步驟③獲得的各個500 1000 μ g蛋白樣品溶液用溶脹液補齊至350 μ L，加入1. 0 1. 5mg 二硫蘇糖醇，均勻鋪于膠槽內，放入IPG干膠條，覆蓋一層礦物油，蓋上膠槽蓋，進行一維等電聚焦電泳；用平衡液I平衡10 20min、平衡液II 平衡10 20min ；所述平衡液I的組成為50mmol 'L-IpH為8. 8的iTris-HCl,質量濃度為 2%的SDS，質量濃度為 2%的二硫蘇糖醇，6mol · L-I尿素，體積濃度為20 40%的甘油，痕量的溴酚藍，余量為水；所述平衡液II的組成為50mmol · L-IpH為8. 8的Tris-HCl，質量濃度為2%的 SDS，質量濃度為2% 3%的碘乙酰胺，6mol · L-I尿素，體積濃度為20 40%的甘油，痕量的溴酚藍，余量為水；⑤SDS-PAGE 電泳配制SDS-PAGE溶液質量濃度為11% 15%的聚丙烯酰胺，3. 75M*L_lpH為8. 8 的Tris-HCl，質量濃度為1%。的SDS，質量濃度為0. 2%。 0. 3%。的過硫酸銨，體積濃度為 0. 5%。 1. 5%。的N，N，N’，N’ -四甲基乙二胺，余量為水；待膠凝后得到凝膠，將步驟④獲得的平衡后的膠條放入凝膠上端，放入HkD IlOkD蛋白marker，加入4 5ml質量濃度為 0.9% 1.5%的低熔點瓊脂糖水溶液，待膠凝后，將其放入垂直電泳槽中，在80 100V恒壓下進行第二維電泳，直到溴酚藍到達膠的前沿時停止；⑥圖像分析將步驟⑤獲得的凝膠染色，用掃描儀投射掃描，將得到的圖像用ImageMaster軟件進行分析，得到蛋白相對含量的數據，找出明顯的差異蛋白；⑦差異表達蛋白鑒定將差異蛋白在37°C，用胰蛋白酶膠內酶切，通過質譜MALDI-T0F-T0F，測定差異蛋白；(2)聚類分析采用Expanderi 0對步驟(1)⑥中得到的數據進行標準化后，進行K-means聚類， 得到具有不同變化規(guī)律的數據類別，獲得候選差異蛋白；(3)過程分析將步驟( 獲得的候選差異蛋白含量按照時間序列制成圖表，觀察并分析這些蛋白變化的規(guī)律，進而發(fā)現其在維生素C工業(yè)混菌發(fā)酵過程中的作用。利用本發(fā)明的方法可以從整體上研究維生素C工業(yè)混菌發(fā)酵過程中，細胞內蛋白變化規(guī)律，找到發(fā)酵過程中的重要蛋白，這些蛋白含量的變化規(guī)律為了解發(fā)酵過程的內在機理提供依據，從而為進一步優(yōu)化發(fā)酵過程，提高維生素C產量，降低環(huán)境污染提供理論基礎。同時也為其他混菌發(fā)酵過程的研究提供新的思路和方法。


圖1為維生素C發(fā)酵過程中不同時間點SDS-PAGE膠圖；圖2為巨大芽孢桿菌胞內與芽孢形成相關蛋白含量在發(fā)酵過程中的變化趨勢；圖3為維生素C混菌發(fā)酵過程中蛋白聚類分析；圖4為氧化葡糖桿菌胞內與生長及產酸相關蛋白含量在發(fā)酵過程中的變化趨勢；圖5為維生素C混菌發(fā)酵過程嘌呤代謝中相關蛋白含量變化趨勢。
具體實施例方式下面的實施例可以使本領域技術人員更全面的理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明本發(fā)明所用的細胞裂解液7mol · L-I尿素，2mol · L-I硫尿，質量濃度為的4% CHAPS,40mmol · L-lTris，余量為水。實施例1一種檢測維生素C工業(yè)混菌發(fā)酵過程中細胞內蛋白質變化方法，包括如下步驟(1)對維生素C發(fā)酵過程中所用的巨大芽孢桿菌(Bacillus me gat erium) CGMCC No 1. 459和氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans)CGMCC No 1. 110細胞內的蛋白質進行測定①細胞收集及淬滅將所述巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌進行發(fā)酵，在發(fā)酵過程中選3-5個時間點， 所述時間點位于所述發(fā)酵過程的前期、中期和后期，在所述時間點快速取出發(fā)酵液樣品，離心，收集下層的細胞，并用磷酸鹽緩沖液清洗，立即用液氮淬滅，終止代謝反應；用液氮研磨用于破碎細胞，獲得5份破碎細胞；②提取細胞內蛋白取步驟①獲得的3-5份破碎細胞100 200mg分別置于離心管中，加入0. 5 2ml 細胞裂解液，混勻，冰上間歇超聲破碎20 50s ；加入5 15 μ L的質量比為2 4 1的 DNase I/RNaseA酶混合溶液，混勻，4°C靜置反應10 30min ；加入5 15 μ L 80 120mM 的苯甲基磺酰氟異丙醇溶液，4°C靜置1 汕；15000rpm離心25 40min ；取上清，加4 6倍體積的_20°C _40°C的丙酮，沉淀12 20h ；離心，棄上清，沉淀用_20°C _40°C的體積濃度為70% -85%的丙酮水溶液洗滌；冷凍干燥備用；③蛋白濃度測定將牛血清蛋白由低濃度到高濃度加入考馬斯亮藍G-250溶液中，測定蛋白在 595nm處的吸光值，建立標準曲線；將步驟②獲得的蛋白分別溶于300 μ L溶脹液中，測定蛋白濃度；并分別按1000 μ g分裝，-80°C貯存，所述溶脹液為8mol · L-I尿素，質量濃度為 2%的CHAPS，體積百分濃度為0. 5%的IPG buffer，余量為水；④一維等電聚焦電泳采用膠內泡脹上樣法，將步驟③獲得的各個1000 μ g蛋白樣品溶液用溶脹液補齊至350 μ L，加入1. 25mg 二硫蘇糖醇，均勻鋪于膠槽內，放入IPG干膠條，覆蓋一層礦物油，蓋上膠槽蓋，進行一維等電聚焦電泳；用平衡液I平衡15min、平衡液II平衡15min ；所述平衡液I的組成為50mmol · L-IpH為8. 8的Tris-HCl，質量濃度為2 %的 SDS，質量濃度為2%的二硫蘇糖醇，6mol · L-I尿素，體積濃度為30%的甘油，痕量的溴酚藍，余量為水；所述平衡液II的組成為50mmol · L-IpH為8. 8的Tris-HCl，質量濃度為2%的 SDS，質量濃度為3%的碘乙酰胺，6mol · L-I尿素，體積濃度為30%的甘油，痕量的溴酚藍， 余量為水；⑤SDS-PAGE 電泳配制SDS-PAGE溶液質量濃度為13 %的聚丙烯酰胺，3. 75M · L-IpH為8. 8的 Tris-HCl，質量濃度為1%。的SDS，質量濃度為0. 3%。的過硫酸銨，體積濃度為1. 0%。的N，N， N’，N’ -四甲基乙二胺，余量為水；待膠凝后得到凝膠，將步驟④獲得的平衡后的膠條放入凝膠上端，放入14kD IlOkD蛋白marker，加入5ml質量濃度為1. 0%的低熔點瓊脂糖水溶液，待膠凝后，將其放入垂直電泳槽中，在90V恒壓下進行第二維電泳，直到溴酚藍到達膠的前沿時停止；⑥圖像分析將步驟⑤獲得的凝膠染色，用掃描儀投射掃描，將得到的圖像用ImageMaster軟件進行分析，得到蛋白相對含量的數據，找出明顯的差異蛋白；⑦差異表達蛋白鑒定將差異蛋白在37°C，用胰蛋白酶膠內酶切，通過質譜MALDI-T0F-T0F，測定差異蛋白；(2)聚類分析采用Expanderi 0對步驟(1)⑥中得到的數據進行標準化后，進行K-means聚類， 得到具有不同變化規(guī)律的數據類別，獲得候選差異蛋白；(3)過程分析將步驟( 獲得的候選差異蛋白含量按照時間序列制成圖表，觀察并分析這些蛋白變化的規(guī)律，進而發(fā)現其在維生素C工業(yè)混菌發(fā)酵過程中的作用。在維生素C工業(yè)混菌發(fā)酵過程中，兩種菌胞內鑒定到的蛋白分別如表1. 1及表1. 2 所示。表1. 1巨大芽孢桿菌胞內蛋白
權利要求
1. 一種檢測維生素C工業(yè)混菌發(fā)酵過程中細胞內蛋白質變化方法，其特征是包括如下步驟(1)對維生素C發(fā)酵過程中所用的巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)和氧化葡糖桿菌(GluconcAacter oxydans)細胞內的蛋白質進行測定①細胞收集及淬滅將所述巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌進行發(fā)酵，在發(fā)酵過程中選3-5個時間點，所述時間點位于所述發(fā)酵過程的前期、中期和后期，在所述時間點快速取出發(fā)酵液樣品，離心， 收集下層的細胞，并用磷酸鹽緩沖液清洗，立即用液氮淬滅，終止代謝反應；用液氮研磨用于破碎細胞，獲得3-5份破碎細胞；②提取細胞內蛋白取步驟①獲得的3-5份破碎細胞100 200mg分別置于離心管中，加入0. 5 2ml細胞裂解液，混勻，冰上間歇超聲破碎20 50s;加入5 15μ L的質量比為2 4 1的 DNase I/RNaseA酶混合溶液，混勻，4°C靜置反應10 30min ；加入5 15 μ L 80 120mM 的苯甲基磺酰氟異丙醇溶液，4°C靜置1 汕；15000rpm離心25 40min ；取上清，加4 6倍體積的_20°C _40°C的丙酮，沉淀12 20h ；離心，棄上清，沉淀用_20°C _40°C的體積濃度為70% -85%的丙酮水溶液洗滌；冷凍干燥備用；③蛋白濃度測定將牛血清蛋白由低濃度到高濃度加入考馬斯亮藍G-250溶液中，測定蛋白在595nm處的吸光值，建立標準曲線；將步驟②獲得的蛋白分別溶于300μ L溶脹液中，測定蛋白濃度； 并分別按500 1000 μ g分裝，-80°C貯存，所述溶脹液為8mol -L-I尿素，質量濃度為2% 的CHAPS，體積百分濃度為0. 5%的IPG buffer，余量為水；④一維等電聚焦電泳采用膠內泡脹上樣法，將步驟③獲得的各個500 IOOOyg蛋白樣品溶液用溶脹液補齊至350 μ L，加入1. 0 1. 5mg 二硫蘇糖醇，均勻鋪于膠槽內，放入IPG干膠條，覆蓋一層礦物油，蓋上膠槽蓋，進行一維等電聚焦電泳；用平衡液I平衡10 20min、平衡液II平衡 10 20min ；所述平衡液I的組成為50mmol -L-IpH為8. 8的Tris-HCl，質量濃度為2%的SDS，質量濃度為 2%的二硫蘇糖醇，6mol · L-I尿素，體積濃度為20 40%的甘油，痕量的溴酚藍，余量為水；所述平衡液II的組成為50mmol · L-IpH為8. 8的Tris-HCl，質量濃度為2%的SDS， 質量濃度為2% 3%的碘乙酰胺，6mol · L-I尿素，體積濃度為20 40%的甘油，痕量的溴酚藍，余量為水；⑤SDS-PAGE電泳配制SDS-PAGE溶液質量濃度為11 % 15 %的聚丙烯酰胺，3. 75M · L-IpH為8. 8 的Tris-HCl，質量濃度為1%。的SDS，質量濃度為0. 2%。 0. 3%。的過硫酸銨，體積濃度為 0. 5%。 1. 5%。的N，N，N’，N’ -四甲基乙二胺，余量為水；待膠凝后得到凝膠，將步驟④獲得的平衡后的膠條放入凝膠上端，放入HkD IlOkD蛋白marker，加入4 5ml質量濃度為 0.9% 1.5%的低熔點瓊脂糖水溶液，待膠凝后，將其放入垂直電泳槽中，在80 100V恒壓下進行第二維電泳，直到溴酚藍到達膠的前沿時停止；⑥圖像分析將步驟⑤獲得的凝膠染色，用掃描儀投射掃描，將得到的圖像用ImageMaster軟件進行分析，得到蛋白相對含量的數據，找出明顯的差異蛋白；⑦差異表達蛋白鑒定將差異蛋白在37°C，用胰蛋白酶膠內酶切，通過質譜MALDI-T0F-T0F，測定差異蛋白；(2)聚類分析采用Expanderf.O對步驟(1)⑥中得到的數據進行標準化后，進行K-means聚類，得到具有不同變化規(guī)律的數據類別，獲得候選差異蛋白；(3)過程分析將步驟( 獲得的候選差異蛋白含量按照時間序列制成圖表，觀察并分析這些蛋白變化的規(guī)律，進而發(fā)現其在維生素C工業(yè)混菌發(fā)酵過程中的作用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測維生素C工業(yè)混菌發(fā)酵過程中細胞內蛋白質變化方法，包括如下步驟(1)對維生素C發(fā)酵過程中所用的巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)和氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans)細胞內的蛋白質進行測定(2)聚類分析；(3)過程分析，利用本發(fā)明的方法可以從整體上研究維生素C工業(yè)混菌發(fā)酵過程中，細胞內蛋白變化規(guī)律，找到發(fā)酵過程中的重要蛋白，這些蛋白含量的變化規(guī)律為了解發(fā)酵過程的內在機理提供依據，從而為進一步優(yōu)化發(fā)酵過程，提高維生素C產量，降低環(huán)境污染提供理論基礎。同時也為其他混菌發(fā)酵過程的研究提供新的思路和方法。
文檔編號G01N1/38GK102175635SQ20111006505
公開日2011年9月7日 申請日期2011年3月17日 優(yōu)先權日2011年3月17日
發(fā)明者元英進, 米造吉, 謝萍, 馬倩 申請人:天津大學, 河北維爾康制藥有限公司