專利名稱：：用于檢測(cè)腎小管細(xì)胞損傷的早發(fā)的方法和試劑盒的制作方法用于檢測(cè)腎小管細(xì)胞損傷的早發(fā)的方法和試劑盒本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2004年3月26日、中國(guó)申請(qǐng)?zhí)枮?00480013336.6(國(guó)際申請(qǐng)?zhí)枮镻CT/US2004/009191)、發(fā)明名稱為“用于檢測(cè)腎小管細(xì)胞損傷的早發(fā)的方法和試劑盒”的發(fā)明申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
背景技術(shù)：
：繼發(fā)于腎小管細(xì)胞損傷(包括缺血性損傷或腎毒性損傷)的急性腎功能衰竭(Acuterenalfailure)(ARF)，盡管在支持療法中取得重大的進(jìn)展，仍是臨床醫(yī)學(xué)和腎病學(xué)(nephrology)中的普遍而具有潛在破壞性的難題，其具有持續(xù)的高死亡率和高發(fā)病率。幾十年來的前期研究已經(jīng)說明持續(xù)的血管收縮、腎小管阻塞、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和代謝改變和炎癥反應(yīng)在ARF發(fā)病機(jī)理中的作用。雖然這些研究已經(jīng)在動(dòng)物模型中顯出可能的治療手段，但是到人體中平移研究的努力卻產(chǎn)生令人失望的結(jié)果。其原因可包括腎對(duì)于缺血性損傷和腎毒素的多方面的反應(yīng)，和ARF早期生物標(biāo)記物的缺乏，造成遲誤開始治療。當(dāng)患者的血清肌酸酐(creatinine)值或者(1)當(dāng)基線血清肌酸酐水平小于2.Omg/dL時(shí)，增加至少0.5mg/dL；⑵當(dāng)基線血清肌酸酐水平大于或等于2.Omg/dL時(shí)，增加至少1.5mg/dL;或(3)不管基線血清肌酸酐水平為何，作為暴露于放射成像劑(radiographicagent)的結(jié)果增加至少0.5mg/dL時(shí)，即認(rèn)為個(gè)體患有急性腎功能衰竭。人們相信，在所述的疾病過程中治療的早期介入會(huì)降低與ARF有關(guān)的死亡率并縮短各種類型的腎小管細(xì)胞損傷的治療時(shí)間，所述的腎小管細(xì)胞損傷包括但不限于缺血性和腎毒性腎損傷。腎小管細(xì)胞損傷的可靠的早期生物標(biāo)記物的鑒定對(duì)于促進(jìn)早期治療干預(yù)是有用的，并通過提供腎毒性的指標(biāo)有助于指導(dǎo)藥物開發(fā)。檢測(cè)腎病的傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室方法包括測(cè)定血清肌酸酐、血液尿素氮、肌酸酐清除率、尿電解質(zhì)、尿沉淀物的顯微鏡檢查及放射學(xué)研究。這些指標(biāo)既沒有敏感性和特異性，又不能用于該疾病的早期檢測(cè)。實(shí)際上，雖然血清肌酸酐的升高被普遍地認(rèn)為是檢測(cè)ARF的“黃金標(biāo)準(zhǔn)(goldstandard)”，但是很顯然，在血清肌酸酐變化的時(shí)間內(nèi)，腎功能已經(jīng)喪失50%之^^ο較早已經(jīng)描述了少數(shù)缺血性腎損傷的尿生物標(biāo)記物，包括腎損傷分子-I(KIM-I)和半胱氨酸富含蛋白61(Cyr61)。KIM-I是一個(gè)涉及腎再生的假定的粘附分子。在缺血-再灌注損傷的大鼠模型中，發(fā)現(xiàn)KIM-I在初始損傷后的M-48小時(shí)上調(diào)，使其成為可靠但有些晚期的標(biāo)記物。近期研究已經(jīng)顯示，KIM-I可在腎活組織檢查中和患有缺血性急性腎小管壞死的患者的尿中檢測(cè)到。然而，這種檢測(cè)在已形成確定的缺血性腎損傷的患者中、在該疾病的晚期也已證明。測(cè)定尿KIM-I用于檢測(cè)早期ARF或臨床癥狀不明顯的腎損傷的效用還遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有得到驗(yàn)證。發(fā)現(xiàn)所述的蛋白Cyr61為分泌的富含半胱氨酸的蛋白，其可以在缺血性腎損傷后3-6小時(shí)的動(dòng)物模型的尿中檢測(cè)到。然而，此檢測(cè)需要生物親和純化和應(yīng)用肝素-瓊脂糖珠的濃縮步驟，然后是Western印跡步驟。即使在生物親和純化之后，幾種非特異性的交叉反應(yīng)肽是明顯的。因此，就特異性以及所述步驟的繁冗特性而言，尿中Cyr61的檢測(cè)是有問題的。因此，鑒定改進(jìn)的用于早期缺血性和腎毒性腎損傷的生物標(biāo)記物仍然有緊迫的需要。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及在哺乳動(dòng)物中檢測(cè)腎小管細(xì)胞損傷的方法，包括以下步驟1)從哺乳動(dòng)物實(shí)驗(yàn)體得到尿樣；幻將尿樣與腎小管細(xì)胞損傷生物標(biāo)記物的抗體接觸，所述的腎小管細(xì)胞損傷生物標(biāo)記物包含NGAL，以允許形成抗體和腎小管細(xì)胞損傷生物標(biāo)記物的復(fù)合物；和3)檢測(cè)所述的抗體-生物標(biāo)記物復(fù)合物。本發(fā)明涉及監(jiān)測(cè)治療腎小管細(xì)胞損傷的有效性的方法，包括以下步驟1)提供對(duì)于正遭受腎小管細(xì)胞損傷的哺乳動(dòng)物實(shí)驗(yàn)體的治療；2)得到至少一種來自所述實(shí)驗(yàn)體的治療后的尿樣；和幻在治療后的尿樣中檢測(cè)腎小管細(xì)胞損傷的生物標(biāo)記物的存在。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于在實(shí)驗(yàn)體的尿液中檢測(cè)腎小管細(xì)胞損傷的立即或早期發(fā)病生物標(biāo)記物的存在的試劑盒，包括1)用于獲得一定量尿樣的方法；幻一種介質(zhì)，其具有附加于其上的能夠與腎小管細(xì)胞損傷的生物標(biāo)記物復(fù)合的捕獲抗體(captureantibody),所述的生物標(biāo)記物為NGAL；和3)檢測(cè)腎小管損傷生物標(biāo)記物和捕獲抗體的復(fù)合物的測(cè)定法。本發(fā)明也涉及一種競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)合的免疫吸附劑測(cè)定(ELISA)試劑盒，其用于測(cè)定哺乳動(dòng)物實(shí)驗(yàn)體的腎小管細(xì)胞損傷的狀態(tài)，包含對(duì)于腎小管細(xì)胞損傷生物標(biāo)記物有特異性的第一抗體，以測(cè)定其在所述實(shí)驗(yàn)體的尿樣中的存在。本發(fā)明進(jìn)一步涉及鑒定由一個(gè)事件引起的腎小管細(xì)胞損傷的程度的方法，包括步驟為1)得到至少一種來自所述哺乳動(dòng)物實(shí)驗(yàn)體的尿樣；幻在所述的尿樣中檢測(cè)腎小管細(xì)胞損傷的生物標(biāo)記物的存在。；3)相對(duì)于所述事件的時(shí)間，根據(jù)尿樣中IRI生物標(biāo)記物的存在的發(fā)生時(shí)間，確定腎小管細(xì)胞損傷的程度。本發(fā)明進(jìn)一步涉及檢測(cè)哺乳動(dòng)物中腎小管細(xì)胞損傷的方法，包括以下步驟1)得到含有多至1毫升的來自懷疑有腎小管細(xì)胞損傷的哺乳動(dòng)物實(shí)驗(yàn)體的第一次尿的尿樣；2)將所述的尿樣與腎小管細(xì)胞損傷的生物標(biāo)記物的抗體接觸，以允許形成抗體和生物標(biāo)記物的復(fù)合物；和幻檢測(cè)所述的抗體-生物標(biāo)記物復(fù)合物。優(yōu)選的腎小管細(xì)胞損傷生物標(biāo)記物為NGAL。本發(fā)明涉及下述各項(xiàng)1.用于檢測(cè)哺乳動(dòng)物中腎小管細(xì)胞損傷的方法，所述損傷包括缺血性腎損傷和腎毒性損傷，包含以下步驟1)從哺乳動(dòng)物實(shí)驗(yàn)體得到尿樣；2)將尿樣與腎小管細(xì)胞損傷生物標(biāo)記物的抗體接觸，所述的生物標(biāo)記物包含NGAL,以允許形成抗體和生物標(biāo)記物的復(fù)合物；和3)檢測(cè)所述的抗體-生物標(biāo)記物復(fù)合物。2.項(xiàng)1的方法，其中來自所述的實(shí)驗(yàn)體的尿樣的大多數(shù)是間斷地得到的。3.項(xiàng)2的方法，其中所述的尿樣是連續(xù)得到的。4.項(xiàng)1的方法，其中檢測(cè)抗體-生物標(biāo)記物復(fù)合物的步驟包括將所述的復(fù)合物與5用于檢測(cè)生物標(biāo)記物的第二抗體接觸。5.項(xiàng)1的方法，其中所述的哺乳動(dòng)物實(shí)驗(yàn)體是人類患者。6.監(jiān)測(cè)腎小管細(xì)胞損傷的治療的有效性的方法，包含以下步驟1)對(duì)正遭受腎小管細(xì)胞損傷的哺乳動(dòng)物實(shí)驗(yàn)體提供治療；2)得到至少一種來自所述實(shí)驗(yàn)體的治療后的尿樣；和3)在治療后的尿樣中檢測(cè)腎小管細(xì)胞損傷的生物標(biāo)記物的存在。7.項(xiàng)6的方法，其中所述的生物標(biāo)記物含有NGAL。8.項(xiàng)6的方法，進(jìn)一步包括得到一種或一種以上后續(xù)的治療后的尿樣的步驟，其中提供治療的步驟是連續(xù)的，直到在后續(xù)的治療后的尿樣中檢測(cè)不到所述的生物標(biāo)記物的存在。9.項(xiàng)6的方法，其中檢測(cè)的步驟包括步驟為i)將尿樣與生物標(biāo)記物的捕獲抗體接觸以允許形成抗體和生物標(biāo)記物的復(fù)合物；和ii)檢測(cè)所述的抗體-生物標(biāo)記物復(fù)合物。10.項(xiàng)9的方法，其中檢測(cè)抗體-生物標(biāo)記物復(fù)合物的步驟包括步驟為(1)將尿樣的任何未結(jié)合物質(zhì)與捕獲抗體-生物標(biāo)記物復(fù)合物分離；(2)將捕獲抗體-生物標(biāo)記物復(fù)合物與用于檢測(cè)生物標(biāo)記物的第二抗體接觸，以允許形成生物標(biāo)記物和第二抗體之間的復(fù)合物；(3)將任何未結(jié)合的第二抗體與生物標(biāo)記物-第二抗體復(fù)合物分離；和(4)檢測(cè)生物標(biāo)記物-第二抗體復(fù)合物中的第二抗體。11.項(xiàng)10的方法，其中步驟(i)包括將尿樣與具有附加于其上的第一抗體的介質(zhì)接觸的步驟。12.用于在實(shí)驗(yàn)體的尿液中檢測(cè)腎小管細(xì)胞損傷，包括缺血性腎損傷和腎毒性損傷的立即或早期發(fā)病生物標(biāo)記物的存在的試劑盒，包括1)用于獲得一定量尿樣的手段；2)具有附加于其上的捕獲抗體的介質(zhì)，所述捕獲抗體能夠與腎小管細(xì)胞損傷的生物標(biāo)記物復(fù)合，所述的生物標(biāo)記物包含NGAL；和3)用于檢測(cè)生物標(biāo)記物和捕獲抗體的復(fù)合物的測(cè)定。13.項(xiàng)12的試劑盒，其中尿樣的量小于1ml，更通常地小于10微升。14.項(xiàng)12的試劑盒，其中所述的獲得手段包括含有表面的器具，所述的表面含有所述介質(zhì)。15.項(xiàng)12的試劑盒，其中所述的獲得手段包括用于接受尿樣的容器，其中容器的尿接觸面含有所述的介質(zhì)。16.項(xiàng)12的試劑盒，其中所述的測(cè)定包含ELISA。17.項(xiàng)12的試劑盒，其中所述的獲得手段包括器具，該器具包括含有所述介質(zhì)的品.ο18.項(xiàng)12的試劑盒，其為病人身邊檢驗(yàn)試劑盒。19.項(xiàng)18的病人身邊檢驗(yàn)試劑盒，其中尿樣的量小于1ml，更通常地小于10微升。20.項(xiàng)19的病人身邊檢驗(yàn)試劑盒，其中所述的獲得手段包括含有蘸取棍的器具，該蘸取棍表面含有所述的介質(zhì)。21.項(xiàng)19的病人身邊檢驗(yàn)試劑盒，其中所述的測(cè)定包括蘸取棍比色測(cè)定。22.競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒，所述試劑盒用于測(cè)定哺乳動(dòng)物實(shí)驗(yàn)體的腎小管細(xì)胞損傷的狀態(tài)，所述損傷包括缺血性腎損傷和腎毒性損傷，所述試劑盒包含特異于NGAL以測(cè)定其在所述實(shí)驗(yàn)體的尿樣中的存在的第一抗體。23.項(xiàng)22的ELISA試劑盒，其中所述的尿樣可包含大約1毫升或1毫升以下的液量。24.鑒定由事件引起的腎小管細(xì)胞損傷，包括缺血性腎損傷和腎毒性損傷的程度的方法，包括步驟為1)得到至少一個(gè)來自所述哺乳動(dòng)物實(shí)驗(yàn)體的尿樣；2)在所述的尿樣中檢測(cè)腎小管細(xì)胞損傷的生物標(biāo)記物的存在；和3)根據(jù)尿樣中生物標(biāo)記物的存在的發(fā)生時(shí)間，相對(duì)于所述事件的時(shí)間確定腎小管細(xì)胞損傷的程度。25.項(xiàng)M的方法，其中所述的生物標(biāo)記物包含NGAL。26.項(xiàng)M的方法，其中所述的事件為手術(shù)操作。27.項(xiàng)M的方法，其中所述的事件為對(duì)腎臟供血不全、心功能受損、手術(shù)操作、在重癥監(jiān)護(hù)病房中的患者、及將藥物、放射性對(duì)照染料或其它藥劑物質(zhì)給予所述的實(shí)驗(yàn)體。28.檢測(cè)哺乳動(dòng)物中腎小管細(xì)胞損傷，包括缺血性腎損傷和腎毒性損傷的方法，包括步驟為1)得到含有多至1毫升的來自哺乳動(dòng)物實(shí)驗(yàn)體的第一次尿的尿樣；2)將所述的尿樣與腎小管細(xì)胞損傷的生物標(biāo)記物的抗體接觸，以允許形成抗體和生物標(biāo)記物的復(fù)合物；和3)檢測(cè)所述的抗體-生物標(biāo)記物復(fù)合物。29.項(xiàng)28的方法，其中所述的生物標(biāo)記物包含NGAL。圖1顯示缺血之后小鼠腎NGALmRNA的誘導(dǎo)。上圖顯示應(yīng)用小鼠肌動(dòng)蛋白和NGAL的引物進(jìn)行代表性的RT-PCR，其應(yīng)用自對(duì)照(C)小鼠的腎或在如圖所示的不同再灌注時(shí)間(小時(shí))之后提取的RNA。通道M包含分子量標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記物。下圖顯示來自對(duì)照物(CON)在不同時(shí)間點(diǎn)NGALmRNA表達(dá)的增加倍數(shù)。由微陣列(實(shí)線)對(duì)比RT-PCR(虛線)得到的值是來自至少3次實(shí)驗(yàn)的平均+/_標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。圖2A顯示單側(cè)缺血之后小鼠腎NGAL蛋白的誘導(dǎo)。上圖顯示應(yīng)用完整腎樣品進(jìn)行代表性的Western印跡，所述的腎樣品從對(duì)照(Con)小鼠中得到或在如圖所示的再灌注時(shí)間(小時(shí))之后得到，該Western印跡以NGAL的多克隆抗體或微管蛋白的單克隆抗體為探針進(jìn)行探測(cè)(以顯示相同的蛋白上樣量)。分子量標(biāo)記物在最左邊。下圖顯示來自對(duì)照物(CON)在不同時(shí)間點(diǎn)NGAL蛋白表達(dá)的增加的倍數(shù)。由密度測(cè)定(densitometry)得到的值是來自至少3次實(shí)驗(yàn)的平均值+/-SD。圖2B顯示雙側(cè)缺血之后小鼠腎NGAL蛋白的誘導(dǎo)。上圖顯示應(yīng)用完整腎樣品進(jìn)行代表性的Western印跡，所述的腎樣品從對(duì)照(Con)小鼠中得到或在如圖所示的再灌注時(shí)間(小時(shí))之后得到，該Western印跡以NGAL的多克隆抗體或微管蛋白的單克隆抗體作為探針進(jìn)行探測(cè)(以顯示相同的蛋白上樣量)。分子量標(biāo)記物在最左邊。下圖顯示來自對(duì)照物(CON)在不同時(shí)間點(diǎn)NGAL蛋白表達(dá)的增加的倍數(shù)。由密度測(cè)定得到的值是來自至少3次實(shí)驗(yàn)的評(píng)價(jià)+/-SD。圖3顯示缺血之后小鼠腎NGAL蛋白的誘導(dǎo)。在小鼠腎的凍結(jié)切片上得到代表性的免疫組織化學(xué)的結(jié)果，所述的凍結(jié)切片從對(duì)照小鼠中得到或在如圖所示的不同回流(reflow)時(shí)間(小時(shí))之后得到，該操作以NGAL的多克隆抗體為探針進(jìn)行探測(cè)。“G”表示腎血管球。最右邊的圖是100X放大圖，而其它圖為20X放大圖。圖4A顯示早期測(cè)定患有單側(cè)缺血性ARF的小鼠的尿中的NGAL蛋白。在單側(cè)腎動(dòng)脈鉗夾(clamping)后，在如圖所示的再灌注時(shí)間(小時(shí))得到的未處理尿樣(每個(gè)通道1-2μ1，對(duì)肌酸酐含量歸一化)的代表性的Western印跡。分子量標(biāo)記物在右邊顯示。該Wfestern印跡以NGAL(上圖)或β2-微球蛋白(Beta2_M)(中圖)作為探針進(jìn)行探測(cè)。在如圖所示的不同再灌注時(shí)間從總共五只動(dòng)物中檢測(cè)了五只動(dòng)物尿的N-乙酰-β-D-氨基葡糖苷酶(NAG)。值為平均+/-SD。在每個(gè)時(shí)間段與對(duì)照物比較*Ρ<0.05，方差分析(ANOVA)。圖4Β顯示早期測(cè)定患有雙側(cè)缺血性ARF的小鼠的尿中的NGAL蛋白。在雙側(cè)腎動(dòng)脈鉗夾后，在如圖所示的再灌注時(shí)間(小時(shí))得到的未處理尿樣(每個(gè)通道1-2μ1，對(duì)肌酸酐含量歸一化)的代表性的Western印跡。分子量標(biāo)記物在右邊顯示。該^iestern印跡以NGAL(上圖)或β2-微球蛋白(Beta2-M)(中圖)作為探針進(jìn)行探測(cè)。在如圖所示的不同再灌注時(shí)間從總共八只動(dòng)物中檢測(cè)了五只動(dòng)物尿的N-乙酰-D-氨基葡糖苷酶。值為平均值+/-SD。在每個(gè)時(shí)間段與對(duì)照物比較*Ρ<0.05，方差分析(ANOVA)。圖5顯示在患有臨床癥狀不明顯的腎缺血的小鼠的尿中測(cè)定NGAL蛋白。在雙側(cè)腎動(dòng)脈鉗夾5、10或20分鐘之后，對(duì)未處理的尿樣(每個(gè)通道1-2μ1，對(duì)肌酸酐含量歸一化)進(jìn)行代表性的Western印跡，所述未處理的尿樣是在如圖所示的再灌注時(shí)間(小時(shí))得到的。分子量標(biāo)記物顯示在左邊。這些動(dòng)物在24小時(shí)回流時(shí)顯示正常的血清肌酸酐。圖6顯示在患有缺血性ARF的大鼠的尿中測(cè)定NGAL蛋白。在大鼠雙側(cè)腎動(dòng)脈鉗夾30分鐘之后，對(duì)未處理的尿樣(每個(gè)通道1_2μ1，對(duì)肌酸酐含量歸一化)進(jìn)行代表性的Western印跡，所述未處理的尿樣是在如圖所示的再灌注時(shí)間(小時(shí))得到的。分子量標(biāo)記物顯示在左邊。這些動(dòng)物在M小時(shí)回流時(shí)顯示血清肌酸酐的顯著增加。圖7顯示缺血之后NGALmRNA的體外誘導(dǎo)。上圖顯示用人NGAL的引物進(jìn)行代表性的RT-PCR，所述RT-PCR應(yīng)用在如圖所示的部分ATP消耗的不同時(shí)間(小時(shí))之后，提取自腎近端小管上皮細(xì)胞(RPTEC)的RNA。通道M含有IOObpDNA序列梯。中圖顯示在距離對(duì)照(0)的不同時(shí)間點(diǎn)，NGALmRNA表達(dá)增加的倍數(shù)，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的表達(dá)歸一化。顯示的值是來自每個(gè)點(diǎn)的至少三次實(shí)驗(yàn)的平均值+/-SD。下圖顯示在如圖所示的部分ATP消耗的不同時(shí)間之后，用RPTEC樣品進(jìn)行(三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的)代表性的Western印跡，所述RPTEC樣品是從細(xì)胞小團(tuán)(Pel)或培養(yǎng)基(Sup)的等量細(xì)胞中獲得的，該Western印跡以NGAL的多克隆抗體作為探針進(jìn)行探測(cè)。分子量標(biāo)記物在左邊顯示。圖8A顯示在所述的尿中NGAL蛋白的早期測(cè)定在順氯氨鉬誘導(dǎo)的損傷的小鼠中進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)未處理的尿樣(每個(gè)通道1-2μ1，對(duì)肌酸酐含量歸一化)進(jìn)行代表性的Western印跡，所述的未處理的尿樣是在給予順氯氨鉬之后在如圖所示的天數(shù)獲得的，該Western印跡以β_2-微球蛋白的抗體(上圖)和NGAL(中圖)作為探針進(jìn)行探測(cè)。分子量標(biāo)記物在左邊顯示。圖8Β顯示在圖8Α中給予順氯氨鉬(n=4)之后的不同天數(shù)(n=4)的尿NAG測(cè)定。值表示平均值+/-SD。與第0天比較*Ρ<0.05。圖9顯示給予順氯氨鉬導(dǎo)致小管細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡。在經(jīng)過順氯氨鉬處理的腎中(中上圖)，蘇木紫-曙紅染色顯示腎小管擴(kuò)張、內(nèi)腔碎片和展平的上皮。在高倍下，以星號(hào)標(biāo)記的腎小管顯示濃縮的強(qiáng)烈染色的細(xì)胞核(箭頭)，顯示細(xì)胞凋亡(右上圖)。TUNEL染色在經(jīng)過順氯氨鉬處理的腎中顯示TUNEL-陽(yáng)性的細(xì)胞核(中下圖)。在高倍下，以星號(hào)指示的腎小管顯示濃縮的破碎的細(xì)胞核(箭頭)，其為細(xì)胞凋亡的特征(右下圖)。標(biāo)記為高倍的圖為100Χ放大圖，而其它為20Χ。對(duì)照小鼠的結(jié)果顯示在左上圖和左下圖中。圖10顯示給予順氯氨鉬導(dǎo)致腎NGAL的快速誘導(dǎo)的結(jié)果。將腎裂解物進(jìn)行代表性的Western印跡，所述的腎裂解物來自經(jīng)過腹膜內(nèi)順氯氨鉬(20μg/kg)處理的小鼠，并且在所示的不同時(shí)間點(diǎn)(小時(shí))得到，該Western印跡以NGAL的多克隆抗體或微管蛋白的單克隆抗體作為探針進(jìn)行探測(cè)。分子量標(biāo)記物在左邊顯示。圖11顯示順氯氨鉬給藥導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)NGAL的快速誘導(dǎo)。在凍結(jié)腎切片上進(jìn)行代表性的免疫組織化學(xué)，所述的腎凍結(jié)切片來自經(jīng)過腹膜內(nèi)的順氯氨鉬(20μg/kg)處理的小鼠，并且在所示的不同時(shí)間點(diǎn)(小時(shí))得到，該免疫組織化學(xué)以NGAL為探針檢測(cè)。G，腎小球。標(biāo)記為HP的圖為100X放大圖，而其它圖為20X放大圖。圖12顯示20μg/kg的順氯氨鉬給藥導(dǎo)致尿中的NGAL的快速出現(xiàn)。未處理的尿樣(3-5μ1/通道，對(duì)肌酸酐含量歸一化)進(jìn)行代表性的Western印跡(上圖)，所述的未處理的尿樣是在如圖所示的順氯氨鉬注射之后，在不同時(shí)間點(diǎn)之前或在不同時(shí)間點(diǎn)得到的。分析相同尿樣的NAG分泌(中圖)，并對(duì)來自相同動(dòng)物的血清進(jìn)行肌酸酐測(cè)定(下圖)。與對(duì)照物比較*P<0.05。圖13顯示5μg/kg的順氯氨鉬給藥導(dǎo)致尿中的NGAL的快速出現(xiàn)。未處理的尿樣(3-5μ1/通道，對(duì)肌酸酐含量歸一化)進(jìn)行代表性的Western印跡(上圖)，所述的未處理的尿樣是在如圖所示的順氯氨鉬注射之后，在不同時(shí)間點(diǎn)之前或在不同時(shí)間點(diǎn)得到的。分析相同尿樣的NAG分泌(中圖)，并對(duì)來自相同動(dòng)物的血清進(jìn)行肌酸酐測(cè)定(下圖)。與對(duì)照物比較*P<0.05。圖14顯示順氯氨鉬注射之后尿NGAL的定量。將已知量的純化的重組NGAL進(jìn)行考馬斯藍(lán)(CB)染色(左上圖)和增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(EnhancedChemiluminescence)(ECL)分析(右上圖)。20μg/kg或5μg/kg的順氯氨鉬給藥之后，在不同時(shí)間點(diǎn)NGAL分泌的定量，通過Wfestern印跡的密度分析和與在同樣條件下進(jìn)行的純化NGAL的確定標(biāo)準(zhǔn)的Western印跡的比較進(jìn)行測(cè)定。圖15在圖A中顯示采用尸體的腎移植體(transplant)(CAD,η=4)的患者對(duì)比采用活體親屬供者(livingrelateddonor)移植體(LRD,n=6)患者的尿NGAL的測(cè)定(ρ<0.005)。圖B顯示CAD中冷缺血時(shí)間與尿NGAL之間的相關(guān)性(ρ<0.001，r=0.98，Spearman分析)。圖C顯示CAD中血清肌酸酐峰和尿NGAL之間的相關(guān)性(ρ<0.001,r=0.96,Spearman分析)。圖16在圖A中顯示開放心臟手術(shù)后患者的尿NGAL的系列測(cè)定結(jié)果，對(duì)旁路(bypass)后的時(shí)間(小時(shí))作圖(n=15)。圖B顯示發(fā)生ARF的患者(n=5)旁路的時(shí)間與2小時(shí)尿NGAL之間的相關(guān)性(ρ<0.01，r=0.76，Spearman分析)。圖C顯示發(fā)生ARF的患者血清肌酸酐變化與2小時(shí)尿NGAL之間的相關(guān)性(ρ<0.01，r=0.66，Spearman分析)。發(fā)明詳述貫穿此申請(qǐng)，在括號(hào)內(nèi)引用了各種出版物和未出版的原稿。所述出版物整體的公開在此并入本申請(qǐng)作為參考以更充分地描述本申請(qǐng)屬于的技術(shù)的狀況。這些參考文獻(xiàn)的完整的文獻(xiàn)資料出處可在本申請(qǐng)的末尾權(quán)利要求之前找到。本發(fā)明提供了一種方法和試劑盒，所述方法和試劑盒用于在早期發(fā)生腎小管細(xì)胞損傷的實(shí)驗(yàn)體的尿中檢測(cè)腎小管細(xì)胞損傷的生物標(biāo)記物的存在。該損傷發(fā)生的早期測(cè)定能夠減少治療損傷的時(shí)間，并可減少發(fā)生臨床的急性腎衰竭(ARF)的危險(xiǎn)。所述的腎小管細(xì)胞損傷可包括，但不限于缺血性腎損傷(IRI)或腎毒性腎損傷(NRI)。一種簡(jiǎn)單的病人身邊檢測(cè)(point-of-care)試劑盒，其利用與廣泛采用的尿妊娠測(cè)試試劑盒相似的原理，用于在病床邊快速檢測(cè)尿NGAL，所述的試劑盒使臨床醫(yī)生能快速診斷ARF、快速進(jìn)行研究室驗(yàn)證及用有效的方法治療和預(yù)防。該試劑盒的應(yīng)用可代表給予所有處于ARF發(fā)病危險(xiǎn)的患者的護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)，包括用于心臟手術(shù)、腎移植、中風(fēng)、外傷、敗血癥、脫水和腎毒素(抗生素、抗炎劑、放射性對(duì)比劑(radio-contrastagent)和化療劑)。目前在臨床實(shí)踐中，當(dāng)ARF在這些發(fā)病誘因條件的背景下發(fā)生時(shí)，診斷是非常滯后的，而且相關(guān)的死亡率和發(fā)病率之高令人難以接受。具有諷刺甚至悲劇意味的是，雖然有效的預(yù)防和治療方法是普遍可以得到的，但由于缺乏ARF的早期生物標(biāo)記物，幾乎從未能以及時(shí)的方式給藥?？梢灶A(yù)期，NGAL的多重系列測(cè)定不僅對(duì)于初始腎損傷的診斷和定量，而且對(duì)于監(jiān)視早期治療的反應(yīng)和預(yù)測(cè)長(zhǎng)期結(jié)果來說，將是不可或缺的。腎小管細(xì)胞損傷的生物標(biāo)記物(也被稱為RTCI生物標(biāo)記物)可以是即時(shí)的RTCI生物標(biāo)記物，如NGAL，其可出現(xiàn)在發(fā)生腎小管細(xì)胞損傷2小時(shí)之內(nèi)的尿中。即時(shí)的RTCI生物標(biāo)記物能夠，如在NGAL的情況下，立即出現(xiàn)在發(fā)生腎小管細(xì)胞損傷的實(shí)驗(yàn)體的第一次尿出物中。RTCI生物標(biāo)記物也可以是早-發(fā)RTCI生物標(biāo)記物，其可出現(xiàn)于發(fā)生腎小管細(xì)胞損傷的最初M小時(shí)之內(nèi)。同樣地，NGAL也是早-發(fā)RTCI生物標(biāo)記物的實(shí)例。有效的RTCI生物標(biāo)記物通常為分泌的蛋白，它可以通過腎分泌到尿中。有效的RTCI生物標(biāo)記物通常也為蛋白酶-抗性的蛋白，如NGAL。然而，RTCI生物標(biāo)記物也可為蛋白酶-敏感的蛋白，只要該蛋白的穩(wěn)定片段可以在尿中，例如應(yīng)用如下文所述的NGAL的抗體檢測(cè)到。所述RTCI生物標(biāo)記物可以是缺血性腎損傷生物標(biāo)記物(IRI生物標(biāo)記物)、腎毒性腎損傷生物標(biāo)記物(NRI生物標(biāo)記物)或它們的混合物。NGAL是IRI生物標(biāo)記物和NRI生物標(biāo)記物兩者的實(shí)例。本發(fā)明的方法可為各種事件檢測(cè)腎小管細(xì)胞損傷的發(fā)生，并監(jiān)測(cè)其治療，所述的各種事件包括各種各樣的腎供血不全、心功能受損、手術(shù)操作、在重癥監(jiān)護(hù)病房中的患者、及將藥物、放射性對(duì)照染料或其它藥劑物質(zhì)給予所述的實(shí)驗(yàn)體。腎小管細(xì)胞的損傷可以是缺血性腎損傷、腎毒性腎損傷或影響腎小管細(xì)胞的其它損傷。所述事件可以包括大量和多種腎毒素的給藥或者攝入，所述腎毒素包括，但不限于癌癥化療(順氯氨鉬、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)、異膦酰胺(isosfamide)、甲氨蝶呤(isosfamide))、抗生素(慶大霉素(gentamicin)、萬(wàn)古霉素(vancomycin)、妥布霉素(tobramycin))、抗真菌劑(兩性霉素(amphotericin))、抗炎劑(NSAIDs)、免疫抑制劑(環(huán)孢霉素(cyclosporine)、他克莫司(tacrolimus))和放射對(duì)比劑。所述方法可用于評(píng)價(jià)新開發(fā)的化合物和已知化合物的腎毒性。本發(fā)明也提供了一種方法和試劑盒，所述方法和試劑盒用于根據(jù)損傷程度和實(shí)驗(yàn)體排出的尿中存在的NGAL的量之間的比例關(guān)系，來評(píng)價(jià)腎損傷的程度，所述的損傷程度可為從腎小管細(xì)胞損傷的最開始起病到臨床ARF。本發(fā)明為臨床醫(yī)生提供了一種方法，以在初期評(píng)定時(shí)估計(jì)腎損傷程度，并根據(jù)在尿中檢測(cè)到的NGAL的量監(jiān)測(cè)損傷狀況的變化(惡化、癥狀改善或保持不變)。通常，臨床醫(yī)生會(huì)建立在選擇的時(shí)間間隔從患者收集并分析一定量新鮮尿樣的規(guī)程。通常地，所述尿樣是在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)間歇地得到的。間歇取樣的時(shí)間段可由實(shí)驗(yàn)體的條件支配，可為從每M小時(shí)取樣到連續(xù)取樣的范圍，更通常地從每4小時(shí)至每30分鐘取樣。應(yīng)用此處描述的方法和技術(shù)，不僅能夠分析和估測(cè)存在于尿中的RTCI生物標(biāo)記物的定性水平，而且能分析和測(cè)定存在于尿中的RTCI生物標(biāo)記物的定量水平。臨床醫(yī)生可根據(jù)患者的狀態(tài)，選擇所述的定性方法、定量方法或兩者都選。通常，收集的尿量小于1毫升，更通常小于10μ1。通常的樣品可為大約1至大約Iml的范圍。通常，較大量的尿樣(大約Iml)用于定量測(cè)定。通常這些少量的尿可容易而迅速地從易于發(fā)生或已經(jīng)發(fā)生ARF的臨床實(shí)驗(yàn)體中得到?！z測(cè)到腎小管細(xì)胞損傷或急性腎衰竭的指標(biāo)，對(duì)該疾病或條件的干預(yù)和治療就開始了，臨床醫(yī)生可以應(yīng)用本發(fā)明的方法和試劑盒監(jiān)測(cè)所述治療或干預(yù)的過程。通常，當(dāng)腎損傷的治療開始并持續(xù)時(shí)，可取得一個(gè)或一個(gè)以上后續(xù)的治療后的尿樣，并分析RTCI生物標(biāo)記物的存在。持續(xù)所述的治療直到在后續(xù)的治療后的尿樣中檢測(cè)不到RTCI生物標(biāo)記物的存在。隨著治療和干預(yù)改善病癥，RTCI生物標(biāo)記物的表達(dá)及其在尿中的存在也會(huì)相應(yīng)地減少。改善的程度可以表示為樣品中測(cè)定的RTCI生物標(biāo)記物，如NGAL水平的相應(yīng)的降低。當(dāng)腎損傷接近完全治愈時(shí)，可采用本方法檢測(cè)RTCI生物標(biāo)記物的完全缺失，這標(biāo)志著治療過程的完成。與RTCI生物標(biāo)記物結(jié)合的單克隆抗體和多克隆抗體在發(fā)明的方法和試劑盒中是有用的。所述的抗體可以通過本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的方法制備。例如，在“CharacterizationoftwoELISAsforNGAL,anewlydescribedlipocalininhumanneutrophils，，，LarsKjeldsenetal.,(1996)JournalofImmunologicalMethods，Vol.198，155-16中，描述了優(yōu)選的RTCI生物標(biāo)記物NGAL的單克隆抗體，上述文獻(xiàn)此處并入以作參考。NGAL的單克隆抗體的實(shí)例，如HYB-211-01、HYB-211-02和NYB-211-05可以從AntibodyShop,Copenhagen,Denmark獲得。通常，HYB-211-01和HYB-211-02可與NGAL的還原的和非還原的形式一起使用。NGAL的多克隆抗體的一個(gè)實(shí)例在“AnIronDeliveryPathwayMediatedbyaLipocalin”，JunYangetal.,MolecularCell,(2002)，Vol.10，1045-1056中描述，在此并入作為參考。為了制備這種多克隆抗體，用重組經(jīng)過凝膠過濾的NGAL蛋白免疫兔子。血清與GST-瓊脂糖4B珠子一起保溫以去除污染物，得到血清中的多克隆抗體，如申請(qǐng)人在JunYangetal.,MolecularCell(2002)中所描述的。通常，檢測(cè)捕獲抗體和RTCI生物標(biāo)記物的復(fù)合物的步驟包括將該復(fù)合物與第二抗體接觸以檢測(cè)生物標(biāo)記物。檢測(cè)RTCI生物標(biāo)記物與初級(jí)抗體的復(fù)合物的方法包括以下步驟將尿樣中任何未結(jié)合的物質(zhì)與捕獲抗體-生物標(biāo)記物復(fù)合物分離；將捕獲抗體-生物標(biāo)記物復(fù)合物與檢測(cè)RTCI生物標(biāo)記物的第二抗體接觸，以允許形成RTCI生物標(biāo)記物和第二抗體之間的復(fù)合物；將任何未結(jié)合的第二抗體與RTCI生物標(biāo)記物-第二抗體復(fù)合物分離；和檢測(cè)RTCI生物標(biāo)記物-第二抗體復(fù)合物中的第二抗體。用于所述方法中的試劑盒通常包括一種介質(zhì)，所述介質(zhì)具有附加于其上的捕獲抗體，由此將尿樣與所述介質(zhì)接觸以將捕獲抗體暴露給樣品含有的NGAL。所述試劑盒包括一種獲取方法，該方法可包括一種器具，如匙形物(spatula)或普通的小棍(stick)，該器具具有包含所述介質(zhì)的表面。所述獲取方法還可以包括接受尿樣的容器，其中所述容器具有包含所述介質(zhì)的接觸尿的表面。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，檢測(cè)RTCI生物標(biāo)記物和所述抗體的復(fù)合物的試驗(yàn)可以包含ELISA，并可用于尿樣中NGAL的定量。在可替換的實(shí)施方案中，所述獲取方法可以包括一種器具，所述器具包括含有所述介質(zhì)的盒(cassette)。RTCI生物標(biāo)記物的早期檢測(cè)可以在短期內(nèi)提供尿樣中存在所述蛋白的指示。一般地，本發(fā)明的方法和試劑盒可以在腎小管細(xì)胞損傷之后的4小時(shí)內(nèi)，更具代表性為2小時(shí)內(nèi)，最具代表性1小時(shí)內(nèi)檢測(cè)尿樣中的RTCI生物標(biāo)記物。優(yōu)選地，可以在腎小管細(xì)胞損傷之后的30分鐘內(nèi)檢測(cè)到所述RTCI生物標(biāo)記物。本發(fā)明用于檢測(cè)RTCI生物標(biāo)記物的方法和試劑盒可以通過修改本領(lǐng)域中已知的方法和試劑盒制備，以用于生物學(xué)樣品中的其它蛋白和配基的快速檢測(cè)。可以修改為本發(fā)明的方法和試劑盒的實(shí)例在1997年8月12日授權(quán)的Mayetal.的美國(guó)專利5，656，503、在2002年12月31日授予0，Conneretal.的美國(guó)專利6，500,627、在1989年9月洸日授予Smith-Lewis的美國(guó)專利4，870，007、在1993年12月28日授予Ahlemetal.的美國(guó)專利5，273，743和在1986年12月30日授予Valkersetal.的美國(guó)專利4，632，901中描述，所有上述參考文獻(xiàn)在此并入作為參考。檢測(cè)RTCI生物標(biāo)記物的快速一步方法可以減少檢測(cè)腎小管細(xì)胞損傷的時(shí)間。通常的方法可以包括如下步驟獲得懷疑含有RTCI生物標(biāo)記物的尿樣；將該樣品的一部分與和RTCI生物標(biāo)記物特異性結(jié)合的檢測(cè)抗體混合，以啟動(dòng)檢測(cè)抗體和樣品中的RTCI生物標(biāo)記物的結(jié)合；將樣品和檢測(cè)抗體的混合物與和RTCI生物標(biāo)記物特異性結(jié)合的固定化的捕獲抗體接觸，其中所述捕獲抗體不與檢測(cè)抗體交叉反應(yīng)，以將檢測(cè)抗體與RTCI生物標(biāo)記物結(jié)合，而將RTCI生物標(biāo)記物與捕獲抗體結(jié)合，形成一種可檢測(cè)的復(fù)合物；從所述復(fù)合物中去除未結(jié)合的檢測(cè)抗體和任何未結(jié)合的樣品；和測(cè)定該復(fù)合物的檢測(cè)抗體。所述可檢測(cè)的抗體用可檢測(cè)的標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記，所述可檢測(cè)的標(biāo)記物如放射性標(biāo)記、酶、生物染料、磁珠或者生物素，如本
技術(shù)領(lǐng)域：
中所熟知的。為了鑒定可以伴隨及標(biāo)記腎小管細(xì)胞損傷，如缺血性和腎毒性腎損傷的最早發(fā)作的潛在的基因及其蛋白，可以應(yīng)用cDNA微陣列檢測(cè)大量潛在的基因靶物中哪些是顯著上調(diào)的。應(yīng)用這個(gè)篩選方法，與中性白細(xì)胞明膠酶(neutrophilgelatinase)相關(guān)的脂籠蛋白(lipocalin)(NGAL)被鑒定為一個(gè)基因，其在小鼠模型中的表達(dá)在缺血性腎損傷之后的最初數(shù)小時(shí)內(nèi)上調(diào)10倍以上。NGAL屬于超過20個(gè)結(jié)構(gòu)上相關(guān)的分泌的蛋白的脂籠蛋白超家族，所述分泌的蛋白被認(rèn)為在β-筒形腎盞(β-barreledcalyx)中轉(zhuǎn)運(yùn)各種配基。人NGAL最初被鑒定為一種與來自人中性白細(xì)胞的明膠酶共價(jià)結(jié)合的25kDa蛋白，其中它代表中性白細(xì)胞第二顆粒蛋白質(zhì)(secondarygranuleprotiens)中的一種。分子克隆研究揭示，人NGAL與小鼠24p3基因相似，所述小鼠Mp3基因起初在被誘導(dǎo)增殖的小鼠腎的原代培養(yǎng)物中得到鑒定。NGAL在其它人組織中，包括腎、氣管、肺、胃和結(jié)腸中以非常低的水平表達(dá)。NGAL表達(dá)在受刺激的上皮中被顯著地誘導(dǎo)。例如，它在結(jié)腸上皮細(xì)胞的炎癥或瘤形成區(qū)域中上調(diào)，但是在未進(jìn)行干預(yù)的區(qū)域或在轉(zhuǎn)移性病灶內(nèi)缺失。NGAL濃度在患有急性細(xì)菌感染的患者的血清內(nèi)，在患有哮喘或慢性梗阻性肺病(chronicobstructivepulmonarydisease)的實(shí)驗(yàn)體的痰中、及來自肺氣腫肺的支氣管液(bronchialfluid)中上升。在所有這些病例中，假定NGAL誘導(dǎo)是炎癥細(xì)胞和上皮層(印itheliallining)之間的相互作用的結(jié)果，而在中性白細(xì)胞和上皮組織中NGAL表達(dá)的上調(diào)是顯而易見的。人們認(rèn)為，檢測(cè)到的NGAL誘導(dǎo)代表腎近端小管細(xì)胞對(duì)于腎小管細(xì)胞損傷，包括缺血性和腎毒性損傷的新的內(nèi)在的反應(yīng)，而且并不僅僅源自激活的中性白細(xì)胞。首先，所述的反應(yīng)是快速的，NGAL與腎動(dòng)脈阻塞之后第一次尿出物一起出現(xiàn)在損傷的2小時(shí)之內(nèi)的尿中，而腎中性白細(xì)胞的累積在此缺血性ARF的模型中通常在損傷后的4小時(shí)最顯著。第二，NGAL誘導(dǎo)和中性白細(xì)胞累積的時(shí)間圖型是離散(divergent)的。NGALmRNA和蛋白表達(dá)在回流的12小時(shí)是最顯著的，然而中性白細(xì)胞累積在M小時(shí)得到峰值，而此時(shí)NGAL表達(dá)已經(jīng)顯著地降低。第三，在檢測(cè)的腎樣品中通過免疫熒光沒有檢測(cè)到表達(dá)NGAL的中性白細(xì)胞(圖幻。第四，證明體外缺血后NGALmRNA和蛋白誘導(dǎo)在培養(yǎng)的人近端小管細(xì)胞中發(fā)生，在完全不存在中性白細(xì)胞的系統(tǒng)中，NGAL在ATP消耗的1小時(shí)以內(nèi)分泌到培養(yǎng)基中。然而，可存在滲透的中性白細(xì)胞對(duì)于觀察到的NGAL上調(diào)中的作用。腎小管細(xì)胞中NGAL的上調(diào)，可以通過局部釋放細(xì)胞因子進(jìn)行誘導(dǎo)，所述細(xì)胞因子來自缺血性損傷后早期在微循環(huán)內(nèi)捕獲的中性白細(xì)胞。缺乏受刺激的上皮細(xì)胞誘導(dǎo)NGAL的適當(dāng)?shù)慕忉?，而且仍然不清楚NGAL對(duì)于損傷是否是保護(hù)性的或前后相接(proximate)的，或者甚至是一種無(wú)害的旁觀者。近期的證據(jù)顯示，至少在細(xì)胞類型的一種亞類中，NGAL可代表一種原-細(xì)胞凋亡(pro-apoptotic)分子。在小鼠原-B淋巴細(xì)胞的細(xì)胞系中，細(xì)胞因子的撤回(withdrawal)導(dǎo)致顯著的NGAL誘導(dǎo)以及細(xì)胞凋亡的發(fā)生。純化的NGAL產(chǎn)生與缺失細(xì)胞因子同樣的原-細(xì)胞凋亡反應(yīng)，包括Bax的激活，這顯示出，NGAL是與程序性細(xì)胞死亡(programmedcelldeath)前后相接的。NGAL也已經(jīng)與生殖組織中的細(xì)胞凋亡相連。復(fù)舊的乳腺和子宮的上皮細(xì)胞表達(dá)高水平的NGAL，時(shí)間上與最大細(xì)胞凋亡(maximalapoptosis)期一致。很可能NGAL通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡調(diào)控細(xì)胞種群的一個(gè)亞類。受刺激的上皮細(xì)胞可以上調(diào)NGAL以誘導(dǎo)滲透的中性白細(xì)胞的凋亡，由此允許定居細(xì)胞(residentcell)幸免于炎癥反應(yīng)的破壞?？蛇x自地，上皮細(xì)胞可應(yīng)用此機(jī)理調(diào)控它們自己的死亡(demise)。然而，有趣地表明，腎缺血-再灌注損傷之后的NGAL誘導(dǎo)主要發(fā)生在近端小管細(xì)胞中，而同樣情況下的細(xì)胞凋亡則主要為遠(yuǎn)端小管細(xì)胞現(xiàn)象。其它的近期研究已經(jīng)揭示，NGAL增強(qiáng)了上皮的表型。NGAL通過穿透大鼠輸尿管芽(uretericbud)表達(dá)，并且通過激發(fā)間質(zhì)細(xì)胞向腎上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化來引發(fā)腎發(fā)生13(nephrogenesis).已經(jīng)顯示另一種脂籠蛋白，生殖糖蛋白(glycodelin)，當(dāng)其在人乳癌細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，誘導(dǎo)上皮細(xì)胞的表型。這些發(fā)現(xiàn)尤其適合于成熟的腎，其中對(duì)于缺血性損傷已充分證明的反應(yīng)之一是沿近端小管排列的去分化的(dedifferentiated)上皮細(xì)胞的顯著出現(xiàn)。缺血性損傷后，腎再生和修復(fù)的一個(gè)重要方面包括上皮細(xì)胞表型的重新取得(reacquisition)，此過程概括了正常發(fā)育的幾個(gè)方面。這說明，NGAL可以由損壞的腎小管表達(dá)以誘導(dǎo)再上皮細(xì)胞化(re-印ithelialization)。對(duì)此觀點(diǎn)的支持源自近期將NGAL鑒定為一種鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其在腎發(fā)生的過程中與轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin)互補(bǔ)。已知鐵向細(xì)胞的傳遞對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育是極其重要的，而且這可能對(duì)于缺血后的腎再生，正如它在個(gè)體發(fā)育過程中那樣，是非常關(guān)鍵的。由于NGAL看來結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)鐵，NGAL也很可能作為從損壞的近端小管上皮細(xì)胞流出的鐵的匯點(diǎn)(sink)。因?yàn)橐延^察到NGAL可被近端小管胞吞(endocytose)，該蛋白可能將鐵循環(huán)進(jìn)入活細(xì)胞。這可刺激生長(zhǎng)和發(fā)育，以及從組織損傷的位點(diǎn)去除反應(yīng)分子-鐵，由此限制鐵-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。NGAL是順氯氨鉬誘導(dǎo)的腎毒性腎損傷的新型的尿生物標(biāo)記物，它比以前描述的生物標(biāo)記物更加敏感。一個(gè)實(shí)例是腎損傷分子-1或KIM-1，一個(gè)推定的涉及腎再生的粘附分子。在順氯氨鉬腎毒性的大鼠模型中，KIM-I在初始損傷后的M-48小時(shí)是可以定量檢測(cè)的，使其成為腎小管細(xì)胞損傷的一種有些晚期的標(biāo)記物。與此相反，在順氯氨鉬以已知導(dǎo)致腎衰竭的劑量給藥后3小時(shí)內(nèi)，方便而定量地檢測(cè)到NGAL。此外，尿NGAL檢測(cè)先于尿中其它標(biāo)記物如NAG的出現(xiàn)。NGAL在尿中的出現(xiàn)也先于血清肌酸酐的增加，所述血清肌酸酐的增加已廣泛地用于診斷腎毒性腎衰竭。甚至在輕微的“臨床癥狀不明顯的”順氯氨鉬劑量之后，尿NGAL是明顯的，盡管血清肌酸酐仍為正常水平。因此，本發(fā)明對(duì)于經(jīng)受順氯氨鉬治療的患者的臨床管理具有重要的含義。順氯氨鉬的有效性是依賴于劑量的，但腎毒性的發(fā)生經(jīng)常阻礙應(yīng)用更高劑量以使其抗腫瘤的潛力最大化。順氯氨鉬治療后的腎毒性是常見的，并且可在單次劑量后出現(xiàn)急性腎衰竭。雖然幾種治療的方法已經(jīng)證明在動(dòng)物體內(nèi)順氯氨鉬誘導(dǎo)的腎毒性的治療中是有效的，但是成功的人體實(shí)驗(yàn)很大程度上仍然是軼事奇聞。其中一個(gè)原因可能是缺乏腎毒性急性腎衰竭的早期標(biāo)記物，而因此延遲治療的開始。在目前的臨床實(shí)踐中，急性腎損傷通常是通過測(cè)定血清肌酸酐進(jìn)行診斷的。然而，眾所周知，肌酸酐在腎功能急性變化的過程中，是一種不可靠而且延遲的指標(biāo)。首先，血清肌酸酐濃度不會(huì)變化，直到大約50%的腎功能已經(jīng)喪失。第二，血清肌酸酐不能準(zhǔn)確地描述腎功能，直到可能需要幾天的時(shí)間以達(dá)到一種穩(wěn)態(tài)。因此，應(yīng)用血清肌酸酐測(cè)定在腎損傷的早期過程中削弱檢測(cè)和定量腎損傷的能力。然而，動(dòng)物研究表明，雖然腎毒性急性腎衰竭可以預(yù)防和/或治療，但是只有狹窄的“機(jī)會(huì)窗口”實(shí)現(xiàn)它，而且治療必須在初始損傷后非常早就開始。腎損傷的早期生物標(biāo)記物的缺乏削弱了臨床醫(yī)生以及時(shí)的方式開始可能的有效治療的能力。在實(shí)驗(yàn)體系中，應(yīng)用NGAL對(duì)于檢測(cè)已經(jīng)存在或形成的治療干預(yù)或預(yù)防干預(yù)，以及對(duì)于其它藥劑的潛在腎毒性的早期評(píng)價(jià)也有價(jià)值。NGAL檢測(cè)對(duì)于順氯氨鉬誘導(dǎo)的腎損傷是新型的、非侵入性的、早期尿生物標(biāo)記物。早期檢測(cè)能夠使臨床醫(yī)生給予及時(shí)的治療干預(yù)，并建立防止發(fā)展成明顯的腎毒性腎衰竭的方法。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在小鼠和大鼠中，用少至1的腎缺血后最初未處理的尿出物，容易而快速地將NGAL檢測(cè)為Western印跡中相對(duì)潔凈的免疫反應(yīng)肽。此外，甚至在非常輕微的“臨床癥狀不明顯的”腎缺血后，尿NGAL是明顯的，盡管血清肌酸酐仍為正常水平。尿NGAL檢測(cè)也遠(yuǎn)遠(yuǎn)先于尿中傳統(tǒng)標(biāo)記物，包括β2-微球蛋白和NAG的出現(xiàn)。NGAL的上調(diào)和尿排泄可說明腎小管細(xì)胞對(duì)于各種損傷的快速反應(yīng)，而NGAL在尿中的檢測(cè)可提供一種廣泛應(yīng)用的非侵入性的臨床工具，其用于小管細(xì)胞損傷的早期診斷。NGAL是一種敏感的、非侵入性的、腎小管細(xì)胞損傷，包括腎缺血和腎毒血癥的尿生物標(biāo)記物。檢測(cè)在患有急性、輕微和早期形式的腎小管細(xì)胞損傷的患者的尿中NGAL的表達(dá)，應(yīng)用本發(fā)明的快速而簡(jiǎn)單的檢測(cè)方法和試劑盒，能夠提醒并使臨床醫(yī)生在經(jīng)歷急性腎衰竭的患者中及時(shí)地開始干預(yù)努力，并提醒臨床醫(yī)生實(shí)施一些方法，旨在防止患有輕微的臨床癥狀不明顯的腎小管細(xì)胞損傷(如腎毒素、腎移植、血管外科和心血管的事件)的患者發(fā)展成明顯的ARF。單在美國(guó)，每年就進(jìn)行大約16，000例腎移植。這個(gè)數(shù)字還在逐年穩(wěn)定上升。其中大約10，000例是尸體的腎移植，并有ARF的風(fēng)險(xiǎn)。這些患者中的每個(gè)人會(huì)極大地受益于系列的NGAL檢測(cè)，其可代表日常護(hù)理。缺血性腎損傷也與開放性心臟手術(shù)有關(guān)，原因在于此過程中固有的血流的短暫中斷?？梢怨烙?jì)每年進(jìn)行的開放性心臟手術(shù)的數(shù)目。在任何中度繁忙的成人醫(yī)院中，每年大約進(jìn)行500例這樣的手術(shù)。假定單在美國(guó)有至少400所這樣的中度繁忙的醫(yī)院，可保守地估計(jì)出每年進(jìn)行200，000例開放性心臟手術(shù)。這些病人的系列NGAL測(cè)定又是無(wú)價(jià)的，并可代表護(hù)理的標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)步驟1.腎缺血-再灌注損傷的小鼠模型我們應(yīng)用已經(jīng)建好的腎缺血-再灌注損傷的鼠類模型，其中腎缺血的短期的結(jié)構(gòu)和功能的結(jié)果先前已經(jīng)得到證明(3-7)。簡(jiǎn)單地，給重25-35g的雄性Swiss-Webster小鼠(TaconicFarm,Germantown,NY)提供帶有12:12小時(shí)光暗循環(huán)的住所，并允許自由地接觸食物和水。所述動(dòng)物用戊巴比妥鈉(50mg/kg向腹膜內(nèi))麻醉，并放置在加熱臺(tái)(warmingtable)上以保持37°C的直腸溫度。應(yīng)用三種單獨(dú)的操作步驟(a)單側(cè)缺血，(b)雙側(cè)缺血及ARFjP(c)雙側(cè)輕微的臨床癥狀不明顯的缺血。對(duì)于第一組(單側(cè)缺血)實(shí)驗(yàn)，將其左腎蒂用非-外傷性的血管鉗堵塞45分鐘，在此期間保持所述的腎溫暖和濕潤(rùn)。然后除去夾鉗，觀察到腎的血液回流，并縫合切口。允許所述的小鼠在溫暖的籠中恢復(fù)。再灌注的0、3、12或M小時(shí)后，將所述動(dòng)物再次麻醉，打開其腹腔，由下腔靜脈穿刺得到的血通過定量比色測(cè)定試劑盒(Sigma，St.Louis,MO)進(jìn)行血清肌酸酐的測(cè)定。所述小鼠用腹膜內(nèi)戊巴比妥致死。然后將左室(leftventricle)用IOml的IXPBS灌注，然后用IOml含4%多聚甲醛(paraformaldehyde)的PBS灌注以實(shí)現(xiàn)腎的原位固定(insitufixation)。收獲兩個(gè)腎(每個(gè)動(dòng)物的右腎作為對(duì)照物)。在每個(gè)回流期，對(duì)至少三個(gè)獨(dú)立的動(dòng)物進(jìn)行檢查。將每個(gè)腎的一半在液氮中急速冷凍并貯存在-70°C直到進(jìn)一步的處理；將樣品在福爾馬林中固定，用石蠟包埋并切片Gym)。石蠟切片用蘇木紫-曙紅染色并進(jìn)行組織學(xué)檢查。經(jīng)鉗夾的腎顯示出由缺血-再灌注損傷引起的特征性的形態(tài)學(xué)的改變，如先前由別人(3-6)和我們(發(fā)表的。每個(gè)腎的另一半在OCT化合物(Tissue-Tek)中包埋并得到冰凍切片(4ym)用于免疫組織化學(xué)。對(duì)于第二組(雙側(cè)缺血)實(shí)驗(yàn)，將兩個(gè)腎鉗夾30分鐘，并在如前詳述的不同回流期檢查。此組的八個(gè)動(dòng)物被設(shè)計(jì)為代表ARF，并在損傷后M小時(shí)顯示血清肌酸酐的顯著上升。對(duì)于第三組(雙側(cè)輕微的臨床癥狀不明顯的缺血)實(shí)驗(yàn)，將不同動(dòng)物的雙腎僅鉗夾5、10或20分鐘，并在如前詳述的不同回流期檢查。這非常輕微程度的損傷被設(shè)計(jì)為模擬臨床癥狀不明顯的腎缺血，而且這組中的小鼠在損傷后M小時(shí)測(cè)定的血清肌酸酐不顯示任何上升。2.腎缺血-再灌注損傷的大鼠模型我們應(yīng)用已經(jīng)建好的腎缺血-再灌注損傷的嚙齒動(dòng)物模型O)。簡(jiǎn)單地，重200-250g的雄性Sprague-Dawley大鼠(TaconicFarm,Germantown,NY)用氯胺酮(ketamine)(150μg/g)和賽拉嗪(xylazine)(3μg/g)麻醉，并用微血管鉗進(jìn)行雙側(cè)腎動(dòng)物阻塞30分鐘，如在小鼠操作中詳述的。定時(shí)的尿收集物在再灌注的3、6、9、12和M小時(shí)得到，而且在致死的時(shí)間04小時(shí))收集血液用于肌酸酐測(cè)定。3.分離RNA:小鼠整個(gè)腎組織(或培養(yǎng)的人近端小管細(xì)胞，見下文)用TissueTearor(BiospecProducts,Racine,WI)破碎。來自對(duì)照物和缺血的腎的總RNA應(yīng)用RNeasyMiniKit(Qiagen，Valencia,CA)分離，并通過分光光度法定量。4.微陣列步驟微陣列硬件和步驟的詳細(xì)說明先前已經(jīng)發(fā)表了(3)。簡(jiǎn)單地，對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)，100μg純化的總小鼠腎RNA在用于對(duì)照物的Cy3-dUTP(Amersham，Piscataway，NJ)和用于缺血性樣品的Cy5_dUTP存在的條件下，用Superscript〗〗反轉(zhuǎn)錄酶(LifeTechnologies,Rockville,MD)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。所述cDNA樣品應(yīng)用MicroconYM-50過濾器(Millipore,Madison,WI)純化，并與含有8，979個(gè)獨(dú)特的序列經(jīng)驗(yàn)證的小鼠探針的微陣列板雜交(3)。在每個(gè)回流期，至少檢查三個(gè)獨(dú)立的動(dòng)物，而且對(duì)于每個(gè)動(dòng)物至少進(jìn)行兩次獨(dú)立的微陣列實(shí)驗(yàn)。所述陣列片用微陣列掃描儀(GenePix4000B，AxonInstruments,FosterCity,CA)進(jìn)行掃描以得到分別用于Cy3和Cy5熒光的獨(dú)立的TIFF圖像。單個(gè)基因的Cy3和Cy5的信號(hào)強(qiáng)度用GenePixPro3.O數(shù)據(jù)提取軟件(AxonInstruments)進(jìn)行檢測(cè)。如先前所描述的(完成質(zhì)量控制和數(shù)據(jù)分析。5.半定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)來自對(duì)照物和實(shí)驗(yàn)的小鼠腎的等量(Iyg)的總RNA，在隨機(jī)六聚物存在的條件下，按照使用說明書用SuperscriptII反轉(zhuǎn)錄酶(LifeTechnologies)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。PCR應(yīng)用一個(gè)試劑盒(Roche，Indianapolis,IN)和下列引物完成小鼠NGAL有義5，-CACCACGGACTACAACCAGTTCGC-3，；小鼠NGAL反義5，-TCAGTTGTCAATGCATTGGTCGGTG-3，；人NGAL有義5，-TCAGCCGTCGATACACTGGTC-3，；禾口人NGAL反義5，-CCTCGTCCGAGTGGTGAGCAC-3，；小鼠和人β-肌動(dòng)蛋白和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的引物對(duì)從Clontech(LaJolla,CA)得到。無(wú)cDNA的模擬反應(yīng)作為陰性對(duì)照物。通過瓊脂糖凝膠電泳然后用溴化乙錠染色分析PCR產(chǎn)物，并通過密度測(cè)定法定量。在肌動(dòng)蛋白或GAPDH擴(kuò)增的歸一化之后，顯示在缺血的腎對(duì)比對(duì)照腎中NGALmRNA表達(dá)的倍數(shù)變化。6.免疫組織化學(xué)冰凍切片用含0.2%TritonX-100的PBS滲透10分鐘，以山羊血清阻斷1小時(shí)，并與NGAL的初級(jí)抗體(1500稀釋)一起溫育1小時(shí)。然后將載玻片在黑暗中暴露于與Cy5結(jié)合的第二抗體(Amersham，ArlingtonHeights,IL)30分鐘，并用裝配若丹明濾光器的熒光顯微鏡(ZeissAxiophot)觀察。為了將NGAL與Rabll協(xié)同定位(co-localization)，首先將系列的切片與NGAL抗體或者Rabll的單克隆抗體(1500稀釋；TransductionLaboratories)—起溫育，然后與結(jié)合Cy5(對(duì)于NGAL)或結(jié)合Cy3(對(duì)于Rabll)的第二抗體一起溫育，并分別以若丹明或熒光素濾光器進(jìn)行觀察。為了將NGAL與增殖的細(xì)胞核抗原(PCNA)協(xié)同定位，將切片與NGAL抗體和PCNA的單克隆抗體(1500稀釋；Upstate)共同溫育，并通過免疫過氧化物Bl染色(immunoperoxidasestaining)(ImmunoCruzStainingSystem,SantaCruzBiotechnology)完成檢測(cè)。對(duì)于TUNEL測(cè)定，我們應(yīng)用ApoAlertDNAFragmentation(AssayKitClontech)。石賭切片通過二甲苯和漸降的(descendinggrade)乙醇脫除石蠟(cbparaffinize)，以4%甲醛/PBS在4°C固定30分鐘，以蛋白酶K在室溫滲透15分鐘，以0.2%TritonX-100/PBS在4°C滲透15分鐘，并以核苷酸和TdT酶的混合物在37°C溫育60分鐘。該反應(yīng)以2XSSC終止，用PBS洗滌所述切片并以Crystal/mount(Biomeda,FosterCity,CA)包埋。TUNEL-陽(yáng)性的細(xì)胞凋亡的核通過觀察熒光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)。7.尿的收集將小鼠或大鼠置于代謝籠(metaboliccage)(Nalgene，Rochester，NY)，并在雙側(cè)腎動(dòng)脈阻塞之前以及阻塞之后的每個(gè)小時(shí)收集尿。尿樣以5000Xg離心以除去碎片，而得到的上清通過Western印跡分析。尿肌酸酐通過定量比色測(cè)定試劑盒(Sigma)進(jìn)行測(cè)定以歸一化用于尿NGAL檢測(cè)的樣品。用于檢測(cè)尿中的N-乙酰-β-D-氨基葡糖苷酶(NAG)的比色測(cè)定試劑盒從Roche得到。8.細(xì)胞培養(yǎng)人腎近端小管上皮細(xì)胞(RPTEC)從Clonetics(SanDiego,CA)得到。細(xì)胞生長(zhǎng)于補(bǔ)充有REGM復(fù)合物的腎上皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(RenalEpithelialCellBasalMedium)(0.5μ1/ml氫化可的松、10pg/mlhEGF.O.5μg/ml腎上腺素、6.5pg/ml三碘甲腺原氨酸、10μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、5μg/ml胰島素、1μg/ml硫酸慶大霉素和2%FBS)，如制造商所推薦的。9.培養(yǎng)的細(xì)胞的溫和的ATP消耗我們修改了先前描述的體外的缺血的操作步驟，所述的體外的缺血由具有氧化磷酸化的抑制子的ATP消耗引起(8，9)。在匯流后(post-confluence)的第二天，RPTEC細(xì)胞與1μ1抗霉素A(Sigma)—起溫育不同的時(shí)間直至6小時(shí)。我們?cè)谙惹耙呀?jīng)顯示，在其它類型的培養(yǎng)的腎上皮細(xì)胞，如MDCK(S)和786-0(9)細(xì)胞中，這導(dǎo)致溫和的部分可逆的ATP消耗，并且無(wú)細(xì)胞生存能力的損失。應(yīng)用基于熒光素酶(Iuciferase)的測(cè)定試劑盒(Sigma)監(jiān)測(cè)ATP水平，并將其表示為對(duì)照值的百分比。在ATP消耗的不同時(shí)間點(diǎn)收獲細(xì)胞，并通過RT-PCR分析NGALmRNA表達(dá)，而通過^festern分析分析NGAL蛋白表達(dá)。也監(jiān)測(cè)NGAL向培養(yǎng)基中的分泌。10.順氯氨鉬腎毒性的小鼠模型我們應(yīng)用已經(jīng)建好的鼠類模型，其中順氯氨鉬誘導(dǎo)的腎毒性的結(jié)構(gòu)上和功能上的結(jié)果在先前已經(jīng)得到證明(12-14，18)。簡(jiǎn)單地，給重25-30g的雄性Swiss-Webster小鼠(TaconicFarm,Germantown,NY)提供帶有12:12小時(shí)光暗循環(huán)的住所，并允許自由地接觸食物和水。給所述小鼠單次腹膜內(nèi)注射順氯氨鉬，其劑量為5μg/kg或者20μg/kg體重。先前已經(jīng)顯示，較大的劑量導(dǎo)致小管細(xì)胞的壞死和細(xì)胞凋亡，并在注射順氯氨鉬的3-4天內(nèi)削弱腎功能(12-14，18)。將動(dòng)物置于代謝籠(Nalgene,Rochester,NY)，并在注射順氯氨鉬之前以及注射之后的不同時(shí)間點(diǎn)(3、12、M、48、72和96小時(shí))收集尿。在相似的時(shí)間點(diǎn)，所述動(dòng)物用戊巴比妥鈉(50mg/kg，向腹膜內(nèi))麻醉，打開其腹腔，由下腔靜脈穿刺得到的血，通過定量比色測(cè)定試劑盒(Sigma，St.Louis，M0)進(jìn)行血清肌酸酐的測(cè)定。殺死所述的小鼠，它的腎用含4%多聚甲醛的PBS灌注固定(perfusionfixed)在原位，并收獲雙腎。將每個(gè)腎的一半在液氮中急速冷凍并貯存在_70°C直到進(jìn)一步的處理將樣品在福爾馬林中固定，用石蠟包埋并切片(4mm)。石蠟切片用蘇木紫-曙紅染色并進(jìn)行TUNEL測(cè)定。剩余的部分用于進(jìn)行W^estern印跡。全腎在冰冷的裂解緩沖液QOmMTris,pH7.4,250mM蔗糖，150mMNaCl,l%NP-40和1xComplete蛋白酶抑制劑)中用Polytron均質(zhì)器進(jìn)行均質(zhì)化。均質(zhì)物在冰上保溫30分鐘，在4°C以1，OOOXg離心5分鐘以除去細(xì)胞核及細(xì)胞碎片，并通過Bradford法(Bio-Rad，Hercules，CA)分析蛋白質(zhì)含量。每個(gè)腎的另一半包埋在OCT化合物(Tissue-Tek)中，并將得到的冰凍切片Gym)用于免疫組織化學(xué)。11.重組鼠科動(dòng)物NGAL的表達(dá)、純化和^festern印跡將全長(zhǎng)的小鼠NGALcDNA克隆到pGEX表達(dá)載體(Pharmacia,Nutley,NJ)，在細(xì)菌中表達(dá)為與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合的融合蛋白，并用谷胱甘肽-瓊脂糖柱(Amersham)純化，然后再用凝血酶切割，如先前所述(16，19，20)。蛋白通過SDS-PAGE，之后進(jìn)行考馬斯藍(lán)染色或以NGAL的多克隆抗體進(jìn)行Western印跡來分析。蛋白濃度采用Bradford法(Bio-Iad，Hercules,CA)測(cè)定。12.通過Western印跡定量尿NGAL尿中NGAL的量通過與重組的純化的NGAL的規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較而測(cè)定。采用已知的重組NGAL濃度和已知的尿體積，在轉(zhuǎn)移和暴露的相同條件下進(jìn)行Western印跡的密度分析。所有的化學(xué)藥品除非另外指出均購(gòu)自Sigma。為了進(jìn)行Western印跡，通過Bradford法(Bio-Rad，Hercules,CA)測(cè)定蛋白濃度，并將等量的總蛋白在每個(gè)通道上樣。除非另外指出，將110，000稀釋的α-微管蛋白的單克隆抗體用于確認(rèn)等量蛋白上樣，而NGAL的多克隆抗體以1500應(yīng)用(15)。除非另外指出，轉(zhuǎn)移的蛋白的免疫檢測(cè)應(yīng)用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhancedchemiluminescence)(Amersham)完成。實(shí)施例1NGAL是一種小的蛋白酶抗性的、分泌的多肽，其可以在尿中檢測(cè)出來。NGALmRNA和蛋白水平的顯著上調(diào)已經(jīng)在小鼠腎臟缺血后的早期顯現(xiàn)出來。主要在近端小管細(xì)胞中檢測(cè)到NGAL蛋白表達(dá)，其類似于一種分泌蛋白在細(xì)胞質(zhì)中以點(diǎn)狀分布。實(shí)際上，在ARF的小鼠和大鼠模型中，可容易而快速地在缺血性損傷后的尿中(在第一次尿出物中)檢測(cè)到NGAL,此時(shí)沒有觀察到腎的白細(xì)胞滲透。來自小管細(xì)胞的NGAL的來源在培養(yǎng)的經(jīng)受體外缺18血損傷的人近端小管細(xì)胞中得到進(jìn)一步確認(rèn)，其中NGALmRNA在所述細(xì)胞中被顯著且立即誘導(dǎo)，而在溫和的ATP消耗的1小時(shí)內(nèi)，在培養(yǎng)基中可容易地檢測(cè)到NGAL蛋白。我們的結(jié)果說明，NGAL可以代表缺血性腎損傷的新的早期尿生物標(biāo)記物。鑒定腎缺血-再灌注損傷后早期上調(diào)的新基因在基因組范圍搜索在小鼠模型中腎缺血-再灌注損傷稍后誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄物，鑒定了7種早期生物標(biāo)記物。在每個(gè)再灌注時(shí)間(3、12和對(duì)小時(shí))檢查3只獨(dú)立的小鼠，并對(duì)于每只檢查的動(dòng)物進(jìn)行至少兩次獨(dú)立的微陣列實(shí)驗(yàn)。對(duì)照物和缺血腎的轉(zhuǎn)錄組(transcriptome)分布型(profile)的比較得到7個(gè)基因的小子集，所述的7個(gè)基因其一貫被誘導(dǎo)超過10倍。近來已經(jīng)確認(rèn)這些轉(zhuǎn)錄物中的一種，半胱氨酸富含蛋白61(Cyrei)，被腎缺血(1)誘導(dǎo)。令人驚訝地，其它6種差別表達(dá)的基因的行為對(duì)于ARF文獻(xiàn)是新的。我們選擇進(jìn)一步描述這些先前未鑒定的基因中的一種的特性，即與中性白細(xì)胞凝膠酶相關(guān)的脂籠蛋白(NGAL)。早期腎衰竭的動(dòng)物模型的特征使用缺血-再灌注損傷的鼠模型，在該模型中腎缺血的短期的結(jié)構(gòu)和功能的結(jié)果已經(jīng)得到證明(3-7)。缺血損傷的特征性組織病理特點(diǎn)在單側(cè)缺血(45分鐘)和雙側(cè)缺血(30分鐘)之后的M小時(shí)再灌注樣品中是顯而易見的。這些包括刷狀緣膜(brushbordermembrane)的喪失、小管擴(kuò)張(tubulardilation)、展平的小管上皮(flattenedtubularepithelium)、腔內(nèi)碎片(Iuminaldebris)和間隙滲透(interstitialinfiltrate)(圖1)。凋亡的細(xì)胞的存在通過TUNEL試驗(yàn)證明。細(xì)胞凋亡主要位于遠(yuǎn)端小管細(xì)胞和髓袢(Henle'sloop)的升支(ascendinglimb)，既在腔內(nèi)分離的細(xì)胞也在附著的細(xì)胞中。近端小管細(xì)胞也偶然地凋亡，但腎小球基本上無(wú)細(xì)胞凋亡。在對(duì)照腎或在忽視TdT的缺血性樣品中，沒有檢測(cè)到TUNEL-陽(yáng)性的細(xì)胞(未給出)。上面的組織變化和細(xì)胞凋亡的變化在經(jīng)受較輕微程度缺血(雙側(cè)缺血5、10或20分鐘)的腎中缺失(未給出)。血清肌酸酐水平反映了觀察到的組織病理的變化。因此，患有單側(cè)腎缺血或輕度的臨床癥狀不明顯的雙側(cè)缺血的小鼠顯示其血清肌酸酐水平與對(duì)照動(dòng)物難以區(qū)別，然而雙側(cè)缺血30分鐘的小鼠顯示血清肌酸酐的顯著升高(圖1)。NGALmRNA在腎缺血后的早期被顯著誘導(dǎo)通過微陣列分析，發(fā)現(xiàn)NGAL在缺血的小鼠腎中再灌注3、12和M小時(shí)，與相同動(dòng)物的對(duì)照腎相比，一貫被誘導(dǎo)3.2士0.5倍、11.1士1.2倍和4.3士0.6倍(來自三個(gè)動(dòng)物在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的平均值+/-SD)。這個(gè)發(fā)現(xiàn)通過半-定量RT-PCR加以證實(shí)，使用以β-肌動(dòng)蛋白或GAPDH進(jìn)行的歸一化操作。在任何進(jìn)行檢測(cè)的再灌注時(shí)間，沒有記錄到肌動(dòng)蛋白或GAPDHmRNA表達(dá)的顯著變化，如前所述(3)。然而，應(yīng)用小鼠特異性的引物，我們檢測(cè)到NGALmRNA表達(dá)的顯著上調(diào)(在再灌注3、12和M小時(shí)分別為4.1士0.5倍、9士0.6倍和4.2士0.4倍，其中的值代表三個(gè)單獨(dú)動(dòng)物的平均值+/-SD)。這些結(jié)果在圖1中說明，并與通過轉(zhuǎn)錄組分析檢測(cè)到的變化總的來說一致。NGAL蛋白在缺血小鼠腎的早期的近端小管中顯著地過量表達(dá)NGAL蛋白在腎中的缺血后表達(dá)平行于mRNA的表達(dá)。通過^festern分析，NGAL剛可在對(duì)照小鼠腎中作為25kDa免疫反應(yīng)肽被檢測(cè)到。此條帶作為NGAL的身份在獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)組中建立，其中將初級(jí)抗體與重組小鼠脂籠蛋白預(yù)-溫育完全阻斷了此免疫反應(yīng)性(未給出)。在單側(cè)缺血實(shí)驗(yàn)中，通過密度分析法，NGAL表達(dá)在來自損傷3小時(shí)以內(nèi)的三個(gè)獨(dú)立的動(dòng)物的缺血腎中被誘導(dǎo)3-4倍，如圖2，A圖面所示。在來自八個(gè)獨(dú)立的動(dòng)物的雙側(cè)缺血實(shí)驗(yàn)中，此反應(yīng)得到顯著的增強(qiáng)。這些小鼠中的NGAL在再灌注后3小時(shí)被誘導(dǎo)3倍，在M小時(shí)樣品中在12-倍以上得到峰值，并在72-h恢復(fù)期內(nèi)降低到正常水平(圖2，圖面B)。應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)，在對(duì)照小鼠腎中幾乎檢測(cè)不到NGAL蛋白，但是它在缺血3小時(shí)以內(nèi)的近端小管中卻被顯著地上調(diào)，如圖3所示?；谒罹壞さ拇嬖?、核與細(xì)胞大小的比例以及細(xì)胞形態(tài)鑒定這些部分中的近端小管。誘導(dǎo)的NGAL在近端小管細(xì)胞中以點(diǎn)狀細(xì)胞質(zhì)分布出現(xiàn)，其類似于一種分泌的蛋白。這種表達(dá)模式在缺血再灌注損傷的單側(cè)和雙側(cè)模型中是同樣的，并在每個(gè)所研究的動(dòng)物中一貫是顯而易見的。腎小球沒有NGAL表達(dá)，而且表達(dá)NGAL的中性白細(xì)胞是不明顯的。因?yàn)橐呀?jīng)顯示NGAL在培養(yǎng)的Wilms腫瘤腎細(xì)胞中至少部分地與核內(nèi)體(endosome)協(xié)同定位(11)，在連續(xù)腎切片(serialkidneysection)中檢驗(yàn)NGAL和Rabll(—種晚期再循環(huán)核內(nèi)體的標(biāo)記物)的分布。合并的圖像顯示NGAL與Rabll顯著的協(xié)同定位(未給出)。為了確定缺血后NGAL表達(dá)增強(qiáng)的功能意義，檢驗(yàn)連續(xù)腎切片的NGAL表達(dá)、TUNEL-陽(yáng)性核或PCNA-陽(yáng)性核。然而過量表達(dá)NGAL的小管細(xì)胞不是TUNEL-陽(yáng)性的(未給出)，NGAL與PCNA顯著的協(xié)同定位在48小時(shí)回流期在增殖和再生細(xì)胞中是明顯的(未給出)。在小鼠中ARF的誘導(dǎo)之后立即在尿中容易地檢測(cè)到NGAL蛋白本實(shí)驗(yàn)說明了檢測(cè)尿NGAL作為缺血性腎損傷的早期非侵入性生物標(biāo)記物的應(yīng)用。應(yīng)用尿肌酸酐濃縮物以使上樣一致，NGAL在缺血之前的尿中缺失。與此明顯相反的是，NGAL在所有檢測(cè)的動(dòng)物中，損傷2小時(shí)以內(nèi)(在缺血后的第一次尿出物中)顯示為25kDa條帶，如圖4A和4B所示。此條帶作為NGAL的身份在獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)組中建立，其中將初級(jí)抗體與重組小鼠脂籠蛋白一起預(yù)-溫育完全阻斷此免疫反應(yīng)性(未給出)。在僅僅μ的未處理的尿中通過Western分析可容易地檢測(cè)NGAL，而且在整個(gè)檢驗(yàn)期間(再灌注的M小時(shí))持續(xù)。然后，我們將尿NGAL分泌與先前建立的損傷的標(biāo)記物，如β2-微球蛋白和NAG的分泌進(jìn)行比較。盡管尿NGAL在缺血的2小時(shí)內(nèi)是明顯的，但是在只有單側(cè)缺血12小時(shí)后的同樣的尿樣中(圖4，圖面Α)和雙側(cè)缺血8小時(shí)之后(圖4，圖面B)，β2-微球蛋白是可檢測(cè)的。類似地，尿NAG分泌只有在單側(cè)缺血12小時(shí)之后(圖4的下圖，圖Α)和雙側(cè)缺血8小時(shí)之后(圖4的下圖，圖面B)，與非缺血性對(duì)照動(dòng)物相比是顯著增加的。在小鼠中甚至輕微的腎缺血之后在尿中容易地檢測(cè)到NGAL蛋白為了在無(wú)明顯的ARF的條件下確定尿NGAL檢測(cè)的敏感性，我們應(yīng)用了將不同的小鼠組經(jīng)過只有5、10或20分鐘的雙側(cè)腎動(dòng)脈阻塞的實(shí)驗(yàn)步驟。這些研究被設(shè)計(jì)為在輕微的臨床癥狀不明顯的腎缺血之后評(píng)價(jià)尿NGAL分泌?；亓鱉小時(shí)之后測(cè)定的血清肌酸酐在所有這些小鼠中在正常限度之內(nèi)。驚人地，在這些動(dòng)物的僅僅1μ1的未處理的尿中容易地檢測(cè)到NGAL(圖5)，雖然它的出現(xiàn)與患ARF的動(dòng)物相比有些延遲。因此，雖然雙側(cè)缺血30分鐘導(dǎo)致在2小時(shí)之內(nèi)尿NGAL分泌(圖4)，雙側(cè)缺血20或10分鐘的小鼠在4小時(shí)以后顯示尿NGAL，而缺血5分鐘的只能在6小時(shí)之后分泌NGAL(圖5)。因此，NGAL在尿中的出現(xiàn)看起來與腎缺血的量(dose)和持續(xù)時(shí)間(duration)相關(guān)。實(shí)施例2在大鼠中ARF的誘導(dǎo)之后立即在尿中容易地檢測(cè)到NGAL蛋白因?yàn)橛嘘P(guān)對(duì)腎動(dòng)脈阻塞的反應(yīng)中的物種差異存在爭(zhēng)論，下面我們檢驗(yàn)了NGAL在不同動(dòng)物模型，即建好的腎缺血-再灌注損傷的大鼠模型的行為。應(yīng)用尿肌酸酐濃度以使上樣一致，NGAL在大鼠腎缺血之前的尿中缺失。與此明顯相反的是，NGAL在損傷的3小時(shí)以內(nèi)(在缺血后的第一次尿出物中)顯示為25kDa免疫反應(yīng)性，如圖6所示。比較起來，此缺血損傷模型中的血清肌酸酐只在再灌注的M小時(shí)之后升高(未給出)。再一次，在僅僅1μ1的未處理的尿中可檢測(cè)到NGAL，而且在整個(gè)檢驗(yàn)期間(再灌注的M小時(shí))持續(xù)。實(shí)施例3在早期輕微缺血之后在培養(yǎng)的人近端小管細(xì)胞中NGALmRNA被誘導(dǎo)為了確認(rèn)來自缺血的近端小管細(xì)胞的NGAL的來源，我們修改了先前描述的體外缺血的操作，所述體外缺血是培養(yǎng)的人近端小管細(xì)胞(RPTEC)中通過ATP消耗造成的。在Iym抗霉素中溫育產(chǎn)生溫和的部分ATP消耗，在1小時(shí)內(nèi)變?yōu)閷?duì)照物的大約83士3%，到6小時(shí)為止更緩慢地下降為對(duì)照物的大約75士3%(來自四個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值+/-SD)。此溫和ATP消耗的形態(tài)學(xué)結(jié)果是不可辨別的。NGALmRNA在靜息細(xì)胞中剛剛可以檢測(cè)。然而，部分ATP消耗后，快速的依賴于持續(xù)時(shí)間的NGALmRNA誘導(dǎo)通過RT-PCR是明顯可見的，如圖7所示ο在體外早期缺血之后在培養(yǎng)基中容易地檢測(cè)到NGAL蛋白我們下一步在輕微ATP消耗后RPTEC細(xì)胞和培養(yǎng)基中檢測(cè)NGAL蛋白表達(dá)。NGAL蛋白在對(duì)照RPTEC細(xì)胞中是可以檢測(cè)的，而且ATP消耗之后，它的表達(dá)以依賴于持續(xù)時(shí)間的方式增加，如圖7所示。在來自對(duì)照細(xì)胞的培養(yǎng)基中沒有發(fā)現(xiàn)NGAL免疫反應(yīng)性蛋白，但是NGAL在輕微ATP消耗的1小時(shí)以內(nèi)可容易地檢測(cè)到。注意到NGAL蛋白豐度的進(jìn)一步增加與ATP消耗的持續(xù)時(shí)間相關(guān)。這些結(jié)果說明，誘導(dǎo)的NGAL蛋白迅速地分泌到培養(yǎng)基中，類似于NGAL在體內(nèi)腎缺血后的尿中的快速出現(xiàn)。實(shí)施例4在小鼠輕微腎毒血癥早期的尿中容易地檢測(cè)到NGAL蛋白為了測(cè)定腎毒血癥是否造成尿中NGAL蛋白的表達(dá)，由此說明其作為腎毒性腎損傷的早期非侵入性生物標(biāo)記物的用途在小鼠中誘導(dǎo)順氯氨鉬誘導(dǎo)的腎毒血癥。在順氯氨鉬腎毒性的已建立的小鼠模型中，NGAL在順氯氨鉬給藥的一天之內(nèi)的尿中可容易地檢測(cè)到(圖8A，下行軌跡)。相比之下，在順氯氨鉬給藥2天后幾乎檢測(cè)不到尿β2-微球蛋白，并且直到順氯氨鉬給藥后4-5天仍不能可靠地檢測(cè)尿β2-微球蛋白(圖8，圖面Α，上行軌跡)。類似地，增加的尿NAG分泌直到順氯氨鉬給藥后的4和5天才是明顯的(圖8，圖面B)。順氯氨鉬腎毒性的特征在于腎小管細(xì)胞的凋亡和壞死給予小鼠單次順氯氨鉬的腹膜內(nèi)注射，其劑量為5mg/kg或20mg/kg體重。對(duì)照小鼠和那些接受較大劑量順氯氨鉬的小鼠中的結(jié)果在圖9中顯示。較大的劑量導(dǎo)致小管細(xì)胞壞死，通過用蘇木紫-曙紅染色的切片中存在腎小管擴(kuò)張、內(nèi)腔碎片和展平的上皮而得到證明(中上圖)。也通過顯示濃縮的強(qiáng)烈-染色的細(xì)胞核，證明了小管細(xì)胞在經(jīng)受程序性細(xì)胞死亡(programmedcelldeath)(右上圖)。這通過TUNEL實(shí)驗(yàn)得到證實(shí)，其顯示細(xì)胞凋亡所特有的濃縮的、破碎的細(xì)胞核(中下和右下圖)。在對(duì)照腎中沒有檢測(cè)到壞死或細(xì)胞凋亡(左上和左下圖)。以較小劑量順氯氨鉬處理的小鼠腎也顯示正常，與未處理的對(duì)照物相似(未給出)。圖9是5次單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的代表。NGAL蛋白在腎小管中被順氯氨鉬快速誘導(dǎo)由于NGAL在腎的缺血性損傷之后被誘導(dǎo)(17)，檢測(cè)了對(duì)于順氯氨鉬-誘導(dǎo)的腎毒性損傷的反應(yīng)。通過Western分析，NGAL在來自對(duì)照小鼠的腎裂解物中幾乎檢測(cè)不到，但在順氯氨鉬給藥O0mg/kg)的3小時(shí)之內(nèi)被快速地誘導(dǎo)，如圖10所示。腎NGAL表達(dá)增加，此增加依賴于持續(xù)時(shí)間，在48小時(shí)具有峰值并且持續(xù)上調(diào)直到96小時(shí)。這些結(jié)果通過免疫熒光染色確認(rèn)，在圖11中顯示。在注射順氯氨鉬之后3小時(shí)(3h)(右上圖)和12小時(shí)(1)(左下圖)收獲的腎顯示NGAL蛋白的誘導(dǎo)。在12小時(shí)收獲的切片的高倍放大圖(HP)(右下圖)也在圖11中顯示。左下圖中的箭頭表示在HP圖中顯示的區(qū)域。NGAL在順氯氨鉬注射3小時(shí)之內(nèi)主要在近端小管細(xì)胞中被誘導(dǎo)，但在對(duì)照小鼠(Con)的細(xì)胞中缺失(左上圖)?；谒罹壞さ拇嬖?、核與細(xì)胞大小的比例以及細(xì)胞形態(tài)鑒定這些切片中的近端小管。誘導(dǎo)的NGAL在近端小管細(xì)胞中以點(diǎn)狀細(xì)胞質(zhì)分布出現(xiàn)，其類似于一種分泌的蛋白。誘導(dǎo)的NGAL在近端小管細(xì)胞中以點(diǎn)狀細(xì)胞質(zhì)分布出現(xiàn)，其類似于一種分泌的蛋白。這種表達(dá)模式與在缺血再灌注損傷的小鼠模型中所觀察到的相類似(17)。腎小球沒有NGAL表達(dá)，而且表達(dá)NGAL的中性白細(xì)胞是不明顯的。圖11代表在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的5個(gè)動(dòng)物。在大劑量順氯氨鉬之后的尿中可容易地檢測(cè)到NGAL蛋白在大劑量順氯氨鉬(20mg/kg)之后的尿中檢測(cè)到NGAL蛋白，由此說明其作為腎毒性腎損傷的早期非侵入性的生物標(biāo)記物的應(yīng)用。采用尿肌酸酐濃度以使上樣一致，NGAL在缺血之前的尿中基本上缺失。與此明顯相反的是，在所有檢測(cè)的動(dòng)物中，順氯氨鉬損傷(20mg/kg)的3小時(shí)以內(nèi)容易地檢測(cè)到尿NGAL，如圖12(上圖)中所示。此條帶作為NGAL的身份在獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)組中建立，其中將初級(jí)抗體與重組小鼠脂籠蛋白一起預(yù)-溫育以完全阻斷此免疫反應(yīng)性(未給出)。在僅僅5μ1的未處理的尿中通過Western分析可容易地檢測(cè)到NGAL。尿NGAL分泌增加，此增加依賴于持續(xù)時(shí)間，在48小時(shí)具有峰值并且持續(xù)上調(diào)直到96小時(shí)。然后，我們將尿NGAL分泌與先前建立的損傷標(biāo)記物，如NAG進(jìn)行比較。鑒于尿NGAL在順氯氨鉬的3小時(shí)之內(nèi)是明顯的，然而尿NAG分泌只有在損傷的96小時(shí)之后才顯著地增加(中圖)。此外，通過血清肌酸酐測(cè)量評(píng)價(jià)腎功能，只有在順氯氨鉬的96小時(shí)之后才顯示顯著的改變(下圖)。此圖代表在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的5個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。甚至在小劑量順氯氨鉬之后的尿中也可以檢測(cè)到NGAL蛋白對(duì)不同的小鼠組進(jìn)行僅5μg/kg的順氯氨鉬注射以在臨床癥狀不明顯的腎毒性損傷之后確定尿NGAL檢測(cè)的敏感性，在圖13中顯示。在這些動(dòng)物僅僅5μ1的未處理的尿中可檢測(cè)到NGAL(上圖)，盡管其出現(xiàn)從量上相比20μg/kg順氯氨鉬的動(dòng)物顯得較小(圖12，上圖)。因此，尿中出現(xiàn)的NGAL與腎毒素的劑量相關(guān)。鑒于尿NGAL分泌在順氯氨鉬的3小時(shí)之內(nèi)是明顯的，這組動(dòng)物中的尿NAG分泌甚至在損傷的96小時(shí)之后也沒有顯著地增加(中圖)。此外，通過血清肌酸酐測(cè)量評(píng)價(jià)腎功能顯示，甚至在小劑量順氯氨鉬的96小時(shí)之后，血清肌酸酐也沒有顯著地改變(下圖)。此實(shí)施例說明，NGAL是比目前采用的生物標(biāo)記物更敏感的腎毒性的生物標(biāo)記物。順氯氨鉬之后的尿NGAL分泌依賴于劑量和持續(xù)時(shí)間對(duì)尿NGAL分泌定量以確定其作為順氯氨鉬給藥后的腎損傷嚴(yán)重程度的指標(biāo)的應(yīng)用，在圖14中顯示。這需要表達(dá)和純化已知量的NGAL用作標(biāo)準(zhǔn)。通過SDS-PAGE在考馬斯藍(lán)染色后分析重組NGAL蛋白，顯示適當(dāng)大小的單一蛋白條帶(左上圖)。已知濃度的等分試樣的Western印跡顯示在3-lOOng/ml范圍內(nèi)信號(hào)強(qiáng)度的線性增加(右上圖)。然后通過與這些重組純化的NGAL的定義的標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行比較測(cè)定尿中NGAL的量。20μg/kg順氯氨鉬之后，尿NGAL分泌增加，此增加依賴于持續(xù)時(shí)間(下圖)。相似的、盡管有些遲鈍的反應(yīng)在以導(dǎo)致臨床癥狀不明顯的腎毒性損傷的順氯氨鉬劑量處理的動(dòng)物中是明顯的。實(shí)施例5從腎移植后2小時(shí)的患者得到尿樣，所述的腎移植是缺血性腎損傷的可預(yù)測(cè)的人體模型，在圖15中顯示。與得到來自活體親屬供者(圖A)的腎的患者(n=6)相比，得到尸體的腎的患者(n=4)具有增加的尿NGAL，其通過Western印跡和ELISA容易地檢測(cè)到，所述尸體的腎在移植之前在冰上儲(chǔ)存一段時(shí)間。在尿NGAL和冷缺血時(shí)間之間有顯著的關(guān)聯(lián)，說明NGAL分泌與腎損傷的程度成正比(圖B)(r=0.98，Spearmananalysis)。尿NGAL與血清肌酸酐峰值之間也有顯著的關(guān)聯(lián)(圖C)(r=0.96，Spearmananalysis)。著重強(qiáng)調(diào)的是，移植的2小時(shí)之內(nèi)測(cè)定的尿NGAL可以預(yù)測(cè)如血清肌酸酐峰值反映的ARF，所述血清肌酸酐峰值出現(xiàn)在幾天以后。來自正常人對(duì)照或來自患慢性腎衰竭的患者的尿中含有的NGAL量幾乎檢測(cè)不到，這說明尿NGAL上調(diào)對(duì)于急性腎損傷是特異性的(未給出)。同樣地，來自患尿路感染和腎移植排異(兩種與中性白細(xì)胞相關(guān)的病癥)的患者的尿中只含有最小量的NGAL(未給出)，容易與在尸體的腎移植中明顯較大的量(>lOOng/ml)相區(qū)別。這些數(shù)據(jù)顯示，NGAL是腎移植之后的急性腎損傷的新型早期尿生物標(biāo)記物。實(shí)施例6預(yù)期地從15位開心手術(shù)后的患者得到系列尿樣，具有在圖16中顯示的結(jié)果。尿NGAL通過Wfestern印跡和ELISA定量，并發(fā)現(xiàn)它在15位患者里的5位中升高(圖A)。每條線代表一位病人。血清肌酸酐從基線的％變化在圖A的右邊顯示。同樣的5位患者發(fā)生手術(shù)后的急性腎衰竭，所述的急性腎衰竭定義為血清肌酸酐從基線增加50%或者50%以上，得到大約33%的發(fā)病率。在沒有發(fā)生急性腎衰竭的10位患者中，尿NGAL分泌有小的早期的增加(2小時(shí)的肌酸酐值為6.O士2.Ong/mg)，所述小的早期的增加在手術(shù)后12小時(shí)內(nèi)迅速地歸一化到幾乎無(wú)法檢測(cè)的水平(圖A)。與此明顯相反的是，后來發(fā)生急性腎衰竭的患者顯示，尿NGAL的2小時(shí)的值增長(zhǎng)10倍以上(75士lOng/mg肌酸酐)，而尿NGAL的4小時(shí)的值增長(zhǎng)20倍以上(120士12ng/mg肌酸酐)。尿NGAL的量與心肺旁路(cardiopulmonarybypass)時(shí)間之間有關(guān)聯(lián)性，這說明NGAL分泌與腎損傷的程度成正比(圖B)(r=0.76,Spearman分析)。尿NGAL與血清肌酸酐峰值之間也有顯著的關(guān)聯(lián)性(圖C)(r=0.66，Spearman分析)。再次著重強(qiáng)調(diào)的是，心臟手術(shù)的2小時(shí)內(nèi)測(cè)定的尿NGAL可以預(yù)測(cè)如血清肌酸酐峰值反映的ARF，所述血清肌酸酐峰值出現(xiàn)在幾小時(shí)或甚至幾天以后。這些數(shù)據(jù)顯示，NGAL是開心手術(shù)之后的急性腎損傷的新型早期尿生物標(biāo)記物，而且它的定量可以在這一易感群體中預(yù)測(cè)急性腎衰竭。盡管已結(jié)合優(yōu)選的實(shí)施例描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員在閱讀了前述的說明書之后，能夠?qū)υ谶@里列出的主題實(shí)施各種改變、同等物的置換和修改。因此，本發(fā)明可以通過除了在此具體描述的方法之外的方法實(shí)施。因此，此處的保護(hù)僅受到附加的權(quán)利要求和其同等物的限制。參考文獻(xiàn)1.MuramatsuY，TsujieM,KohdaYiPhamBiPerantoniAO,ZhaoH,JoS-KiYuenPST,CraigL，HuX，StarRA:Earlydetectionofcysteinerichprotein61(CYR61,CCN1)inurinefollowingrenalischemiareperfusioninjury.KidneyInt621601-1610,20022.YoshidaT,KureliaM，BeatoF,MinH,IngelfingerJR,StearsRL,SwinfordRD，GullansSR，TangS_S:Monitoringchangesingeneexpressioninrenalischemia-reperfusionintherat.KidneyInt61:1646-1654,20023.SupavekinS，ZhanhW,KucherlapatiR，KaskelFJ,MooreLC,DevarajanPDifferentialgeneexpressionfollowingearlyrenalischemia-reperfusion.KidneyInt63:1714-1724,20034.NogaeS,MiyazakiM，KobayashiN，SaitoT，AbeK，SaitoH，NakanePK,NakanishiY,KojiTInductionofapoptosisinischemia-reperfusionmodelofmousekidney:PossibleinvolvementofFas.JAmSocNephrol9:620-631,19985.DaemenMARC,VandeVenMWCM，HeinemanE，BuurmanWAInvolvementofendogenousinterleukin-IOandtumornecrosisfactor-αinrenalischemia-reperfusioninjury.Transplantation67:792-800,19996.KellyKJ,PlotkinZ，DagherPC:Guanosinesupplementationreducesapoptosisandprotectsrenalfunctioninthesettingofischemicinjury.JClinInvest108:1291-1298,20017.BurneNJ，RabbH-Pathophysiologicalcontributionsoffucosyltransferasesinrenalischemiareperfusioninjury.JImmunol1692648-2652,20028.FeldenbergLR，ThevanantherS，delRioM，DeLeonM，DevarajanP:PartialATPdepletioninducesFas—andcaspase—mediatedapoptosisinMDCKcelIs.AmJPhysiol276(Renalphysiol45):F837_F846，19999.DevarajanP，DeLeonM，TalasazanF，SchoenfeldAR,DavidowitzEJ,BurkRD:ThevonHippel-LindaugeneproductinhibitsrenalcellapoptosisviaBcl-2-dependentpathways.JBiolChem276:40599-40605,200110.MolitorisBA,WeinbergJM,VenkatachalamMA,ZagerRA，NathKA,GoligorskyMS:AcuterenalfailureII.Experimentalmodelsofacuterenalfailureimperfectbutindispensable.AmJPhysiolRenalPhysiol278Fl-F12，200011.KjeldsenL，CowlandJB,BorregaardN:Humanneutrophilgelatinase-associatedlipocalinandhomologousproteinsinratandmouse.BiochimBiophysActa1482:272-283,200012.MegyesiJ,SafirsteinRL,PricePMJnductionofp21WAF1/CIP/SDlinkidneytubulecellsaffectsthecourseofcisplatin-inducedacuterenalfailure.JCl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