專利名稱：用于顯微鏡觀察的植物樣品的前處理方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于顯微鏡觀察的植物樣品的前處理方法，特別是一種植物材料超薄切片、半超薄切片、表面掃描樣品制作前的處理方法，屬于顯微鏡樣品制作技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
顯微技術(shù)已成為現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)研究中不可缺少的重要工具。透射與掃描電子顯微鏡在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、材料學(xué)及其他學(xué)科方面有著廣泛應(yīng)用，與光學(xué)顯微鏡相比，具有高分辨率、高放大倍數(shù)和可做高分辨圖像的特點(diǎn)，利用它可以獲得生物組織細(xì)胞精細(xì)的超微結(jié)構(gòu)， 顯微結(jié)構(gòu)或立體結(jié)構(gòu)圖像，為物體組織表面或斷面的精細(xì)結(jié)構(gòu)的研究提供了光學(xué)顯微鏡技術(shù)所不能得到的大量信息，為研究微觀世界開辟了新的領(lǐng)域。而光學(xué)顯微鏡可為生物組織顯微結(jié)構(gòu)的觀察提供較廣的視野，提供生物細(xì)胞顯微水平的結(jié)構(gòu)信息。細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、顯微結(jié)構(gòu)、表面形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察的效果，關(guān)鍵是樣品的制備，而樣品制備的關(guān)鍵步驟是材料的有效、快速固定。作物高產(chǎn)與穩(wěn)產(chǎn)是提高我國經(jīng)濟(jì)安全和糧食安全的重要因素。目前，對作物細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、顯微結(jié)構(gòu)以及表面特征及其變化的觀察是評價作物抗逆性、適應(yīng)性及其高產(chǎn)性狀的重要方面，作物高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、水肥高效利用機(jī)理等日益成為生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)；因而，電子與光學(xué)顯微鏡樣品的制備與觀察也成為該領(lǐng)域研究的重要手段。然而，受眾多因素和繁雜實(shí)驗(yàn)步驟的影響，顯微鏡樣品的制備與觀察往往難以成功。很多作物，例如小麥、玉米、水稻等我國重要農(nóng)作物，其莖、葉表面為硅質(zhì)細(xì)胞層，并包裹有臘質(zhì)角質(zhì)層，阻礙固定液在有效時間內(nèi)進(jìn)入組織細(xì)胞，使得材料不能充分固定，嚴(yán)重影響顯微鏡下的觀察效果，甚至導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)前功盡棄。另外，很多作物由于表面污物障礙而使掃描電子顯微鏡的觀察效果大打折扣。例如，小麥白粉病為真菌性病害，發(fā)病初期，葉片、葉鞘和莖稈，甚至麥穗產(chǎn)生白色粉狀小霉斑，表面覆有一層白色粉質(zhì)；水稻、小麥等作物莖、葉表面具有一層疏水性的白色蠟質(zhì)角質(zhì)層；大豆由于較長而密集的腺毛以及經(jīng)常發(fā)生的霜霉病導(dǎo)致葉片表面黏附較多的雜塵等異物；檉柳、補(bǔ)血草、濱藜等泌鹽植物，從土壤中吸收鹽分，部分鹽離子如鉀、鈉、鈣、 鎂、氯和硫離子等會通過鹽腺分泌出來，形成白色的結(jié)晶體粘附于葉片或莖的表面。以上黏附于材料表面的異物很難用常規(guī)方法去除，特別是對材料體積較小而又需要及時固定的樣品。因此，顯微鏡觀察植物樣品的快速、有效固定以及表面黏附物體的潔凈是保證植物細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、顯微結(jié)構(gòu)、組織表面形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察的關(guān)鍵步驟。公開號為。C W673722A(申請?zhí)枮?00510067183. X)的中國專利，公開了一種細(xì)胞凝集素探針。它設(shè)有組分I、II、III，其中；III為樣品固定體系，選自魯格氏碘液、多聚甲醛和戊二醛中的一種，魯格氏碘液的濃度為10% 20%，魯格氏碘液的終濃度為0. 5% 1. 5%，多聚甲醛的濃度為10% 20%，多聚甲醛的終濃度為0. 5% 1. 5%，戊二醛的濃度為20% 25%，戊二醛的終濃度為1. 0% 2. 5%。該申請中的固定體系是用來固定赤潮生物，由于赤潮生物中不存在作物表面的硅質(zhì)細(xì)胞層和蠟質(zhì)角質(zhì)層，因此該固定液無法在有效時間內(nèi)進(jìn)入組織細(xì)胞，無法充分固定材料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于顯微鏡觀察的植物樣品的前處理方法，該方法可有效地提高植物細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、顯微結(jié)構(gòu)、表面形態(tài)結(jié)構(gòu)的固定與表面的潔凈，提高植物樣品制作的成功率與觀察效果。本發(fā)明解決技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案是用于顯微鏡觀察的植物樣品的前處理方法，步驟如下(1)吸取固定液2_3ml置入容積5_10ml的器皿中，然后冷卻，得樣品固定液；(2)將植物組織切成l_3m3的組織塊，然后置入步驟(1)制得的樣品固定液中，密封器皿；(3)對步驟( 制得的密封后的器皿抽氣，使植物組織塊全部沉到器皿底部；然后將器皿放入超聲波清洗器，調(diào)整水溫，工作頻率40-60kHz，功率0. 3-0. 6w/cm2,清洗2_5分鐘，得清洗樣品；(4)將步驟(3)制得的清洗樣品在4°C下固定2-4小時，得經(jīng)前處理的植物樣品。所述步驟(1)中的固定液通過如下方法配制將戊二醛和多聚甲醛分別加入至磷酸緩沖液中，使戊二醛的終濃度為2. 2-2.8% (體積百分比)，多聚甲醛的終濃度為2. 8-3. 2% (重量體積百分比)，磷酸緩沖液終濃度為 IOOmM0優(yōu)選的，所述戊二醛的終濃度為2. 5% (體積百分比)，多聚甲醛的終濃度為3% (重量體積百分比)。優(yōu)選的，所述重量體積百分比單位為g/ml。優(yōu)選的，所述的磷酸緩沖液的pH = 7. 2。所述步驟(1)中的冷卻溫度為4_8°C。所述步驟C3)將器皿放入超聲波清洗器，使器皿的80%沒入清洗槽的水中。所述步驟(3)中調(diào)整水溫至4_8°C。經(jīng)前處理的植物樣品隨后的處理可按常規(guī)超薄切片、半薄切片、掃描電子顯微鏡觀察樣品制作方法等現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行處理。有益效果1、本發(fā)明的采用超聲波清洗器處理植物組織塊，通過超聲波所具有的空化效應(yīng)， 增大介質(zhì)分子的運(yùn)動速度及穿透力，激活固定液戊二醛和多聚甲醛分子，消除組織細(xì)胞間隙微小氣泡對固定液入滲的阻礙，有效提升植物材料的固定效果，同時起到材料表面清潔的效果；2、超聲波清洗器對于不可避免的需要隔離的材料必須間接處理，即放在容器中再置于清洗槽內(nèi)進(jìn)行，本發(fā)明所采用的特定的超聲波頻率和功率使得固定液分子具有很強(qiáng)的穿透力，使得間接處理與直接處理有著同樣的效果；3、本發(fā)明的操作步驟均是在4_8°C下進(jìn)行，細(xì)胞中的蛋白水解酶類、脂肪酶類、淀粉酶類等處于鈍化狀態(tài)，避免以上酶類對細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及有機(jī)大分子的降解，有利于穩(wěn)定細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、顯微結(jié)構(gòu)以及表面形態(tài)結(jié)構(gòu)，使觀察效果達(dá)到最佳狀態(tài)；
4、樣品固定液中加入3%的多聚甲醛，多聚甲醛溶解于水后解聚為分子量較小的單體或寡聚體，可快速通過細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)膜滲透到細(xì)胞內(nèi)部，起到快速固定的效果；5、本發(fā)明可有效地提高植物材料組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的固定與表面潔凈效果，使細(xì)胞內(nèi)葉綠體、線粒體、細(xì)胞核等膜系統(tǒng)清晰度顯著增加；對諸如胞間連絲等在常規(guī)操作中難以觀察到的細(xì)胞組分其固定效果更為顯著；同時，由于對材料表面進(jìn)行了有效的清潔，因而在掃面電子顯微鏡下對組織表皮細(xì)胞排列、氣孔分布、腺毛、鹽腺等植物材料表面形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察更為清晰；6、本發(fā)明操作簡單，所用的超聲波清洗器為實(shí)驗(yàn)室中的常規(guī)儀器，成本低，便于應(yīng)用；7、本發(fā)明適用于所有需要固定的植物樣品的制作，特別是對表面有較厚的蠟質(zhì)角質(zhì)層、表層為硅質(zhì)細(xì)胞的植物材料，例如小麥、玉米、水稻等莖、葉組織，應(yīng)用效果更佳。


圖1是按照實(shí)施例1的方法制得的樣品在透射電子顯微鏡下觀察的照片；圖2是按照實(shí)施例1中的對照例的方法制得的樣品在透射電子顯微鏡下觀察的照片；圖3是按照實(shí)施例2的方法制得的樣品在光學(xué)顯微鏡下觀察的照片；圖4是按照實(shí)施例2中的對照例的方法制得的樣品在光學(xué)顯微鏡下觀察的照片；圖5是按照實(shí)施例3的方法制得的樣品在掃描電子顯微鏡下觀察的照片；圖6是按照實(shí)施例3中的對照例的方法制得的樣品在掃描電子顯微鏡下觀察的照片。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。戊二醛購自Sigma公司，多聚甲醛購自上海試一化學(xué)試劑有限公司。實(shí)施例1、用于小麥穗下莖組織細(xì)胞固定、透射電子顯微鏡下對超微結(jié)構(gòu)的觀察用于顯微鏡觀察的植物樣品的前處理方法，步驟如下(1)吸取固定液2_3ml置入容積5ml的小玻璃瓶中，然后冷卻至4°C，得樣品固定液，固定液通過如下方法配制將戊二醛和多聚甲醛分別加入至pH7. 2的磷酸緩沖液中，使戊二醛得終濃度為 2.5% (體積百分比)，多聚甲醛的終濃度為3% (重量體積百分比，g/ml)，磷酸緩沖液終濃度為IOOmM ；(2)將穗下莖切成Im3的組織塊，然后置入步驟(1)制得的樣品固定液中，小瓶用橡膠瓶蓋蓋緊；(3)將醫(yī)用注射器針頭插入步驟( 制得的用橡膠瓶蓋蓋緊的小瓶內(nèi)，抽氣3-5分鐘，以樣品全部沉到瓶底為準(zhǔn)；然后將器皿放入超聲波清洗器，使器皿的80%沒入清洗槽的水中，調(diào)整水溫至4-8°C，工作頻率40-60kHz，功率0. 3-0. 6w/cm2,清洗2_5分鐘，得清洗樣品；(4)將步驟(3)制得的清洗樣品在4°C下固定2-4小時，得經(jīng)前處理的植物樣品。
(5)按照《實(shí)用電子顯微鏡技術(shù)》(ISBN:978-7-206-05491-4，2007年12月出版)49-66頁的記載，隨后的操作步驟與常規(guī)超薄切片的制作相同。將最終制作的小麥穗下莖稈組織細(xì)胞超薄切片在透射電子顯微鏡下觀察，觀察結(jié)果如圖1所示(標(biāo)尺=lym)。對照例按照《實(shí)用電子顯微鏡技術(shù)》(ISBN :978-7-206-05491-4, 2007年12月出版)49-66 頁的記載進(jìn)行操作，將最終制作的小麥穗下莖稈組織細(xì)胞超薄切片在透射電子顯微鏡下觀察，觀察結(jié)果如圖2所示(標(biāo)尺=lym)。通過將實(shí)施例1的結(jié)果圖1與對照例的結(jié)果圖2進(jìn)行比較，可以得出，用本發(fā)明制作的超薄切片所觀察的小麥莖稈組織細(xì)胞其超微結(jié)構(gòu)觀察效果顯著提高，即使衰老的莖細(xì)胞其葉綠體中類囊體片層也非常清晰，說明本發(fā)明可有效對表面有較厚蠟質(zhì)角質(zhì)層、硅質(zhì)細(xì)胞層的小麥莖組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)快速固定。實(shí)施例2、用于小麥穗下莖組織固定、光學(xué)顯微鏡下對顯微結(jié)構(gòu)的觀察用于顯微鏡觀察的植物樣品的前處理方法，步驟如下(1)吸取固定液2_3ml置入容積8ml的小玻璃瓶中，然后冷卻至4°C，得樣品固定液，固定液通過如下方法配制將戊二醛和多聚甲醛分別加入至pH7. 2的磷酸緩沖液中，使戊二醛得終濃度為 2.5% (體積百分比)，多聚甲醛的終濃度為3% (重量體積百分比，g/ml)，磷酸緩沖液終濃度為IOOmM ；(2)將穗下莖切成3m3的組織塊，然后置入步驟(1)制得的樣品固定液中，小瓶用橡膠瓶蓋蓋緊；(3)將醫(yī)用注射器針頭插入步驟( 制得的用橡膠瓶蓋蓋緊的小瓶內(nèi)，抽氣5-8分鐘，以樣品全部沉到瓶底為準(zhǔn)；然后將器皿放入超聲波清洗器，使器皿的80%沒入清洗槽的水中，調(diào)整水溫至4-8°C，工作頻率40-60kHz，功率0. 3-0. 6w/cm2,清洗3_5分鐘，得清洗樣品；(4)將步驟(3)制得的清洗樣品在4°C下固定2-4小時，得經(jīng)前處理的植物樣品。(5)按照《實(shí)用電子顯微鏡技術(shù)》(ISBN:978-7-206-05491-4，2007年12月出版)49-66頁和68頁的記載，隨后的操作步驟與常規(guī)超薄切片的制作相同。將最終制作的小麥穗下莖稈組織細(xì)胞超薄切片在光學(xué)顯微鏡下觀察，觀察結(jié)果如圖3所示(標(biāo)尺=200 μ m)。對照例按照《實(shí)用電子顯微鏡技術(shù)》(ISBN :978-7-206-05491-4, 2007年12月出版)49-66 頁和68頁的記載進(jìn)行操作，將最終制作的小麥穗下莖稈組織細(xì)胞超薄切片在光學(xué)顯微鏡下觀察，觀察結(jié)果如圖4所示(標(biāo)尺= 200μπι)。通過將實(shí)施例2的結(jié)果圖3與對照例的結(jié)果圖4進(jìn)行比較，可以得出，用本發(fā)明制作的半超薄切片所觀察的小麥莖稈組織細(xì)胞其顯微結(jié)構(gòu)觀察效果顯著提高，其薄壁細(xì)胞中葉綠體數(shù)目明顯多于對照例中的葉綠體數(shù)目，說明本發(fā)明可有效對材料體積較大、表面有較厚蠟質(zhì)角質(zhì)層、硅質(zhì)細(xì)胞層的小麥莖組織細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)快速固定。實(shí)施例3、用于小麥穗下莖組織表面的固定、掃描電子顯微鏡下對表面形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察用于顯微鏡觀察的植物樣品的前處理方法，步驟如下(1)吸取固定液2_3ml置入容積IOml的小玻璃瓶中，然后冷卻至4°C，得樣品固定液，固定液通過如下方法配制將戊二醛和多聚甲醛分別加入至pH7. 2的磷酸緩沖液中，使戊二醛得終濃度為 2.5% (體積百分比)，多聚甲醛的終濃度為3% (重量體積百分比，g/ml)，磷酸緩沖液終濃度為IOOmM ；(2)將小麥葉片組織切成3m3的組織塊，然后置入步驟⑴制得的樣品固定液中， 小瓶用橡膠瓶蓋蓋緊；(3)將醫(yī)用注射器針頭插入步驟( 制得的用橡膠瓶蓋蓋緊的小瓶內(nèi)，抽氣5-8分鐘，以樣品全部沉到瓶底為準(zhǔn)；然后將器皿放入超聲波清洗器，使器皿的80%沒入清洗槽的水中，調(diào)整水溫至4-8°C，工作頻率40-60kHz，功率0. 3-0. 6w/cm2,清洗3_5分鐘，得清洗樣品；(4)將步驟(3)制得的清洗樣品在4°C下固定2-4小時，得經(jīng)前處理的植物樣品。(5)按照《實(shí)用電子顯微鏡技術(shù)》(ISBN:978-7-206-05491-4，2007年12月出版)89-99頁的記載，隨后的操作步驟與常規(guī)超薄切片的制作相同。將最終制作的小麥穗下莖組織表面在掃描電子顯微鏡下觀察，觀察結(jié)果如圖5所示(標(biāo)尺=30 μ m)。對照例按照《實(shí)用電子顯微鏡技術(shù)》(ISBN :978-7-206-05491-4, 2007年12月出版)89-99 頁的記載進(jìn)行操作，將最終制作的小麥穗下莖組織表面在掃描電子顯微鏡下觀察，觀察結(jié)果如圖6所示(標(biāo)尺=30 μ m)。通過將實(shí)施例3的結(jié)果圖5與對照例的結(jié)果圖6進(jìn)行比較，可以得出，用本發(fā)明制作的超薄切片所觀察的小麥穗下莖組織表面非常潔凈，其氣孔等表面形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察效果顯著提高，說明本發(fā)明可有效對表面有白色蠟質(zhì)層的小麥莖組織表面進(jìn)行有效清洗。
權(quán)利要求
1.用于顯微鏡觀察的植物樣品的前處理方法，其特征在于，步驟如下(1)吸取固定液2-3ml置入容積5-10ml的器皿中，然后冷卻，得樣品固定液；(2)將植物組織切成l_3m3的組織塊，然后置入步驟(1)制得的樣品固定液中，密封器皿；(3)對步驟( 制得的密封后的器皿抽氣，使植物組織塊全部沉到器皿底部；然后將器皿放入超聲波清洗器，調(diào)整水溫，工作頻率40-60kHz，功率0. 3-0. 6w/cm2,清洗2_5分鐘，得清洗樣品；(4)將步驟(3)制得的清洗樣品在4°C下固定2-4小時，得經(jīng)前處理的植物樣品。
2.如權(quán)利要求1所述的前處理方法，其特征在于，所述步驟(1)中的固定液通過如下方法配制將戊二醛和多聚甲醛分別加入至磷酸緩沖液中，使戊二醛的終濃度為2. 2-2. 8% (體積百分比)，多聚甲醛的終濃度為2. 8-3.2% (重量體積百分比)，磷酸緩沖液終濃度為 IOOmM0
3.如權(quán)利要求2所述的前處理方法，其特征在于，所述戊二醛的終濃度為2.5% (體積百分比)，多聚甲醛的終濃度為3% (重量體積百分比)。
4.如權(quán)利要求2所述的前處理方法，其特征在于，所述重量體積百分比單位為g/ml。
5.如權(quán)利要求2所述的前處理方法，其特征在于，所述的磷酸緩沖液的pH= 7. 2。
6.如權(quán)利要求1所述的前處理方法，其特征在于，所述步驟(1)中的冷卻溫度為 4-8 "C。
7.如權(quán)利要求1所述的前處理方法，其特征在于，所述步驟C3)將器皿放入超聲波清洗器，使器皿的80%沒入清洗槽的水中。
8.如權(quán)利要求1所述的前處理方法，其特征在于，所述步驟(3)中調(diào)整水溫至4-8°C。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于顯微鏡觀察的植物樣品的前處理方法，屬于顯微鏡樣品制作技術(shù)領(lǐng)域。步驟如下(1)吸取固定液置入器皿中，冷卻，得樣品固定液；(2)將植物組織切成組織塊，然后置入步驟(1)制得的樣品固定液中，密封器皿；(3)對步驟(2)制得的密封后的器皿抽氣；然后將器皿放入超聲波清洗器，清洗2-5分鐘，得清洗樣品；(4)將步驟(3)制得的清洗樣品固定2-4小時，得經(jīng)前處理的植物樣品。本發(fā)明通過超聲波所具有的空化效應(yīng)，增大介質(zhì)分子的運(yùn)動速度及穿透力，激活固定液戊二醛和多聚甲醛分子，消除組織細(xì)胞間隙微小氣泡對固定液入滲的阻礙，有效提升植物材料的固定效果，同時起到材料表面清潔的效果。
文檔編號G01N1/34GK102175501SQ20111000321
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月7日
發(fā)明者馮波, 司紀(jì)升, 孔令安, 宋華東, 張賓, 李升東, 王法宏 申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所