專利名稱：用于檢測致癌基因C-myc重組蛋白的LSPR傳感芯片的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于腫瘤細胞中蛋白含量檢測技術(shù)領域，涉及一種用于檢測致癌基因 C-myc重組蛋白的傳感芯片及其方法。
背景技術(shù)：
C-myc是一種原癌基因，在調(diào)節(jié)DNA合成、細胞凋亡、分化及細胞周期的進程中起重要作用。由C-myc基因編碼的C-myc重組蛋白不僅在細胞生命活動如細胞增殖、細胞分化和細胞周期中有極其重要的作用，而且還密切地參與了細胞腫瘤的轉(zhuǎn)化。C-myc重組蛋白的表達與很多癌組織和細胞腫瘤的啟動及癌性程度密切相關(guān)。目前針對蛋白質(zhì)、抗原、抗體的檢測方法分別有Bradford法以及傳統(tǒng)生物學酶聯(lián)免疫吸附測定法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，并沒有專門針對C_myc重組蛋白的檢測方法。而Bradford法抗干擾性、選擇性不好；傳統(tǒng)的ELISA方法僅能做到定性或半定量，上述方法操作繁瑣、精度低，使其應用受到限制。因此需要尋找一種能夠快速定量地檢測C-myc重組蛋白的方法。本發(fā)明提供了一種基于金納米粒子的局域表面等離子體共振(LSPR)光譜技術(shù)的生物傳感檢測芯片及其方法，能簡便、快速、定量地檢測癌變組織中C-myc重組蛋白的含量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供了一種致癌基因C-myc重組蛋白檢測用的LSI5R 傳感芯片及其方法，其特征在于利用基于金納米粒子表面產(chǎn)生的局域表面等離子體共振光譜技術(shù)實現(xiàn)快速、簡便、定量地檢測癌變組織中C-myc重組蛋白的含量，即所述LSra傳感芯片的檢測方法是通過固定于傳感芯片上的C-myc單克隆抗體與C-myc重組蛋白的免疫反應結(jié)合，引起芯片上金納米粒子表面產(chǎn)生局域表面等離子體共振光譜吸收峰的位移，與C-myc 重組蛋白含量成線性響應關(guān)系而達到檢測目的。為解決上述問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案采用磁控濺射鍍膜法，在聚苯乙烯塑料、硅氧化物玻璃表面鍍上一層金膜(30 300nm)，通過控制鍍膜真空度< 1.0乂10_節(jié) 鍍膜速度^1.0 A/s，使所述金膜表面平整光滑， 形成金平板電極。然后將Piranha溶液(注=Piranha溶液為濃硫酸雙氧水=7 3的溶液)滴加在金平板電極金膜表面浸潤5 30s，取出用二次蒸餾水反復沖洗3次處理后，將上述電極依次浸泡在無水乙醇和二次蒸餾水中超聲5 600s。然后將上述電極浸入10 200mmol/L的1，4_ 二硫蘇糖醇(DTT)/乙醇溶液中，放置1 24h，可在金膜表面組裝上一層DTT單分子膜層。分別用無水乙醇、二次蒸餾水反復沖洗后，將上述電極浸入納米金溶膠溶液(粒徑大小為5 50nm)中放置1 24h，這樣金納米粒子可通過Au-S鍵固定在金平板電極金膜表面形成金納米粒子層，用二次蒸餾水反復沖洗干凈，并保存于二次蒸餾水中備用。將上述電極浸入0. 1 lOOmmol/L的3_巰基丙酸中，靜置1 24h，可在金納米粒子層表面修飾上3-巰基丙酸單分子層；用二次蒸餾水反復沖洗后，滴加1 200mmol/ L DMAP-EDC的乙醇溶液(注DMAP為4- 二甲氨基吡啶，EDC為1-乙基_(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺)于電極上活化1 30min，再分別用乙醇、二次蒸餾水反復沖洗干凈。經(jīng)過DMAP-EDC活化，在上述電極上滴加O 2. 6 μ g/mL C-myc單克隆抗體水溶液，反應3 600min后，使3-巰基丙酸與C-myc單克隆抗體鍵合，C-myc單克隆抗體的吸附量范圍為 0. 01 0. 4g -πιΓ1 ·πιπΓ2 ；再用二次蒸餾水沖洗干凈，保存于4°C環(huán)境中備用，即得C-myc單克隆抗體修飾的Lsra傳感芯片。當入射光照射傳感芯片，入射光子頻率與金納米粒子上的自由電子的集體振動發(fā)生共振時，導致金納米粒子表面的局部電場被增強，反射光能量增強，從而展現(xiàn)出強烈的表面等離子體吸收，其局域表面等離子體共振光譜的吸收峰范圍在200 700nm之間。當 C-myc單克隆抗體與C-myc重組蛋白結(jié)合后，等離子體共振頻率變小，共振吸收峰向長波方向移動，該峰位移與待測C-myc重組蛋白含量在6. 5 X 10_3 1. 3 μ g/mL范圍內(nèi)成線性響應關(guān)系，檢測下限達到6. 5ng/mL，可實現(xiàn)在線動態(tài)監(jiān)測、快速定量檢測致癌基因C-myc重組蛋白分子的目的。同時，所述LSra傳感芯片對癌變組織中C-myc重組蛋白含量能進行準確測定，其回收率為92. 31 109. 23%，在癌癥疾病預測和治療等生物醫(yī)學方面具有非常重要的應用前景和經(jīng)濟價值。

本發(fā)明的有益效果是，該LSra傳感芯片與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)相比，靈敏度高，選擇性和重現(xiàn)性好，且具有組裝簡便、定量快速、可實現(xiàn)多通道檢測等優(yōu)點。


圖ι是LSra傳感芯片敏感膜結(jié)構(gòu)示意圖。圖2是基于金納米粒子的局域表面等離子體共振光譜檢測示意圖。圖3是傳感芯片的局域表面等離子共振吸收峰位移與c-myc重組蛋白濃度的對應關(guān)系曲線圖，其在6. 5X10—3 1.3 μ g/mL范圍的標準曲線(見圖3內(nèi)插圖)方程為Δ λ = -9. 5075Χ 1(Γ5+1· 9156C其中Δ λ表示為最大吸收峰位移值(nm)，C表示C-myc重組蛋白的濃度(μ g/ mL)。上述關(guān)系曲線是在室溫25°C時繪制的。圖1、2中，1.厚度均勻的金膜，2. DTT自組裝單分子層，3.金納米粒子層，4.3-巰基丙酸單分子層，5. C-myc單克隆抗體，6. C-myc重組蛋白。
具體實施例方式實施例1LSPR傳感芯片的組裝制備1)采用磁控濺射鍍膜法在聚苯乙烯塑料、硅氧化物玻璃基質(zhì)表面鍍上一層IOOnm 的金膜，通過控制鍍膜真空度為1. O X IO-4Pa,鍍膜速度為1.0 A/s，使所述金膜表面平整光滑，形成金平板電極；2)將Piranha溶液(注=Piranha溶液為濃硫酸雙氧水=7 3的溶液)滴加在金平板電極表面浸潤15s，取出后用二次蒸餾水反復沖洗3次；3)將上述電極依次浸泡在無水乙醇和二次蒸餾水中超聲60s ；
4)將上述電極浸入50mmol/L的DTT溶液中，放置10h，形成DTT單分子層， 用無水乙醇反復沖洗3次以去除表面游離的DTT，再用二次蒸餾水反復沖洗干凈；5)將上述電極浸入粒徑為10. 5nm的納米金溶膠中，放置24h，取出后用二次蒸餾水反復沖洗干凈，這樣金納米粒子通過Au-S鍵固定在金平板電極金膜表面形成金納米粒子層，然后保存于二次蒸餾水中備用；6)將上述電極浸入lOmmol/L的3-巰基丙酸中，靜置6h，在金納米粒子上形成 3_巰基丙酸單分子層，然后用二次蒸餾水沖洗干凈；7)用二次蒸餾水反復沖洗后，滴加lOOmmol/LDMAP-EDC的乙醇溶液(注DMAP為 4_ 二甲氨基吡啶，EDC為1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺)于電極上活化lOmin， 再分別用乙醇、二次蒸餾水反復沖洗干凈；8)在上述電極上滴加2. 4 μ g/mL C-myc單克隆抗體水溶液，反應60min后，再用二次蒸餾水沖洗干凈，保存于4°C環(huán)境中備用，即制得用于檢測致癌基因C-myc重組蛋白的 C-myc單克隆抗體修飾的LSI3R傳感芯片。實施例2C-myc重組蛋白標準曲線的測定1)所用試劑(二次蒸餾水、PBS緩沖溶液)經(jīng)滅菌處理后均保存于4°C環(huán)境中備用；2)取1 μ L C-myc重組蛋白(抗原)置于1. 5mL小試管中，以PBS為緩沖溶液，分別稀釋ι 100000倍，配制成0 6. 5 μ g/mL的一系列溶液備用；3)采用上述C-myc單克隆抗體修飾的LSI3R傳感芯片分別測試各濃度的C-myc重組蛋白樣品，通過C-myc單克隆抗體與C-myc重組蛋白的免疫反應結(jié)合，引起芯片上金納米粒子局域表面等離子體共振光譜吸收峰紅移，該峰位移與C-myc重組蛋白含量成線性響應關(guān)系；以C-myc重組蛋白的濃度C( μ g/mL)為橫坐標，最大吸收峰位移值Δ λ (nm)為縱坐標，繪制測定C-myc重組蛋白樣品濃度的標準曲線(見圖3內(nèi)插圖)，通過C-myc對應濃度的LSra吸收峰位移信號，即可測定出癌變組織樣品中的C-myc重組蛋白的含量；4)測試完后，用0. lmol/LHCl溶液洗脫回復，再分別用PBS緩沖溶液、二次蒸餾水沖洗干凈，可保存于4°C環(huán)境中備用。實施例3肝癌組織中C-myc重組蛋白含量的測定組織中蛋白的提取取0. Ig組織標本，在4°C環(huán)境下用預冷的PBS沖洗干凈除去組織異物。用剪刀剪成0. 5mm3小塊并加入配置好的LOmL裂解液，再用PBS稀釋備用。C-myc重組蛋白含量的測定將上述制備好的LSI3R傳感芯片置于PBS緩沖溶液中，先記錄PBS緩沖溶液的吸收峰波長位置讀數(shù)X1 = SSSjTm^取上述稀釋后的樣品溶液進行測定，記錄吸收峰波長位置讀數(shù)λ 2 = 354. 68nm。該樣品的吸收峰位移值(Δ λ，nm) 可由下式得出Δ λ = X2-X1JE Δ λ代入到擬合好的標準曲線方程中，即可算出該肝癌組織樣品中C-myc重組蛋白的濃度值為0. 632μ g/mL。檢測結(jié)果表明肝癌組織中致癌基因 C-myc高表達，與ELISA的檢測結(jié)果一致，且該芯片能進行定量檢測，優(yōu)于ELISA方法，說明該方法能對癌變組織中的C-myc重組蛋白含量進行準確測定，具有通用性。實施例4
乳腺癌細胞中C-myc重組蛋白含量檢測采集乳腺組織樣品，在實驗室進行培養(yǎng)，得到C-myc突變的腫瘤細胞 (MDA-MB-231)。培養(yǎng)條件:L_15培養(yǎng)基，15% (胎?；蛐∨?血清，5% C02, 37攝氏度溫箱中培養(yǎng)。細胞生長狀態(tài)上皮樣貼壁生長。取0. Ig組織標本，在4°C的環(huán)境下用預冷的PBS沖洗干凈除去組織異物。用剪刀剪成0. 5mm3小塊并加入配置好的1. OmL裂解液，再用PBS稀釋備用。取上述稀釋后的樣品溶液，用所制備LSra傳感芯片進行測試，峰位移為0. 23nm, 代入到擬合好的標準曲線方程中，可以算出乳腺癌細胞稀釋液中的C-myc含量為120ng/ mL。檢測結(jié)果表明致癌基因C-myc高表達，與ELISA的檢測結(jié)果一致，且該芯片能進行定量檢測，優(yōu)于ELISA方法，說明該方法能對癌變組織中的C-myc重組蛋白含量進行準確測定， 具有通用性。實施例5回收率的測定本實施例測定LSra傳感芯片對不同濃度C-myc重組蛋白樣品的回收率，并與 ELISA方法比較。在已知濃度溶液中加入已知量的C-myc樣品溶液，然后測定各樣品的吸收峰，計算位移值△ λ，對照工作曲線找出濃度，比較測得的加入量和實際加入量，所得回收率在92. 31 109. 23%范圍，平均回收率為100. 66%，而ELISA僅能做出定性檢測，說明本發(fā)明方法優(yōu)于ELISA法，且回收率好，在致癌基因C-myc重組蛋白檢測方面具有實際應用價值。實施例6選擇性的測定固定主響應C-myc重組蛋白濃度為1. 08 μ g/mL，增大干擾物質(zhì)濃度為主響應蛋白濃度100倍，即干擾蛋白濃度為108yg/mL。所考察的干擾蛋白分別為牛血清白蛋白、豬血紅蛋白、牛白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、人血紅蛋白、凝血酶、溶菌酶。當C-myc重組蛋白的濃度為 1. 08 μ g/mL的時候，LSPR吸收峰位移為2. 07士0. 07nm。當加入濃度為響應蛋白濃度100 倍的干擾物時，吸收峰位置的移動偏差均在5%以內(nèi)，由此可見，上述蛋白物質(zhì)對C-myc單克隆抗體識別C-myc重組蛋白的過程不會產(chǎn)生明顯的干擾影響，說明所述LSra傳感芯片對 C-myc重組蛋白有很好的特異選擇性。實施例7重現(xiàn)性的測定本實施例測定LSI3R傳感芯片對響應不同濃度C-myc重組蛋白溶液的吸收峰位置的重現(xiàn)性，對650ng/mL和260ng/mL的C-myc重組蛋白樣品重復測定12次，獲得的相對標準偏差分別為3. 22%和1. 56%，說明所述LSra傳感芯片有著良好的重現(xiàn)性，確保了所測實驗數(shù)據(jù)的準確性。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測致癌基因c-myc重組蛋白(6)的LSI5R傳感芯片，其特征在于利用金納米粒子表面產(chǎn)生的局域表面等離子體共振(LSPR)光譜對C-myc重組蛋白(6)的含量進行測定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的LSPR傳感芯片，其特征在于所述LSPR傳感芯片的制備過程如下1)采用磁控濺射鍍膜法，在聚苯乙烯塑料、硅氧化物玻璃基質(zhì)表面鍍上一層金膜(1)， 通過控制鍍膜真空度< 1.0\10_節(jié) 鍍膜速度幻.0 A/s，使所述金膜(1)表面平整光滑，形成金平板電極；2)將Piranha溶液(注=Piranha溶液為濃硫酸雙氧水=7 3的溶液)滴加在金平板電極金膜(1)表面浸潤5 30s，取出后用二次蒸餾水反復沖洗3次；3)將上述電極依次浸泡在無水乙醇和二次蒸餾水中超聲5 600s；4)將上述電極浸入10 200mmol/L的1，4-二硫蘇糖醇(DTT)/乙醇溶液中，放置1 24h，形成DTT單分子層(2)，用無水乙醇反復沖洗3次以去除表面游離的DTT，再用二次蒸餾水反復沖洗干凈；5)將上述電極浸入納米金溶膠溶液中，放置1 24h，取出后用二次蒸餾水反復沖洗干凈，這樣金納米粒子通過Au-S鍵固定在金平板電極金膜(1)表面形成金納米粒子層(3)，然后保存于二次蒸餾水中備用；6)將上述電極浸入0.1 lOOmmol/L的3-巰基丙酸中，靜置1 24h，在金納米粒子層(3)上形成3-巰基丙酸單分子層(4)；7)用二次蒸餾水反復沖洗后，滴加1 200mmol/LDMAP-EDC的乙醇溶液(注DMAP 為4-二甲氨基吡啶，EDC為1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺)于電極上活化1 30min，再分別用乙醇、二次蒸餾水反復沖洗干凈；8)在上述電極上滴加0 2.6 μ g/mL C-myc單克隆抗體水溶液，反應3 600min后， 再用二次蒸餾水沖洗干凈，保存于4°C環(huán)境中備用，即得C-myc單克隆抗體(5)修飾的LSI5R 傳感芯片。
3.根據(jù)權(quán)利要求ι所述的Lsra傳感芯片，其特征在于所述LSra傳感芯片的檢測方法是通過固定于傳感芯片上的C-myc單克隆抗體(5)與C-myc重組蛋白(6)的免疫反應結(jié)合，引起芯片上金納米粒子層(3)表面產(chǎn)生局域表面等離子體共振光譜吸收峰的位移，與 C-myc重組蛋白(6)含量成線性響應關(guān)系。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的Lsra傳感芯片，其特征在于在聚苯乙烯塑料、硅氧化物玻璃基質(zhì)表面所鍍金膜(1)的厚度控制為30 300nm之間。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的Lsra傳感芯片，其特征在于所述金溶膠溶液中金納米粒子的粒徑大小在5 50nm之間。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的LSra傳感芯片，其特征在于固定于LSra傳感芯片上的C-myc 單克隆抗體(5)的吸附量在0. 01 0. 4g · mL—1 · mm 2之間。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的LSI^R傳感芯片，其特征在于所述LSI^R傳感芯片上金納米粒子層(3)表面所展現(xiàn)的局域表面等離子體共振光譜的吸收峰范圍在200 700nm之間。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的LSPR傳感芯片，其特征在于所述LSPR傳感芯片對癌變組織中C-myc重組蛋白(6)含量能進行準確測定，其回收率為92. 31 109. 23%，線性范圍為(6. 5 X IO"3 1· 3 μ g/mL，檢測下限達至IJ 6. 5ng/mL。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種基于局域表面等離子體共振(LSPR)光譜檢測致癌基因C-myc重組蛋白(6)的LSPR傳感芯片。本發(fā)明是在LSPR傳感芯片的金膜(1)表面組裝上一層DTT單分子層(2)，接上金納米粒子層(3)，在所述金納米粒子層(3)表面修飾上3-巰基丙酸單分子層(4)，然后通過DMAP-EDC活化，使所述的3-巰基丙酸單分子層(4)與C-myc單克隆抗體(5)結(jié)合，通過C-myc單克隆抗體(5)與C-myc重組蛋白(6)的免疫反應結(jié)合，引起金納米粒子表面產(chǎn)生局域表面等離子體共振吸收峰的位移，以此來檢測癌變組織中C-myc重組蛋白(6)的含量。本發(fā)明的效果和益處在于所述LSPR傳感芯片具有組裝簡便、定量快速、可實現(xiàn)多通道檢測，且靈敏度高、選擇性和重現(xiàn)性好，優(yōu)于傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)。
文檔編號G01N21/55GK102175649SQ201110000089
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月4日
發(fā)明者何婧琳, 孫立賢, 張玲, 戴云林, 曹忠, 曾巨瀾, 王明星, 黃茜茜 申請人:長沙理工大學