專利名稱：Dna微陣列中的探針設(shè)計(jì)方法、具有利用該方法設(shè)計(jì)的探針的dna微陣列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及例如設(shè)計(jì)用于檢測(cè)基因組DNA中的突變的DNA微陣列中的探針的方法、具有利用該方法設(shè)計(jì)的探針的DNA微陣列、使用該DNA微陣列的突變檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
在以單核苷酸多態(tài)性(SNP)為代表的多態(tài)性中，有可將同種生物中的變異作為帶有特征的突變而利用的多態(tài)性。即，同種生物的規(guī)定的變異可通過(guò)檢測(cè)、鑒定所謂多態(tài)性的基因組DNA中的特定的突變從而與其它突變區(qū)別。另外，通過(guò)檢測(cè)、鑒定該突變，從而能指定供試的生物的變異。作為這種檢測(cè)基因組DNA中的突變的方法，已知有對(duì)突變位置進(jìn)行直接 序列確定的方法，利用限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)的方法，利用擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)的方法等。另外，已知有利用被稱為DArT (Diversity ArrayTechnology)法的DNA微陣列的、基于多態(tài)性鑒定的突變的解析方法(Nucleic AcidsResearch, 2001, Vol. 29, No. 4, e25)。將DArT法所使用的DNA微陣列的制作方法示于圖9。首先，從特定生物種中提取基因組DNA，使用限制性內(nèi)切酶A和限制性內(nèi)切酶B將基因組DNA片段化。接著，在由限制性內(nèi)切酶處理得到的基因組DNA片段的兩端部連結(jié)接頭，將各基因組DNA片段克隆到載體上。然后，使用能與該接頭雜交的引物利用PCR擴(kuò)增各基因組DNA片段。接著，將擴(kuò)增的各基因組DNA片段作為探針在基板上點(diǎn)樣，由此制作DNA微陣列。使用這樣制作的DNA微陣列，可以解析供試生物種的突變。首先，由供試生物提取基因組DNA，使用DNA微陣列制作時(shí)利用的限制性內(nèi)切酶A和限制性內(nèi)切酶B將基因組DNA片段化。對(duì)于片段化的基因組DNA，與DNA微陣列制作時(shí)同樣地連結(jié)接頭，通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)±曾。用熒光標(biāo)記等將擴(kuò)增的基因組DNA片段標(biāo)記化，與在DNA微陣列上點(diǎn)樣的探針雜交。檢測(cè)標(biāo)記化的基因組DNA片段與探針的雜交的有無(wú)，由此能解析DNA微陣列制作時(shí)所使用的特定的生物種與所述供試生物種的區(qū)別。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)DArT法，通過(guò)使用如上所述制作的DNA微陣列，能夠在基因組DNA中的基因型水平判定生物種的多樣性。但是，在如上所述制作的DNA微陣列中，存在作為被限制性內(nèi)切酶識(shí)別部位夾入的區(qū)域而規(guī)定的探針的檢測(cè)能力不充分的問(wèn)題。即，即使在來(lái)自供試生物種的基因組DNA片段中包含例如SNP等細(xì)微突變，也有時(shí)對(duì)DNA微陣列中的探針發(fā)生雜交。換言之，DArT法中，存在如果不是在限制性內(nèi)切酶識(shí)別部位存在多態(tài)性等突變、或者不是在數(shù)百堿基對(duì)范圍存在缺失時(shí)就不能檢測(cè)的檢測(cè)極限。因此，本發(fā)明鑒于上述情況，目的在于提供基因組DNA所含有的SNP等多態(tài)性的檢測(cè)效率優(yōu)異的DNA微陣列中的探針的設(shè)計(jì)方法、具有利用該方法設(shè)計(jì)的探針的DNA微陣列以及使用了該DNA微陣列的突變檢測(cè)方法。鑒于上述情況，本發(fā)明人等進(jìn)行了認(rèn)真研究，研究出了即使是基因組DNA中的SNP等的細(xì)微突變也能以優(yōu)異的靈敏度進(jìn)行檢測(cè)的探針的設(shè)計(jì)方法、以及使用了固定有該探針的DNA微陣列的突變檢測(cè)方法。本發(fā)明包含以下內(nèi)容。S卩，本發(fā)明的探針的設(shè)計(jì)方法，包括對(duì)于來(lái)源于對(duì)象生物的基因組DNA所含有的、被限制性內(nèi)切酶識(shí)別部位夾入的基因組DNA片段，指定具有比該基因組DNA片段短的堿基長(zhǎng)度且覆蓋該片段內(nèi)的至少一部分的I個(gè)或多個(gè)區(qū)域的步驟；將指定的I個(gè)或多個(gè)區(qū)域作為用于檢測(cè)供試生物中的上述片段的探針來(lái)進(jìn)行設(shè)計(jì)的步驟。所述I個(gè)或多個(gè)區(qū)域能夠通過(guò)以下工序指定。 (Ia)提取所述基因組DNA的工序，(Ib)用所述限制性內(nèi)切酶將提取的基因組DNA消化的工序，(Ic)將接頭連結(jié)到所述(Ib)中得到的基因組DNA片段的工序，(Id)使用與所述接頭雜交的引物將所述基因組DNA片段擴(kuò)增的工序，(Ie)確定擴(kuò)增的所述基因組DNA片段的堿基序列的工序，(If)基于確定的堿基序列來(lái)確定所述I個(gè)或多個(gè)區(qū)域的工序。在此，在所述(Ib)中，可以用多種限制性內(nèi)切酶消化所述基因組DNA，也可以用單獨(dú)的限制性內(nèi)切酶消化所述基因組DNA。另外，在所述(Ic)中，作為所述接頭，優(yōu)選使用具有與所述(Ib)中得到的基因組DNA片段的突出末端互補(bǔ)序列的接頭。另外，在所述(If)中確定的區(qū)域例如是20 10000堿基長(zhǎng)度，優(yōu)選是100 8000堿基長(zhǎng)度，更優(yōu)選是200 6000堿基長(zhǎng)度。另外，所述I個(gè)或多個(gè)區(qū)域可以使用與所述基因組DNA相關(guān)的堿基序列信息通過(guò)以下工序而指定。(2a)由與所述基因組DNA相關(guān)的堿基序列信息檢索所述限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列，指定用所述限制性內(nèi)切酶消化所述基因組DNA時(shí)產(chǎn)生的基因組DNA片段的堿基序列的
工序，(2b)基于所述指定的堿基序列來(lái)確定所述I個(gè)或多個(gè)區(qū)域的工序。在此，所述(2b)中確定的區(qū)域例如是20 10000堿基長(zhǎng)度，優(yōu)選是100 8000堿基長(zhǎng)度，更優(yōu)選是200 6000堿基長(zhǎng)度。另外，所述I個(gè)或多個(gè)區(qū)域可以通過(guò)以下工序指定。(3a)提取所述基因組DNA的工序，(3b)用所述限制性內(nèi)切酶將提取的基因組DNA消化的工序，(3c)將接頭連結(jié)到所述(3b)中得到的基因組DNA片段的工序，(3d)使用與所述接頭雜交的引物將所述基因組DNA片段擴(kuò)增的工序，(3e)用其它限制性內(nèi)切酶消化擴(kuò)增的所述基因組DNA片段的工序，(3f)分離所述(3e)中消化得到的DNA片段而作為探針的工序。另外，在本發(fā)明的探針的設(shè)計(jì)方法中，被所述限制性內(nèi)切酶識(shí)別部位夾入的片段可以是由識(shí)別序列不同的多種限制性內(nèi)切酶夾入的片段。在此，在所述(3b)中，可以用多種限制性內(nèi)切酶消化所述基因組DNA，也可以用單獨(dú)的限制性內(nèi)切酶消化所述基因組DNA。另外，在所述(3c)中，作為所述接頭，優(yōu)選使用具有與所述(Ib)中得到的基因組DNA片段的突出末端互補(bǔ)的序列的接頭。另一方面，本發(fā)明的DNA微陣列是將利用上述的本發(fā)明的探針的設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)的探針固定在載體上而形成的。特別優(yōu)選本發(fā)明的DNA微陣列中所述探針是在所述載體上基于序列信息而合成的。另一方面，使用了本發(fā)明的DNA微陣列的突變檢測(cè)方法是使用上述的本發(fā)明的DNA微陣列檢測(cè)來(lái)自檢測(cè)對(duì)象的生物的基因組DNA中的突變的方法。尤其，本發(fā)明的使用了DNA微陣列的突變檢測(cè)方法包括以下工序提取來(lái)自檢測(cè)對(duì)象的生物的基因組DNA的工序；利用具有與本發(fā)明的探針的設(shè)計(jì)方法中使用的限制性內(nèi)切酶相同的識(shí)別序列的限制性內(nèi)切酶來(lái)消化該基因組DNA的工序；將接頭連結(jié)到用限制性內(nèi)切酶處理而得到的基因組DNA片段的工序；使用與所述接頭雜交的引物將所述基因組DNA片段擴(kuò)增的工序；使擴(kuò)增的所述基因組DNA片段與本發(fā)明的DNA微陣列接觸，檢測(cè)該基因組DNA片段與探針的雜交的工序。
在此，在利用所述限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA的工序中，與所述探針的設(shè)計(jì)方法同樣地，可以用多種限制性內(nèi)切酶消化所述基因組DNA，也可以用單獨(dú)的限制性內(nèi)切酶消化所述基因組DNA。另外，在所述連結(jié)接頭的工序中，作為所述接頭，優(yōu)選使用具有與在利用所述限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA的工序中得到的基因組DNA片段的突出末端互補(bǔ)的序列的接頭。另外，擴(kuò)增所述基因組DNA片段的工序可以進(jìn)一步具有在擴(kuò)增的基因組DNA片段附加標(biāo)記分子的工序，可以在擴(kuò)增所述基因組DNA片段時(shí)引入標(biāo)記分子。本說(shuō)明書包含作為本申請(qǐng)優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)的日本國(guó)專利申請(qǐng)2009-283430號(hào)的說(shuō)明書和/或附圖記載的內(nèi)容。根據(jù)本發(fā)明，可以提供基因組DNA所含有的SNP等多態(tài)性的檢測(cè)效率優(yōu)異的、DNA微陣列中的探針的設(shè)計(jì)方法。另外，根據(jù)本發(fā)明，能提供基因組DNA所含有的SNP等多態(tài)性的檢測(cè)效率優(yōu)異的DNA微陣列以及使用了該DNA微陣列的突變檢測(cè)方法。通過(guò)應(yīng)用本發(fā)明，從而以往方法中難以檢測(cè)的、基于基因型的生物種的判定、鑒定之類的解析成為可能。


圖I是示意性地表示應(yīng)用了本發(fā)明的探針的設(shè)計(jì)方法的一個(gè)例子的流程圖。圖2是示意性地表示應(yīng)用了本發(fā)明的探針的設(shè)計(jì)方法的其它例子的流程圖。圖3是示意性地表示應(yīng)用了本發(fā)明的探針的設(shè)計(jì)方法的其它例子的流程圖。圖4是示意性地表示使用具有應(yīng)用本發(fā)明設(shè)計(jì)而成的探針的DNA微陣列，檢測(cè)突變的工序的流程圖。圖5是表示A I和A 2的比對(duì)和設(shè)計(jì)的探針的位置的特性圖。圖6是表示B I和B 2的比對(duì)和設(shè)計(jì)的探針的位置的特性圖。圖7是表示導(dǎo)入探針的突變比例與檢測(cè)的信號(hào)強(qiáng)度的關(guān)系的特性圖。圖8是表示實(shí)施例3中制作的探針的突變部位探針的比例與序列信息中檢測(cè)到突變的比例的關(guān)系的特性圖。圖9是示意性地表示以往的DArT法中使用的DNA微陣列的制作工序的特性圖。
具體實(shí)施例方式以下，參照附圖詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明的DNA微陣列中的探針的設(shè)計(jì)方法、具有利用該設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)的探針的DNA微陣列以及使用了該DNA微陣列的突變檢測(cè)方法。探針的設(shè)計(jì)方法本發(fā)明中設(shè)計(jì)的探針特別優(yōu)選適用于所謂的寡核苷酸微陣列。所謂寡核苷酸微陣列是指在載體上合成具有目的堿基序列的寡核苷酸并將其作為探針的微陣列。在此，作為探針的合成寡核苷酸例如是20 100堿基長(zhǎng)度，優(yōu)選是30 90堿基長(zhǎng)度，更優(yōu)選是50 75堿基長(zhǎng)度。應(yīng)予說(shuō)明，本發(fā)明中設(shè)計(jì)的探針也可以適用于與所謂的斯坦福型微陣列同樣地通過(guò)將具有所述堿基長(zhǎng)度的合成寡核苷酸點(diǎn)樣而固定在載體上的類型的微陣列。S卩，本發(fā)明中設(shè)計(jì)的探針可以適用于以往公知的任何微陣列。因此，本發(fā)明中設(shè)計(jì)的探針也可以適用于以玻璃、聚硅氧烷等平面基板為載體的微陣列，以微球?yàn)檩d體的微球·陣列。具體而言，本發(fā)明的探針的設(shè)計(jì)方法，如圖I所示，首先，從規(guī)定的生物提取基因組DNA (工序la)。作為生物，可以是細(xì)菌、真菌等微生物、昆蟲(chóng)、植物以及動(dòng)物中的任一種。應(yīng)予說(shuō)明，圖I表示的探針的設(shè)計(jì)方法是適合于使用基因組DNA的堿基序列信息不明的生物的情況的例子。另外，基因組DNA的提取方法沒(méi)有特別限定，可以使用以往公知的方法。接著，用I種或多種限制性內(nèi)切酶將提取的基因組DNA消化(工序lb)。應(yīng)予說(shuō)明，在圖I表示的例子中，依次使用限制性內(nèi)切酶A和限制性內(nèi)切酶B這2種限制性內(nèi)切酶來(lái)消化基因組DNA。在此，作為限制性內(nèi)切酶，沒(méi)有特別限定，例如可以使用PstI、EcoRI,Hindi 11、BstNI、HpaI I、HaeII I等。尤其，作為限制性內(nèi)切酶，可以考慮識(shí)別序列的出現(xiàn)頻率等而進(jìn)行適當(dāng)選擇使得完全消化基因組DNA時(shí)形成20 10000堿基長(zhǎng)度的基因組DNA片段。另外，使用多種限制性內(nèi)切酶時(shí)，優(yōu)選使用全部的限制性內(nèi)切酶后的基因組DNA片段形成200 6000堿基長(zhǎng)度。另外，使用多種限制性內(nèi)切酶時(shí)，供處理的限制性內(nèi)切酶的順序沒(méi)有特別限定，另外，處理?xiàng)l件(溶液組成、溫度等)相同時(shí)，可以在同一反應(yīng)系中使用多種限制性內(nèi)切酶。即，在圖I所示的例子中，雖然依次使用限制性內(nèi)切酶A和限制性內(nèi)切酶B消化基因組DNA，但也可以在相同反應(yīng)系同時(shí)使用限制性內(nèi)切酶A和限制性內(nèi)切酶B來(lái)消化基因組DNA，也可以依次使用限制性內(nèi)切酶B和限制性內(nèi)切酶A來(lái)消化基因組DNA。另外，使用的限制性內(nèi)切酶的數(shù)目可以是3種以上。接著，對(duì)限制性內(nèi)切酶處理后的基因組DNA片段結(jié)合接頭(工序lc)。在此，所謂接頭，只要能與由上述的限制性內(nèi)切酶處理而得到的基因組DNA片段的兩端結(jié)合的接頭則沒(méi)有特別限定。作為接頭，例如可以使用具有與由限制性內(nèi)切酶處理形成在基因組DNA的兩末端的突出末端(粘性末端)互補(bǔ)的一條主鏈，具有詳細(xì)內(nèi)容后述的擴(kuò)增處理時(shí)使用的引物能夠雜交的引物結(jié)合序列的接頭。另外，作為接頭，也可以使用具有與所述突出末端(粘接末端)互補(bǔ)的一條主鏈并具有用于編入克隆時(shí)的載體的限制性內(nèi)切酶識(shí)別部位的接頭。另外，使用多種限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA時(shí)，可以準(zhǔn)備與各限制性內(nèi)切酶對(duì)應(yīng)的多種接頭來(lái)使用。即，可以使用分別對(duì)于用多種限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA時(shí)生成的多種突出末端具有互補(bǔ)的一條主鏈的多種接頭。此時(shí)，與多種限制性內(nèi)切酶對(duì)應(yīng)的多種接頭可以具有共同的引物結(jié)合序列使得能夠雜交共同的引物，也可以具有不同引物結(jié)合序列使得能夠雜交各自不同的引物。另外，使用多種限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA時(shí)，作為接頭，也可以準(zhǔn)備與選自使用的多種限制性內(nèi)切酶中的I種限制性內(nèi)切酶或使用的限制性內(nèi)切酶中的一部分限制性內(nèi)切酶對(duì)應(yīng)的接頭來(lái)使用。接著，將在兩末端附加有接頭的基因組DNA片段擴(kuò)增(工序Id)。使用具有引物結(jié)合序列的接頭時(shí)，通過(guò)使用能與該引物結(jié)合序列雜交的引物，從而可以擴(kuò)增所述基因組DNA片段?；蛘撸媒宇^序列將附加接頭的基因組DNA片段克隆到載體上，使用能與該載體的規(guī)定的區(qū)域雜交的引物來(lái)擴(kuò)增基因組DNA片段。應(yīng)予說(shuō)明，作為使用了引物的基因組DNA片段的擴(kuò)增反應(yīng)，可以使用PCR作為一個(gè)例子。另外，使用多種限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA，而且將與各限制性內(nèi)切酶對(duì)應(yīng)的多種接頭連結(jié)在基因組DNA片段時(shí)，通過(guò)使用多種限制性內(nèi)切酶的處理而得到的全部基因組DNA片段連結(jié)有接頭。此時(shí)，通過(guò)使用接頭所含的引物結(jié)合序列進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，從而可 以擴(kuò)增得到的全部基因組DNA片段?；蛘撸褂枚喾N限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA，而且將與選自使用的多種限制性內(nèi)切酶中的I種限制性內(nèi)切酶或使用的限制性內(nèi)切酶中一部分限制性內(nèi)切酶對(duì)應(yīng)的接頭連結(jié)到基因組DNA片段時(shí)，在得到的基因組DNA片段中，可以僅擴(kuò)增兩末端具有選出的限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列的基因組DNA片段。接著，確定擴(kuò)增的基因組DNA片段的喊基序列(工序Ie),指定具有比該基因組DNA片段短的堿基長(zhǎng)度且覆蓋基因組DNA片段內(nèi)的至少一部分的I個(gè)或多個(gè)區(qū)域，將指定的I個(gè)或多個(gè)區(qū)域作為用于檢測(cè)供試生物中的所述擴(kuò)增的基因組DNA片段的探針進(jìn)行設(shè)計(jì)(工序If)。確定基因組DNA片段的堿基序列的方法沒(méi)有特別限定，可使用適用了 Sanger法等的利用了 DNA序列的以往公知的方法。在本工序(工序Ie和If)中，將比擴(kuò)增的基因組DNA片段短的堿基長(zhǎng)度的I個(gè)或多個(gè)區(qū)域作為用于檢測(cè)該基因組DNA片段的探針進(jìn)行設(shè)計(jì)。在此，對(duì)于規(guī)定的基因組DNA片段設(shè)計(jì)多個(gè)區(qū)域時(shí)，意圖使用多種探針檢測(cè)該基因組DNA片段。另外，也可以對(duì)于某個(gè)基因組DNA片段設(shè)計(jì)I個(gè)區(qū)域，對(duì)于其它基因組DNA片段設(shè)計(jì)2個(gè)以上的規(guī)定數(shù)目的區(qū)域。即，可以對(duì)每個(gè)基因組DNA片段設(shè)計(jì)不同數(shù)目的區(qū)域。在此，作為設(shè)計(jì)的區(qū)域，如上所述，例如是20 10000堿基長(zhǎng)度，優(yōu)選是100 8000堿基長(zhǎng)度，更優(yōu)選是200 6000堿基長(zhǎng)度。另外，設(shè)計(jì)多種區(qū)域時(shí)，相鄰區(qū)域可以部分重復(fù)，也可以離開(kāi)數(shù)個(gè)堿基。尤其，優(yōu)選按照用多個(gè)區(qū)域覆蓋確定了堿基序列的基因組DNA片段的全部區(qū)域的方式設(shè)定多個(gè)區(qū)域。此時(shí)，關(guān)于來(lái)自規(guī)定生物的基因組DNA，多種探針與通過(guò)限制性內(nèi)切酶處理而得到的基因組DNA片段對(duì)應(yīng)，用這些多種探針檢測(cè)該基因組DNA片段。但是，本發(fā)明的探針的設(shè)計(jì)方法不限定于如上述所的包含使用限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA的工序的方法，也可以如圖2所示利用對(duì)象生物的基因組信息。在圖2表示的方法中，首先，獲取與來(lái)自對(duì)象生物的基因組相關(guān)的堿基序列信息(工序2a)。與基因組相關(guān)的堿基序列信息可以從以往公知的各種數(shù)據(jù)庫(kù)獲取。作為數(shù)據(jù)庫(kù)，沒(méi)有特別限定，可以適當(dāng)使用DNAData Bank of Japan提供的DDBJ數(shù)據(jù)庫(kù)、EuropeanBioinformatics Institute 提供的 EMBL 數(shù)據(jù)庫(kù)、National Center for BiotechnologyInformation 提供的 Genbank 數(shù)據(jù)庫(kù)、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes 提供的KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)或綜合了這些各種數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)庫(kù)。本方法中，接著，從與獲取的基因組DNA相關(guān)的堿基序列信息中檢索所述限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列(工序2a)，指定用所述限制性內(nèi)切酶消化所述基因組DNA時(shí)產(chǎn)生的基因組DNA片段的堿基序列。在此，作為檢索的識(shí)別序列，是與圖I表示的方法中使用的限制性內(nèi)切酶對(duì)應(yīng)的限制性內(nèi)切酶。即，本工序中，對(duì)于I種或多種限制性內(nèi)切酶檢索其識(shí)別序列。接著，基于確定的基因組DNA片段的堿基序列來(lái)確定覆蓋該基因組DNA片段內(nèi)的至少一部分的I個(gè)或多個(gè)區(qū)域(工序2b)。本工序(工序2b)中，將比堿基序列確定的基因組DNA片段短的堿基長(zhǎng)度的I個(gè)或多個(gè)區(qū)域作為用于檢測(cè)該基因組DNA片段的探針進(jìn)行設(shè)計(jì)。在此，對(duì)規(guī)定的基因組DNA片段設(shè)計(jì)多個(gè)區(qū)域時(shí)，意圖使用多種探針檢測(cè)該基因組DNA片段。另外，也可以對(duì)某個(gè)基因組DNA片段設(shè)計(jì)I個(gè)區(qū)域，對(duì)其它基因組DNA片段設(shè)計(jì)2個(gè)以上的規(guī)定數(shù)目的區(qū)域。即，可以對(duì)每個(gè)基因組DNA片段設(shè)計(jì)不同數(shù)目的區(qū)域。在此，作為設(shè)計(jì)的區(qū)域，如上所述，例如是20 100堿基長(zhǎng)度，優(yōu)選是30 90堿基長(zhǎng)度，更優(yōu)選是 50 75堿基長(zhǎng)度。另外，優(yōu)選按照用多個(gè)區(qū)域覆蓋確定了堿基序列的基因組DNA片段的全部區(qū)域的方式設(shè)定多個(gè)區(qū)域。此時(shí)，關(guān)于來(lái)自規(guī)定生物的基因組DNA，多種探針與通過(guò)限制性內(nèi)切酶處理而得到的基因組DNA片段對(duì)應(yīng)，用這些多種探針檢測(cè)該基因組DNA片段。另外，如圖3所示，本發(fā)明的探針的設(shè)計(jì)方法也可以是不具有確定堿基序列的工序和使用數(shù)據(jù)庫(kù)的堿基序列信息的獲取工序的方法，可以是包括進(jìn)一步用不同的限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA片段的工序的方法。即，在圖3表示的方法中，首先，適用從圖I表示的方法中的工序Ia到工序ld，擴(kuò)增兩末端附加有接頭的基因組DNA片段(工序3a 3d)。接著，用具有與工序3b中使用的限制性內(nèi)切酶不同的識(shí)別序列的其它限制性內(nèi)切酶(以下，限制性內(nèi)切酶C)消化擴(kuò)增的所述基因組DNA片段(工序3e)。利用本工序，工序3d中擴(kuò)增的PCR片段被消化至更短的片段。由此，可以在不確定堿基序列的情況下以多個(gè)DNA片段指定用限制性內(nèi)切酶A和限制性內(nèi)切酶B消化基因組DNA而得到的覆蓋基因組DNA片段內(nèi)的至少一部分的多個(gè)區(qū)域。作為指定的區(qū)域，如上所述，例如是20 100堿基長(zhǎng)度，優(yōu)選是30 90堿基長(zhǎng)度，更優(yōu)選是50 75堿基長(zhǎng)度。換言之，作為限制性內(nèi)切酶C，可使用能將用限制性內(nèi)切酶A和限制性內(nèi)切酶B消化基因組DNA而得到的基因組DNA片段例如切斷成20 100堿基長(zhǎng)度、優(yōu)選為30 90堿基長(zhǎng)度、更優(yōu)選為50 75堿基長(zhǎng)度的DNA片段的限制性內(nèi)切酶。接著，將以限制性內(nèi)切酶C消化而得到的DNA片段按照每種分離而作為探針序3f)。在該工序中，可以將以限制性內(nèi)切酶C消化而得到的DNA片段通過(guò)電泳、其后的切出等進(jìn)行分離。另外，分離的DNA片段可以在進(jìn)一步克隆到載體的狀態(tài)下作為探針，也可以克隆后進(jìn)一步擴(kuò)增作為探針。本方法中，關(guān)于來(lái)自規(guī)定的生物的基因組DNA，多種探針與工序3d中得到的基因組DNA片段對(duì)應(yīng)。DNA微陣列具有如上設(shè)計(jì)的探針的DNA微陣列可以利用以往公知的方法制作。例如，基于由圖I或圖2表示的方法設(shè)計(jì)的各探針的堿基序列，在載體上合成具有目的堿基序列的寡核苷酸，由此可以制作具有由圖I或圖2所示的方法設(shè)計(jì)的探針的DNA微陣列。在此，作為合成寡核苷酸的方法，沒(méi)有特別限定，可以使用以往公知的方法。例如可以適用組合光刻技術(shù)和光照射化學(xué)合成技術(shù)而在載體上合成寡核苷酸的方法。另外，也可以適用基于由圖I或圖2表示的方法設(shè)計(jì)的各探針的堿基序列信息而另外合成末端附加有與載體表面親和性高的連接分子的寡核苷酸，之后固定在載體表面的規(guī)定位置的方法。另外，通過(guò)將由圖3表示的方法設(shè)計(jì)并制作的探針固定在載體上，從而可以制作具有由圖3表示的方法設(shè)計(jì)的探針的DNA微陣列。此時(shí)，例如使用針型點(diǎn)樣儀(C >夕4:/7 ^ \ 一)或噴嘴型點(diǎn)樣儀(7 O夕4 7° 7 X \—)將以圖3表示的方法制作的探針在載體上點(diǎn)樣，由此可以制作DNA微陣列。如上制作的DNA微陣列是相對(duì)于將來(lái)自規(guī)定生物的基因組DNA進(jìn)行限制性內(nèi)切酶處理而得到的基因組DNA片段具有比該基因組DNA片段短的堿基長(zhǎng)度的I種或多種探針的DNA微陣列。即，如上制作的DNA微陣列是用比該基因組DNA片段短的堿基長(zhǎng)度的I種或多種探針檢測(cè)規(guī)定基因組DNA片段的DNA微陣列。特別地作為DNA微陣列，優(yōu)選是相對(duì)于規(guī)定基因組DNA片段具有多種探針，用這些多種探針檢測(cè)該基因組DNA片段的DNA微陣列?！?br> 應(yīng)予說(shuō)明，作為DNA微陣列，可以是將玻璃、聚硅氧烷等的平面基板作為載體的微陣列，將微球作為載體的微球陣列、或在中空纖維的內(nèi)壁固定探針的3維微陣列等的任何類型的微陣列。突變檢測(cè)方法通過(guò)使用如上制作的DNA微陣列，可以檢測(cè)存在于基因組DNA的突變。在此，突變是指同種生物間存在的單核苷酸多態(tài)性等的多態(tài)性、近緣種間存在的堿基序列的區(qū)別、或?qū)σ?guī)定生物人為性導(dǎo)入的突變。更具體而言，如圖4所示，首先，從供試生物提取基因組DNA。該供試生物是指與制作DNA微陣列時(shí)使用的生物進(jìn)行比較的生物。接著，用制作DNA微陣列時(shí)使用的限制性內(nèi)切酶將提取的基因組DNA消化而調(diào)整多個(gè)基因組DNA片段。接著，連結(jié)得到的基因組DNA片段與制作DNA微陣列時(shí)使用的接頭。接著，使用制作DNA微陣列時(shí)使用的引物而擴(kuò)增兩末端附加有接頭的基因組DNA片段。由此，可以將與制作DNA微陣列時(shí)的工序Id中擴(kuò)增的基因組DNA片段、工序2a中指定了堿基序列的基因組DNA片段、工序3d中擴(kuò)增的基因組DNA片段對(duì)應(yīng)的、來(lái)自供試生物的基因組DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。在該工序中，附加了接頭的基因組DNA片段中，可以選擇性擴(kuò)增規(guī)定基因組DNA片段。例如使用與多種限制性內(nèi)切酶對(duì)應(yīng)的多種接頭時(shí)，可以選擇性擴(kuò)增附加有特定的接頭的基因組DNA片段。另外，用多種限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA時(shí)，在得到的基因組DNA片段中，通過(guò)僅在具有與規(guī)定的限制性內(nèi)切酶對(duì)應(yīng)的突出末端的基因組DNA片段附加接頭，從而可以選擇性地?cái)U(kuò)增附加了接頭的基因組DNA片段。這樣，通過(guò)選擇性地?cái)U(kuò)增規(guī)定的基因組DNA片段，從而能夠濃縮。接著，對(duì)擴(kuò)增的基因組DNA片段附加標(biāo)記。作為標(biāo)記，可以使用以往公知的任何物質(zhì)。作為標(biāo)記，例如可以使用熒光分子、色素分子、放射性分子等。應(yīng)予說(shuō)明，通過(guò)在擴(kuò)增基因組DNA片段的工序中使用具有標(biāo)記的核苷酸而可以省略本工序。通過(guò)使用所述工序中具有標(biāo)記的核苷酸來(lái)擴(kuò)增基因組DNA片段，從而擴(kuò)增的DNA片段被標(biāo)記化。接著，在規(guī)定的條件下使具有標(biāo)記的基因組DNA片段接觸DNA微陣列，使固定于DNA微陣列的探針與具有標(biāo)記的基因組DNA片段雜交。此時(shí)，探針對(duì)基因組DNA片段的一部分雜交，但優(yōu)選為存在I個(gè)堿基的不匹配時(shí)不發(fā)生雜交，僅在完全匹配時(shí)雜交的高度嚴(yán)格條件。通過(guò)是這樣的高度嚴(yán)格條件，從而能檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性等細(xì)微突變。應(yīng)予說(shuō)明，嚴(yán)格條件可以用反應(yīng)溫度和鹽濃度調(diào)節(jié)。即，通過(guò)形成更高溫從而得到更高的嚴(yán)格條件，或用更低的鹽濃度得到更高的嚴(yán)格條件。例如，使用50 75堿基長(zhǎng)度的探針時(shí)，作為雜交條件，可以在40 44°C、0. 21SDS、6 X SSC的條件下形成更高的嚴(yán)格條件。另外，探針與具有標(biāo)記的基因組DNA片段的雜交可以基于標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)。S卩，具有上述標(biāo)記的基因組DNA片段與探針的雜交反應(yīng)后，清洗未反應(yīng)的基因組DNA片段等，之后，觀察對(duì)探針特異性雜交的基因組DNA片段的標(biāo)記。例如在標(biāo)記是熒光物質(zhì)時(shí)，檢測(cè)其熒光波長(zhǎng)；如果標(biāo)記是色素分子，則檢測(cè)其色素波長(zhǎng)。更具體而言，可使用用于通常的DNA微陣列解析的熒光檢測(cè)裝置、圖像分析儀等裝置。尤其，如果使用上述的DNA微陣列，則將來(lái)自供試生物的基因組DNA片段利用堿基長(zhǎng)度比該基因組DNA片段短的I種或多種探針進(jìn)行檢測(cè)。在以往的DArT法(圖9)中，利用 PCR將來(lái)自規(guī)定的生物的基因組DNA片段擴(kuò)增而作為探針，所以有時(shí)即使是具有數(shù)十個(gè)堿基不匹配的來(lái)自供試生物的基因組DNA片段，也進(jìn)行雜交(假陽(yáng)性)。但是，在如上述的DNA微陣列中，利用堿基長(zhǎng)度比該基因組DNA片段短的I種或多種探針進(jìn)行檢測(cè)，所以可以減少這種假陽(yáng)性的發(fā)生概率，可以更高精度地檢測(cè)來(lái)自供試生物的基因組DNA片段。尤其，利用多種探針檢測(cè)來(lái)自供試生物的基因組DNA片段時(shí)，通過(guò)檢測(cè)這些多種探針中有無(wú)雜交，從而能檢測(cè)來(lái)自供試生物的基因組DNA片段所含的細(xì)微突變。另外，在上述的DNA微陣列中，能夠檢測(cè)未知的突變。以往，在載體上合成寡核苷酸而形成突變檢測(cè)用的探針的DNA微陣列，僅能將已知序列信息的已知突變作為檢測(cè)對(duì)象。但是，根據(jù)上述的探針的設(shè)計(jì)方法，即使在基因組DNA片段含有序列信息未知的突變，也可以將這些未知的突變作為檢測(cè)對(duì)象。換言之，通過(guò)使用具有上述探針的DNA微陣列，從而可以鑒定未知的突變。如上所述，根據(jù)本發(fā)明的DNA微陣列，能在與制作DNA微陣列時(shí)使用的規(guī)定生物的比較中檢測(cè)供試生物的基因組DNA所含的突變，所以例如可以在基因水平解析同種生物的多樣性。另外，通過(guò)針對(duì)同種生物所包含的各種突變體預(yù)先制作本發(fā)明的DNA微陣列，從而可以在基因水平解析供試生物歸屬于何種突變體。實(shí)施例以下，使用實(shí)施例更加詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，本發(fā)明的技術(shù)范圍不限定于以下的實(shí)施例?！矊?shí)施例I〕本實(shí)施例中，不使用全序列信息和突變信息，通過(guò)按照?qǐng)DI表示的順序設(shè)計(jì)探針，從而能檢測(cè)甘蔗品種NiF8和Ni9的等位基因中的突變。(I)材料使用甘蔗品種NiF8和Ni9。(2)限制性內(nèi)切酶處理按照常法分別從甘蔗品種NiF8和Ni9中提取基因組DNA。用限制性內(nèi)切酶PstI(NEB公司，25unit)在37°C處理基因組DNA (750ng) 2小時(shí)后，添加限制性內(nèi)切酶BstNI(NEB 公司，25unit)，60°C處理 2 小時(shí)。(3)接頭連接在(2)中處理的基因組DNA片段(120ng)中，添加PstI序列接頭(5，-CACGATGGATCCAGTGCA-3’(序列編號(hào) 1)、5’ -CTGGATCCATCGTGCA-3’(序列編號(hào) 2))和T4DNA Ligase (NEB公司，800unit)，在16°C處理一晝夜。由此，在(2)中處理的基因組DNA片段中，對(duì)兩末端具有PstI識(shí)別序列的基因組DNA片段選擇性地附加接頭。(4) PCR 擴(kuò)增在具有(3)中得到的接頭的基因組DNA片段(15ng)中添加PstI序列接頭識(shí)別引物(5 ’ -GATGGATCCAGTGCAG-3 ’(序列編號(hào) 3 ))和 Taq 聚合酶(TAKALA 公司 PrimeSTAR，1.25unit)，用PCR(98°C處理10秒，55°C處理15秒，72°C處理I分鐘，30循環(huán)后，在72°C處理3分鐘后，在4°C保存)擴(kuò)增基因組DNA片段。
(5)基因組序列獲取對(duì)于(4)中PCR擴(kuò)增的基因組DNA片段，利用Sanger法確定堿基序列。其結(jié)果，獲得了來(lái)自NiF8的2種基因組序列信息(A_l (序列編號(hào)4)和B_1 (序列編號(hào)5))。另外，使用基因組序列A_1和B_1的序列信息，獲得了 Ni9的等位基因座區(qū)域的基因組序列信息(A_2 (序列編號(hào)6)和[2 (序列編號(hào)7))(6)探針設(shè)計(jì)基于(5)的基因組序列信息(A_l、B_l)來(lái)分別設(shè)計(jì)5和6個(gè)50 70bp的探針。即，本實(shí)施例中，對(duì)甘蔗品種NiFS設(shè)計(jì)探針。將八_1和八_2的比對(duì)以及設(shè)計(jì)的探針的位置示于圖5。另外，將B_1和B_2的比對(duì)以及設(shè)計(jì)的探針的位置示于圖6。(7)微陣列制造基于設(shè)計(jì)的探針的堿基序列信息而制作具有這些探針的DNA微陣列(委托Roche公司)。(8)樣品的調(diào)整利用上述的(2) (4)的方法，由甘蔗品種NiF8和Ni9分別調(diào)整PCR擴(kuò)增片段。用色譜柱(Qiagen公司)純化PCR擴(kuò)增片段后,加入Cy3-labeled 9mers (TriLink公司，10. D.)，在98°C處理10分鐘后，在冰上靜置10分鐘。之后，加入Klenow (NEB公司，lOOunit)，在37°C處理2小時(shí)。接著，利用乙醇沉淀調(diào)整標(biāo)記化樣品。(9)雜交 信號(hào)檢測(cè)使用(8)的標(biāo)記化樣品，按照NimbleGen Array User’s Guide,使用(7)中制作的DNA微陣列進(jìn)行雜交，檢測(cè)基于標(biāo)記的信號(hào)。(10)突變比例的算出突變比例基于各探針內(nèi)的NiF8和Ni9的等位基因座區(qū)域的基因組序列的相同性來(lái)算出。(11)信號(hào)強(qiáng)度比的算出信號(hào)強(qiáng)度比使用以NiFS作為樣品的陣列的信號(hào)強(qiáng)度除以以Ni9作為樣品的陣列的信號(hào)強(qiáng)度而得的值。(12)結(jié)果和考察將測(cè)定信號(hào)強(qiáng)度而得到的結(jié)果和由其算出的信號(hào)強(qiáng)度比示于表I和表2。
[表 I]
權(quán)利要求
1.一種探針的設(shè)計(jì)方法，包括 對(duì)于來(lái)源于對(duì)象生物的基因組DNA所含有的、被限制性內(nèi)切酶識(shí)別部位夾入的基因組DNA片段，指定具有比該基因組DNA片段短的堿基長(zhǎng)度且覆蓋該基因組DNA片段內(nèi)的至少ー部分的I個(gè)或多個(gè)區(qū)域的步驟； 將指定的I個(gè)或多個(gè)區(qū)域作為探針來(lái)進(jìn)行設(shè)計(jì)的步驟。
2.如權(quán)利要求I所述的探針的設(shè)計(jì)方法，其特征在于，所述I個(gè)或多個(gè)區(qū)域通過(guò)以下エ序指定， (Ia)提取所述基因組DNA的エ序， (Ib)用所述限制性內(nèi)切酶將提取的基因組DNA消化的エ序， (Ic)將接頭連結(jié)到所述(Ib)中得到的基因組DNA片段的エ序， (Id)使用與所述接頭雜交的引物將所述基因組DNA片段擴(kuò)增的エ序， (Ie)確定擴(kuò)增的所述基因組DNA片段的堿基序列的エ序， (If)基于確定的堿基序列來(lái)確定所述I個(gè)或多個(gè)區(qū)域的エ序。
3.如權(quán)利要求2所述的探針的設(shè)計(jì)方法，其特征在于，所述(Ib)中，用多種限制性內(nèi)切酶消化所述基因組DNA。
4.如權(quán)利要求3所述的探針的設(shè)計(jì)方法，其特征在于，所述(Ic)中，連結(jié)與選自所述多種限制性內(nèi)切酶中的I種限制性內(nèi)切酶或使用的所述多種限制性內(nèi)切酶中的一部分限制性內(nèi)切酶對(duì)應(yīng)的接頭。
5.如權(quán)利要求2所述的探針的設(shè)計(jì)方法，其特征在干，作為所述接頭，具有與所述(Ib)中得到的基因組DNA片段的突出末端互補(bǔ)的序列。
6.如權(quán)利要求I所述的探針的設(shè)計(jì)方法，其特征在于，所述I個(gè)或多個(gè)區(qū)域使用與所述基因組DNA相關(guān)的喊基序列/[目息通過(guò)以下エ序指定， (2a)由與所述基因組DNA相關(guān)的堿基序列信息檢索所述限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列，指定用所述限制性內(nèi)切酶消化所述基因組DNA時(shí)產(chǎn)生的基因組DNA片段的堿基序列的エ序，(2b)基于所述指定的堿基序列來(lái)確定所述I個(gè)或多個(gè)區(qū)域的エ序。
7.如權(quán)利要求6所述的探針的設(shè)計(jì)方法，其特征在于，所述(2a)中，確定用多種限制性內(nèi)切酶消化所述基因組DNA時(shí)產(chǎn)生的基因組DNA片段的堿基序列。
8.如權(quán)利要求7所述的探針的設(shè)計(jì)方法，其特征在于，所述(2b)中，針對(duì)被選自所述多種限制性內(nèi)切酶中的I種限制性內(nèi)切酶或使用的所述多種限制性內(nèi)切酶中的一部分限制性內(nèi)切酶夾入的基因組DNA片段，確定所述I個(gè)或多個(gè)區(qū)域。
9.如權(quán)利要求I所述的探針的設(shè)計(jì)方法，其特征在于，所述I個(gè)或多個(gè)區(qū)域通過(guò)以下エ序指定， (3a)提取所述基因組DNA的エ序， (3b)用所述限制性內(nèi)切酶將提取的基因組DNA消化的エ序， (3c)將接頭連結(jié)到所述(3b)中得到的基因組DNA片段的エ序， (3d)使用與所述接頭雜交的引物將所述基因組DNA片段擴(kuò)增的エ序， (3e)用其它限制性內(nèi)切酶消化擴(kuò)增的所述基因組DNA片段的エ序， (3f)分離所述(3e)中消化得到的DNA片段而作為探針的エ序。
10.如權(quán)利要求9所述的探針的設(shè)計(jì)方法，其特征在于，在所述(3b)中，用多種限制性內(nèi)切酶消化所述基因組DNA。
11.如權(quán)利要求3所述的探針的設(shè)計(jì)方法，其特征在于，在所述(3c)中，連結(jié)與選自所述多種限制性內(nèi)切酶中的I種限制性內(nèi)切酶或使用的所述多種限制性內(nèi)切酶中的一部分限制性內(nèi)切酶對(duì)應(yīng)的接頭。
12.如權(quán)利要求9所述的探針的設(shè)計(jì)方法，其特征在干，作為所述接頭，具有與所述(3b)中得到的基因組DNA片段的突出末端互補(bǔ)的序列。
13.如權(quán)利要求I所述的探針的設(shè)計(jì)方法，其特征在于，設(shè)計(jì)20 100堿基長(zhǎng)度的探針。
14.ー種DNA微陣列，具備利用權(quán)利要求I 13中任一項(xiàng)所述的探針的設(shè)計(jì)方法而設(shè)計(jì)的探針和固定該探針的載體。
15.如權(quán)利要求14所述的DNA微陣列，其特征在于，所述探針是在所述載體上基于序列信息而合成得到的。
16.ー種使用了 DNA微陣列的突變檢測(cè)方法，包括 提取來(lái)自檢測(cè)對(duì)象的生物的基因組DNA的エ序， 利用具有與權(quán)利要求I 13中任一項(xiàng)所述的探針的設(shè)計(jì)方法中使用的限制性內(nèi)切酶相同的識(shí)別序列的限制性內(nèi)切酶來(lái)消化該基因組DNA的エ序， 將接頭連結(jié)到用限制性內(nèi)切酶處理而得到的基因組DNA片段的エ序， 使用與所述接頭雜交的引物將所述基因組DNA片段擴(kuò)增的エ序；以及 使擴(kuò)增的所述基因組DNA片段與權(quán)利要求14或15所述的DNA微陣列接觸，檢測(cè)該基因組DNA片段與探針的雜交的エ序。
17.如權(quán)利要求16所述的使用了DNA微陣列的突變檢測(cè)方法，其特征在于，在消化所述基因組DNA的エ序中，用多種限制性內(nèi)切酶消化所述基因組DNA。
18.如權(quán)利要求17所述的使用了DNA微陣列的突變檢測(cè)方法，其特征在于，在所述連結(jié)接頭的エ序中，連結(jié)與選自所述多種限制性內(nèi)切酶中的I種限制性內(nèi)切酶或使用的所述多種限制性內(nèi)切酶中的一部分限制性內(nèi)切酶對(duì)應(yīng)的接頭。
19.如權(quán)利要求16所述的使用了DNA微陣列的突變檢測(cè)方法，其特征在于，作為所述接頭，具有與所述(3b)中得到的基因組DNA片段的突出末端互補(bǔ)的序列。
20.如權(quán)利要求16所述的使用了DNA微陣列的突變檢測(cè)方法，其特征在于，所述檢測(cè)對(duì)象的生物是與制作所述DNA微陣列時(shí)使用的生物不同種的生物。
全文摘要
本發(fā)明提供基因組DNA所含有的SNP等多態(tài)性的檢測(cè)效率優(yōu)異的DNA微陣列中的探針。本發(fā)明的探針的設(shè)計(jì)方法包括對(duì)于來(lái)源于對(duì)象生物的基因組DNA所包含的、限制性內(nèi)切酶識(shí)別的限制性內(nèi)切酶識(shí)別部位夾入的片段，指定覆蓋該片段內(nèi)的至少一部分的1個(gè)或多個(gè)區(qū)域的步驟；將指定的1個(gè)或多個(gè)區(qū)域作為用于檢測(cè)供試生物中的上述片段的探針來(lái)進(jìn)行設(shè)計(jì)的步驟。
文檔編號(hào)G01N33/53GK102753686SQ20108006366
公開(kāi)日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2010年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月14日
發(fā)明者村上亞矢, 榎宏征, 西村哲 申請(qǐng)人:豐田自動(dòng)車株式會(huì)社