專利名稱：用于實施測定法的方法和裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于實施測定法的方法和裝置尤其，本發(fā)明涉及可以用于實施測定法、尤其多步驟測定法的可轉(zhuǎn)動平臺。盡管已經(jīng)主要開發(fā)本發(fā)明用于通過焦磷酸測序法對核酸測序，并且下文將參考這種應(yīng)用描述本發(fā)明，然而將理解，本發(fā)明不限于這種具體使用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
提供以下的現(xiàn)有技術(shù)討論以將本發(fā)明置于適宜的技術(shù)背景下并且能使本發(fā)明的優(yōu)點更充分地理解。然而，應(yīng)當(dāng)理解在本說明書通篇范圍內(nèi)對現(xiàn)有技術(shù)的任何討論不應(yīng)當(dāng)視為表示或暗示承認這種現(xiàn)有技術(shù)是廣泛已知的或形成本領(lǐng)域公知常識的部分。測定DNA核苷酸序列的能力在最近時間變得日益重要。以往，兩種最常使用的DNA測序方法是酶促鏈終止方法和化學(xué)切割技術(shù)，二者均依賴于凝膠電泳以根據(jù)大小解析從更大DNA區(qū)段產(chǎn)生的DNA片段。電泳步驟和檢測分離的DNA片段是繁瑣的過程。然而，盡管自動化電泳裝置是市售的，電泳法不充分適合大規(guī)?；蚪M計劃或臨床測序，在這些情況下需要在高通量情況下相對有成本效益的裝置。因而，對非電泳測序方法的需求是明顯的。能夠快速檢測單一 DNA堿基變化的技術(shù)也是遺傳分析的重要工具。先前描述了基于固相原理的最小測序方案，其中測量放射標記的核苷酸的摻入并且將其用于分析人載脂蛋白E基因的三種等位多態(tài)性。然而，放射性方法不充分適合例行臨床應(yīng)用，并且因而，開發(fā)用于快速DNA序列分析的簡單、非放射性方法還具有意義。先前已經(jīng)描述了基于檢測聚合酶反應(yīng)期間釋放的無機焦磷酸鹽(PPi)的構(gòu)思的測序方法(見國際PCT公開號W093/23564和W089/09283)并且所述方法通常稱作焦磷酸測序法。隨著聚合酶反應(yīng)期間每個核苷酸添加至正在生長的核酸鏈時，釋放焦磷酸分子。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以例如通過螢光素酶-螢光素反應(yīng)中光的產(chǎn)生酶促地檢測在這些條件下釋放的焦磷酸。此類方法能夠鑒定靶位置內(nèi)的堿基并且能夠?qū)NA簡單和快速地測序，同時不需要電泳和使用有害的放射標記物。用于實施焦磷酸測序法的早期現(xiàn)有技術(shù)方法使用O. 2mL微量離心管(或相似物)同時依次添加試劑至該管以檢測該管中存在的DNA的序列。盡管這種方法是相對簡單的，但是該方法遭遇以下缺點讀出長度短，原因是該反應(yīng)因每次添加核苷酸試劑而稀釋和/或反應(yīng)副產(chǎn)物積累并且反應(yīng)條件達到該反應(yīng)不再繼續(xù)進行的程度。例如，通常僅可以用這種方法可靠地測得約80個堿基。也已經(jīng)開發(fā)了利用焦磷酸測序法的商業(yè)設(shè)備。這些系統(tǒng)使用流動小室來進行靶DNA/RNA分子的雜交。旨在解釋，通常通過固定雙鏈DNA并且使互補鏈變性，將單鏈DNA固定在位于流動小室中的靜止珠上。使包含核苷酸(A、G、C或T)的試劑流經(jīng)該珠，并且如果摻入核苷酸，則檢測到光。光的信號強度與單個反應(yīng)中摻入的核苷酸的數(shù)目成正比。在該珠暴露于不同核苷酸之間，還進行洗滌步驟，并且重復(fù)該過程以檢測下一個核苷酸的摻入。
還已知借助合成的其他測序方法，例如通過使用熒光標記的核苷酸。在這種方法中，首先將DNA樣品片段化并且將DNA雙螺旋解鏈成單鏈。在流動小室內(nèi)部的表面上捕獲單鏈DNA分子并且所述單鏈DNA分子充當(dāng)合成測序方法的模板。將熒光標記的核苷酸一次添加一種并且由DNA聚合酶摻入正在生長的互補鏈中。洗去未使用的核苷酸。一旦用激光照亮，則摻入的核苷酸發(fā)射可檢測到的光。在添加下一個核苷酸以繼續(xù)該循環(huán)之前，除去熒光標記物。對核苷酸摻入的追蹤確定每個單獨DNA分子的精確順序。借助連接的測序法也是已知的。這種DNA測序方法使用DNA連接酶來鑒定DNA序列中給定位置處存在的核苷酸。DNA連接酶的錯配敏感性用來確定靶DNA分子的潛藏序列。例如見美國專利號5，750，341和US4, 883，750。需要用于實施測定法和分析的裝置，所述裝置可以隨多種化學(xué)和檢測方法一起使用，和尤其用于實施包括多重反應(yīng)和洗滌步驟(如核酸測序中所用的多重反應(yīng)和洗滌步驟)的測定法的裝置。另外，需要這樣的裝置，所述裝置可以用作要求流通環(huán)境的測定法的便利替代物或用來替換其中在核酸測序情況下稀釋效應(yīng)限制最大測序讀出長度的固定反應(yīng)容器測定法。
本發(fā)明的目的是克服或改進上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點中至少一者或是提供有用的替代物。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)第一方面，本發(fā)明提供一種用于實施測定法的可轉(zhuǎn)動平臺，所述平臺適應(yīng)于在所述平臺的表面上的一個或多個分立區(qū)域內(nèi)固定第一結(jié)合配偶體。根據(jù)第二方面，本發(fā)明提供一種用于實施測定法的可轉(zhuǎn)動平臺，所述平臺適應(yīng)于在所述平臺的表面上的一個或多個分立區(qū)域內(nèi)選擇性固定第二結(jié)合配偶體。在一個實施方式中，該平臺的整個上表面適應(yīng)于固定第一結(jié)合配偶體或選擇性固定第二結(jié)合配偶體。然而，在其他實施方式中，在該平臺的表面或備選地第二表面上提供多個分立區(qū)域或預(yù)定義的部位或靶部位，其中所述的第二表面相對容易地與該平臺(例如，珠)的表面結(jié)合以固定第一結(jié)合配偶體或選擇性固定第二結(jié)合配偶體。在另一個實例中，所述分立區(qū)域是可轉(zhuǎn)動平臺上的涂層，其中該涂層適應(yīng)于固定第一結(jié)合配偶體。在一些實施方式中，第一結(jié)合配偶體化學(xué)地吸附在該平臺的表面上。在其他實施方式中，第一結(jié)合配偶體與該平臺的表面共價地或離子地或成氫鍵地結(jié)合，并且在其他實施方式中，范德華力將第一結(jié)合配偶體固定至該平臺的表面?？梢岳斫獾诙Y(jié)合配偶體是與已經(jīng)與該平臺的表面結(jié)合的第一結(jié)合配偶體可結(jié)合或可反應(yīng)的。本發(fā)明特別涉及諸如核酸測序法(例如焦磷酸測序法)的方法和測定法。例如，單一和第二結(jié)合配偶體是結(jié)合配偶體對(任選地，其中之一可以是可檢測標記的)，它們優(yōu)選地選自抗生物素蛋白或鏈霉親和素或鏈霉抗生物素蛋白變體(streptactin)或類似物以及生物素或類似物。然而并且如下文進一步討論，本發(fā)明的優(yōu)點會提供相對快速且相對簡單的洗滌步驟，和相關(guān)的低廢棄體積的洗滌液及試劑。本發(fā)明現(xiàn)在將在焦磷酸測序法的背景下解釋，然而可以理解本發(fā)明不限于這種測定法?？梢岳斫庠诘谝环矫?，該平臺適應(yīng)于固定第一結(jié)合配偶體，所述第一結(jié)合配偶體可以是例如抗生物素蛋白或鏈霉親和素或鏈霉抗生物素蛋白變體(streptactin)或類似物，并且隨后，所述抗生物素蛋白或鏈霉親和素或鏈霉抗生物素蛋白變體(streptactin)或類似物可以在后續(xù)處理步驟中依次與生物素?；疍NA反應(yīng)?？梢赃M一步理解在第二方面，該平臺已經(jīng)包含第一結(jié)合配偶體，并且該平臺適應(yīng)于選擇性固定第二結(jié)合配偶體。因此，可以進一步理解，根據(jù)第一方面的平臺可以認為是‘非官能化的’，并且根據(jù)第二方面的平臺可以認為是‘官能化的’或‘預(yù)官能化的’。根據(jù)第三方面，本發(fā)明提供一種用于實施測定法的方法，所述方法包括以下步驟提供根據(jù)第一方面的平臺；將第一結(jié)合配偶體結(jié)合或固定至所述平臺的所述表面上或嵌于所述平臺(例如，珠)的所述表面內(nèi)的表面上的一個或多個分立區(qū)域；并且
使每個所述分立區(qū)域依次地與一系列試劑接觸，其中在一個或多個或全部的所述接觸步驟之間如此轉(zhuǎn)動所述平臺，從而基本上以離心方式從每個所述分立區(qū)域移去任何殘余或未反應(yīng)的所述試劑。優(yōu)選地，所述系列試劑的第一者包含針對第一結(jié)合配偶體的第二或互補性結(jié)合配偶體，并且后續(xù)的試劑選自洗滌或淋洗試劑，并且如下文進一步討論。根據(jù)第四方面，本發(fā)明提供一種用于實施測定法的方法，所述方法包括以下步驟提供根據(jù)第二方面的平臺；將第二結(jié)合配偶體選擇性結(jié)合或固定至所述平臺的所述表面上或嵌于所述平臺中的表面上的一個或多個分立區(qū)域；并且使每個所述靶部位依次地與一系列試劑接觸，其中在一個或多個或全部的所述接觸步驟之間如此轉(zhuǎn)動所述平臺，從而基本上以離心方式從每個所述靶部位移去任何殘余或未反應(yīng)的所述試劑。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法還包括在每個所述接觸步驟期間和/或之后分析所述測定法的步驟。在優(yōu)選的實施方式中，在分立區(qū)域與后續(xù)試劑接觸之前，每個所述分立區(qū)域經(jīng)受采用洗滌試劑的洗滌或淋洗步驟。該洗滌試劑可以任何試劑，所述試劑可以基本上洗去來自先前接觸步驟的任何殘余溶液或減少任何殘余溶液及所述溶液中存在的組分(活性物質(zhì)，例如，降解副產(chǎn)物或降低副產(chǎn)物濃度的腺苷三磷酸雙磷酶或其他合適酶)的量。盡管該洗滌試劑可以任何試劑，所述試劑可以基本上洗去來自先前接觸步驟的任何殘余溶液或減少任何殘余溶液及下述組分的量，其中所述組分存在于所述溶液中并且可以是活性物質(zhì)，如腺苷三磷酸雙磷酶，然而在其他實施方式中，用于除去過多核苷酸的洗漆步驟優(yōu)選地不含腺苷三磷酸雙磷酶，如Mashayekhi F.和Ronaghi M. , Analysis ofread-length limiting factors inpyrosequencing chemistry(焦憐酸測序化學(xué)中讀出長度限制性因素的分析)，Anal. Biochem.(分析生物化學(xué))(2007)，363 (2) =275-287中詳述，所述文獻通過引用的方式完整并入本文。如Mashayekhi等人中詳述，已經(jīng)顯示用腺苷三磷酸雙磷酶洗滌步驟替換所述洗滌步驟改善了焦磷酸測序法的讀出長度。優(yōu)選地，在分配試劑時，可轉(zhuǎn)動平臺以低速度轉(zhuǎn)動，例如以約10至200轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)動，從而不移走添加至靶部位的試劑；并且在分配試劑時，該平臺以低速度轉(zhuǎn)動，例如以約400至1000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)動。然而，可以理解其他轉(zhuǎn)動速度是可能的。在優(yōu)選的實施方式中，通過以下方式將每個所述分立區(qū)域為每種所述后續(xù)試劑做好準備通過轉(zhuǎn)動所述平臺以離心方式移走任何殘余試劑而基本上‘干燥’所述分立區(qū)域，從而所述分立區(qū)域被來自先前步驟的試劑污染的情況大為減少，優(yōu)選地基本上不存在。根據(jù)第五方面，本發(fā)明提供根據(jù)第一或第二方面的平臺用于實施測定法的用途。根據(jù)第六方面，本發(fā)明提供試劑盒，所述試劑盒包括根據(jù)第一或第二方面的平臺和用于實施所述測定法的一種或多種試劑。根據(jù)第七方面，本發(fā)明提供用于實施測定法的裝置，所述裝置包括用于以預(yù)定的可控的用戶可選性轉(zhuǎn)動速度轉(zhuǎn)動根據(jù)第一或第二方面的平臺的裝置； 任選地，用于分配所述第一結(jié)合配偶體到所述平臺的所述表面上的所述一個或多個分立區(qū)域上，以固定所述第一結(jié)合配偶體至所述分立區(qū)域的裝置；或用于分配所述第二結(jié)合配偶體到所述平臺的所述表面上的所述一個或多個分立區(qū)域，以選擇性固定所述第二結(jié)合配偶體至所述分立區(qū)域的裝置；用于分配試劑與所述分立區(qū)域接觸的裝置；以及任選地，用于分配洗滌試劑的裝置。優(yōu)選地，用于轉(zhuǎn)動該平臺的裝置是馬達，并且預(yù)定的轉(zhuǎn)動速度是用戶可選的并且在約10至1000轉(zhuǎn)/分鐘之間。該裝置還優(yōu)選地配有真空抽取系統(tǒng)以抽取從所述可轉(zhuǎn)動平臺甩離的廢試劑。在可選性設(shè)計中，可轉(zhuǎn)動平臺并不一定需要本身是盤；它可能由多個分立的反應(yīng)孔組成，其中將所述反應(yīng)孔載入以轉(zhuǎn)動模式容納每個分立反應(yīng)孔的掛籃中。例如，改良的0. 2mL離心管可以在可轉(zhuǎn)動掛籃形式的平臺上以45度安裝。在這種布局中，離心管的蓋是打開的并且位于水平面上(該蓋的內(nèi)側(cè)面朝上)。該蓋經(jīng)過修改，從而可能將以低每分鐘轉(zhuǎn)速分配至該蓋中/上的試劑以高每分鐘轉(zhuǎn)速離心至該管中。離心管的塑料鉸合部也優(yōu)選地經(jīng)修改以充當(dāng)引導(dǎo)廢試劑離開蓋至管的通道。此蓋充當(dāng)接受并固定第一結(jié)合配偶體或者接受并選擇性固定第二結(jié)合配偶體并且隨后接受后續(xù)試劑的分立區(qū)域，并且管本身將充當(dāng)廢物槽/容器。優(yōu)點是操作員可以通過插入所需要數(shù)目的管至掛籃中裝載一份樣品許多樣品。根據(jù)第八方面，本發(fā)明提供用于實施測定法的裝置，所述裝置包括包含分立區(qū)域的平板，其中所述分立區(qū)域適應(yīng)于固定第一結(jié)合配偶體或選擇性固定第二結(jié)合配偶體；和通過凸緣與所述平板連接的容器，其中所述凸緣包含用于流體從所述平板通達所述容器的通道。優(yōu)選地，該容器包含開頂(open top)并且該平板包含適應(yīng)于選擇性嚙合該容器開頂并且提供流體密封的凸緣。優(yōu)選地，該平板是此容器的蓋。優(yōu)選地，該容器包含放射狀向外擴展的用于在支架(如轉(zhuǎn)盤(carousel))中支撐該容器的環(huán)狀凸緣。優(yōu)選地，容器是基本上圓柱形的。優(yōu)選地，該容器是一次性的，并且由塑料材料制成。優(yōu)選地，根據(jù)第七方面的用于實施測定法的裝置是改良的微量離心機/微量離心管，如改良艾本德(Eppendorf8 )。根據(jù)第九方面，本發(fā)明提供可轉(zhuǎn)動掛籃，所述掛籃適應(yīng)于接受2塊或多塊平板，每塊平板包含適應(yīng)于固定第一結(jié)合配偶體或適應(yīng)于選擇性固定第二結(jié)合配偶體的分立區(qū)域。優(yōu)選地，可轉(zhuǎn)動掛籃還適應(yīng)于接受兩個或更多個容器，每個容器通過凸緣與相應(yīng)平板連接，其中所述凸緣包含用于流體從所述平板通達所述容器的通道。優(yōu)選地，所述平板是改良微量離心管的蓋并且所述容器是微量離心管本身。優(yōu)選地，第九方面利用根據(jù)第八方面的裝置。根據(jù)第十方面，本發(fā)明提供一種用于實施測定法的方法，所述方法包括以下步驟提供根據(jù)第九方面的可轉(zhuǎn)動掛籃和根據(jù)第八方面的裝置；使至少一塊平板嚙合至所述平臺；
將第一結(jié)合配偶體結(jié)合或固定至所述分立區(qū)域，或?qū)⒌诙Y(jié)合配偶體選擇性結(jié)合或固定至所述分立區(qū)域；以及使每個所述分立區(qū)域依次地與一系列試劑接觸，其中在每個或任何的所述接觸步驟之間如此轉(zhuǎn)動可轉(zhuǎn)動掛籃(cradle)，從而基本上以離心方式從所述分立區(qū)域移去任何殘余或未反應(yīng)的所述試劑。根據(jù)第十一方面，本發(fā)明提供根據(jù)第九方面的可轉(zhuǎn)動掛籃用于實施測定法的用途，或根據(jù)第八方面的裝置用于實施測定法的用途。根據(jù)第十二方面，本發(fā)明提供試劑盒，所述試劑盒包括根據(jù)第八方面的裝置和用于實施所述測定法的一種或多種試劑。根據(jù)第十三方面，本發(fā)明提供試劑盒，所述試劑盒包括根據(jù)第九方面的可轉(zhuǎn)動掛籃和用于實施所述測定法的一種或多種試劑。根據(jù)第十四方面，本發(fā)明提供用于實施測定法的裝置，所述裝置包括用于以預(yù)定的可控的用戶可選性轉(zhuǎn)動速度轉(zhuǎn)動根據(jù)第九方面的可轉(zhuǎn)動掛籃的裝置；任選地，用于分配第一結(jié)合配偶體或第二結(jié)合配偶體到所述分立區(qū)域上的裝置；以及用于分配一種或多種試劑與所述分立區(qū)域接觸的裝置。本發(fā)明的其他方面涉及平行地實施測定法。例如，根據(jù)第十五方面，本發(fā)明提供用于實施測定法的可轉(zhuǎn)動圓柱體，所述圓柱體具有至少一條在周圍伸展的通道，每條通道包含一個或多個適應(yīng)于固定第一結(jié)合配偶體或適應(yīng)于選擇性固定第二結(jié)合配偶體的分立區(qū)域。可以理解在這個方面，本發(fā)明提供用于實施測定法的圓柱體，其中所述圓柱體適應(yīng)于或設(shè)置成是可轉(zhuǎn)動的。技術(shù)人員會理解，這種實施方式能夠使許多樣品同時或平行地運轉(zhuǎn)?？梢岳斫?，可轉(zhuǎn)動圓柱體可以裝在具有縱向伸展的縫隙的容器中，其中所述的縫隙能夠使結(jié)合配偶體和試劑等分配到分立區(qū)域上。當(dāng)然，可以理解當(dāng)圓柱體以高速度轉(zhuǎn)動時，檢測單元會處于廢液的切線路徑中。因此，可以使用在離心期間關(guān)閉縱向伸展的縫隙的開閉器避免這種情況。根據(jù)第十六方面，本發(fā)明提供一種用于實施測定法的方法，所述方法包括以下步驟
提供根據(jù)第十五方面的可轉(zhuǎn)動圓柱體；將所述第一結(jié)合配偶體結(jié)合或固定至一個或多個分立區(qū)域，或?qū)⒌诙Y(jié)合配偶體選擇性結(jié)合或固定至一個或多個分立區(qū)域；和使每個所述分立區(qū)域依次地與一系列試劑接觸，其中在每個或任何的所述接觸步驟之間如此轉(zhuǎn)動可轉(zhuǎn)動圓柱體，從而基本上以離心方式從所述分立區(qū)域移去任何殘余或未反應(yīng)的所述試劑。根據(jù)第十七方面，本發(fā)明提供根據(jù)第十五方面的可轉(zhuǎn)動圓柱體用于所述測定法的用途。根據(jù)第十八方面，本發(fā)明提供試劑盒，所述試劑盒包括根據(jù)第十五方面的可轉(zhuǎn)動圓柱體和用于實施所述測定法的一種或多種試劑。根據(jù)第十九方面，本發(fā)明提供用于實施測定法的裝置，所述裝置包括用于以預(yù)定的可控的用戶可選性轉(zhuǎn)動速度轉(zhuǎn)動根據(jù)所述第十五方面的可轉(zhuǎn)動圓柱體的裝置；任選地，用于分配所述第一或第二結(jié)合配偶體到一個或多個分立區(qū)域上，以固定或選擇性分別固定所述結(jié)合配偶體至所述分立區(qū)域的裝置；和用于分配試劑與所述分立區(qū)域接觸的裝置。本發(fā)明現(xiàn)在將在焦磷酸測序法的背景下解釋，然而可以理解本發(fā)明不限于這種測定法。焦磷酸測序法在第二十方面，所述測定法是焦磷酸測序法，并且本發(fā)明提供一種用于實施核酸鏈測序的可轉(zhuǎn)動平臺，所述平臺適應(yīng)于在所述平臺的表面上或在嵌于所述表面內(nèi)的珠子上的一個或多個分立區(qū)域內(nèi)固定核酸鏈結(jié)合配偶體。在第二十一方面，所述測定法是焦磷酸測序法，并且本發(fā)明提供一種用于實施核酸鏈測序的可轉(zhuǎn)動平臺，所述平臺適應(yīng)于在所述平臺的表面上或在嵌于所述表面內(nèi)的珠子上的一個或多個分立區(qū)域內(nèi)選擇性固定核酸鏈。優(yōu)選地，使用的測序方法是焦磷酸測序法。然而，可以理解可以利用對核酸鏈測序的其他方法，如下文進一步討論。優(yōu)選地，所述核酸鏈是DNA或RNA或它們的修飾形式，例如亞硫酸氫鹽處理后，或涵蓋天然存在核酸中不存在的額外堿基。可以理解核酸鏈的副本停留在一個或多個分立區(qū)域的每個區(qū)域上。優(yōu)選地，可轉(zhuǎn)動平臺是基本上圓形的，并且具有約50至500mm之間的直徑。優(yōu)選地，可轉(zhuǎn)動平臺包括約2至500個之間的分立區(qū)域，所述分立區(qū)域與可轉(zhuǎn)動平臺的中心等距地間隔?？梢岳斫庠撝睆娇梢允侨我庵睆?，并且可以選擇該直徑以容納分立區(qū)域的數(shù)目，所述數(shù)目可以在數(shù)字上是2或更大。在優(yōu)選的實施方式中，所述分立區(qū)域基本上均勻地分布或位于可轉(zhuǎn)動平臺的周界周圍以形成基本上圓形的陣列。優(yōu)選地，所述分立區(qū)域適應(yīng)于選擇性結(jié)合、捕獲或固定核酸鏈(例如，測序模板或測序引物)。例如在一些優(yōu)選的實施方式中，所述核酸鏈是生物素酰化的，并且所述分立區(qū) 域包含抗生物素蛋白，并優(yōu)選地包含鏈霉親和素或類似物，用于固定生物素?；暮怂徭?。備選地，所述分立區(qū)域或珠適應(yīng)于結(jié)合、捕獲或固定抗生物素蛋白和優(yōu)選地鏈霉親和素，并且在后續(xù)步驟中，將生物素?；暮怂徭溸x擇性固定至與所述分立區(qū)域結(jié)合的抗生物素蛋白。然而，可以理解，其他化學(xué)可用于固定核酸鏈至分立區(qū)域。本發(fā)明不限于可以用來固定核酸鏈至分立區(qū)域的化學(xué)。技術(shù)人員會理解，也可能需要處理可轉(zhuǎn)動平臺上的分立區(qū)域以允許鏈霉親和素(或等同的化學(xué)，如上文討論)選擇性地與其結(jié)合或黏附。例如，如果制成可轉(zhuǎn)動平臺的材料是聚碳酸酯，則鏈霉親和素抗拒與這種聚合物的結(jié)合或不與之結(jié)合。因此，所述分立區(qū)域可能需要與鏈霉親和素結(jié)合的材料(如聚苯乙烯)的涂層。當(dāng)然，技術(shù)人員會理解，可以使用除聚苯乙烯之外的材料來產(chǎn)生用于與鏈霉親和素結(jié)合的分立區(qū)域，并且因此最終能夠使生物素?；暮怂徭湽潭ㄖ了龇至^(qū)域。優(yōu)選地，所述分立區(qū)域包括適應(yīng)于能夠使核酸與之選擇性固定的處理。在一個實施方式中，本發(fā)明的平臺是一次性物品，然而在備選實施方式中，就核酸而言，該平臺適于被‘清潔’并且在其他測定法中重復(fù)使用。例如，該平臺可以由陶瓷或玻璃制成。 在一個實施方式中，所述分立區(qū)域單純地是可轉(zhuǎn)動平臺的表面上的區(qū)帶或區(qū)域，其適應(yīng)于接受并且選擇性保留核酸鏈或抗生物素蛋白/鏈霉親和素。所述分立區(qū)域可以是基本上平的，或具有與可轉(zhuǎn)動平臺相同的面貌。然而在其他優(yōu)選的實施方式中，所述分立區(qū)域可以是淺孔，所述淺孔可以包括約0. 5至100 y L之間的體積?？梢岳斫鉁\孔可以是任何形狀，并且所述的孔可以具有任何體積。然而，就常見焦磷酸測序分析/測定法中所用試劑的相對小的量，所述孔適應(yīng)于僅含有低體積，如約0. 5至IOii L之間。在其他實施方式中，構(gòu)思了與可轉(zhuǎn)動平臺的表面相比，所述分立區(qū)域甚至可能是相對升高的部分。在優(yōu)選的實施方式中，所述分立區(qū)域具有約I至5mm的直徑。然而，可以理解在平面圖中觀察時，所述分立區(qū)域可能具有任何直徑或形狀。優(yōu)選地，該可轉(zhuǎn)動平臺便利地由塑料材料制成，然而，技術(shù)人員會理解其他材料是可能的，如玻璃或石英。優(yōu)選地，塑料材料選自聚碳酸酯、聚苯乙烯或聚丙烯。還構(gòu)思該可轉(zhuǎn)動平臺還可能是層壓結(jié)構(gòu)。無論制成可轉(zhuǎn)動平臺的材料是什么，該平臺必須能夠耐受轉(zhuǎn)動而不變形，并且潛在地耐受用于使核酸變性的熱效應(yīng)，如下文進一步討論。在一些優(yōu)選的實施方式中，所述可轉(zhuǎn)動平臺(其可以是基本上圓形的盤)，還包含布置在所述平臺周界處的用于接收廢液的槽，所述廢液從所述可轉(zhuǎn)動平臺的表面在其轉(zhuǎn)動期間甩離或離心下來?？梢岳斫庖坏┙沽姿釡y序反應(yīng)的每個步驟或眾多步驟完成，應(yīng)當(dāng)移去與分立區(qū)域接觸的未使用或廢棄試劑以實現(xiàn)長的讀出長度。通過轉(zhuǎn)動可轉(zhuǎn)動平臺產(chǎn)生離心力引起廢液從該平臺甩離，并且為了改善廢液處置，提供槽。備選地，廢棄試劑可以每隔50輪核苷酸添加或恰好在試劑變得充分稀薄從而抑制反應(yīng)之前從該平臺甩離。在這個實施方式中，可以理解隨著額外的焦磷酸測序試劑添加至分立區(qū)域并且隨即在每個焦磷酸測序反應(yīng)結(jié)束后從平臺甩離，可轉(zhuǎn)動平臺的總質(zhì)量會增加。因此，在備選實施方式，可能合乎需要的是，可轉(zhuǎn)動平臺不包括槽并且可轉(zhuǎn)動平臺位于其內(nèi)部的殼應(yīng)當(dāng)設(shè)置成具有鄰近該平臺周界布置的槽，從而在所述‘靜止的’槽中接住在所述轉(zhuǎn)動平臺轉(zhuǎn)動期間從其表面甩離的廢液。熟悉焦磷酸測序法背后的技術(shù)和化學(xué)的技術(shù)人員會理解固定至分立區(qū)域的核酸鏈可能需要變性以移走互補性核酸鏈。變性可以通過任何方法實現(xiàn)，然而，優(yōu)選的實例包括加熱分立區(qū)域或甚至整個可轉(zhuǎn)動平臺至足以變性的溫度，例如94至99°C，或通過使分立區(qū)域暴露于加熱至超過94°C的溶劑如緩沖液。備選地，分立區(qū)域可以暴露于變性組合物(例如，包含NaOH的組合物)。其他方法包括通過紅外輻射或等效輻射加熱?？梢岳斫饪赊D(zhuǎn)動平臺應(yīng)當(dāng)由能夠耐受此類變性條件的材料制成。也可能使可轉(zhuǎn)動平臺能夠加熱和冷卻，從而使DNA與雜交或捕獲的核酸靶或與捕獲的測序引物熔融。在焦磷酸測序法的情況下，一旦已經(jīng)捕獲dsDNA靶并使其變性，則添加測序引物以與ssDNA雜交或備選地，該ssDNA與捕獲的測序引物雜交。在這種情況下，可以將可轉(zhuǎn)動平臺加熱以除去ssDNA中的任何立體結(jié)構(gòu)并且隨后冷卻以使測序引物與固定的革巴雜父?？梢岳斫庥捎谑褂孟鄬π◇w積的試劑時，該室通過合適的手段密封，故加熱該室可能多少增加裝置的復(fù)雜性。備選地，可以使用油覆層以減少加熱期期間的蒸發(fā)。其他合適的手段是技術(shù)人員熟知的。備選地，可以添加變性試劑至捕獲的ssDNA和測序引物，隨后添 加PH較低的緩沖液以降低靶部位范圍內(nèi)的pH并且使測序引物與DNA靶復(fù)性。一旦復(fù)性，可以甩離PH緩沖液以廢棄。技術(shù)人員會理解本發(fā)明在多種實施方式中能夠提供的許多優(yōu)點。例如，與現(xiàn)有技術(shù)的儀器和方法相比，本發(fā)明能夠增加堿基讀出長度。為了解釋，現(xiàn)有技術(shù)方法在0. 2mL微量離心管(或相似物)中實施焦磷酸測序，并且依次添加試劑至該管以檢測該管中存在的DNA的序列。將核苷酸依次添加至含有反應(yīng)緩沖液中的DNA、全部酶和底物的反應(yīng)。該反應(yīng)在96或24孔平板中進行。將平板加熱(28°C)并且在反應(yīng)期間振搖。因而，添加核苷酸的體積或多或少等于蒸發(fā)的體積，其中所述的蒸發(fā)不導(dǎo)致反應(yīng)混合物稀釋但是導(dǎo)致副產(chǎn)物積累?，F(xiàn)有技術(shù)方法遭遇以下缺點讀出長度比較短，這最可能地歸因于(例如由腺苷三磷酸雙磷酶活性產(chǎn)生的)降解產(chǎn)物的積累。本發(fā)明不產(chǎn)生從現(xiàn)有技術(shù)已知的缺點，原因在于固定的核酸鏈與核苷酸接觸，剩余的核苷酸以及全部反應(yīng)產(chǎn)物和副產(chǎn)物依次從如上文所述的分立區(qū)域基本上移走，所述分立區(qū)域在與后續(xù)核苷酸試劑接觸之前還任選地被洗滌。構(gòu)思了超過300或400個堿基的堿基讀出長度是可能的，并且化學(xué)改善的情況下可能超過1000個喊基。另外，技術(shù)人員會顯而易見諸多優(yōu)點，然而為清晰性目的，本發(fā)明提供比現(xiàn)有技術(shù)的流通池相對簡單的裝置。甚至其他優(yōu)點涉及比現(xiàn)有技術(shù)的方法和儀器可能相對更快的測序法，并且涉及與現(xiàn)有技術(shù)相比可能更低體積的所需試劑?，F(xiàn)有技術(shù)方法并且尤其實施焦磷酸測序的方法的又一項限制是一個反應(yīng)循環(huán)即添加一種核苷酸所需要的時間很長。一個反應(yīng)循環(huán)所需要的時間正常是約60秒或甚至更長，這取決于降解先前反應(yīng)循環(huán)的全部剩余核苷酸所需要的時間。僅在完全降解先前反應(yīng)循環(huán)的基本上全部剩余核苷酸后才添加下一種核苷酸?？梢岳斫馊绫疚乃龅难b置能夠以高得多的速度(即，通過離心步驟、洗滌步驟)除去剩余核苷酸。這導(dǎo)致?lián)饺胍环N堿基的循環(huán)時間短得多，最可能是大約15秒，從而產(chǎn)生減少大約至少4倍的運行時間。與一些現(xiàn)有技術(shù)儀器相比，本發(fā)明還能夠使流體操作改善。還可能的是，與現(xiàn)有技術(shù)儀器相比，本發(fā)明可以提供增加的靈敏度，條件是可以使用高速光電倍增器替代CCD陣列。
焦磷酸測序法是基于‘合成測序’原理的DNA測序方法，該方法依賴于檢測核苷酸摻入時的焦磷酸鹽釋放，而非采用雙脫氧核苷酸的鏈終止過程?！铣蓽y序’涉及取得待測序的DNA單鏈并且隨后酶促地合成其互補鏈?！铣蓽y序’方法基于通過檢測DNA聚合酶(DNA合成酶)的核苷酸加成反應(yīng)(DNA+xdNTP- > DNA+1+PPi或取決于x的不同副產(chǎn)物。x也可以是ATP)的反應(yīng)副產(chǎn)物來檢測該DNA聚合酶的活性。在焦磷酸測序反應(yīng)中，使用產(chǎn)生光的酶級聯(lián)對PPi定量。I.硫酸化酶 APS+PPi- > ATP+S042.螢光素酶螢光素+ATP- >氧代螢光素+PPi+光3.腺苷三磷酸雙磷酶降解剩余dNTP和ATP 另外，存在本領(lǐng)域已知的幾種反應(yīng)，其可以用來量化副產(chǎn)物，例如，使用轉(zhuǎn)變PPi+PEP+AMP- >丙酮酸+ATP+Pi的PI3DK(烯醇丙酮酸雙激酶)。另外，可以通過例如pH變化或其他檢測參數(shù)變化檢測到所述副產(chǎn)物。‘合成測序’方法可以備選地基于檢測DNA連接酶的活性，其中所述DNA連接酶檢測該DNA連接酶的引物加成反應(yīng)的反應(yīng)副產(chǎn)物。合適的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。實質(zhì)上，該方法允許通過沿DNA單鏈以一次一個堿基對方式合成互補鏈并且檢測在每個步驟實際上添加哪種堿基而將該DNA單鏈測序。將模板DNA或測序引物固定，并且依次添加A、C、G和/或T核苷酸的溶液并在反應(yīng)后除去。僅添加的核苷酸互補于第一未配對堿基或模板的堿基時才產(chǎn)生光。產(chǎn)生可檢測信號(例如化學(xué)發(fā)光信號)的所添加核苷酸的序列允許確定模板的序列。ssDNA模板與測序引物雜交或反之亦然，并且與DNA聚合酶和任選地與ATP硫酸化酶、螢光素酶和/或腺苷三磷酸雙磷酶孵育，并例如與底物腺苷5'磷酸硫酸鹽(APS)及螢光素。提供可檢測信號的其他反應(yīng)級聯(lián)是技術(shù)人員熟知的。就廣義看來，焦磷酸測序法遵循以下一般步驟I.添加4種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)之一或其合適的衍生物至核酸鏈模板。DNA聚合酶摻入正確的互補性dNTP或其衍生物到該模板上，這以化學(xué)計量方式釋放焦磷酸(PPi)。2. ATP硫酸化酶定量地將PPi轉(zhuǎn)化成ATP。這種ATP觸發(fā)螢光素酶介導(dǎo)螢光素至氧代螢光素的轉(zhuǎn)化，所述的轉(zhuǎn)化以與ATP量成正比的量產(chǎn)生可見光。檢測并分析螢光素酶反應(yīng)中產(chǎn)生的光。3.未摻入的核苷酸和ATP隨后由腺苷三磷酸雙磷酶或其他合適的酶降解。經(jīng)典焦磷酸測序方案的幾種改良是本領(lǐng)域熟知的并且充分適合在本發(fā)明的裝置上進行。由于每個單核苷酸摻入步驟中產(chǎn)生的光與所摻入核苷酸的量成正比，故合適的軟件允許以特定核苷酸序列圖樣轉(zhuǎn)換產(chǎn)生的光信息。在經(jīng)典焦磷酸測序法中，將光圖樣稱作‘熱解圖’。另外，所述軟件優(yōu)選地允許量化混合群體在特定位置處的摻入率。本發(fā)明構(gòu)思了測序方法，所述的測序方法包括固定待測序的核酸模板或測序引物的步驟和逐步添加核苷酸的循環(huán)。盡管本發(fā)明已經(jīng)就焦磷酸測序法方面例舉，然而可以理解，本發(fā)明也用于其他核酸測序化學(xué)，并且尤其用于從流通環(huán)境和固相中得益的此類化學(xué)。本發(fā)明也可以避免上文所提及的某些步驟，或至少使其更便利。焦磷酸測序法要求存在ssDNA模板。任選地，可轉(zhuǎn)動平臺還發(fā)揮作用以捕獲dsDNA并使所述dsDNA變性以將例如ssDNA交給為焦磷酸測序做好準備的復(fù)性測序引物，因而消除對獨立分離步驟的需求。在本發(fā)明的一個實施方式中，可轉(zhuǎn)動平臺可以用來通過例如添加實現(xiàn)優(yōu)先降解dsDNA鏈中一條鏈的酶或酶混合物產(chǎn)生ssDNA。具體而言，本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，術(shù)語“流通DNA測序法”包括例如下述方法固定核酸模板或測序引物，使該引物與該模板雜交或反之亦然，并且在核苷酸存在下以逐步方式進行引物介導(dǎo)的合成，其中所述核苷酸包括例如任選地鏈延伸終止部分(如雙脫氧部分)和任選地可檢測標記物(例如Sanger測序法)。又一種核酸測序法實施方式包括以下步驟摻入標記的核苷酸至正在延伸的引物鏈中；鑒定摻入的核苷酸；并且移除鏈延伸終止部分和標記物，從而正在延伸的鏈為摻入下一個核苷酸做好準備。本領(lǐng)域技術(shù)人員還會理解術(shù)語“流通DNA測序法”包括例如核酸連接測序法。顯而易見，術(shù)語“核酸連接測序法”包括固定核酸模板或測序引物，使該引物與模板雜交或反之亦然，隨后是連續(xù)輪次的DNA連接,例如標記核苷酸或標記短探針的DNA連接。本領(lǐng)域技術(shù)人員還會清楚，本發(fā)明構(gòu)思了包括核酸固定和核苷酸逐步添加及檢測的步驟的任何DNA測序方法。 本領(lǐng)域技術(shù)人員還會理解，術(shù)語“流通DNA測序法”包括上文所提及技術(shù)的全部。另外，在又一個實施方式中，如本文所述的“流通DNA測序”法可以包括酶的使用，其中所述酶固定在平臺表面上和/或在結(jié)合至或固定于該平臺表面上的其他表面上，例如固定在以如此方式被修飾從而可以結(jié)合所述酶的珠上。根據(jù)第二十二方面，本發(fā)明提供一種用于實施核酸鏈測序的方法，所述方法包括以下步驟 提供根據(jù)第二十方面的平臺；將核酸鏈結(jié)合配偶體結(jié)合或固定至所述分立區(qū)域并且隨后將核酸鏈選擇性結(jié)合或固定至所述分立區(qū)域；任選地變性并移走任何互補性核酸鏈，使測序引物與所述分立區(qū)域復(fù)性；以及使每個所述分立區(qū)域依次地與包含A、T、G和/或C核苷酸或相應(yīng)的合適核苷酸類似物的一系列試劑接觸，其中在每個或任何的所述接觸步驟之間如此轉(zhuǎn)動所述平臺，從而基本上以離心方式從所述分立區(qū)域移去基本上任何殘余或未反應(yīng)的試劑。任選的洗滌步驟或酶處理可以改善殘余或未反應(yīng)試劑的移去。根據(jù)第二十三方面，本發(fā)明提供一種用于實施核酸鏈測序的方法，所述方法包括以下步驟提供根據(jù)第二十一方面的平臺；將核酸鏈選擇性結(jié)合或固定至所述分立區(qū)域；任選地變性并移走任何互補性核酸鏈，使測序引物與所述分立區(qū)域復(fù)性；并且 使每個所述分立區(qū)域依次地與包含A、T、G和/或C核苷酸或相應(yīng)的合適核苷酸類似物的一系列試劑接觸，其中在每個或任何的所述接觸步驟之間如此轉(zhuǎn)動所述平臺，從而基本上以離心方式從所述分立區(qū)域移去任何殘余或未反應(yīng)的所述試劑。在這個方面，可以理解所述分立區(qū)域已經(jīng)使核酸鏈結(jié)合配偶體與其固定，并且所述核酸鏈正是與所述核酸鏈結(jié)合配偶體選擇性結(jié)合。任選的洗滌步驟或酶處理可以改善殘余或未反應(yīng)試劑的移去。在一個實施方式中，依次接觸步驟包括
a. ) A，隨后是T，隨后是G，并且隨后是C核苷酸，隨后再是A等，或b.)作為混合物的A+T+G+C核苷酸，并且再次添加該混合物等。在另一個實施方式中，使每個所述分立區(qū)域依次地與包含A、T、G和/或C核苷酸的一系列試劑接觸。依次接觸步驟可以包括以下之一a.)將每種核苷酸或其類似物以任何合乎需要或預(yù)定的順序單獨并且依次地添加，b.)將A+T+G+C核苷酸或這些核苷酸的任何預(yù)定或合乎需要的亞組作為混合物添力口，并且再次添加所述混合物等。依次接觸步驟a.)對焦磷酸測序法特別有用，并且如果使用標記的核苷酸，如其中每種核苷酸用不同染料標記的熒光標記核苷酸，則依次接觸步驟b.)是特別有用的。
可以理解整個方法是迭代的，在于可以按任何預(yù)定義的秩序和/或任何預(yù)定義的組合添加核苷酸的順序并且該順序如所需要那樣重復(fù)足夠次數(shù)以將核酸模板測序。例如，A、T、G和C可以僅在已知的突變位點添加。該實施方式的優(yōu)點在于該過程加快檢測已知突變的速度，原因是需要更少的堿基添加。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法還包括在每個所述接觸步驟期間和/或之后分析核酸鏈的步驟。該分析可以是任何分析，然而可以理解，在焦磷酸測序法的背景下，分析步驟包括在所述分析的每個步驟中通過使光輸出與已經(jīng)摻入所述核酸鏈的核苷酸的數(shù)目相關(guān)而鑒定所述核酸鏈中的下一個堿基對。技術(shù)人員可以采取檢測核苷酸摻入的全部適宜和合適的技術(shù)措施。例如，用于檢測由該反應(yīng)產(chǎn)生的光的合適檢測器是光電倍增器。可以理解隨著可轉(zhuǎn)動平臺轉(zhuǎn)動，樣品通過該檢測器，優(yōu)選地，全部樣品均通過該檢測器。在優(yōu)選的實施方式中，在分立區(qū)域與后續(xù)試劑接觸之前，每個所述分立區(qū)域經(jīng)受采用洗滌試劑的洗滌或淋洗步驟。該洗滌試劑可以是適于洗去來自先前接觸步驟的殘余溶液，優(yōu)選地適于洗去來自先前接觸步驟的基本上全部殘余溶液的任何試劑。然而，在優(yōu)選的實施方式中，洗滌試劑是在其中進行以下反應(yīng)步驟的緩沖液。該洗滌試劑也可以含有洗滌增強物，例如，腺苷三磷酸雙磷酶、磷酸酶等。合適的洗滌試劑是技術(shù)人員熟知的。優(yōu)選地，在分配試劑和所述酶時，可轉(zhuǎn)動平臺以低速度轉(zhuǎn)動，例如以約10至200轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)動，從而不移走添加至分立區(qū)域的試劑；并且在分配洗滌試劑時，該平臺以低速度轉(zhuǎn)動，例如以約400至1000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)動。然而，可以理解其他轉(zhuǎn)動速度是可能的。如上文討論，變性步驟可以包括加熱所述核酸鏈以實現(xiàn)變性，或使所述核酸鏈暴露于升高的PH，或使所述核酸鏈暴露于合適的酶或酶混合物。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的方法包括其中在所述核酸鏈變性后，用淋洗試劑(rinsing reagent)通過淋洗步驟移去互補鏈的步驟。優(yōu)選地，通過以下方式將每個所述分立區(qū)域為每種所述后續(xù)試劑做好準備通過轉(zhuǎn)動所述平臺以離心方式移走任何殘余試劑而基本上干燥所述分立區(qū)域，從而所述分立區(qū)域被試劑污染的情況大為減少，優(yōu)選地基本上不存在所述分立區(qū)域被試劑污染的情況。根據(jù)第二十四方面，本發(fā)明提供根據(jù)第二十或第二十一方面的平臺用于實施核酸鏈測序的用途。根據(jù)第二十五方面，本發(fā)明提供試劑盒，所述試劑盒包括根據(jù)第二十或第二十一方面的平臺和用于實施核酸鏈測序的一種或多種試劑。
根據(jù)第二十六方面，本發(fā)明提供用于核酸鏈測序的裝置，所述裝置包括用于以預(yù)定的可控的用戶可選性轉(zhuǎn)動速度轉(zhuǎn)動根據(jù)第二十方面的平臺的裝置；任選地，用于分配核酸鏈結(jié)合配偶體到所述分立區(qū)域上以使所述核酸鏈結(jié)合配偶體固定至所述分立區(qū)域的裝置；任選地，用于分配核酸鏈到所述分立區(qū)域上以選擇性地使所述核酸鏈固定至所述分立區(qū)域的裝置；任選地，用于變性并且任選移走任何互補性核酸鏈的裝置；用于分配A、T、G和/或C核苷酸或其相應(yīng)類似物或其組合與所述分立區(qū)域接觸的 裝置；用于分配洗滌試劑的裝置；和任選地，用于分配一種或多種酶溶液的裝置。根據(jù)第二十七方面，本發(fā)明提供用于核酸鏈測序的裝置，所述裝置包括用于以預(yù)定的可控的用戶可選性轉(zhuǎn)動速度轉(zhuǎn)動根據(jù)第二十一方面的平臺的裝置；任選地，用于分配核酸鏈到所述分立區(qū)域上以選擇性地使所述核酸鏈固定至所述分立區(qū)域的裝置；任選地，用于變性并且任選移走任何互補性核酸鏈的裝置；用于分配A、T、G和/或C核苷酸或其相應(yīng)類似物或其組合與所述分立區(qū)域接觸的
裝置；用于分配洗滌試劑的裝置；以及任選地，用于分配一種或多種酶溶液的裝置。優(yōu)選地，用于轉(zhuǎn)動該平臺的裝置是馬達，并且預(yù)定的轉(zhuǎn)動速度是用戶可選的并且在約10至1000轉(zhuǎn)/分鐘之間。用于分配所述核酸鏈、用于分配A、T、G和/或C核苷酸和用分配洗漆試劑(washing reagent)的裝置可以是任何裝置,然而優(yōu)選地,該裝置與壓電激勵或空氣脈沖驅(qū)動的噴墨型技術(shù)相似。該裝置還優(yōu)選地配有真空抽取系統(tǒng)以抽取從所述可轉(zhuǎn)動平臺甩離的廢試劑。該裝置還配有合適的檢測手段/裝置以檢測由焦磷酸測序反應(yīng)產(chǎn)生的光。合適的檢測器會是技術(shù)人員已知的，例如可以安裝在可轉(zhuǎn)動平臺下方或上方的光電倍增器。用于變性和任選地移走任何互補性核酸鏈的裝置可以包括用于加熱該平臺至94°C的裝置，或還包括分配加熱過的試劑或其他變性化學(xué)品的注射器或蠕動分配器。在備選性設(shè)計中，可轉(zhuǎn)動平臺并不一定需要本身是盤；它可能由多個分立的反應(yīng)孔組成，其中將所述反應(yīng)孔載入以轉(zhuǎn)動模式容納每個分立反應(yīng)孔的掛籃中。例如，改良的
0.2mL離心管可以在可轉(zhuǎn)動掛籃形式的平臺上以45度安裝。在這種布局中，該蓋是打開的并且處于水平面上(該蓋的內(nèi)側(cè)面朝上)。該蓋經(jīng)過修改，從而可能將以低每分鐘轉(zhuǎn)速分配至該蓋中的試劑以高每分鐘轉(zhuǎn)速離心至該管中。離心管的塑料鉸合部也經(jīng)修改以充當(dāng)引導(dǎo)廢試劑離開蓋至管的通道。此蓋會充當(dāng)執(zhí)行測序反應(yīng)的分立區(qū)域，并且管本身將充當(dāng)廢物槽。優(yōu)點是操作員可以通過插入所需要數(shù)目的管至掛籃中裝載一份樣品許多樣品。本發(fā)明的其他方面涉及平行地實施核酸鏈測序，S卩，多重測序。例如，本發(fā)明提供用于實施核酸鏈測序的可轉(zhuǎn)動圓柱體，所述圓柱體具有至少一條在周圍伸展的通道，每條通道包含一個或多個適應(yīng)于固定第一結(jié)合配偶體或適應(yīng)于選擇性固定第二結(jié)合配偶體的分立區(qū)域。技術(shù)人員會理解，這種實施方式能夠使許多樣品同時或平行地運轉(zhuǎn)。技術(shù)人員會理解本發(fā)明包括本文中公開的實施方式和特征以及所公開實施方式和特征的全部組合和/或擴散(permeation)。


例如僅參考附圖，現(xiàn)在描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，在所述附圖中圖IA是本發(fā)明可轉(zhuǎn)動平臺的平面圖；圖IB是圖IA中所示的可轉(zhuǎn)動平臺的側(cè)視圖；圖IC是沿圖IB的線1C-1C上取得的截面圖；
圖2A是透視圖，并且圖2B是圖I中所示可轉(zhuǎn)動平臺的實施方式的剖面透視圖；圖3A是透視圖，并且圖3B是圖I中所示可轉(zhuǎn)動平臺的實施方式的剖面透視圖；圖4A和4B分別是圖I中所示并且具有周沿槽的可轉(zhuǎn)動平臺的備選實施方式的平面圖及側(cè)視圖；圖5是圖IA中所示可轉(zhuǎn)動平臺安裝于其中的裝置的截面圖；圖6顯示了使用用于監(jiān)測反應(yīng)的聚焦光學(xué)器件的光學(xué)檢測裝置；圖7顯示了使用用于監(jiān)測反應(yīng)的直接成像法的光學(xué)檢測裝置；圖8顯示用于加熱該平臺上分立區(qū)域的加熱環(huán)；圖9顯示并入圖8中所示加熱環(huán)的裝置；圖IOA是掛籃形式的可轉(zhuǎn)動平臺的平面圖，所述掛籃適應(yīng)于接受用于實施核酸測序的至少一個微量離心管；圖IOB是圖4A中所示的可轉(zhuǎn)動掛籃的側(cè)視圖；圖IOC是沿圖IOB的線10C-10C上取得的截面圖；圖IOD是隨本發(fā)明可轉(zhuǎn)動平臺一起使用的改良離心管的透視圖，所述的可轉(zhuǎn)動平臺是可轉(zhuǎn)動掛籃形式；圖11是在EDC存在下用鏈霉親和素包被的聚苯乙烯孔的熱解圖結(jié)果；圖12是鏈霉親和素陰性對照孔的熱解圖，該熱解圖顯示僅與鏈霉親和素結(jié)合的模板可能已經(jīng)產(chǎn)生信號；圖13是EDC陰性對照孔的熱解圖，該熱解圖顯示測序期間無信號；并且圖14是使用測序-洗滌-測序策略時，SEQ-0LIG0-30BP合成性寡核苷酸序列的熱解圖。定義在描述并要求保護本發(fā)明時，將根據(jù)下文所述定義使用以下術(shù)語。也應(yīng)當(dāng)理解，本文所用術(shù)語的目的僅在于描述本發(fā)明的具體實施方式
并且不意圖是限制性的。除非另外定義，本文所用的全部技術(shù)及科學(xué)術(shù)語具有如本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解那樣相同的意思。除非上下文清晰地要求，否則在本說明書和權(quán)利要求書通篇范圍內(nèi)，與排他性或詳盡性意思相反，詞‘包含’、‘包含著’等應(yīng)當(dāng)以包容性意思，也就是說，以‘包含，但不限于’的意思解釋。
在下文或另外指出的情況下，‘V將意指‘重量V，‘比率’將意指‘重量比’并且‘份’將意指‘重量份’。盡管描述本發(fā)明廣闊范圍的數(shù)字范圍和參數(shù)是近似值，但是盡可能精確地報道具體實例中所述的數(shù)值。然而，任何數(shù)值內(nèi)在地含有因它們相應(yīng)的檢驗量值中存在的標準偏差而必然產(chǎn)生的某些誤差。為提供更精確的描述，本文中給出的一些定量性表述不用術(shù)語‘約’限制。應(yīng)理解無論是否明確地使用術(shù)語‘約’，本文中給出的每個量意指實際給出的值，并且還意指這種給出值的將基于本領(lǐng)域技術(shù)人員合理推斷的近似值，包括因這種給出值的實驗條件和/或測量條件所致的近似值。如本文所用的術(shù)語‘主導(dǎo)地’和‘基本上’應(yīng)當(dāng)意指包含以重量計多于50%，除非另外說明。對使用端點的數(shù)字范圍的描述包括隸屬該范圍的全部數(shù)字(例如，I至5包括I、 I. 5,2,2. 75,3,3. 80、4、5 等)。術(shù)語‘優(yōu)選的’和‘優(yōu)選地’指可以在某些環(huán)境下提供某些益處的本發(fā)明實施方式。然而，在相同或其他環(huán)境下，其他實施方式可以也是優(yōu)選的。另外，對一個或多個優(yōu)選實施方式的描述不暗示其他實施方式不是有用的，并且不意圖從本發(fā)明的范圍中排除其他實施方式。術(shù)語‘一(a)’、‘一(an)’和‘該(the) ’意指‘一個或多個’，除非另外明確地說明。術(shù)語‘一個實施方式’、‘實施方式’、‘諸實施方式’、‘該實施方式’、‘這些實施方式’、‘一個實施方式’、‘一些實施方式’、‘一個示例實施方式’、‘至少一個實施方式’、‘一個或多個實施方式’和‘一個實施方式’意指‘本發(fā)明的一個或多個(但是并不必定全部)實施方式’，除非另外明確地說明。列舉的細目名單不暗示任何或全部的細目是相互排斥的。列舉的細目名單不暗示任何或全部的細目總體上窮盡任何事物，除非另外明確地說明。列舉的細目名單不暗示諸細目根據(jù)列舉它們的次序以任何方式排序。本專利申請中提供的各部分的標題并且該專利申請的標題僅出于方便目的，并且不應(yīng)以任何方式理解為限制本公開。如本文所用，術(shù)語‘結(jié)合配偶體’理解為意指結(jié)合配偶體對的一個成員，所述結(jié)合配偶體對可以是任何配體/受體對。該結(jié)合配偶體對的一個成員稱作“第一結(jié)合配偶體”并且該結(jié)合配偶體對的另一個成員稱作“第二結(jié)合配偶體”。例如，該結(jié)合配偶體對可以是鏈霉親和素/抗生物素蛋白和生物素。該結(jié)合配偶體對可以包括例如鏈霉親和素和生物素酰化的核酸。如本文所用，術(shù)語‘可轉(zhuǎn)動的’意圖指適應(yīng)于被轉(zhuǎn)動。
具體實施例方式本專利申請中描述了眾多實施方式，并且僅出于說明目的提出它們。所描述的實施方式無論如何不意圖是限制性的。本發(fā)明廣泛適用于眾多實施方式，如從本文公開內(nèi)容輕易可見。將這些實施方式充分詳細地描述以使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)嵤┍景l(fā)明，并且應(yīng)當(dāng)理解，可以使用其他實施方式并且可以做出其他變化而不脫離本發(fā)明的范圍。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到，可以在多種修改和改變的情況下實施本發(fā)明?，F(xiàn)在將參考附圖，其中相似的附圖標記在通篇范圍表示相似的部分?，F(xiàn)在將參考焦磷酸測序法描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。參考焦磷酸測序法情況對優(yōu)選實施方式的描述不應(yīng)當(dāng)理解為將本發(fā)明限于焦磷酸測序法。參考圖1，提供了聚碳酸酯盤I形式的可轉(zhuǎn)動平臺，所述的聚碳酸酯盤I包括適應(yīng)于選擇性留住用于實施核酸測序的核酸鏈的兩個或多個分立區(qū)域2。分立區(qū)域2優(yōu)選地具有約2-3mm的直徑，用鏈霉親和素包被，并且以相等間隔的間距環(huán)繞盤I的周長存在。例如，具有120mm直徑的盤I具有377mm的周長,并且通過以距離盤I中心的半徑55mm形成(分立區(qū)域/靶部位2的各中心之間)間隔為6mm的直徑3mm分立區(qū)域2，在盤I的周界周圍產(chǎn)生大致57個分立區(qū)域。然而，通過使用更大的盤I或更小分立區(qū)域，例如，0. 5mm直徑間距Imm或任何其組合，分立區(qū)域的數(shù)目可以是更小或更大數(shù)字。優(yōu)選地，分立區(qū)域2是包括約0. 5至100 ii L之間體積的淺孔。可以在圖2和圖3中見到其他實施方式，其中相似特征已經(jīng)給予相似附圖標記。在 這些實例中，可轉(zhuǎn)動平臺具有120_直徑，伴有在周界周圍相等間隔的50個孔。所述孔具有約3mm直徑，并且可以由包括聚碳酸酯、透明聚苯乙烯和白色高抗沖聚苯乙烯(HIPS)的材料制成。平臺厚度通常是Imm至3mm,并且孔深度是0. 8mm至2. 8mm。在一些優(yōu)選的實施方式中，如圖4中最佳所示，可轉(zhuǎn)動平臺I還包含布置在所述平臺周界處的用于接收廢液的槽3，所述廢液從可轉(zhuǎn)動平臺I的表面在其轉(zhuǎn)動期間甩離或離心下來。優(yōu)選地，槽3是平臺I的模制單元?？梢岳斫?，伴隨測序反應(yīng)中的每個步驟，廢試劑從該平臺甩離，并且為了改善廢液處置，提供槽3。然而，在備選實施方式，可轉(zhuǎn)動平臺I位于其內(nèi)部的殼4可以設(shè)置成具有鄰近該平臺周界布置的槽5以接收在轉(zhuǎn)動平臺I轉(zhuǎn)動期間從其表面甩離的廢液。槽5中的流體可以經(jīng)導(dǎo)管6抽離平臺I以使污染最小化。優(yōu)選地，使用真空系統(tǒng)(未顯示)。優(yōu)選使用的測序方法是焦磷酸測序法。然而，可以理解可以利用對核酸鏈測序的其他方法，如前文討論。優(yōu)選地，分立區(qū)域2適應(yīng)于選擇性地固定該核酸鏈。例如，該核酸鏈可以是生物素?；?，并且分立區(qū)域2包含用于與生物素酰化核酸鏈固定的鏈霉親和素。然而，可以理解，其他化學(xué)是可用于固定核酸鏈至分立區(qū)域2。根據(jù)用于實施核酸鏈測序的本發(fā)明方法，提供可轉(zhuǎn)動平臺I并且將核酸鏈固定至分立區(qū)域2。隨后將任何互補性核酸鏈變性并且移去，例如通過加熱平臺I至約94°C。分立區(qū)域2隨后依次與A、T、G和C核苷酸接觸，其中在每個接觸步驟之間如此轉(zhuǎn)動平臺1，從而基本上以離心方式從分立區(qū)域2移走任何殘余或未反應(yīng)的核苷酸。本發(fā)明的方法還包括在每個所述接觸步驟期間和/或之后分析核酸鏈的步驟。該分析步驟包括通過使光輸出與已經(jīng)同所述核酸鏈結(jié)合的核苷酸的數(shù)目相關(guān)而檢測該核酸鏈中的下一個堿基對，其中所述的光因核苷酸的摻入而產(chǎn)生。用于檢測由該反應(yīng)產(chǎn)生的光的合適檢測器是光電倍增器。可以理解隨著可轉(zhuǎn)動平臺I轉(zhuǎn)動，全部樣品均通過該檢測器。如果沒有核苷酸摻入，則沒有光信號，并使用離心力甩離反應(yīng)混合物(每個循環(huán)或每隔第10-50第循環(huán)(即)但是小于第80個循環(huán))，并且另一輪隨下一個核苷酸開始。在優(yōu)選的實施方式中，在分立區(qū)域2與后續(xù)核苷酸接觸之前，每個靶部位2經(jīng)受采用洗滌試劑的洗滌或淋洗步驟。該洗滌試劑可以是任何試劑，其中所述的任何試劑可以基本上洗去來自先前接觸步驟的任何殘余溶液，并且優(yōu)選地是PCR緩沖液。優(yōu)選地，在分配核苷酸試劑和酶時，可轉(zhuǎn)動平臺I以低速度轉(zhuǎn)動，例如以約10至200轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)動，并且在分配洗滌試劑時，平臺I以低速度轉(zhuǎn)動，例如以約400至1000轉(zhuǎn)
/分鐘轉(zhuǎn)動。本發(fā)明提供試可轉(zhuǎn)動平臺I用于核酸鏈測序的用途，和試劑盒，所述試劑盒包括可轉(zhuǎn)動平臺I和用于所述核酸鏈測序的一種或多種試劑。參考圖5，本發(fā)明還提供隨用于核酸鏈測序的可轉(zhuǎn)動平臺I 一起使用的裝置。該裝置包含用于以預(yù)定的可控的用戶可選轉(zhuǎn)動速度轉(zhuǎn)動平臺I的馬達，如能夠傳送約10至1000轉(zhuǎn)/分鐘之間的轉(zhuǎn)動速度的馬達。還提供用于分配核酸鏈到分立區(qū)域2以固定所述核酸鏈至分立區(qū)域2的裝置。這種裝置可以采取噴墨型技術(shù)或合適的分配器7 (如注射器泵)的 形式。還提供用于分配A、T、G和C核苷酸與分立區(qū)域2接觸和用于分配洗滌試劑的裝置。再次地，這種裝置可以采取噴墨型技術(shù)的形式。還提供用于變性并移走任何互補性核酸鏈的裝置，并且這種裝置可以采取布置在殼4內(nèi)部的加熱盤管(未在該圖中顯示)的形式。還提供合適的檢測裝置8以檢測由焦磷酸測序反應(yīng)產(chǎn)生的光。合適的檢測器會是技術(shù)人員已知的，例如可以安裝在可轉(zhuǎn)動平臺下方或上方的光電倍增器I?，F(xiàn)在具體參考圖6和圖7，所述圖顯示用于本發(fā)明中的光電倍增檢測器的多種實施方式。一種光學(xué)構(gòu)造使用聚焦光學(xué)器件(圖6)并且第二種光學(xué)布局使用直接成像法(圖7)。圖6詳述了聚焦透鏡10、縫隙11、光敏表面12、光電倍增器13和檢測電子部件14。圖7詳述了縫隙15、光敏表面16、光電倍增器17和檢測電子部件18。現(xiàn)在參考圖8，顯示加熱盤管或加熱環(huán)20。加熱環(huán)20由與加熱器PCB (印刷電路板)結(jié)合的鋁環(huán)組成。加熱器PCB并入溫度敏感元件(未顯示)以允許閉環(huán)控制加熱器溫度。取決于可轉(zhuǎn)動平臺I上孔/分立區(qū)域的設(shè)計，加熱環(huán)20可以在表面上具有或可以沒有凸出部21。設(shè)計凸出部21以確保僅可轉(zhuǎn)動平臺中的孔的底部與加熱環(huán)20接觸。將加熱環(huán)20優(yōu)選地設(shè)計成向上移動以接觸可轉(zhuǎn)動平臺I并且向下移動以允許可轉(zhuǎn)動平臺I自由轉(zhuǎn)動并允許快速移走來自反應(yīng)孔的熱。使用螺線管22以使加熱環(huán)20向上滑動并且向下引導(dǎo)桿23，可以實現(xiàn)這一點?？梢詫⒖赊D(zhuǎn)動平臺I以分配酶和核苷酸混合物的低速度(即200轉(zhuǎn)/分鐘或更小)轉(zhuǎn)動，其中離心力低到不足以從分立區(qū)域2移走混合物并且足以允許反應(yīng)繼續(xù)進行和光學(xué)檢測完成?？梢詫⑾礈煸噭┮愿咿D(zhuǎn)子速度添加(即400轉(zhuǎn)/分鐘)，從而所述洗液從靶部位2移走全部試劑并且在分立區(qū)域2之間基本上不造成污染?，F(xiàn)在轉(zhuǎn)至圖IOA至10C，在備選性設(shè)計中，可轉(zhuǎn)動平臺I并不一定需要本身是盤；它可能由多個分立的反應(yīng)孔30組成，其中將所述反應(yīng)孔30載入以轉(zhuǎn)動模式容納每個分立反應(yīng)孔31的掛籃中。例如，分立反應(yīng)孔30可以是改良0. 2mL離心管的形式，所述的離心管可以在可轉(zhuǎn)動掛籃31形式的平臺I上以45度安裝。在這種布局中，蓋32是打開的并且處于水平面上(該蓋的內(nèi)側(cè)面朝上)。該蓋32經(jīng)過修改，從而可能將以低每分鐘轉(zhuǎn)速分配至該蓋中的試劑以高每分鐘轉(zhuǎn)速離心至管33中(見虛線箭頭)。蓋32充當(dāng)執(zhí)行測序反應(yīng)的靶部位2，并且管33本身充當(dāng)廢物槽3。鉸合部34可以經(jīng)修改以充當(dāng)將離心的廢試劑運輸至管33的通道。
實施例如上文討論，可以通過使用焦磷酸測序法實現(xiàn)DNA序列的測定(見AgahA.，Aghajan M. , Mashayekhi F. , Amini S. , Davis R. , Plummer J. D. , Ronaghi M. , GriffinP. B. , A multi-enzyme model for pyrosequencing (用于焦憐酸測序法的多重酶模式)，Nucleic Acids Res (核苷酸研究).，2004 ;32 :el66)。通過檢測互補性3'-脫氧核糖核苷酸5'-三磷酸(dNTP)由DNA聚合酶摻入單鏈模板后焦磷酸的釋放，實現(xiàn)測序。最初，焦磷酸鹽必須由硫酸化酶轉(zhuǎn)化成腺苷三磷酸(ATP)。正是ATP與螢光素借助螢光素酶發(fā)生反應(yīng)才產(chǎn)生指示核苷酸摻入和因而指示模板鏈序列的光信號。為允許摻入并且檢測下一個核苷酸而不受源自先前所添加核苷酸的干擾，使用腺苷三磷酸雙磷酶。腺苷三磷酸雙磷酶會在添加下一個核苷酸之前降解過多的核苷酸。在焦磷酸測序過程期間存在副產(chǎn)物(如硫酸鹽和二磷酸核苷酸)的積累。這些副產(chǎn)物抑制了酶，導(dǎo)致長時測序運行期間信號質(zhì)量的降低。例如，腺苷三磷酸雙磷酶的抑制引起未摻入的核苷酸的移除減少，這種減少導(dǎo)致堿基的不同步摻入并且因而導(dǎo)致不良的信號檢測。因而，使用焦磷酸測序法的測序長度目前局限于不超過60個核苷酸(見Mashayekhi F. , Ronaghi M. , Analysis of read-length limiting factors in pyrosequencingchemistry (焦磷酸測序化學(xué)中讀出長度限制因素的分析),Anal. Biochem(分析生物化學(xué)) ,2007 ；363 :275-287)。因此，為了降低副產(chǎn)物抑制作用的影響并且增加讀出長度，本發(fā)明能夠在眾多核苷酸暴露后洗去反應(yīng)組分，從而允許添加新鮮試劑以繼續(xù)該工序的下一段，同時確保模板仍與支持物物結(jié)合。測序靶使用帶有自我引發(fā)環(huán)(以下劃線突出顯示)的5'-生物素標記的合成性寡核苷酸以在本發(fā)明的平臺上實現(xiàn)直到30個堿基對的測序。合成性寡核苷酸(SEQ-0LIG0-30BP)的完整喊基對序列是5'-生物素-A GTGTGCA GG ACGAGT CCCC A CC A C A CCCAGGAAACAGCTATGACCATGCTTGCATGGTCATAGCTGTTTCC-3'由于自我引發(fā)環(huán)序列折疊于其互補性序列上，故自我引發(fā)環(huán)序列允許焦磷酸測序反應(yīng)從合成性寡核苷酸的3'端開始。因此，由該反應(yīng)待識別的第一核苷酸是以粗體突出顯示腺苷(A)堿基。作為結(jié)果，該反應(yīng)順序中使用的第一核苷酸是互補性核苷酸，胸苷(dlTP)。因而，用于 SEQ-0LIG0-30BP 反應(yīng)的完整序列是T GGG T G T GG T GGGG ACTCGT CC TGCACAC T。由于焦磷酸測序法反應(yīng)可以識別雜聚物核苷酸(多段的相同核苷酸)，故測序用核苷酸的實際分配次序縮短至TGTGTGTGACTCGTCTGCA C A CT0 SEQ-0LIG0-30BP寡核苷酸被稀釋降至0. 2微摩爾濃度。鏈霉親和素包被的盤使用化學(xué)品鹽酸I-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺(EDC)，高抗沖聚苯乙烯盤用鏈霉親和素借助該蛋白質(zhì)與聚合物之間的共價鍵包被。通過添加濃度10毫克/毫升的2. 5微升EDC和濃度5毫克/毫升的2. 5微升鏈霉親和素，隨后在室溫在減少反應(yīng)體系蒸發(fā)的濕盒中孵育4小時，準備好多個孔。孵育后，將孔用磷酸鹽緩沖鹽水并且隨后用水洗滌。允許孔晾干I小時，并且隨后將孔在4°C貯藏于含有干燥劑的密封袋中。
通過使用QIAGEN GmbH提供的對照寡核苷酸進行眾多對照實驗展示鏈霉親和素與聚苯乙烯平臺共價結(jié)合的能力。在無洗滌步驟的情況下如下文所述實現(xiàn)對照寡核苷酸的測序。對照寡核苷酸的序列是T A(C或T)G G T T TG C，核苷酸分配的次序是T ACTGTGC。對照孔缺少EDC或鏈霉親和素。陽性盤的焦磷酸測序顯示出優(yōu)良的強信號(圖11)。對鏈霉親和素陰性對照或EDC陰性對照(圖12和圖13)未觀察到真實信號。圖11中顯示在EDC存在下用鏈霉親和素包被的聚苯乙烯孔的熱解圖結(jié)果。該結(jié)果表明，模板已經(jīng)通過允許鑒定序列的生物素-鏈霉親和素鍵與容器結(jié)合。圖12中所示鏈霉親和素陰性對照的熱解圖結(jié)果表明，僅與鏈霉親和素結(jié)合的模板可能已經(jīng)產(chǎn)生信號。因此，在圖11的結(jié)果中，洗滌后的殘余模板沒有提供信號。圖13中顯示EDC陰性對照的熱解圖結(jié)果，該結(jié)果顯示測序期間無信號。該結(jié)果表明，鏈霉親和素僅在EDC存在下與聚苯乙烯孔結(jié)合。因此，使用共價鍵合作用實現(xiàn)與該平臺的結(jié)合。

測定法設(shè)置將5微升寡核苷酸分配至共價結(jié)合性鏈霉親和素包被的聚苯乙烯盤/平臺的孔中以提供I皮摩爾靶用于測序。模板在室溫孵育10分鐘以允許生物素-鏈霉親和素結(jié)合發(fā)生。孵育后，吸掉任何未結(jié)合的模板并且將孔用5微升去離子水洗滌2次以確保除去任何殘余的未結(jié)合模板。測序-洗滌-測序?qū)⒈PI置入儀器中。手工建立運行以允許微量注射2微升水、I微升包含DNA聚合酶、硫酸化酶、螢光素酶和腺苷三磷酸雙磷酶的酶混合物和I微升由螢光素酶和緩沖液組成的底物。在允許基線穩(wěn)定的10秒時間后，在添加酶和底物后，以100納升微量注射陰性對照核苷酸dGTP以確保運行期間無隨機信號產(chǎn)生。由于鳥苷不是該序列中的第一堿基，故它不應(yīng)當(dāng)在添加時產(chǎn)生信號峰。使用以下分配次序以30秒間距以100納升加載下一組核苷酸TGTGTGT。每種核苷酸的正確添加產(chǎn)生一個光信號峰。峰值取決于隊列中相同核苷酸的數(shù)目。這些峰的所得圖稱作熱解圖。在添加這八種核苷酸后，將反應(yīng)內(nèi)容物通過1000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)動該盤5秒甩離。在高速轉(zhuǎn)動結(jié)束時，降低轉(zhuǎn)子速度返回至60轉(zhuǎn)/分鐘并且通過添加相同體積的水、酶和底物重啟測序循環(huán)。依次地，隨后加載下一組核苷酸并且測量信號峰。使用的第二和第三組核苷酸是G ACTCGTC和TGTCACA T，加下劃線的核苷酸用作又一種陰性對照以監(jiān)測反應(yīng)的非特異性。在2組序列之間施加洗滌步驟。完整序列數(shù)據(jù)可以在圖14中見到。圖14顯示使用測序-洗滌-測序策略時，SEQ-0LIG0-30BP合成性寡核苷酸序列的熱解圖。將具有自我引發(fā)環(huán)序列的5'-生物素標記的SEQ-0LIG0-30BP模板載入的鏈霉親和素包被的高抗沖聚苯乙烯盤的孔以允許捕獲該靶至此孔的生物素-鏈霉親和素結(jié)合。洗去任何未結(jié)合的模板并且伴隨酶和底物的添加啟動測序反應(yīng)。首先加載陰性對照核苷酸(dGTP)以監(jiān)測該反應(yīng)中的非特異性。將已知序列的7種第一核苷酸以100納升體積以30秒間距微量注射。產(chǎn)生了序列中每個相應(yīng)堿基的峰。峰值根據(jù)相同核苷酸在該序列內(nèi)部的分布變動。在添加第一組的全部核苷酸時，將轉(zhuǎn)子速度增加至1000轉(zhuǎn)/分鐘以移去孔的液體內(nèi)容物，從而使模板留在原位與鏈霉親和素包被的盤結(jié)合。在5秒后，降低該速度返回至60轉(zhuǎn)/分鐘并且通過添加新酶和底物及下一組核苷酸重啟測序過程。結(jié)果顯示了測序-洗滌-測序在本發(fā)明的鏈霉親和素包被盤上的能力。盡管參考下述實施方式說明和描述本發(fā)明，其中將所述實施方式目前構(gòu)思為最佳模式或在實際實施時開展本發(fā)明的模式，然而應(yīng)當(dāng)理解可以做出多種變化以使本發(fā)明適應(yīng) 于不同實施方式而不脫離本文中公開并由下述權(quán)利要求書所包括的更廣泛發(fā)明構(gòu)思。
權(quán)利要求
1.一種用于實施測定法的可轉(zhuǎn)動平臺，所述平臺適應(yīng)于在所述平臺的表面上的一個或多個分立區(qū)域內(nèi)固定第一結(jié)合配偶體。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的可轉(zhuǎn)動平臺，其中，所述平臺的整個上表面適應(yīng)于固定所述第一結(jié)合配偶體。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的可轉(zhuǎn)動平臺，其中，多個分立區(qū)域以陣列方式分布在所述平臺的所述表面上。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的可轉(zhuǎn)動平臺，其中，所述分立區(qū)域是基本上平的。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的可轉(zhuǎn)動平臺，其中，所述分立區(qū)域是淺孔。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的可轉(zhuǎn)動平臺，其中，所述淺孔包含在約0.5至100 y L之間的體積或約0. 5至3mm的孔深度。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的可轉(zhuǎn)動平臺，其中，與所述可轉(zhuǎn)動平臺的表面相比，所述分立區(qū)域是相對升高的部分。
8.根據(jù)權(quán)利要求3至7中任一項所述的可轉(zhuǎn)動平臺，其中，所述分立區(qū)域具有約I至5mm的直徑。
9.根據(jù)權(quán)利要求3至8中任一項所述的可轉(zhuǎn)動平臺，其中，所述平臺是基本上圓形的盤并且所述盤的厚度是約I至4mm。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的可轉(zhuǎn)動平臺，其中，所述分立區(qū)域分布在所述盤的周界周圍。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的可轉(zhuǎn)動平臺，其中，約2至500個分立區(qū)域分布在所述盤的周界周圍。
12.根據(jù)權(quán)利要求9至11中任一項所述的可轉(zhuǎn)動平臺，其中，所述盤的直徑在約50至500mm之間。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的可轉(zhuǎn)動平臺，其中，所述平臺由選自聚碳酸酯、聚苯乙烯、高抗沖聚苯乙烯、聚乙烯和聚丙烯的塑料材料形成或者由玻璃或石英形成。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的可轉(zhuǎn)動平臺，其中，所述一個或多個分立區(qū)域是所述平臺上的涂層，其中，所述涂層適應(yīng)于固定所述第一結(jié)合配偶體。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的可轉(zhuǎn)動平臺，其中，所述第一結(jié)合配偶體化學(xué)地吸附到或者共價地或離子地或成氫鍵地結(jié)合到所述平臺的所述表面上，或者范德華力將所述第一結(jié)合配偶體固定至所述平臺的所述表面。
16.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的可轉(zhuǎn)動平臺，其還包含布置在所述平臺周界處的用于接收廢液的槽，所述廢液從所述可轉(zhuǎn)動平臺的表面在其轉(zhuǎn)動期間甩離或離心下來。
17.一種用于實施測定法的方法，所述方法包括以下步驟 提供權(quán)利要求I至16中任一項所述的平臺； 將第一結(jié)合配偶體結(jié)合或固定至所述平臺的所述表面上的一個或多個分立區(qū)域；以及使每個所述分立區(qū)域依次地與一系列試劑接觸，其中在一個或多個或全部的所述接觸步驟之間轉(zhuǎn)動所述平臺，從而基本上以離心方式從每個所述分立區(qū)域移去任何殘余或未反應(yīng)的所述試劑。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述系列試劑的第一者包含針對第一結(jié)合配偶體的第二結(jié)合配偶體，并且后續(xù)的試劑選自洗滌試劑或淋洗試劑。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或權(quán)利要求18所述的方法，所述方法還包括在每個所述接觸步驟期間和/或之后分析所述測定法的步驟。
20.根據(jù)權(quán)利要求17至19中任一項所述的方法，所述方法還包括以下步驟以約10至200轉(zhuǎn)/分鐘的速度轉(zhuǎn)動所述可轉(zhuǎn)動平臺，同時分配所述試劑，并且以約400至1000轉(zhuǎn)/分鐘的速度轉(zhuǎn)動所述可轉(zhuǎn)動平臺，從而基本上以離心方式從所述靶部位移走所述試劑。
21.權(quán)利要求I至16中任一項所述的平臺用于實施測定法的用途。
22.—種試劑盒，其包含權(quán)利要求I至16中任一項所述的平臺和一種或多種用于所述測定法的試劑。
23.用于實施測定法的裝置，所述裝置包括 用于以預(yù)定的可控的用戶可選性轉(zhuǎn)動速度轉(zhuǎn)動權(quán)利要求I至16中任一項的所述平臺的裝置； 任選地，用于分配所述第一結(jié)合配偶體到所述平臺的所述表面上的所述一個或多個分立區(qū)域上，以將所述第一結(jié)合配偶體固定至所述分立區(qū)域的裝置； 用于分配試劑與所述分立區(qū)域接觸的裝置；以及 任選地，用于分配洗滌試劑的裝置。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的裝置，其中，用于轉(zhuǎn)動所述平臺的所述裝置是馬達，并且預(yù)定的轉(zhuǎn)動速度是在約10至1000轉(zhuǎn)/分鐘之間可選的。
25.根據(jù)權(quán)利要求23或權(quán)利要求24所述的裝置，所述裝置還包括抽取從所述可轉(zhuǎn)動平臺甩離的廢試劑的真空抽取系統(tǒng)。
26.根據(jù)權(quán)利要求23至25中任一項所述的裝置，所述裝置還包括鄰近所述平臺周界所布置的槽，從而在所述槽中接收所述轉(zhuǎn)動平臺轉(zhuǎn)動期間從該表面甩離的廢液。
27.一種用于實施測定法的可轉(zhuǎn)動平臺，所述平臺適應(yīng)于在所述平臺的表面上的一個或多個分立區(qū)域內(nèi)選擇性固定第二結(jié)合配偶體。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的可轉(zhuǎn)動平臺，其中，所述第二結(jié)合配偶體是與已經(jīng)與所述平臺的所述表面結(jié)合的第一結(jié)合配偶體可結(jié)合或可反應(yīng)的。
29.根據(jù)權(quán)利要求27或權(quán)利要求28所述的可轉(zhuǎn)動平臺，其中，所述平臺的整個上表面適應(yīng)于選擇性固定所述第二結(jié)合配偶體。
30.根據(jù)權(quán)利要求27或權(quán)利要求28所述的可轉(zhuǎn)動平臺，其中，多個分立區(qū)域以陣列方式分布在所述平臺的所述表面上。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的可轉(zhuǎn)動平臺，其中，所述分立區(qū)域是基本上平的。
32.根據(jù)權(quán)利要求30所述的可轉(zhuǎn)動平臺，其中，所述分立區(qū)域是淺孔。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的可轉(zhuǎn)動平臺，其中，所述淺孔包含在約O.5至100 μ L之間的體積或約O. 5至3mm的孔深度。
34.根據(jù)權(quán)利要求30所述的可轉(zhuǎn)動平臺，其中，與所述可轉(zhuǎn)動平臺的表面相比，所述分立區(qū)域是相對升高的部分。
35.根據(jù)權(quán)利要求30至34中任一項所述的可轉(zhuǎn)動平臺，其中，所述分立區(qū)域具有約I至5mm的直徑。
36.根據(jù)權(quán)利要求30至35中任一項所述的可轉(zhuǎn)動平臺，其中，所述平臺是基本上圓形的盤并且所述盤的厚度是約I至4mm。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的可轉(zhuǎn)動平臺，其中，所述分立區(qū)域分布在所述盤的周界周圍。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的可轉(zhuǎn)動平臺，其中，約2至500個分立區(qū)域分布在所述盤的周界周圍。
39.根據(jù)權(quán)利要求36至38中任一項所述的可轉(zhuǎn)動平臺，其中，所述盤的直徑在約50至.500mm之間。
40.根據(jù)前述權(quán)利要求27至39中任一項所述的可轉(zhuǎn)動平臺，其中，所述平臺由選自聚碳酸酯、聚苯乙烯、高抗沖聚苯乙烯、聚乙烯和聚丙烯的塑料材料形成或者由玻璃或石英形成。
41.根據(jù)前述權(quán)利要求28至40中任一項所述的可轉(zhuǎn)動平臺，其中，所述一個或多個分立區(qū)域是所述平臺上的涂層，其中，所述涂層適應(yīng)于固定所述第一結(jié)合配偶體。
42.根據(jù)前述權(quán)利要求28至41中任一項所述的可轉(zhuǎn)動平臺，其中，所述第一結(jié)合配偶體化學(xué)地吸附到或者共價地或離子地或成氫鍵地結(jié)合到所述平臺的所述表面上，或者范德華力將所述第一結(jié)合配偶體固定至所述平臺的所述表面。
43.根據(jù)前述權(quán)利要求29至42中任一項所述的可轉(zhuǎn)動平臺，其還包含布置在所述平臺周界處的用于接收廢液的槽，所述廢液在所述可轉(zhuǎn)動平臺轉(zhuǎn)動期間從其表面甩離或離心下來。
44.一種用于實施測定法的方法，所述方法包括以下步驟 提供權(quán)利要求27至43中任一項所述的平臺； 將第二結(jié)合配偶體選擇性結(jié)合或固定至所述平臺的所述表面上的一個或多個分立區(qū)域；以及 使每個所述祀部位依次地與一系列試劑接觸，其中在一個或多個或全部的所述接觸步驟之間轉(zhuǎn)動所述平臺，從而基本上以離心方式從每個所述靶部位移去任何殘余或未反應(yīng)的所述試劑。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中，所述第二結(jié)合配偶體是與已經(jīng)同所述平臺的所述表面結(jié)合的第一結(jié)合配偶體可結(jié)合或可反應(yīng)的。
46.根據(jù)權(quán)利要求44或權(quán)利要求45所述的方法，其中，后續(xù)的試劑選自洗滌試劑或淋洗試劑。
47.根據(jù)權(quán)利要求44至46中任一項所述的方法，所述方法還包括在每個所述接觸步驟期間和/或之后分析所述測定法的步驟。
48.根據(jù)權(quán)利要求44至47中任一項所述的方法，所述方法還包括以下步驟以約10至200轉(zhuǎn)/分鐘的速度轉(zhuǎn)動所述可轉(zhuǎn)動平臺，同時分配所述試劑，并且以約400至1000轉(zhuǎn)/分鐘的速度轉(zhuǎn)動所述可轉(zhuǎn)動平臺，從而基本上以離心方式從所述靶部位移走試劑。
49.權(quán)利要求27至43中任一項所述的平臺用于實施測定法的用途。
50.一種試劑盒,其包含權(quán)利要求27至43中任一項所述的平臺和一種或多種用于所述測定法的試劑。
51.用于實施測定法的裝置，所述裝置包括 用于以預(yù)定的可控的用戶可選性轉(zhuǎn)動速度轉(zhuǎn)動權(quán)利要求27至43中任一項的所述平臺的裝置；任選地，用于分配所述第二結(jié)合配偶體到所述平臺的所述表面上的所述一個或多個分立區(qū)域上，以選擇性固定所述第二結(jié)合配偶體至所述分立區(qū)域的裝置； 用于分配試劑與所述分立區(qū)域接觸的裝置；以及 任選地，用于分配洗滌試劑的裝置。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的裝置，其中，用于轉(zhuǎn)動所述平臺的所述裝置是馬達，并且預(yù)定的轉(zhuǎn)動速度是從約10至1000轉(zhuǎn)/分鐘之間可選的。
53.根據(jù)權(quán)利要求51或權(quán)利要求52所述的裝置，所述裝置還包括抽取從所述可轉(zhuǎn)動平臺甩離的廢試劑的真空抽取系統(tǒng)。
54.根據(jù)權(quán)利要求51至53中任一項所述的裝置，所述裝置還包括鄰近所述平臺周界所布 置的槽，從而在所述槽中接收在所述轉(zhuǎn)動平臺轉(zhuǎn)動期間從其表面甩離的廢液。
55.一種用于實施核酸鏈測序的可轉(zhuǎn)動平臺，所述平臺適應(yīng)于在所述平臺的表面上的一個或多個分立區(qū)域內(nèi)固定核酸鏈結(jié)合配偶體。
56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的可轉(zhuǎn)動平臺，其中，所述核酸鏈是DNA或RNA或它們的修飾形式。
57.根據(jù)權(quán)利要求55或權(quán)利要求56所述的可轉(zhuǎn)動平臺，其中，所述核酸鏈是生物素?；牟⑶宜龊怂徭溄Y(jié)合配偶體包含抗生物素蛋白或鏈霉親和素或用于結(jié)合生物素酰化核酸鏈的類似物。
58.一種用于實施核酸鏈測序的方法，所述方法包括以下步驟 提供權(quán)利要求55至57中任一項所述的平臺； 將核酸鏈結(jié)合配偶體結(jié)合或固定至所述分立區(qū)域并且隨后將核酸鏈選擇性結(jié)合或固定至所述分立區(qū)域； 任選地變性并移走任何互補性核酸鏈，使測序引物與所述分立區(qū)域復(fù)性；以及 使每個所述分立區(qū)域依次地與包含A、T、G和/或C核苷酸或者相應(yīng)的合適核苷酸類似物的一系列試劑接觸，其中，在每個或任何的所述接觸步驟之間轉(zhuǎn)動所述平臺，從而基本上以離心方式從所述分立區(qū)域移去基本上任何殘余或未反應(yīng)的試劑。
59.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其中，使每個所述分立區(qū)域依次地與包含A、T、G和/或C核苷酸的一系列試劑接觸。
60.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中，所述的依次接觸步驟或者包括 a.)將每種核苷酸或其類似物以任何合乎需要或預(yù)定的順序單獨并且依次地添加， b.)將A+T+G+C核苷酸或這些核苷酸的任何預(yù)定或合乎需要的亞組作為混合物添加，并且再次添加所述混合物及其他。
61.根據(jù)權(quán)利要求58至60中任一項所述的方法，所述方法還包括在每個所述接觸步驟期間和/或之后分析所述核酸鏈的步驟。
62.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中，所述分析包括通過使光輸出與已經(jīng)同所述核酸鏈結(jié)合的核苷酸的數(shù)目相關(guān)而檢測所述核酸鏈中的下一個堿基對。
63.根據(jù)權(quán)利要求58至62中任一項所述的方法，其中，所述可轉(zhuǎn)動平臺在約10至200轉(zhuǎn)/分鐘之間轉(zhuǎn)動，同時分配所述試劑和所述酶，從而不移走添加至所述靶部位的試劑，并且所述平臺在約400至1000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)動，同時分配所述洗滌試劑。
64.根據(jù)權(quán)利要求58至63中任一項所述的方法，其中，所述變性步驟包括加熱所述核酸鏈以實現(xiàn)變性，或使所述核酸鏈暴露于升高的pH。
65.根據(jù)權(quán)利要求58至64中任一項所述的方法，所述方法包括其中在所述核酸鏈變性后，用淋洗試劑通過淋洗步驟移去互補鏈的步驟。
66.根據(jù)權(quán)利要求58至65中任一項所述的方法，其中，通過以下方式將每個所述靶部位為每種所述后續(xù)試劑做好準備通過轉(zhuǎn)動所述平臺以離心方式移走任何殘余試劑而基本上干燥所述靶部位，從而基本上不存在所述靶部位被試劑污染的情況。
67.權(quán)利要求55至57中任一項所述的平臺用于實施核酸鏈測序的用途。
68.一種試劑盒，其包含權(quán)利要求27至43中任一項所述的平臺和一種或多種用于實施核酸鏈測序的試劑。
69.用于核酸鏈測序的裝置，所述裝置包括 用于以預(yù)定的可控的用戶可選性轉(zhuǎn)動速度轉(zhuǎn)動權(quán)利要求55至57中任一項所述平臺的裝置； 任選地，用于分配核酸鏈結(jié)合配偶體到所述分立區(qū)域上以使所述核酸鏈結(jié)合配偶體固定至所述分立區(qū)域的裝置； 任選地，用于分配核酸鏈到所述分立區(qū)域上以選擇性地使所述核酸鏈固定至所述分立區(qū)域的裝置； 任選地，用于變性并且任選移走任何互補性核酸鏈的裝置； 用于分配A、T、G和/或C核苷酸或它們相應(yīng)類似物或它們的組合與所述分立區(qū)域接觸的裝置； 用于分配洗滌試劑的裝置；以及 任選地，用于分配一種或多種酶溶液的裝置。
70.一種用于實施核酸鏈測序的可轉(zhuǎn)動平臺，所述平臺適應(yīng)于在所述平臺的表面上的一個或多個分立區(qū)域內(nèi)選擇性固定核酸鏈。
71.根據(jù)權(quán)利要求58所述的可轉(zhuǎn)動平臺，其中，所述核酸鏈是與已經(jīng)與所述平臺的所述表面結(jié)合的第一結(jié)合配偶體可結(jié)合或可反應(yīng)的。
72.根據(jù)權(quán)利要求70或權(quán)利要求71所述的可轉(zhuǎn)動平臺，其中，所述核酸鏈是DNA或RNA或它們的修飾形式。
73.根據(jù)權(quán)利要求71或權(quán)利要求72所述的可轉(zhuǎn)動平臺，其中，所述核酸鏈是生物素酰化的并且所述第一結(jié)合配偶體包含抗生物素蛋白或鏈霉親和素或用于結(jié)合生物素酰化核酸鏈的類似物。
74.一種用于實施核酸鏈測序的方法，所述方法包括以下步驟 提供權(quán)利要求70至73中任一項所述的平臺； 將核酸鏈選擇性結(jié)合或固定至所述分立區(qū)域； 任選地變性并移走任何互補性核酸鏈，使測序引物與所述分立區(qū)域復(fù)性；以及 使每個所述分立區(qū)域依次地與包含A、T、G和/或C核苷酸或相應(yīng)的合適核苷酸類似物的一系列試劑接觸，其中，在每個或任何的所述接觸步驟之間轉(zhuǎn)動所述平臺，從而基本上以離心方式從所述分立區(qū)域移去任何殘余或未反應(yīng)的所述試劑。
75.根據(jù)權(quán)利要求74所述的方法，其中，所述分立區(qū)域已經(jīng)使核酸鏈結(jié)合配偶體與其固定，并且其中，所述核酸鏈與所述核酸鏈結(jié)合配偶體選擇性結(jié)合。
76.權(quán)利要求70至73中任一項所述的平臺用于核酸鏈測序的用途。
77.—種試劑盒，其包含權(quán)利要求70至73中任一項所述的用于核酸鏈測序的平臺。
78.用于核酸鏈測序的裝置，所述裝置包括 用于以預(yù)定的可控的用戶可選性轉(zhuǎn)動速度轉(zhuǎn)動權(quán)利要求70至73中任一項的所述平臺的裝置； 任選地，用于分配核酸鏈到所述分立區(qū)域上以選擇性地使所述核酸鏈固定至所述分立區(qū)域的裝置； 任選地，用于變性并且任選移走任何互補性核酸鏈的裝置； 用于分配A、T、G和/或C核苷酸或它們相應(yīng)類似物或它們的組合與所述分立區(qū)域接觸的裝置； 用于分配洗滌試劑的裝置；以及任選地，用于分配一種或多種酶溶液的裝置。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于實施測定法的方法和裝置。尤其，本發(fā)明涉及可以用于實施測定法、尤其多步驟測定法的可轉(zhuǎn)動平臺。本發(fā)明提供一種可轉(zhuǎn)動平臺，其適應(yīng)于在所述平臺的表面上的一個或多個分立區(qū)域內(nèi)固定第一結(jié)合配偶體，或適應(yīng)于在所述平臺的表面上的一個或多個分立區(qū)域內(nèi)選擇性固定第二結(jié)合配偶體。本發(fā)明也涉及用于實施測定法的方法、裝置、試劑盒和可轉(zhuǎn)動平臺用途。尤其，已經(jīng)主要開發(fā)本發(fā)明用于通過焦磷酸測序法對核酸測序，然而本發(fā)明不限于該領(lǐng)域。
文檔編號G01N33/543GK102712950SQ201080042696
公開日2012年10月3日 申請日期2010年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月29日
發(fā)明者約翰·思恩·科比特, 約翰·科比特 申請人:皮羅比特私人有限公司