專利名稱:一種重要發(fā)熱病原抗體快速篩查的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本實(shí)用新型涉及同時檢測幾種重要發(fā)熱病原抗體的檢測如結(jié)核抗體、流感抗體、 禽流感抗體、鼠疫抗體、SARS抗體這幾種抗體的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)。
背景技術(shù):
2003年全球SARS流行、亞洲各國頻頻爆發(fā)的禽流感、登革熱、中緬邊境的惡性瘧疾、此起彼伏的腦炎、流感、又進(jìn)入活躍期的鼠疫、美國的西尼羅熱、非洲的埃博拉出血熱等,引起民眾對傳染病的廣泛恐懼。世界衛(wèi)生組織2002年關(guān)于傳染病的分析報告中指出, 全世界每小時有1500人死于傳染病。而發(fā)熱是傳染病最常見最為突出的臨床癥狀之一。 目前已知能引起發(fā)熱的物質(zhì)有許多種,但與發(fā)熱最相關(guān)的是生物源的,如結(jié)核分枝桿菌、流感病毒、禽流感病、鼠疫菌、SARS、毒炭疽桿菌、登革病毒、西尼羅病毒、肺炎衣原體、支原體感染等。由于每一個感染者都是一個快速流動、難以控制的傳染源,實(shí)施快速檢測,及時、快速鑒別病原是傳染病防控早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)警、早處置的基礎(chǔ)和前提。目前病原的快速檢測技術(shù)發(fā)展很快,針對不同的生物標(biāo)識物分別發(fā)展了不同的快速檢測方法。如檢測核酸的各類 PCR、原位雜交、DNA芯片、NASBA等技術(shù),檢測蛋白質(zhì)等抗原、抗體物質(zhì)的ELISA、免疫層析技術(shù)、蛋白芯片技術(shù)等,都具有各自的特點(diǎn)。針對病原核酸的PCR等快速檢測技術(shù)需依賴儀器的基因擴(kuò)增和電泳過程,也依賴操作人員的技術(shù)水平,難以滿足口岸現(xiàn)場簡便快速篩查需要。一般的方法主要檢測單種病原或傳染病,面對一個發(fā)熱患者,難以實(shí)現(xiàn)多病因的同時篩查。快速篩查是早期識別傳染病的關(guān)鍵,傳染病的快速檢測技術(shù)水平不僅關(guān)系人民的生命健康,也關(guān)系著中國的檢疫水平在國際上的可信程度和聲譽(yù),影響著我國對外的人員交流活動和國家的國際形象,也影響著能否控制傳染病的傳入傳出避免外事糾紛。因此,快速檢測技術(shù)的提高是傳染病防控工作非常重要的環(huán)節(jié),加強(qiáng)快速檢測技術(shù)應(yīng)用基礎(chǔ)研究刻不容緩,具有非常重要的意義既是提高我國衛(wèi)生檢疫防疫整體工作水平和質(zhì)量的需要,又維護(hù)我國公共衛(wèi)生安全的需要。浮芯片(suspension array)也禾爾液才百芯片(liquid array, liquid chip),是 20世紀(jì)70年代美國Luminex公司研制出的新一代生物芯片技術(shù),利用帶編碼的微球體作為載體,流式細(xì)胞儀作為檢測平臺,對核酸、蛋白質(zhì)等生物分子進(jìn)行大規(guī)模測定。懸浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球,包覆不同比例的紅光及紅外光發(fā)色劑,而產(chǎn)生100種不同比例顏色,作為100種獨(dú)特的色彩編號,每顆微球大小約5. 5 μ m,可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受體和配體識別分析等,并根據(jù)不同研究目的而標(biāo)定特定抗體、核酸探針及各種受體探針。標(biāo)記探針的微球與待測物在96孔板中進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)后,利用機(jī)器自動將反應(yīng)液吸起并通過一微細(xì)管檢測通道,每次僅允許一個微球通過檢測通道,檢測通道中設(shè)有兩道激光,一道為紅色,激發(fā)微球基質(zhì)中的顏色,識別微球分類編碼以確定檢測項(xiàng)目;一道為綠色,激發(fā)報告分子的顏色,記錄信號強(qiáng)弱以檢測待測物的含量。當(dāng)待測樣本與特定微球的探針吸附在一起時,兩道激光所激發(fā)的光都可被檢測到。而若樣本中不含該標(biāo)的物,則僅有微球中的激發(fā)光可被檢測到。再通過機(jī)器與計(jì)算機(jī)自動統(tǒng)計(jì)分析兩道激光所激發(fā)的微球種類與數(shù)量,從而判定待測樣本中有幾種測試目標(biāo)物在其中,得知測試樣本中有無待測病原存在,或同時存在有幾種至數(shù)十種病原。與以往的技術(shù)相比,當(dāng)今發(fā)展的生物芯片技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)把幾種發(fā)熱病原一次性聯(lián)合檢測的目的,目前產(chǎn)生的懸浮芯片技術(shù)還是生物芯片的一種,它除了可以檢測多種病原以外,還具有比ELISA反應(yīng)更加充分的液相環(huán)境,且具有省時省力,特異性強(qiáng),靈敏度高,并且無創(chuàng)傷的優(yōu)點(diǎn)。因此研制和開發(fā)一種重要發(fā)熱病原快速篩查系統(tǒng)對我國出入境人員的快速檢測其有無攜帶傳染病原的監(jiān)測有重要的研究意義。
實(shí)用新型內(nèi)容本實(shí)用新型的目的在于為人們提供一種重要發(fā)熱病原抗體快速篩查的蛋白懸浮芯片系統(tǒng),該芯片系統(tǒng)包括芯片基體、加液系統(tǒng)、懸浮芯片檢測儀和計(jì)算機(jī),其中,芯片基體內(nèi)裝有相關(guān)緩沖溶液和待測抗體,相關(guān)緩沖液中設(shè)置有027號、031號、032號、033號、043 號、044號編碼微球,各種編碼微球上分別包被有相應(yīng)的捕獲抗原,加液系統(tǒng)依次向芯片基體中加入生物素標(biāo)記的二抗、熒光信號檢測物,懸浮芯片檢測儀包括微細(xì)管檢測通道和檢測激光,反應(yīng)后的溶液吸入到微細(xì)管檢測通道中,以使得每個編碼微球依次通過微細(xì)管檢測通道,檢測激光激發(fā)并識別編碼微球的顏色及其上待測物的熒光信號,計(jì)算機(jī)與懸浮芯片檢測儀相連,并記錄、分析懸浮芯片檢測儀的測量結(jié)果。進(jìn)一步,所述相關(guān)緩沖溶液包括用于所述待測抗體稀釋的樣品稀釋液、稀釋所述編碼微球所用的微球稀釋液、稀釋所述生物素標(biāo)記的二抗所用的抗體稀釋液、每個反應(yīng)之后洗滌編碼微球所用的微球清洗液、SA-PE稀釋液、檢測緩沖液。進(jìn)一步,結(jié)核分枝桿菌的38KD蛋白和16KD蛋白抗原作為捕獲抗原來包被所述027 號編碼微球,流感NP蛋白抗原作為捕獲抗原來包被所述031號編碼微球,LAM抗原作為捕獲抗原來包被所述033號編碼微球,禽流感H5抗原作為捕獲抗原來包被所述032號編碼微球,鼠疫菌Fl抗原作為捕獲抗原來包被所述043號編碼微球,SARS-CoV N蛋白抗原作為捕獲抗原來包被所述044號編碼微球。進(jìn)一步,所述待測抗體為血清樣品。進(jìn)一步,所述生物素標(biāo)記的二抗優(yōu)選為Biotin-羊抗兔和/或Biotin-羊抗人 IgG0進(jìn)一步,所述熒光信號檢測物為鏈親和素-藻紅蛋白。進(jìn)一步,所述芯片基體為96孔濾板或者微量離心管。進(jìn)一步,所述檢測激光包括用激發(fā)所述編碼微球基質(zhì)中的顏色、識別編碼微球分類編碼以確定檢測項(xiàng)目的紅色激光,用于激發(fā)并識別待測分子的顏色信號、記錄信號強(qiáng)弱以檢測所述待測抗體的含量的綠色激光。經(jīng)過大量試驗(yàn)和深入的研究,對同步篩查結(jié)核分枝桿菌抗體、流感病毒抗體、禽流感病毒抗體、鼠疫桿菌抗體、SARS病毒抗體的蛋白懸浮芯片制備及其檢測條件作了實(shí)質(zhì)性的改進(jìn)和創(chuàng)新,其具有下列優(yōu)點(diǎn)1、抗原包被量的改進(jìn)抗原的包被量是成功檢測的關(guān)鍵,本實(shí)用新型對包被微球的抗原包被量進(jìn)行實(shí)質(zhì)性優(yōu)化使血清樣本的檢測效果非常良好,并且包被懸浮芯片所需的抗原包被量很低,本實(shí)用新型的抗原包被量為0. 01 250 μ g/1. 25X IO6個微球,即0. 004 1000ng/5000個微球/測試,而傳統(tǒng)免疫學(xué)ELISA方法的包被量為1 μ g/測試。2、生物素標(biāo)記的改進(jìn)通常,標(biāo)記抗體需要使用過量的生物素。理論上講,在檢測過程中,過量的生物素因未標(biāo)記上抗體而不被微球上結(jié)合捕獲抗體的抗體連接,清洗時被抽濾掉,不會與隨后加入的SA-PE反應(yīng),不影響檢測。但在實(shí)際檢測過程中,偶爾遇到過檢測信號可能過高的現(xiàn)象,出現(xiàn)假陽性,因此建議生物素標(biāo)記抗體后,盡量去除多余的生物素。以標(biāo)記ang/mL的 IgG (分子量150,000) ImL溶液為例,需加入IOmM生物素溶液約27 μ L。3、檢測的靈敏度本實(shí)用新型一種重要發(fā)熱病原抗體快速篩查的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)檢測結(jié)核抗體的靈敏度為1. 5815ng/mL ;檢測流感抗體靈敏度為968. 8ng/mL ;檢測禽流感病毒抗體靈敏度為69. 4ng/mL ;檢測鼠疫桿菌抗體靈敏度為6. 29475ng/mL ;檢測SARS病毒抗體靈敏度為 15.5265ng/mL。4、方法的特異性本實(shí)用新型通過選用結(jié)核分枝桿菌的38KD蛋白、16KD蛋白、LAM抗原,流感NP蛋白、禽流感H5抗原、鼠疫菌Fl抗原、SARS-CoV N蛋白為包被抗原,分別以兔抗結(jié)核抗體、鼠抗流感NP IgG、鼠抗禽流感H5W血清、兔抗鼠疫IgG、兔抗SARS IgG為待測抗體,以生物素化的羊抗兔IgG/羊抗鼠IgG為捕獲抗體。本研究試驗(yàn)證明各對應(yīng)的抗原特異性的與對應(yīng)抗體結(jié)合,不與其它抗體發(fā)生交叉反應(yīng),說明本方法具有良好的特異性。5、樣品的檢測能力本實(shí)用新型評價了蛋白懸浮芯片方法對人血清的檢測能力。通過對人血清的檢測,初步證實(shí)了該方法在檢測人血清中結(jié)核分枝桿菌抗體、流感病毒抗體、禽流感病毒抗體、鼠疫桿菌抗體、SARS病毒抗體的實(shí)用性。
圖1為本實(shí)用新型結(jié)構(gòu)示意圖;圖2為蛋白懸浮芯片系統(tǒng)檢測多種病原抗體示意圖;圖3為蛋白懸浮芯片系統(tǒng)檢測兔抗結(jié)核抗體劑量-反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖;圖4為蛋白懸浮芯片系統(tǒng)檢測鼠抗流感NP劑量-反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖;圖5為蛋白懸浮芯片系統(tǒng)檢測鼠抗禽流感H5W抗體劑量-反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖;圖6為蛋白懸浮芯片系統(tǒng)檢測兔抗鼠疫Fl抗體劑量-反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖;圖7為蛋白懸浮芯片系統(tǒng)檢測兔抗SarsN13抗體劑量-反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施方式
如圖1至圖7所示,本實(shí)用新型一種重要發(fā)熱病原抗體快速篩查的蛋白懸浮芯片系統(tǒng),包括芯片基體1、加液系統(tǒng)2、懸浮芯片檢測儀3和計(jì)算機(jī)4,其中,芯片基體1為96孔濾板或者微量離心管,其內(nèi)裝有相關(guān)緩沖溶液和待測抗體,相關(guān)緩沖液中設(shè)置有若干種編碼微球,各種編碼微球上包被有相應(yīng)的捕獲抗原,編碼微球包括027號編碼微球、031號編碼微球、032號編碼微球、033號編碼微球、043號編碼微球、044號編碼微球,其中,結(jié)核分枝桿菌的38KD蛋白和16KD蛋白抗原作為捕獲抗原來包被27號羧基微球,流感NP蛋白抗原作為捕獲抗原來包被31號羧基微球,LAM抗原作為捕獲抗原來包被33號編碼微球,禽流感 H5抗原作為捕獲抗原來包被32號編碼微球,鼠疫菌Fl抗原作為捕獲抗原來包被43號編碼微球,SARS-CoV N蛋白抗原作為捕獲抗原來包被44號編碼微球。結(jié)核分枝桿菌的38KD蛋白和16KD蛋白、LAM抗原,流感NP蛋白、禽流感H5抗原、 鼠疫菌Fl抗原、SARS-CoV N蛋白用于捕獲待檢測血清樣品中的待測抗體。例如如果樣品中有結(jié)核抗體,結(jié)核抗體與編碼微球上的結(jié)核分枝桿菌的38KD蛋白和16KD蛋白結(jié)合,再加入帶有生物素標(biāo)記的二抗,形成編碼微球-結(jié)核分枝桿菌的38KD蛋白和16KD蛋白-結(jié)核抗體-二抗-生物素復(fù)合物,最后加入鏈親和素-藻紅蛋白,鏈親和素與生物素結(jié)合,形成編碼微球-結(jié)核分枝桿菌的38KD蛋白和16KD蛋白-結(jié)核抗體-二抗-生物素復(fù)-鏈親和素-藻紅蛋白復(fù)合物,通過懸浮芯片檢測儀對藻紅蛋白熒光信號的檢測來達(dá)到對血清樣品中結(jié)核抗體的檢測,如果血清樣品中沒有結(jié)核抗體,包被有結(jié)核分枝桿菌的38KD蛋白和 16KD蛋白的編碼微球不會與后面加入的生物素標(biāo)記的二抗、鏈親和素-藻紅蛋白結(jié)合,最后通過懸浮芯片檢測儀器進(jìn)行檢測時無熒光信號或應(yīng)該信號非常弱。同理如果樣品中有流感抗體,流感抗體與編碼微球上的流感NP蛋白結(jié)合,再加入帶有生物素標(biāo)記的二抗,形成編碼微球-流感NP蛋白-流感抗體-二抗-生物素復(fù)合物, 最后加入鏈親和素-藻紅蛋白,鏈親和素與生物素結(jié)合,形成編碼微球-流感NP蛋白-流感抗體-二抗-生物素-鏈親和素-藻紅蛋白復(fù)合物,通過懸浮芯片檢測儀對藻紅蛋白熒光信號的檢測來達(dá)到對血清樣品中流感抗體的檢測,如果血清樣品中沒有土拉抗體,包被有流感NP蛋白的編碼微球不會與后面加入的生物素標(biāo)記的二抗、鏈親和素-藻紅蛋白結(jié)合, 最后通過懸浮芯片檢測儀器進(jìn)行檢測時無熒光信號或應(yīng)該信號非常弱。如果樣品中有禽流感抗體,禽流感抗體與編碼微球上的禽流感H5蛋白結(jié)合,再加入帶有生物素標(biāo)記的二抗,形成編碼微球-禽流感H5蛋白-禽流感抗體-二抗-生物素復(fù)合物,最后加入鏈親和素-藻紅蛋白,鏈親和素與生物素結(jié)合,形成編碼微球-禽流感H5 蛋白-禽流感抗體-二抗-生物素-鏈親和素-藻紅蛋白復(fù)合物,通過懸浮芯片檢測儀對藻紅蛋白熒光信號的檢測來達(dá)到對血清樣品中禽流感抗體的檢測,如果血清樣品中沒有禽流感抗體,包被有禽流感H5蛋白的編碼微球不會與后面加入的生物素標(biāo)記的二抗、鏈親和素-藻紅蛋白結(jié)合,最后通過懸浮芯片檢測儀器進(jìn)行檢測時無熒光信號或應(yīng)該信號非常弱。如果樣品中有鼠疫抗體,鼠疫抗體與編碼微球上的鼠疫Fl蛋白結(jié)合,再加入帶有生物素標(biāo)記的二抗,形成編碼微球-鼠疫Fl蛋白-鼠疫抗體-二抗-生物素復(fù)合物,最后加入鏈親和素-藻紅蛋白,鏈親和素與生物素結(jié)合,形成編碼微球-鼠疫Fl蛋白-鼠疫抗體-二抗-生物素-鏈親和素-藻紅蛋白復(fù)合物,通過懸浮芯片檢測儀對藻紅蛋白熒光信號的檢測來達(dá)到對血清樣品中登革熱抗體的檢測,如果血清樣品中沒有鼠疫抗體,包被有鼠疫Fl蛋白的編碼微球不會與后面加入的生物素標(biāo)記的二抗-鏈親和素-藻紅蛋白結(jié)合, 最后通過懸浮芯片檢測儀器進(jìn)行檢測時無熒光信號或應(yīng)該信號非常弱。如果樣品中有SARS抗體,SARS-CoV N抗體與編碼微球上的SARS-CoV N蛋白結(jié)合, 再加入帶有生物素標(biāo)記的二抗,形成編碼微球-SARS-CoV N蛋白-SARS抗體-二抗-生物素復(fù)合物,最后加入鏈親和素-藻紅蛋白,鏈親和素與生物素結(jié)合,形成編碼微球-SARS-CoVN蛋白-SARS抗體-二抗/SPA-生物素-鏈親和素-藻紅蛋白復(fù)合物,通過懸浮芯片檢測儀對藻紅蛋白熒光信號的檢測來達(dá)到對血清樣品中SARS抗體的檢測,如果血清樣品中沒有 SARS抗體,包被有SARS-CoV N蛋白的編碼微球不會與后面加入的生物素標(biāo)記的二抗、鏈親和素-藻紅蛋白結(jié)合,最后通過懸浮芯片檢測儀器進(jìn)行檢測時無熒光信號或應(yīng)該信號非常弱。上述芯片系統(tǒng)中,編碼微球在微球稀釋液,待測抗體在樣品稀釋液中,生物素標(biāo)記的二抗在抗體稀釋液中,熒光信號檢測物在SA-PE稀釋液中,懸浮芯片檢測儀檢測時編碼微球復(fù)合物在檢測緩沖液中,每步結(jié)合之后均用微球清洗液洗滌微球,使得沒有結(jié)合的物質(zhì)清除體系。懸浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球,包覆不同比例的紅光及紅外光發(fā)色劑,而產(chǎn)生100種不同比例顏色,作為100種獨(dú)特的色彩編號,每顆微球大小約5. 6 μ m,可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受體和配體識別分析等,并根據(jù)不同研究目的而標(biāo)定特定抗體、核酸探針及各種受體探針。標(biāo)記探針的微球與待測物在96孔板中進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)后,利用機(jī)器自動將反應(yīng)液吸起并通過一微細(xì)管檢測通道,每次僅允許一個微球通過檢測通道。檢測通道中設(shè)有兩道激光,一道為紅色,激發(fā)微球基質(zhì)中的顏色,識別微球分類編碼以確定檢測項(xiàng)目;一道為綠色,激發(fā)報告分子的顏色,記錄信號強(qiáng)弱以檢測待測物的含量。當(dāng)待測樣本與特定微球的探針吸附在一起時,兩道激光所激發(fā)的光都可被檢測到。而若樣本中不含該標(biāo)的物,則僅有微球中的激發(fā)光可被檢測到。 再通過機(jī)器與計(jì)算機(jī)自動統(tǒng)計(jì)分析兩道激光所激發(fā)的微球種類與數(shù)量,從而判定待測樣本中有幾種測試目標(biāo)物在其中,得知測試樣本中有無待測病原存在,或同時存在有幾種至數(shù)十種病原。懸浮芯片技術(shù)由于利用微球在溶液中反應(yīng),克服了片膜芯片在大分子檢測時受表面張力、空間效應(yīng)等對反應(yīng)動力學(xué)的影響,同時利用激光檢測技術(shù),大大提高了樣品檢測的準(zhǔn)確性和重復(fù)性,具有優(yōu)于片膜芯片的操作簡便、重復(fù)性好等特點(diǎn)。本實(shí)用新型一種重要發(fā)熱病原抗體快速篩查的蛋白懸浮芯片系統(tǒng),通過下面的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步說明,但本實(shí)用新型不以任何方式受該實(shí)施例的限定。一、材料1.蛋白懸浮芯片的相關(guān)緩沖液(I)PBS 緩沖液(pH7. 4) =NaCl 137mmol/L ;KCl 2. 7mmol/L ;Na2HPO4IOmmo 1/L ; KH2PO4 2mmol/L0 用 800mL 蒸餾水溶解 8gNaCl,0. 2gKCl, 1. 44g Nei2HPO4 禾口 0. 24g KH2PO40 用 HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7. 4,加水至1L。分裝后在15psi (1. 05kg/cm2)高壓蒸汽20分鐘, 或過濾除菌,保存于室溫。(2)微球清洗液:PBS(ρΗ7· 4) ,0. 05% TWEEN-20。(3)微球活化緩沖液 IOOmM NaH2PO4 :3g NaH2PO4, 5N NaOH 1. 5mL,定容于 25OmL, pH 6. 2。(4)微球包被緩沖液 0· 05M MES,pH 5. 0 2. 44g MES,5N NaOHO. 15mL,定容于 250mLo(5)微球保存液PBS-TBN :PBS,0. 1%BSA,0. 02% TWEEN,0. 05%疊氮化物,pH 7. 4。(6)微球封閉液 PBS-BN :PBS, 1% BSA,0. 05%疊氮化物,ρΗ7· 4。(7)檢測緩沖液:PBS, 1 % BSA, ρΗ7· 4。[0049](8)抗體稀釋液 PBS,pH7. 4。。(9)微球稀釋液:PBS, 1 % BSA, ρΗ7· 4。(10)樣品稀釋液 PVX :PBS,0. 5% PVA,0. 8% PVP ;(11) SA-PE 稀釋液:PBS (ρΗ7· 4), 1% BSA02.抗原與抗體本實(shí)用新型所使用的抗原為結(jié)核分枝桿菌的38KD蛋白和16KD蛋白、LAM抗原,流感NP蛋白、鼠疫菌Fl抗原、SARS-CoV N蛋白可購自事醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院微生物研究所,禽流感Η5蛋白可購自中國農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所。本實(shí)用新型所使用檢測抗體為兔抗土拉IgG,可購自中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院,兔抗登革熱2型抗體可購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院微生物研究所,檢測二抗為生物素化羊抗兔 IgG和生物素化羊抗人IgG,所述的羊抗兔IgG可購自北京鼎國生物技術(shù)公司。二、待測樣品的制備1、目標(biāo)分析物樣品的制備目標(biāo)分析物為兔抗結(jié)核抗體、鼠抗流感NP IgG、鼠抗禽流感H5W血清、兔抗鼠疫 IgG、兔抗SARS IgG為待測抗體,以生物素化的羊抗兔IgG/羊抗鼠IgG為捕獲抗體。將待分析的抗體用樣品稀釋液以4倍倍比系列稀釋為不同濃度樣品,以繪制樣品檢測劑量-反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線,其中幾個樣品濃度低于檢測的敏感度,高濃度樣品應(yīng)使編碼微球的結(jié)合位點(diǎn)處于飽和狀態(tài)。2、人血清樣本的處理將人血清樣本用樣品稀釋1 10稀釋,例如人血清樣本5 μ L加樣品稀釋液50 μ L 混勻后,作為待檢樣品進(jìn)行懸浮芯片方法的檢測。實(shí)施例1 一種重要發(fā)熱病原抗體快速篩查的蛋白懸浮芯片的制備1.分別取27,31,32,33,43,44號編碼微球,用漩渦振蕩器振蕩微球懸液,時間 30s,超聲30秒,使微球混合均勻;2.分別取上述各編碼微球1. 25X106個到1. 5mL離心管中,IOOOOg 14000g離心%iin,小心吸出上清并棄去;3.加入100 μ L的珠球洗滌緩沖液(PBS,pH7. 4,0. 05% TWEEN-20)懸浮微球,震蕩 30秒,超聲30秒,IOOOOg 14000g離心4min,小心吸出上清并棄去;4.加入 80 μ L 的珠球活化緩沖液(3g NaH2PO4, 5N Na0H40drops/250mL H2O),用漩渦振蕩器振蕩微球懸液;5.加入10 μ L新鮮配置的EDC(50mg/mL),緊接著加入10 μ L新鮮配置的 Sulfo-NHS (50mg/mL),高速震蕩30秒后用鋁箔包裹,在室溫震搖20min ;6.加入 15(^1^的?85&!17.4),震蕩 10 秒后,IOOOOg 14000g 離心 4min,小心吸出上清并棄去;7.重復(fù)上步驟一次;8.加入100 μ L的PBS (ρΗ7. 4)懸浮編碼微球,中速震蕩30秒后,超聲15秒;9.分別取抗原結(jié)核分枝桿菌的38KD蛋白和16KD蛋白、流感NP蛋白、LAM抗原、 禽流感Η5抗原、鼠疫菌Fl抗原、SARS-CoV N蛋白1_10 μ g加入到活化后的編碼微球中,用 PBS (pH7. 4)定溶至 500 μ L ;[0072]10.鋁箔包裹在室溫震搖2h,IOOOOg 14000g離心4min,小心吸出上清,棄去;11.用 500 μ L 的 PBS (ρΗ7· 4)洗一次,IOOOOg 14000g 離心 4min,小心吸出上清,
棄去;12.加入 250 μ L 的封閉緩沖液(PBS (pH7. 4),1% BSA, 0. 05% Azide)懸浮編碼微球,中速震蕩15秒,用鋁箔包裹,在室溫震搖30min,IOOOOg 14000g離心%iin,小心吸出
上清,棄去;13.加入 500 μ L 的儲備緩沖液(PBS (pH7. 4), 0. 1 % BSA, 0. 02 % TWEEN, 0. 05 %# 氮化物)洗滌編碼微球,IOOOOg 16000g離心6min,小心吸出上清,棄去;14.最后用150 μ L的儲備緩沖液懸浮編碼微球,即得結(jié)核分枝桿菌的38KD蛋白和 16KD蛋白與27號羧基微球形成偶聯(lián)體,流感NP蛋白與31號羧基微球形成偶聯(lián)體,LAM抗原與33號羧基微球形成偶聯(lián)體,禽流感Η5抗原與32號羧基微球形成偶聯(lián)體,鼠疫菌Fl抗原與43號羧基微球形成偶聯(lián)體,SARS-CoV N蛋白與44號羧基微球形成偶聯(lián)體;15.吸取適量微球,稀釋后,用血球計(jì)數(shù)板在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù),換算出每種微球的濃度;16.把偶聯(lián)號得微球放在4°C避光保存,一般每種抗原偶聯(lián)體的微球單獨(dú)保存,使用時,依據(jù)檢測項(xiàng)目選擇混合。實(shí)施例2 樣品的蛋白懸浮芯片檢測采用間接法的免疫學(xué)檢測模式,檢測過程中全部反應(yīng)均在96孔濾板上進(jìn)行。1.每孔加入150 μ L檢測緩沖液預(yù)濕孔,用真空泵抽濾;2.每孔加入50 μ L含相應(yīng)編碼微球的工作溶液,洗液洗滌并用真空泵抽濾兩次;3.加入50 μ L稀釋的檢測樣品,混勻后室溫避光震搖30min,洗液洗滌并抽濾三次;4.加入50 μ L適當(dāng)濃度的用抗體稀釋液稀釋后的生物素化二抗,混勻后室溫避光震搖30min,洗液100 μ L洗滌3次,并真空泵抽濾;5.加入50 μ L的SA-PE,混勻后室溫避光震搖lOmin。洗液100 μ L洗滌3次,并真
空泵抽濾;6.加入125 μ L的檢測緩沖液,經(jīng)振蕩使小球重懸均勻;7.用Bio-Plex懸浮芯片系統(tǒng)讀取FMI數(shù)值并分析數(shù)據(jù)。實(shí)施例3 蛋白懸浮芯片系統(tǒng)對不同濃度兔抗TB IgG的檢測1.各抗原與不同編碼微球偶聯(lián),具體操作方法如實(shí)施例1,得到不同抗原與編碼微球的偶聯(lián)體;2.取包被有抗原結(jié)核分枝桿菌的38KD蛋白和16KD蛋白的27號羧基微球偶聯(lián)體, 禽流感Η5抗原的32號羧基微球偶聯(lián)體,鼠疫菌Fl抗原的43號羧基微球偶聯(lián)體,SARS-CoV N蛋白的44號羧基微球偶聯(lián)體,各3500個,加入同一離心管中,加微球稀釋液至總體積 50 μ L作為多重微球體系的檢測工作溶液;3.將兔抗TB IgG用樣品稀釋液做4倍梯度稀釋作為檢測的樣品,兔抗TB IgG的濃度分別是0. 147ng/ml、0. 588ng/ml、2. 354ng/ml,9. 418ng/ml、37. 672ng/mlU50. 687ng/ ml、602.75ng/ml、2. 411 μ g/ml ;4.具體的檢測操作步驟如實(shí)施例2 ;[0093]5.各微球檢測兔抗TB的得到的MFI值見下表1,蛋白懸浮芯片體系檢測兔抗TB 的標(biāo)準(zhǔn)曲線FI = 2. 32671+(5582. 99-2. 32671)/[1+(Conc/331. 934)“1·42723J 0-78545檢測靈敏度為1. 5815ng/ml。表1蛋白懸浮芯片體系檢測兔抗TB的MFI值
權(quán)利要求1.一種重要發(fā)熱病原抗體快速篩查的蛋白懸浮芯片系統(tǒng),其特征在于,該芯片系統(tǒng)包括芯片基體、加液系統(tǒng)、懸浮芯片檢測儀和計(jì)算機(jī),其中,芯片基體內(nèi)裝有相關(guān)緩沖溶液和待測抗體,相關(guān)緩沖液中設(shè)置有027號、031號、032號、033號、043號、044號編碼微球,各種編碼微球上分別包被有相應(yīng)的捕獲抗原,加液系統(tǒng)依次向芯片基體中加入生物素標(biāo)記的二抗、熒光信號檢測物,懸浮芯片檢測儀包括微細(xì)管檢測通道和檢測激光,反應(yīng)后的溶液吸入到微細(xì)管檢測通道中,以使得每個編碼微球依次通過微細(xì)管檢測通道,檢測激光激發(fā)并識別編碼微球的顏色及其上待測物的熒光信號,計(jì)算機(jī)與懸浮芯片檢測儀相連,并記錄、分析懸浮芯片檢測儀的測量結(jié)果。
2.如權(quán)利要求1所述的蛋白懸浮芯片系統(tǒng),其特征在于,所述相關(guān)緩沖溶液包括用于所述待測抗體稀釋的樣品稀釋液、稀釋所述編碼微球所用的微球稀釋液、稀釋所述生物素標(biāo)記的二抗所用的抗體稀釋液、每個反應(yīng)之后洗滌編碼微球所用的微球清洗液、SA-PE稀釋液、檢測緩沖液。
3.如權(quán)利要求2所述的蛋白懸浮芯片系統(tǒng),其特征在于,結(jié)核分枝桿菌的38KD蛋白和 16KD蛋白抗原作為捕獲抗原來包被所述027號編碼微球,流感NP蛋白抗原作為捕獲抗原來包被所述031號編碼微球,LAM抗原作為捕獲抗原來包被所述033號編碼微球,禽流感H5抗原作為捕獲抗原來包被所述032號編碼微球,鼠疫菌Fl抗原作為捕獲抗原來包被所述043 號編碼微球,SARS-CoV N蛋白抗原作為捕獲抗原來包被所述044號編碼微球。
4.如權(quán)利要求2所述的蛋白懸浮芯片系統(tǒng),其特征在于,所述待測抗體為血清樣品。
5.如權(quán)利要求2所述的蛋白懸浮芯片系統(tǒng),其特征在于,所述生物素標(biāo)記的二抗優(yōu)選為Biotin-羊抗兔IgG和/或Biotin-羊抗人IgG。
6.如權(quán)利要求2所述的蛋白懸浮芯片系統(tǒng),其特征在于,所述熒光信號檢測物為鏈親和素-藻紅蛋白。
7.如權(quán)利要求2所述的蛋白懸浮芯片系統(tǒng),其特征在于,所述芯片基體為96孔濾板或者微量離心管。
8.如權(quán)利要求2所述的蛋白懸浮芯片系統(tǒng),其特征在于,所述檢測激光包括用激發(fā)所述編碼微球基質(zhì)中的顏色、識別編碼微球分類編碼以確定檢測項(xiàng)目的紅色激光,用于激發(fā)并識別待測分子的顏色信號、記錄信號強(qiáng)弱以檢測所述待測抗體的含量的綠色激光。
專利摘要本實(shí)用新型公開了一種用于重要發(fā)熱病原抗體快速篩查蛋白懸浮芯片系統(tǒng)包括芯片基體、加液系統(tǒng)、懸浮芯片檢測儀和計(jì)算機(jī),芯片基體內(nèi)裝有相關(guān)緩沖溶液和待測抗體,相關(guān)緩沖液中設(shè)置有若干個編碼微球,編碼微球上包被有相應(yīng)的捕獲抗原,加液系統(tǒng)依次向芯片基體中加入生物素標(biāo)記的二抗,熒光信號檢測物,懸浮芯片檢測儀包括微細(xì)管檢測通道和檢測激光,編碼微球依次通過微細(xì)管檢測通道,檢測激光激發(fā)并識別編碼微球的顏色及其上待測物的顏色,計(jì)算機(jī)與懸浮芯片檢測儀相連,并記錄、分析懸浮芯片檢測儀的測量結(jié)果。懸浮芯片技術(shù)利用微球在溶液中反應(yīng),利用激光檢測技術(shù),提高了樣品檢測的準(zhǔn)確性和重復(fù)性,具有操作簡便、重復(fù)性好等特點(diǎn)。
文檔編號G01N21/64GK201984071SQ20102062847
公開日2011年9月21日 申請日期2010年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月24日
發(fā)明者徐寶梁, 楊宇, 楊永莉, 王靜 申請人:中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院