專利名稱：脫敏治療效果的評價監(jiān)測方法及過敏原特異性IgG4抗體檢測試劑盒及制備方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種用于脫敏治療效果的評價監(jiān)測方法及過敏原特異性IgG4的酶聯(lián) 免疫吸附分析(ELISA)檢測試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
脫敏療法(desensitization)又稱為特異性免疫治療(specificimmunotherapy, SIT)或減敏療法(hyposensitization)。1997年WHO根據(jù)多年來對特異性免疫治療機 制的了解和臨床療效，提出了新的術(shù)語即特異性變態(tài)反應疫苗治療(specific allergy vaccination，SAV)。SAV是在臨床上確定過敏性疾病患者的變應原后，將該變應原制成變 應原提取液并配制成各種不同濃度的制劑，經(jīng)反復注射或通過其它給藥途徑與患者反復接 觸，劑量由小到大，濃度由低到高，從而提高患者對該種變應原的耐受性，當再次接觸此種 變應原時，不再產(chǎn)生過敏現(xiàn)象或過敏現(xiàn)象得以減輕。但進行脫敏治療后，往往對脫敏治療效果沒有進行科學的評價，無法判斷脫敏治 療的效果。成功的免疫治療通常伴隨血清特異性IgG4抗體的顯著上升。早在1968年，就 有研究顯示SIT誘導產(chǎn)生的IgG抗體的相關(guān)功能。過敏原阻斷性IgG抗體水平的升高，尤 其是IgG4亞型抗體水平的升高，在特異性免疫治療(specific immunotherapy, SIT)過程 中，發(fā)揮了重要的作用。對于免疫治療誘發(fā)的IgG抗體亞型的分析顯示IgGl和IgG4有顯 著升高，尤其是IgG4。IgG4抗體水品可增高10倍 100倍。IgG4抗體被認為捕捉過敏原，阻止過敏原到達效應細胞與IgE的結(jié)合，從而阻止 肥大細胞和嗜堿性粒細胞的活化，并釋放顆粒內(nèi)活性介質(zhì)，引發(fā)I型超敏反應(Fe ε R I途 徑)。并且能夠通過阻斷過敏原-IgE復合物與低親和性IgE受體的結(jié)合(Fe ε R II途徑)，抑 制過敏性疾病中炎癥通路的活化和加劇。這些研究清楚的說明了 IgG4抗體在免疫治療中 起到封閉抗體的作用?，F(xiàn)在評價脫敏療效的唯一公認指標是過敏原特異性IgG4抗體的含量檢測。在接 受特異性免疫治療(specific immunotherapy，SIT)后，過敏原特異性IgG4抗體含量升高， 且隨脫敏劑量的增加，抗體含量上升，成為免疫治療的療效的評個指標。通過檢測過敏原特 異性IgG4抗體水平對脫敏治療效果進行評價。酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)方法由于只需使用普通酶標儀，具有簡單安全、經(jīng)濟快 速的特點，適合我國多級醫(yī)院進行脫敏治療效果評價。ELISA法檢測血清樣本中過敏原特異性IgG4抗體(sIgG4)是利用固相載體固定的 過敏原蛋白結(jié)合血清樣本中的sIgG4，洗去未結(jié)合的其他蛋白后加入酶標記的抗人IgG4抗 體，與過敏原特異性IgG4抗體結(jié)合，形成過敏原-sIgG4-酶標抗體復合物，通過與酶底物顯 色液反應，檢測結(jié)合的酶量，間接地檢測出血清中的sIgG4種類及濃度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于脫敏治療效果的評價監(jiān)測方法，該評價方法在脫 敏治療過程中，為醫(yī)生提供客觀的指標，用以調(diào)整患者的脫敏治療劑量，為之前進行的脫敏 治療 效果提供依據(jù)；在脫敏治療療程結(jié)束之后，為脫敏治療效果提供了一個客觀的數(shù)據(jù)指 標，避免了僅憑借醫(yī)生的經(jīng)驗對脫敏治療效果進行評價的弊端。本發(fā)明的還有一個目的是針對上述監(jiān)測方法提出一種靈敏度高、特異性好、使用 快速方便的過敏原特異性IgG4的酶聯(lián)免疫吸附分析檢測試劑盒及其制備方法，通過檢測 血清中的sIgG4種類及濃度判斷脫敏治療療效以及患者的耐受情況，具有靈敏度高、特異 性好和使用快速方便的優(yōu)點。本發(fā)明為解決上述提出的問題所采用的解決方案是
用于脫敏治療效果的評價監(jiān)測方法，其特征在于在脫敏治療結(jié)束后，通過檢測血清內(nèi) 過敏原特異性IgG4抗體的含量，來判斷所進行的脫敏治療的療效，當血清內(nèi)過敏原特異性 IgG4抗體上升顯著，說明脫敏治療效果顯著，當血清內(nèi)過敏原特異性IgG4抗體達到峰值 后，說明脫敏治療已經(jīng)成功。在脫敏治療過程中，過敏原特異性IgG4抗體有一個明顯的增加，成功的免疫治療 通常伴隨血清特異性IgG4抗體的顯著上升。當血清內(nèi)過敏原特異性IgG4抗體顯著升高后， 說明脫敏治療療效明顯。過敏原特異性IgG4的酶聯(lián)免疫吸附分析檢測試劑盒，其特征在于包括有包被有 致敏蛋白的酶標板、酶標抗體、底物顯色液A、底物顯色液B、樣品稀釋液、濃縮洗滌液和反 應終止液。按上述方案，所述的包被有致敏蛋白的酶標板為包被有屋塵螨的預包被板、包被 有狗毛皮屑的預包被板、包被有貓毛皮屑的預包被板、包被有短豚草的預包被板、包被有艾 蒿的預包被板、包被有雞蛋白的預包被板或包被有牛奶的預包被板。按上述方案，所述的酶標抗體為辣根過氧化物酶標記的抗人IgG4單克隆抗體。按上述方案，所述的底物顯色液A為3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺。按上述方案，所述的底物顯色液B為過氧化脲。按上述方案，所述的樣品稀釋液為含有牛血清白蛋白(BSA)、細胞因子和 TWEEN-20的溶液。按上述方案，所述的濃縮洗滌液為含有磷酸緩沖鹽和TWEEN-20的溶液。按上述方案，所述的反應終止液為硫酸。本發(fā)明過敏原特異性IgG4的酶聯(lián)免疫吸附分析檢測試劑盒的制備方法，其特征 在于主要包括有以下步驟
1)準備底物顯色液A、底物顯色液B、樣品稀釋液、濃縮洗滌液和反應終止液；
2)包被有致敏蛋白的酶標板的制備a)致敏蛋白的制備將過敏原蛋白粉末以1: 15-25 (w/v)的量加入0. 03-3mol/l的碳酸氫鈉-氯化鈉緩沖液(pH8. 0-8. 4)，其中磁力攪 拌器的轉(zhuǎn)速250轉(zhuǎn)/分鐘，于4°C下過夜，取上清液-20°C下保存；b)包被酶標板①用包 被液將各類致敏蛋白稀釋成0. 05ug/ml-10ug/ml的包被濃度，混勻得到稀釋后的過敏原溶 液，將酶標板上的每孔加入IOOul稀釋后的過敏原溶液；②將酶標板封膜后在4°C下反應過 夜；③將酶標板內(nèi)的稀釋后的過敏原溶液倒出，洗板，酶標板的每孔加入200ul封閉液進行封閉，在4°C下反應過夜；④將酶標板內(nèi)的封閉液倒出，拍干，真空干燥后密封入裝有干燥 劑的鋁箔袋中，在4°C下貯存即可；
3)酶標抗體的制備所述的酶標抗體為辣根過氧化物酶標記的抗人IgG4單克隆抗體， 其制備方法是
a)將單克隆細胞株注射到老鼠體內(nèi)，產(chǎn)生腹水；
b)收集腹水，提取并純化得到單克隆抗體溶液；
c)將單克隆抗體溶液用活化辣根過氧化物酶混合進行標記；
d)透析過夜，得到辣根過氧化物酶標記的抗人IgG4單克隆抗體。按上述方案，所述的包被液為pH9. 0-9. 8的碳酸氫鈉緩沖溶液，所述的封閉液為 含有1-10%(w/v)的BSA的Tris-Hcl緩沖溶液。本發(fā)明的使用方法，包括有以下步驟
⑴平衡溫度使用前所有試劑及酶標板都應恢復到室溫，試劑在使用前必須充分搖勻； ⑵洗滌液的準備將濃縮洗滌液按照稀釋倍數(shù)稀釋；
⑶初次孵育將實驗所需的酶標板從包裝內(nèi)取出，編號或標記患者姓名，除空白每孔加 入樣品稀釋液2滴(IOOul)和血清lul，注意每加一份樣品就更換一個管嘴，混勻后于37°C 孵育45min ；
⑷洗板倒盡酶標板中的液體，每孔加入200ul 300ul洗滌液，靜置lmin，倒盡液體， 如此反復洗5次，輕輕晃動可以增強清洗效果；
(5)二次孵育在每孔中加入2滴(IOOul)酶標抗體，混勻后于37°C孵育45min；
(6)洗板同步驟⑷；
(7)顯色每孔各加入一滴底物顯色液A，一滴底物顯色液B，混勻后于37°C孵育15min；
(8)終止每孔加入一滴反應終止液，測量每孔OD值(吸光度)。本發(fā)明的有益效果在于
1、在患者通過脫敏治療之后，提供了一種檢測特異性IgG4抗體的方法，為脫敏治療療 效提供了評價指標；在脫敏治療中，過敏原特異性IgG4抗體有一個明顯的增加，成功的免 疫治療通常伴隨血清特異性IgG4抗體的顯著上升。當血清內(nèi)過敏原特異性IgG4抗體達到 峰值(平臺期)后，說明脫敏治療成功。通過檢測人體內(nèi)過敏原特異性IgG4抗體的含量，來 判斷所進行的脫敏治療的療效；
2、具有靈敏度高、特異性好、使用快速方便的優(yōu)點 靈敏度檢測靈敏度為lng/ml
特異性陰性符合率為95. 1% 陽性符合率為98. 3% 總符合率為96. 7% 總檢測時間不到2小時，操作步驟簡便，能適應一般實驗室檢測。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的說明，但是此說明不能構(gòu)成對本發(fā)明的限制。實施例1
1)準備底物顯色液A、底物顯色液B、樣品稀釋液、濃縮洗滌液和反應終止液；所述的底物顯色液A為3，3 ’，5，5 ’ -四甲基聯(lián)苯胺。所述的底物顯色液B為過氧化脲。所述的樣品稀釋液為含有牛血清白蛋白(BSA)、細胞因子和TWEEN-20的溶液。 所述的濃縮洗滌液為含有磷酸緩沖鹽和TWEEN-20的溶液。所述的反應終止液為硫酸。2)包被有致敏蛋白的酶標板的制備a)致敏蛋白的制備將塵螨蛋白粉末以1 : 15 (w/v)的量加入0. 03mol/l的碳酸氫鈉-氯化鈉緩沖液(pH8. 0-8. 4)，其中磁力攪拌器 的轉(zhuǎn)速250轉(zhuǎn)/分鐘，于4°C下過夜，取上清液_20°C下保存；b)包被酶標板①用包被液將 各類致敏蛋白稀釋成0. 05ug/ml的包被濃度，混勻得到稀釋后的過敏原溶液，將酶標板上 的每孔加入IOOul稀釋后的過敏原溶液；②將酶標板封膜后在4°C下反應過夜；③將酶標板 內(nèi)的稀釋后的過敏原溶液倒出，洗板，酶標板的每孔加入200ul封閉液進行封閉，在4°C下 反應過夜；④將酶標板內(nèi)的封閉液倒出，拍干，真空干燥后密封入裝有干燥劑的鋁箔袋中， 在4°C下貯存即可；所述的包被液為pH9. 0-9. 8的碳酸氫鈉緩沖溶液，所述的封閉液為含有 1-10% (w/v)的 BSA 的 Tris-Hcl 緩沖溶液；
3)酶標抗體的制備所述的酶標抗體為辣根過氧化物酶標記的抗人IgG4單克隆抗體， 其制備方法是
a)將單克隆細胞株注射到老鼠體內(nèi)，產(chǎn)生腹水；
b)收集腹水，提取并純化得到單克隆抗體溶液；
c)將單克隆抗體溶液用活化辣根過氧化物酶混合進行標記；
d)透析過夜，得到辣根過氧化物酶標記的抗人IgG4單克隆抗體。
實施例2
1)準備底物顯色液A、底物顯色液B、樣品稀釋液、濃縮洗滌液和反應終止液； 所述的底物顯色液A為3，3 ’，5，5 ’ -四甲基聯(lián)苯胺。所述的底物顯色液B為過氧化脲。所述的樣品稀釋液為含有牛血清白蛋白(BSA)、細胞因子和TWEEN-20的溶液。所述的濃縮洗滌液為含有磷酸緩沖鹽和TWEEN-20的溶液。所述的反應終止液為硫酸。2)包被有致敏蛋白的酶標板的制備a)致敏蛋白的制備將狗毛皮屑蛋白粉末以 1 20 (w/v)的量加入1. 5mol/l的碳酸氫鈉-氯化鈉緩沖液(pH8. 0-8. 4)，其中磁力攪拌器 的轉(zhuǎn)速250轉(zhuǎn)/分鐘，于4°C下過夜，取上清液-20°C下保存；b)包被酶標板①用包被液 將各類致敏蛋白稀釋成5ug/ml的包被濃度，混勻得到稀釋后的過敏原溶液，將酶標板上的 每孔加入IOOul稀釋后的過敏原溶液；②將酶標板封膜后在4°C下反應過夜；③將酶標板 內(nèi)的稀釋后的過敏原溶液倒出，洗板，酶標板的每孔加入200ul封閉液進行封閉，在4°C下 反應過夜；④將酶標板內(nèi)的封閉液倒出，拍干，真空干燥后密封入裝有干燥劑的鋁箔袋中， 在4°C下貯存即可；所述的包被液為pH9. 0-9. 8的碳酸氫鈉緩沖溶液，所述的封閉液為含有 1-10% (w/v)的 BSA 的 Tris-Hcl 緩沖溶液；
3)酶標抗體的制備所述的酶標抗體為辣根過氧化物酶標記的抗人IgG4單克隆抗體， 其制備方法是a)將單克隆細胞株注射到老鼠體內(nèi)，產(chǎn)生腹水；
b)收集腹水，提取并純化得到單克隆抗體溶液；
c)將單克隆抗體溶液用活化辣根過氧化物酶混合進行標記；
d)透析過夜，得到辣根過氧化物酶標記的抗人IgG4單克隆抗體。
實施例3
1)準備底物顯色液A、底物顯色液B、樣品稀釋液、濃縮洗滌液和反應終止液； 所述的底物顯色液A為3，3 ’，5，5 ’ -四甲基聯(lián)苯胺。所述的底物顯色液B為過氧化脲。所述的樣品稀釋液為含有牛血清白蛋白(BSA)、細胞因子和TWEEN-20的溶液。所述的濃縮洗滌液為含有磷酸緩沖鹽和TWEEN-20的溶液。所述的反應終止液為硫酸。2)包被有致敏蛋白的酶標板的制備a)致敏蛋白的制備將艾蒿蛋白粉末以1 : 25(w/v)的量加入3mol/l的碳酸氫鈉-氯化鈉緩沖液(pH8. 0-8. 4)，其中磁力攪拌器的轉(zhuǎn)速 250轉(zhuǎn)/分鐘，于4°C下過夜，取上清液-20°C下保存；b)包被酶標板①用包被液將各類致 敏蛋白稀釋成lOug/ml的包被濃度，混勻得到稀釋后的過敏原溶液，將酶標板上的每孔加 入IOOul稀釋后的過敏原溶液；②將酶標板封膜后在4°C下反應過夜；③將酶標板內(nèi)的稀釋 后的過敏原溶液倒出，洗板，酶標板的每孔加入200ul封閉液進行封閉，在4°C下反應過夜； ④將酶標板內(nèi)的封閉液倒出，拍干，真空干燥后密封入裝有干燥劑的鋁箔袋中，在4°C下貯 存即可；所述的包被液為PH9. 0-9. 8的碳酸氫鈉緩沖溶液，所述的封閉液為含有l(wèi)_10%(w/ ν)的BSA的Tris-Hcl緩沖溶液；
3)酶標抗體的制備所述的酶標抗體為辣根過氧化物酶標記的抗人IgG4單克隆抗體， 其制備方法是
a)將單克隆細胞株注射到老鼠體內(nèi)，產(chǎn)生腹水；
b)收集腹水，提取并純化得到單克隆抗體溶液；
c)將單克隆抗體溶液用活化辣根過氧化物酶混合進行標記；
d)透析過夜，得到辣根過氧化物酶標記的抗人IgG4單克隆抗體。
實施例1過敏原特異性IgG4抗體ELISA檢測試劑盒的使用方法
⑴平衡溫度使用前所有試劑及酶標板都應恢復到室溫，試劑在使用前必須充分混
勻；
⑵洗滌液的準備將洗滌液按照稀釋倍數(shù)稀釋；
⑶初次孵育將實驗所需的酶標板從包裝內(nèi)取出，編號或標記患者姓名，除空白每孔加 入樣品稀釋液2滴(IOOul)和血清lul，注意每加一份樣品就更換一個管嘴，混勻后于37°C 孵育45分鐘；
⑷洗板倒盡酶標板中的液體，每孔加入200ul 300ul洗滌液，靜置lmin，倒盡液體， 如此反復洗5次，輕輕晃動可以增強清洗效果；
(5)二次孵育在每孔中加入1滴(50ul)HRP標記的抗人IgG4抗體，混勻后于37°C孵育 45分鐘；
權(quán)利要求
1.用于脫敏治療效果的評價監(jiān)測方法，其特征在于通過檢測血清內(nèi)過敏原特異性 IgG4抗體的含量，來判斷所進行的脫敏治療的療效，當血清內(nèi)過敏原特異性IgG4抗體上升 顯著，說明脫敏治療效果顯著，當血清內(nèi)過敏原特異性IgG4抗體達到峰值后，說明脫敏治 療已經(jīng)成功。
2.過敏原特異性IgG4的酶聯(lián)免疫吸附分析檢測試劑盒，其特征在于包括有包被有致 敏蛋白的酶標板、酶標抗體、底物顯色液A、底物顯色液B、樣品稀釋液、濃縮洗滌液和反應 終止液。
3.按權(quán)利要求2所述的過敏原特異性IgG4的酶聯(lián)免疫吸附分析檢測試劑盒，其特征在 于所述的包被有致敏蛋白的酶標板為包被有屋塵螨的預包被板、包被有狗毛皮屑的預包被 板、包被有貓毛皮屑的預包被板、包被有短豚草的預包被板、包被有艾蒿的預包被板、包被 有雞蛋白的預包被板或包被有牛奶的預包被板。
4.按權(quán)利要求2或3所述的過敏原特異性IgG4的酶聯(lián)免疫吸附分析檢測試劑盒，其特 征在于所述的酶標抗體為辣根過氧化物酶標記的抗人IgG4單克隆抗體。
5.按權(quán)利要求2或3所述的過敏原特異性IgG4的酶聯(lián)免疫吸附分析檢測試劑盒，其特 征在于所述的底物顯色液A為3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺。
6.按權(quán)利要求2或3所述的過敏原特異性IgG4的酶聯(lián)免疫吸附分析檢測試劑盒，其特 征在于所述的底物顯色液B為過氧化脲。
7.按權(quán)利要求2或3所述的過敏原特異性IgG4的酶聯(lián)免疫吸附分析檢測試劑盒，其特 征在于所述的樣品稀釋液為含有牛血清白蛋白、細胞因子和TWEEN-20的溶液。
8.按權(quán)利要求2或3所述的過敏原特異性IgG4的酶聯(lián)免疫吸附分析檢測試劑盒，其特 征在于所述的濃縮洗滌液為含有磷酸緩沖鹽和TWEEN-20的溶液。
9.過敏原特異性IgG4的酶聯(lián)免疫吸附分析檢測試劑盒的制備方法，其特征在于主要 包括有以下步驟1)準備底物顯色液A、底物顯色液B、樣品稀釋液、濃縮洗滌液和反應終止液；2)包被有致敏蛋白的酶標板的制備a)致敏蛋白的制備將過敏原蛋白粉末以1 15-25 (w/v)的量加入0. 03-3mol/l的碳酸氫鈉-氯化鈉緩沖液，其中磁力攪拌器的轉(zhuǎn)速 250轉(zhuǎn)/分鐘，于4°C下過夜，取上清液-20°C下保存；b)包被酶標板①用包被液將各類致 敏蛋白稀釋成0. 05ug/ml-10ug/ml的包被濃度，混勻得到稀釋后的過敏原溶液，將酶標板 上的每孔加入IOOul稀釋后的過敏原溶液；②將酶標板封膜后在4°C下反應過夜；③將酶標 板內(nèi)的稀釋后的過敏原溶液倒出，洗板，酶標板的每孔加入200ul封閉液進行封閉，在4°C 下反應過夜；④將酶標板內(nèi)的封閉液倒出，拍干，真空干燥后密封入裝有干燥劑的鋁箔袋 中，在4°C下貯存即可；3)酶標抗體的制備所述的酶標抗體為辣根過氧化物酶標記的抗人IgG4單克隆抗體， 其制備方法是a)將單克隆細胞株注射到老鼠體內(nèi)，產(chǎn)生腹水；b)收集腹水，提取并純化得到單克隆抗體溶液；c)將單克隆抗體溶液用活化辣根過氧化物酶混合進行標記；d)透析過夜，得到辣根過氧化物酶標記的抗人IgG4單克隆抗體。
10.按權(quán)利要求9所述的過敏原特異性IgG4的酶聯(lián)免疫吸附分析檢測試劑盒的制備方法，其特征在于所述的包被液為pH9. 0-9. 8的碳酸氫鈉緩沖溶液，所述的封閉液為含有 1-10%(w/v)的 BSA 的 Tris-Hcl 緩沖溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于脫敏治療效果的評價監(jiān)測方法及過敏原特異性IgG4的酶聯(lián)免疫吸附分析檢測試劑盒及其制備方法，在脫敏治療結(jié)束后，通過檢測血清內(nèi)過敏原特異性IgG4抗體的含量，來判斷所進行的脫敏治療的療效，當血清內(nèi)過敏原特異性IgG4抗體上升顯著，說明脫敏治療效果顯著，當血清內(nèi)過敏原特異性IgG4抗體達到峰值后，說明脫敏治療已經(jīng)成功。本發(fā)明的有益效果在于1、在患者通過脫敏治療之后，提供了一種檢測特異性IgG4抗體的方法，為脫敏治療療效提供了評價指標；2、具有靈敏度高、特異性好、使用快速方便的優(yōu)點。
文檔編號G01N33/543GK102128937SQ201010615559
公開日2011年7月20日 申請日期2010年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月31日
發(fā)明者尹玉敏, 梁智慧, 祝戎飛, 陳建軍, 陳琰, 龔睿, 龔鎮(zhèn)奎 申請人:湖北楚冠生物藥業(yè)有限公司