專利名稱：一種利用lc-ms/ms高效鑒別植物次生代謝產(chǎn)物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，更具體涉及一種利用LC-MS/MS高效鑒別植物次生代 謝產(chǎn)物的方法，可用于研究任何一種植物的任何組織器官中所含有的次生代謝產(chǎn)物。
背景技術(shù)：
代謝組學(xué)是對生物或細(xì)胞內(nèi)所有低相對分子質(zhì)量代謝產(chǎn)物同時進行定性和定量 分析的一門新學(xué)科，它是以組群指標(biāo)分析為基礎(chǔ)，以高通量檢測和數(shù)據(jù)處理為手段，以信息 建模與系統(tǒng)整合為目標(biāo)的系統(tǒng)生物學(xué)的一個分支，是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)后 系統(tǒng)生物學(xué)的另一重要研究領(lǐng)域，已成為后基因組學(xué)時代的一個非常重要的分支學(xué)科。在 生物學(xué)研究領(lǐng)域，作為基因型與表型之間的橋梁，代謝組學(xué)將基因產(chǎn)物和基因關(guān)聯(lián)起來，實 現(xiàn)基因功能的鑒定，成為功能基因組學(xué)研究的有力工具(Oliver Fiehn0Metabolomics-the link between genotypes and phenotypes。 Plant Molecular Biology，2002)。據(jù)佛羅里達大學(xué)的有關(guān)專家估計，所有植物代謝產(chǎn)物加起來有90000-200000種， 如擬南芥代謝組中化合物的數(shù)量有近5000個。然而，代謝組學(xué)作為一種重要的功能基因 組的工具，對植物組織和細(xì)胞中復(fù)雜的次生代謝產(chǎn)物進行高通量的鑒別與分析仍然是其發(fā) 展的瓶頸所在。(Raoul J. Bino et al. , Potential of metabolomics as afunctional genomics tool。TRENDS in Plant Science，2004)，所以，對植物次生代謝產(chǎn)物建立一 種快速可靠、高通量、高靈敏度的檢測與分析方法是必須的(Oliver Fiehn0 Metabolite profiling for plant functional genomics。Nature，2000)，對細(xì)胞、組織或整個有機體 內(nèi)所有的次生代謝產(chǎn)物進行綜合定性及定量分析是代謝組學(xué)發(fā)展的一個長遠(yuǎn)而又偉大的 目標(biāo)(Lloyd W. Sumner et al.，Plant metabolomics :large_scale phytochemistry in the functional genomics era。Phytochemistry，2003)?，F(xiàn)有的技術(shù)中，OliverFiehn 等 利用GC/MS在擬南芥的葉子提取物中同時檢測到3 種不同的次生代謝產(chǎn)物，并測定了近 一半代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)(Oliver Fiehn。Metabolite profiling for plant functional genomics。Nature，2000)，這是代謝組發(fā)展的一個飛躍，它進一步證明了代謝組是功能基 因組研究的重要工具。Sofia Moco等利用LC/MS在番茄的果肉和果皮中鑒別出一系列代 謝產(chǎn)物，同時，他們還結(jié)合在番茄中已報道的次生代謝產(chǎn)物，建立了番茄代謝數(shù)據(jù)庫(Sofia Moco et al. ,A Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolome Database for Tomato ο Plant Physiology，2006)。Kazuki Saito 等利用 LC/MS/MS 在擬南芥的不 同組織中檢測到多個峰圖，其中大約一半有譜圖(Kazuki Saito et a 1.，MS/MS spectral tag-based armotation of non-targeted profile of plant secondary metabolites。 The Plant Journal，2009)，這些物質(zhì)大多都是黃酮和糖類物質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種利用LC-MS/MS高效鑒別植物次生代謝產(chǎn)物的方 法，其最大特點是對任何植物的任何組織或器官，都可以同時檢測到近千種次生代謝產(chǎn)物。本方法操作簡便，應(yīng)用性強，對植物次生代謝產(chǎn)物的研究有著重大的意義。同時，可以利用 該方法建立不同植物的次生代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫，從而促進植物代謝組學(xué)的發(fā)展。為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施一種利用LC-MS/MS高效鑒別植物次生代謝產(chǎn)物的方法，其步驟是1、樣品制備(1)取適量(大于IOg)新鮮樣品，液氮保存。(2)配制提取液。水溶性代謝產(chǎn)物提取液為Vfe Vilg= 100 0.04，V代表體 積；脂溶性代謝產(chǎn)物的提取液為V氣仿Vw: Viig= 70 30 0.04，V代表體積。其中 甲醇和乙酸為色譜純試劑(TEDIA公司，America)，氯仿為分析純試劑(國藥集團化學(xué)試劑 有限公司)。(3)稱取適量(大于IOg)樣品，在研缽中加液氮磨成粉狀后加入預(yù)凍好的離心管 中，立即按Ig 2ml加入提取液，強烈渦旋IOs后將樣品放入4°C冰箱，每隔IOmin再渦旋 一次，重復(fù)3次后放入4°C冰箱過夜。(4)次日用4°C離心機IOOOOrpm離心IOmin后吸取上清，將上清氮吹吹干后再按 IOg Iml比例加入純甲醇進行充分溶解。( 用0.22 μ m尼龍膜將溶解液過濾后裝入進樣樣品管，放-70°C冰箱保存，待測。2、儀器條件(1)、色譜條件島津UFLC shimADZU色譜儀；進樣量5 μ 1 ；色譜柱shimpack VP-ODS, 150mm*5 μ m ；流動相A體積比為0. 04%乙酸水溶液，B為體積比為0. 04%乙酸乙 腈溶液，柱溫40°C，流速0. 25mL/min ；洗脫梯度為Omin = 5% B ；20min = 95% B ;20 25min = 95% B ;25· 1 !35min = 5% B。其中乙腈為色譜純(Merck 公司，Germany)。(2)、質(zhì)譜條件AB API 4000QTRAP串聯(lián)四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀。(3)、儀器參數(shù)離子源=Turbo V，電離模式ESI (+)、MRM 參數(shù):DP = 40 ；EP = 10 ；Ql = Q3 時，CE = 5 ；Ql Φ Q3 時，CE = 30 ；CXP =10 ；CAD = High ；每對離子對掃描時間為5ms ；(5)、IDA參數(shù)離子流預(yù)值1000cpS，排除IOs內(nèi)的目標(biāo)離子；(6) ,EPI 參數(shù):DP = 40 ；CEs = 15 ；CCE = 40 ；CAD = Hihg.3、100-1000每間隔0. 1-0. 3組成母離子0)1)等于子離子^!3)的離子對，
即 Ql = Q3(如 100/100,100. 1/100. 1......或 100/100，100. 2/100. 2.......或
100/100,100. 3/100. 3......)，按每個文件80對離子對組成不同的文件，以采集方式為
mrm-ida-epi進行跑樣。4、對每個文件找出一級質(zhì)譜母離子Ql在相應(yīng)時間被裂解所對應(yīng)的二級質(zhì)譜子離 子Q3 (及其他二級質(zhì)譜子離子Q4、Q5......)，峰保留時間(RT)。5、以多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)對第四步所篩選出的離子對進行分四段跑樣，每個文 件800對離子對。四段所跑樣的離子對分別為140/220/220/220對，然后利用Analyst數(shù) 據(jù)處理軟件的定量積分方法選出峰強度在lOOOcps以上的離子對。6、對第五步篩選出來的離子對再次以采集方式為MRM-IDA-EPI進行跑樣，每個文
件80對離子對，進一步對一級質(zhì)譜母離子Oil)，二級質(zhì)譜子離子0)3、Q4......)，峰保留
時間進行核對校準(zhǔn)，去卷積，從而建立二級質(zhì)譜子離子(MS2T)及保留時間為標(biāo)簽代謝數(shù)據(jù)庫。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和效果(1)高通量。通過質(zhì)荷比步進掃描，結(jié)合MRM技術(shù)，可以同時檢測出千種以上代謝 產(chǎn)物。如我們在在水稻發(fā)芽7 種子中共檢測到1400多種代謝產(chǎn)物，在帶殼穗子中共檢測 到1200多種代謝產(chǎn)物，在劍葉中共檢測到1600多種代謝產(chǎn)物，其中水溶性代謝產(chǎn)物有750 多種，如圖1A-D，展示出所檢測的部分代謝產(chǎn)物。(2)高靈敏度。利用MRM技術(shù)通過兩級離子選擇，排除了大量干擾離子，使質(zhì)譜的 化學(xué)背景大大降低，目標(biāo)檢測物的信噪比顯著提高，能夠完成其他質(zhì)譜掃描方式所達不到 的高靈敏度檢測。如我們檢測到大量含量在PPm級的物質(zhì)，如圖2，展示出所檢測的部分代 謝產(chǎn)物。(3)準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好。利用MRM技術(shù)特異性，對符合設(shè)定的代謝產(chǎn)物進行檢測， 并且進一步進行增強產(chǎn)物掃描分析(EPI)，得到高分辨的串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MQ碎片數(shù)據(jù)，使分 析過程中的定性結(jié)果假陽性率大大降低，重現(xiàn)性提高。(4)對所研究的植物或組織建立二級質(zhì)譜子離子(MS2T)及保留時間為標(biāo)簽代謝 數(shù)據(jù)庫，方便檢索，推動代謝組學(xué)的發(fā)展。(5)操作簡單，具有廣泛的適用性，可用于研究任何植物甚至是其他生物的任何組 織中的代謝產(chǎn)物，我們在番茄果實中檢測也到2000多種代謝產(chǎn)物，其中水溶性代謝產(chǎn)物有 920多種，如圖3A-E，展示出所檢測的部分代謝產(chǎn)物。


圖IA為一種利用本發(fā)明高通量鑒別水稻抽穗期劍葉水溶性次生代謝產(chǎn)物的結(jié)果 圖。其峰強度在8. OX 103-9. 8X IO4Cps之間，展示出代謝產(chǎn)物1 種。圖IB為一種利用本發(fā)明高通量鑒別水稻抽穗期劍葉水溶性次生代謝產(chǎn)物的結(jié)果 圖。其峰強度在1. 9X 104-2. 3XlO5Cps之間，展示出代謝產(chǎn)物135種。圖IC為一種利用本發(fā)明高通量鑒別水稻抽穗期劍葉水溶性次生代謝產(chǎn)物的結(jié)果 圖。其峰強度在7. 6X 104-8. 5 XlO5Cps之間，展示出代謝產(chǎn)物巧4種。圖ID為一種利用本發(fā)明高通量鑒別水稻抽穗期劍葉水溶性次生代謝產(chǎn)物的結(jié)果 圖。其峰強度在1. 7X IO5-L 8 X IO6Cps之間，展示出代謝產(chǎn)物144種。圖2為利用本發(fā)明高靈敏度鑒別水稻發(fā)芽7 種子水溶性次生代謝產(chǎn)物的結(jié)果 圖。以Y -亞麻酸(紅色箭頭所指)為標(biāo)樣，濃度為4. 5ppm。圖3A為證明利用本發(fā)明高效鑒別植物次生代謝產(chǎn)物廣泛適用性結(jié)果圖。其峰強度在6. OX 103-9. 8X IO4Cps之間，展示出代謝產(chǎn)物123種。圖;3B為證明利用本發(fā)明高效鑒別植物次生代謝產(chǎn)物廣泛適用性結(jié)果圖。其強度在1. 9X 104-2. 5XlO5Cps之間，展示出代謝產(chǎn)物130種。
圖3C為證明利用本發(fā)明高效鑒別植物次生代謝產(chǎn)物廣泛適用性結(jié)果圖。其強度在3. 2X104-3. 7XlO5Cps之間，展示出代謝產(chǎn)物136種。圖3D為證明利用本發(fā)明高效鑒別植物次生代謝產(chǎn)物廣泛適用性結(jié)果圖。其強度在8X 104-8. 5 X IO5Cps之間，展示出代謝產(chǎn)物1 種。圖3E為證明利用本發(fā)明高效鑒別植物次生代謝產(chǎn)物廣泛適用性結(jié)果圖。其強度在1. 4X IO5-L 4X IO6Cps之間，展示出代謝產(chǎn)物191種。
具體實施例方式實施例1 一種利用LC-MS/MS高效鑒別植物次生代謝產(chǎn)物的方法，其步驟是1、樣品制備(1)取樣。取明恢63及珍汕97抽穗期的劍葉各10片，裝入預(yù)先扎過孔50ml的離
心管中，液氮保存。( 配制提取液。配制水溶性代謝產(chǎn)物提取液，Vmi Vilg= 100 0.04，V代表 體積。其中甲醇和乙酸為色譜純試劑(TEDIA公司，America)。(3)稱取14. 30g樣品，在研缽中加液氮磨成粉狀后加入預(yù)凍好的50ml離心管中， 立即按Ig 2ml加入提取液，強烈渦旋IOs后將樣品放入4°C冰箱，每隔IOmin再渦旋一 次，重復(fù)3次后放入4°C冰箱過夜。(4)次日用4°C離心機IOOOOrpm離心IOmin后吸取上清，將上清氮吹吹干后再按 IOg Iml比例加入純甲醇進行充分溶解。(5)用0. 22 μ m尼龍膜將溶解液過濾后得到約1. 4ml提取液，將提取液裝入進樣樣 品管中，放-70 V冰箱保存，待測。2、儀器條件(1)、色譜條件島津UFLC shimADZU色譜儀；進樣量5 μ 1 ；色譜柱shimpack VP-ODSaSOmm^ym;流動相A為體積比為0. 04%乙酸水溶液，B為體積比為0. 04%乙酸 乙腈溶液，柱溫40°C，流速0. 25mL/min ；洗脫梯度為Omin = 5% B ；20min = 95% B ;20 25min = 95% B ;25· 1 !35min = 5% B。其中乙腈為色譜純(Merck 公司，Germany)。(2)、質(zhì)譜條件AB API 4000QTRAP串聯(lián)四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀。(3)、儀器參數(shù)離子源=Turbo V，電離模式ESI (+)(4)、MRM 參數(shù)DP = 40 ；EP = 10 ;Q1 = Q3 時，CE = 5 ；Ql 乒 Q3 時，CE = 30 ；CXP =10 ；CAD = High ；每對離子對掃描時間為5ms ；(5)、IDA參數(shù)離子流預(yù)值1000cpS，排除IOs內(nèi)的目標(biāo)離子；(6)、EPI 參數(shù):DP = 40 ；CEs = 15 ；CCE = 40 ；CAD = High.3、100-1000每間隔0. 3組成母離子0)1)等于子離子^!3)的離子對，即Ql =
Q3 (如 100. 1/100. 1，100. 4/100. 4，100. 7/100. 7......)，按每個文件 80 對離子對組成不同
的文件，以采集方式為MRM-IDA-EPI進行跑樣。(請見表一)表一 100-1000每間隔0. 3組成母離子^!1)等于子離子^!3)的離子對對水稻劍 葉進行跑樣
權(quán)利要求
1. 一種利用LC-MS/MS高效鑒別植物次生代謝產(chǎn)物的方法，其步驟是A、樣品制備(1)取新鮮樣品，液氮保存；(2)配制提取液水溶性代謝產(chǎn)物提取液為Vfs =V^ig =100:0. 04，V代表體積；脂溶性 代謝產(chǎn)物的提取液為Vlw =Vw =Viig =70:30:0. 04，V代表體積，其中甲醇和乙酸為色譜純 試劑，氯仿為分析純試劑；(3)稱取樣品，在研缽中加液氮磨成粉狀后加入預(yù)凍好的離心管中，立即按lg:2ml加 入提取液，強烈渦旋IOs后將樣品放入4°C冰箱，每隔IOmin再渦旋一次，重復(fù)3次后放入 4°C冰箱過夜；(4)次日用4°C離心機IOOOOrpm離心IOmin后吸取上清，將上清氮吹吹干后再按IOg Iml比例加入純甲醇進行充分溶解；(5)用0.22 μ m尼龍膜將溶解液過濾后裝入進樣樣品管，放-70°C冰箱保存，待測；B、儀器條件(1)、色譜條件島津UFLCshimADZU色譜儀；進樣量5μ 1 ；色譜柱shimpack VP-ODS, 150 mm *5 μ m ；流動相A為體積比為0. 04%乙酸水溶液，B為體積比0. 04%乙酸乙 腈溶液，柱溫 40°C，流速 0. 25mL/min ；洗脫梯度為 Omin = 5%B ；20min = 95%B ；20 25min =95%B ；25. 1 35min=5%B，其中乙腈為色譜純；(2)、質(zhì)譜條件ABAPI 4000QTRAP串聯(lián)四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀；(3)、儀器參數(shù)離子源TurboV，電離模式ESI( + )；(4)、MRM參數(shù):DP=40; EP=IO ;Q1=Q3 時，CE=5; Ql 乒 Q3 時，CE=30 ； CXP=IO ； CAD=High；每對離子對掃描時間為5ms ；(5)、IDA參數(shù)離子流預(yù)值lOOOcps，排除IOs內(nèi)的目標(biāo)離子；(6)、EPI參數(shù):DP=40;CEs=15;CCE=40; CAD=Hihg ；C、100-1000每間隔0.1-0. 3組成母離子(Ql)等于子離子(Q3)的離子對，即Q1=Q3,按 每個文件80對離子對組成不同的文件，以采集方式為MRM-IDA-EPI進行跑樣；D、對每個文件找出一級質(zhì)譜母離子Ql在相應(yīng)時間被裂解所對應(yīng)的二級質(zhì)譜子離子Q3 及二級質(zhì)譜子離子Q4、Q5，峰保留時間(RT)；E、以多反應(yīng)監(jiān)測模式對(D)步驟所篩選出的離子對進行分四段跑樣，每個文件800對 離子對，四段所跑樣的離子對分別為140/220/220/220對，然后利用Analyst數(shù)據(jù)處理軟件 的定量積分方法選出峰強度在lOOOcps以上的離子對；F、對(E)步驟篩選出來的離子對再次以采集方式為MRM-IDA-EPI進行跑樣，每個文件 80對離子對，進一步對一級質(zhì)譜母離子(Q1)，二級質(zhì)譜子離子(Q3、Q4)，峰保留時間進行核 對校準(zhǔn)，去卷積，建立二級質(zhì)譜子離子及保留時間為標(biāo)簽代謝數(shù)據(jù)庫。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用LC-MS/MS高效鑒別植物次生代謝產(chǎn)物的方法，其步驟是首先是對樣品進行Q1=Q3的質(zhì)荷比步進掃描；其次是利用MRM(多反應(yīng)監(jiān)測模式)對第一步所產(chǎn)生的離子對進行分段跑樣，找出有峰離子對，同時根據(jù)峰強度的大小進行去重；第三是利用MRM結(jié)合IDA再結(jié)合EPI對第二步找到的有峰離子對進行打碎跑樣，進一步去重并最終確定離子對，同時對確定離子對進行存庫。使用本方法，可以對植物不同組織的次生代謝產(chǎn)物進行高通量、高靈敏度鑒別。本方法操作簡便，應(yīng)用性強，對植物次生代謝產(chǎn)物的研究有著重大的意義。同時，可以利用該方法建立不同植物的次生代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫，從而促進植物代謝組學(xué)的發(fā)展。
文檔編號G01N30/02GK102128882SQ20101056242
公開日2011年7月20日 申請日期2010年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月26日
發(fā)明者李 東, 羅杰, 陳偉, 龔亮 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)