專利名稱：一種基于壓電傳感器檢測致病菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測致病菌的方法，尤其是一種基于壓電傳感器檢測致病菌的 方法。
背景技術(shù)：
1982 年大腸桿菌 0157:H7 (Enterohemorrhagic Escherichiacoli, EHEC)首次在美
國分離并確認為一種新型的腸道致病菌。它是腸出血性大腸桿菌的一個主要菌型，可引 起人類腹瀉、出血性腸炎、溶血性尿毒綜合征(uremic syndrome hemolytic，HUS)和血 栓形成性血小板減少性紫癜(thrombocytopenic purpura，TTP)，個別患者可因急性或慢性
腎功能衰竭而死亡，病死率高達30%以上，是全球關(guān)注的世界性公共衛(wèi)生問題。由該菌 引起的食物中毒已在世界范圍內(nèi)多次出現(xiàn)，1996年日本發(fā)生了世界上規(guī)模最大、涉及上 萬人的由出血性大腸桿菌0157:Η7引起的食物中毒。我國自1986年在徐州發(fā)現(xiàn)感染病 人，已在全國其它城市分離到了大腸桿菌0157:Η7，而且據(jù)報道食入不足10個大腸桿菌 0157 7即可引起致病。傳統(tǒng)的大腸桿菌0157:Η7等致病菌的檢測方法主要包括山梨醇麥康凱瓊脂分離 培養(yǎng)法，生化方法等，這些方法大多操作步驟繁瑣，且耗時較長。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā) 展，出現(xiàn)了一些新興檢測方法，如PCR法，ELISA法，免疫磁珠分離法，流式細胞儀法 及基因芯片法等，這些方法同樣也存在著儀器昂貴，操作復(fù)雜，費時等缺點。隨著科技的發(fā)展，生物傳感器以其靈敏度高、分析速度快、成本低等優(yōu)點開始 廣泛用于大腸桿菌0157:Η7等致病菌的檢測研究。壓電傳感器作為生物傳感器的一個 重要分支，在大腸桿菌0157:Η7等致病菌的檢測方法中也開展了廣泛的研究。壓電傳 感器(Piezoelectric biosensor)是20世紀60年代建立起來的一種新型測量技術(shù)，其檢測 的理論基礎(chǔ)是固載在晶體表面的沉積物質(zhì)量與晶體頻率變化存在著一定的比例關(guān)系，即 Sauerbrey 方禾呈AF = -2.26X IO^6F2 Am/A,式中，F(xiàn)為石英晶體天然諧振頻率(Hz) ； Am為 沉積在晶體表面的質(zhì)量變化(g) AF為晶體頻率的變化(Hz) ； A為參與晶振的面積 (cm2)；負號表示質(zhì)量的增加導(dǎo)致頻率的下降。但是目前單純利用壓電傳感器進行大 腸桿菌0157:H7的檢測，其靈敏度一般為105Cfu/ml。學(xué)者為了提高壓電傳感器的檢測 靈敏度，分別借助納米等技術(shù)對壓電傳感器的檢測信號進行放大，使得靈敏度提高到了 IOWml0然而這還是不能達到對大腸桿菌0157:H7的檢測要求。其他致病菌亦是如此，通過有效的檢測方法，提高靈敏度，達到并優(yōu)化致病菌 的檢測要求，具有非常重要的實踐意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種基于壓電傳感器檢測致病菌的方去。。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是本發(fā)明通過借助信標免疫納米磁顆粒和金生長技術(shù)對壓電傳感器的檢測信號進 行多級放大，從而達到對致病菌的超靈敏檢測。所述信標免疫納米磁顆粒是指納米磁顆 粒上同時連接能夠捕獲目標菌的抗體(目標抗體)和用于對檢測信號進行放大的抗體(信 標抗體)。具體實現(xiàn)方法如下一種基于壓電傳感器檢測致病菌的方法，具體步驟為(1)制備信標免疫納米磁顆粒；(2)制備親和素標記膠體金；(3)制備金生長液，確定親和素標記膠體金在金生長液中的生長時間；(4)壓電傳感器的檢測取信標免疫納米磁顆粒加入到進行梯度稀釋的致病菌的菌懸液中，通過超強磁 的吸引去除非目標菌；將制備好的親和素標記膠體金加入，通過生物素-親和素系統(tǒng)將 膠體金結(jié)合到信標免疫納米磁顆粒上；將連接有信標免疫納米磁顆粒和親和素標記膠體 金的致病菌加入金生長液中，按照步驟(3)確定的生長時間使膠體金得到生長放大，收 集該液體滴加至固定有SPA和致病菌鼠單克隆抗體并用牛血清白蛋白(BSA)封閉非特異 性位點的壓電傳感器的石英晶振上，觀察壓電傳感器頻率的變化確定待檢測樣本中致病 菌的濃度。優(yōu)選的，上述基于壓電傳感器檢測致病菌的方法，具體步驟為(1)制備信標免疫納米磁顆粒采用化學(xué)共沉淀法制備粒徑為IOnm 200nm的納米磁顆粒，將采用SPA親和純 化的致病菌兔多克隆抗體(目標抗體)和相同濃度的生物素標記的兔IgG(信標抗體)按 體積比為1 60混勻后，取混合抗體連接到納米磁顆粒上制成信標免疫納米磁顆粒；(2)制備親和素標記膠體金膠體金采用檸檬酸鈉還原法制備粒徑為10nm-20nm的膠體金，將濃度為0.2mg/ mL-1.0mg/mL的親和素連接至膠體金上，即為親和素標記膠體金；(3)制備金生長液，確定親和素標記膠體金在金生長液中的生長時間取氯金酸溶液加入十六烷基三甲基浴溴化胺(CTAB)溶液中混勻，然后置于 100°C水浴鍋中加熱lOmin，顏色變?yōu)榍辶恋狞S色，室溫下冷卻備用；在加入親和素標記 膠體金溶液之前加入抗壞血酸(AA)溶液輕輕混勻，金生長液顏色即消失；取不同濃度 的親和素標記膠體金溶液于金生長液中進行自生長，利用紫外分光度度計進行波長掃描 確定膠體金在金生長液中的生長時間；(4)壓電傳感器的檢測①石英晶振用piranha液進行洗滌，取SPA溶液固定于壓電傳感器的石英晶振， 取致病菌鼠單克隆抗體溶液固定于壓電傳感器的石英晶振，檢測頻率變化，確定致病菌 鼠單克隆抗體的固定濃度和時間；②取信標免疫納米磁顆粒加入到進行梯度稀釋的致病菌的菌懸液中，通過超強 磁的吸引去除非目標菌；再借助膜將多余的信標免疫納米磁顆粒離心去除；將步驟(2) 中制備好的親和素標記膠體金加入，通過生物素_親和素系統(tǒng)將膠體金結(jié)合到信標免疫納米磁顆粒上，然后借助超強磁將未結(jié)合的親和素標記膠體金去除；最后將連接有信標 免疫納米磁顆粒和親和素標記膠體金的致病菌加入金生長液中，按照步驟(3)確定的生 長時間使膠體金得到生長放大，繼續(xù)用超強磁將多余的金生長液去除；③按上述步驟(4)①確定的固定濃度和固定時間分別將SPA和致病菌鼠單克隆抗 體固定于壓電傳感器的石英晶振上，并用牛血清白蛋白(BSA)封閉石英晶振上非特異性 位點，將步驟(4)②中最后收集到的液體滴加至石英晶振上，觀察壓電傳感器頻率的變 化確定待檢測樣本中致病菌的濃度。在檢測致病菌的過程中，只需更換目標抗體和固定在壓電傳感器電極上的抗體 即可。優(yōu)選的，上述基于壓電傳感器檢測致病菌的方法，所述致病菌所述致病菌為大 腸桿菌0157:H7、沙門氏菌或嗜肺軍團菌等。優(yōu)選的，上述基于壓電傳感器檢測致病菌的方法，所述致病菌為大腸桿菌 0157:H7。優(yōu)選的，上述基于壓電傳感器檢測致病菌的方法，當(dāng)致病菌為大腸桿菌 0157:H7時，具體檢測方法為(1)制備信標免疫納米磁顆粒采用化學(xué)共沉淀法制備粒徑為IOnm 200nm的納米磁顆粒，將采用SPA親和純 化的濃度為0.5mg/mL大腸桿菌0157:H7兔多克隆抗體(目標抗體)和相同濃度的生物素 標記的兔IgG(信標抗體)按體積比為1 60混勻后，取每0.3mL混合抗體連接到ImL 納米磁顆粒上制成信標免疫納米磁顆粒；(2)制備親和素標記膠體金膠體金采用檸檬酸鈉還原法制備，制備粒徑為18nm的膠體金，將濃度為0.5mg/ mL的親和素連接至膠體金上，即為親和素標記膠體金；(3)制備金生長液，確定親和素標記膠體金在金生長液中的生長時間取52 μ 1 0.024Μ氯金酸溶液加入5ml 0.1M十六烷基三甲基浴溴化胺(CTAB)溶 液中混勻，然后置于100°c的水浴鍋中加熱lOmin，顏色變?yōu)榍辶恋狞S色，室溫下冷卻備 用；在加入親和素標記膠體金溶液之前加入50 μ IlM抗壞血酸(AA)溶液輕輕混勻，金生 長液顏色即消失；取100 μ 1的親和素標記膠體金溶液于900 μ 1金生長液中進行自生長， 即待生長的親和素標記膠體金溶液與金生長液的體積比為1 9，其中親和素標記膠體 金溶液的濃度為對步驟(2)中親和素標記膠體金進行對倍稀釋，即1/2、1/4和1/8的濃 度，利用紫外分光度度計進行波長掃描觀察膠體金在金生長液中的生長時間為15min;(4)壓電傳感器的檢測①石英晶振用piranha液進行洗滌，取濃度為0.2mg/mL 2.0mg/mL的SPA溶 液10 μ 1固定于壓電傳感器的石英晶振10 90min，取濃度為O.lmg/mL 1.8mg/mL的 大腸桿菌0157:H7鼠單克隆抗體溶液10 μ 1固定于壓電傳感器的石英晶振10 90min ；②取信標免疫納米磁顆粒加入到進行梯度稀釋的大腸桿菌0157:H7的菌懸液 中，通過超強磁的吸引去除非目標菌；再通過0.45 μ m的膜將多余的信標免疫納米磁顆 粒離心去除；將制備好的親和素標記膠體金溶液加入，通過生物素-親和素系統(tǒng)將膠體 金結(jié)合到信標免疫納米磁顆粒上，然后借助超強磁將未結(jié)合的親和素標記膠體金去除；最后將連接有信標免疫納米磁顆粒和親和素標記膠體金的大腸桿菌0157:H7加入金生長 液中，按照步驟(3)確定的生長時間使膠體金得到生長放大，繼續(xù)用超強磁將多余的金 生長液去除；③按上述步驟(4)①的固定濃度和固定時間分別將SPA和大腸桿菌0157:H7鼠 單克隆抗體固定于壓電傳感器的石英晶振上，并用牛血清白蛋白(BSA)封閉石英晶 振上非特異性位點；將步驟(4)②中最后收集到的液體滴加至石英晶振上，觀察壓電傳 感器頻率的變化確定待檢測樣本中大腸桿菌0157:H7的濃度。優(yōu)選的，上述基于壓電傳感器檢測致病菌的方法，所述步驟(1)中的納米磁顆 粒粒徑約為50nm，連接的大腸桿菌0157:H7兔多克隆抗體的濃度為0.5mg/mL ；步驟⑵ 中親和素的連接量為14μ g/ml。優(yōu)選的，上述基于壓電傳感器檢測致病菌的方法，所述步驟(4)中SPA的固定 濃度和時間為1.2mg/ml、40min ；大腸桿菌0157:H7鼠單克隆抗體的固定濃度和時間為 1.0mg/ml、60min。本發(fā)明的有益效果是上述基于壓電傳感器檢測致病菌的方法，通過抗原抗體反應(yīng)(信標免疫納米磁 顆粒)、生物素_親和素系統(tǒng)(親和素標記膠體金)和金的自生長技術(shù)(金生長液)，對 壓電免疫傳感器的檢測信號進行了多級放大，使得本發(fā)明的檢測靈敏度得到了最大限度 提高，其檢測大腸桿菌0157:H7的靈敏度達到了 23CFU/ml，該方法具有靈敏度高，特異 性強、操作簡便快速等特點，而且只要更換檢測過程中涉及的抗體就可以檢測不同的微 生物，在微生物的檢測領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為不同體積比的大腸桿菌0157:H7信標免疫納米磁顆粒回收率的測定圖 譜；圖2為SPA對傳感器頻率變化的影響圖譜，其中a濃度、b時間；圖3為大腸桿菌0157:H7鼠單克隆抗體對傳感器頻率變化的影響圖譜，其中a濃 度、b時間；圖4為大腸桿菌0157:H7菌懸液濃度與頻率變化關(guān)系圖譜，其中a高濃度、b低 濃度；圖5為本發(fā)明所述檢測方法檢測大腸桿菌0157:H7的流程圖。
具體實施例方式為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好的理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實施方 式對本發(fā)明所述技術(shù)方案作進一步的詳細說明。實施例1大腸桿菌0157:H7純菌懸液的檢測(1)信標免疫納米磁顆粒①納米磁顆粒的制備將0.7mol/L的FeCl3 · 6H20水溶液16mL與1.6mol/L FeCl2 · 4H20水溶液4mL混合，在氮氣條件下，加入IOg葡聚糖T_40，混勻，60°C，水浴20min，在2000rpm的攪拌下，20min內(nèi)，向混合液中滴加5mol/L的氨水40mL， 溫度保持60°C，并始終通氮氣，制成懸液；然后用去離子水透析24h，離心管離心， 2100rpm, 15min,保留上清(阻氧避光保存)，所制備的納米磁顆粒粒徑約為50nm ；②信標免疫納米磁顆粒的制備游離的葡聚糖經(jīng)聚丙烯酰胺葡聚糖S-300凝膠 層析柱過濾與葡聚糖納米磁顆粒分離，洗脫平衡液為pH為7.4的O.Olmol/L磷酸鹽緩沖 液，收集的顆粒冷凍干燥，使葡聚糖納米磁顆粒懸液的濃度為Smg/mL ；取葡聚糖納米 磁顆粒懸液l.OmL，加入20mmol/LNaIO4水溶液0.25mL，150轉(zhuǎn)/分鐘避光阻氧震蕩6h 后，力卩入2mol/L乙二醇的水溶液0.21mL終止氧化，pH為7.4的O.Olmol/L磷酸鹽緩沖液 4°C透析24h，去除過量的NaIO4,使葡聚糖納米磁顆粒懸液的濃度為5.5mg/mL ；取SPA 親和純化的大腸桿菌0157:H7兔多克隆抗體(中國公共衛(wèi)生，2005; 21(6) 705-6)和 生物素化兔IgGCBBI生物公司購買)分別按體積比為1 O、1 5、1 10、1 20、
1 40、1 60、1 80和1 100的比例混合，抗體混合溶液的總體積為0.3ml，兩種 抗體的濃度均為0.5mg/mL，將混合好的抗體溶液加入到步驟(1)②中的ImL納米磁顆粒 中，混勻后，放入4°C冰箱過夜(避光)，次日，在上述溶液中加入BSA(終濃度為1%) 進行封閉，過夜，置4°C冰箱備用；③信標免疫納米磁顆?；厥章实臏y定分別取20 μ 1步驟(1)②中制備的不同 體積比的大腸桿菌0157:Η7信標免疫納米磁顆粒加入濃度為8.1X102CFU/ml的大腸桿菌 0157:H7菌懸液中，于室溫下孵育15min，借助超強磁將溶液濃縮至100 μ 1 ；將此100 μ 1 溶液轉(zhuǎn)移至遠藤平板(BD公司產(chǎn)品)均勻涂布后于37°C下培養(yǎng)24h后計數(shù)，并將此計數(shù) 結(jié)果除以大腸桿菌0157:H7菌液的原始濃度即為信標免疫納米磁顆粒的回收率，如圖1所 示，綜合考慮信標免疫納米磁顆粒的回收率及信標抗體的后期信號放大作用，確定信標 免疫納米磁顆粒的目標抗體與信標抗體的最佳比例為體積比1 60，且此信標免疫納米 磁顆粒在保存1年后，其回收率基本不變。(2)親和素標記膠體金取2.0mL的1 %氯金酸加入198mL超純水，于沸水浴中加熱IOmin ；然后迅速 加入5mL的檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)加熱15min;當(dāng)膠體金顏色變?yōu)槠咸丫萍t色時，繼 續(xù)加熱lOmin，冷卻后用透射電鏡觀察其粒徑大小約為18nm。用0.2% K2CO3調(diào)pH值 為6.5。利用分光光度計法測得穩(wěn)定膠體金最適親和素量為14 μ g/mL。取調(diào)好pH值的 膠體金25ml，加入濃度為0.5mg/mL的親和素0.7ml，緩慢攪拌lOmin，加入牛血清白蛋 白(BSA)，使其終濃度為1%，繼續(xù)攪拌IOmin以上。將上述初步制得的膠體金探針以 4000rpm離心20min，收集上清以IOOOOrpm 4°C離心60min ；丟棄上清，留下管底為暗紅 色疏松狀沉淀，沉淀用0.005mo 1/L pH為7.6的PB緩沖液(含1 % BSA, 0.02% NaN3) 重新懸浮，再同前離心洗滌一次。最后將沉淀用同前的pH為7.4的O.Olmol/L磷酸鹽緩 沖液懸浮，置4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?3)金生長液取52 μ 1 0.024Μ氯金酸溶液加入5ml 0.1M十六烷基三甲基浴溴化胺(CTAB)溶 液中混勻，然后置于100°c下的水浴鍋中加熱lOmin，顏色變?yōu)榍辶恋狞S色，室溫下冷卻 備用；在加入膠體金溶液之前加入50 μ 1 IM抗壞血酸(AA)溶液輕輕混勻，金生長液顏 色即消失，此即為金生長液。
(4)壓電傳感器的檢測①先將石英晶振用piranha液(濃H2S04/H2023/1，現(xiàn)用現(xiàn)配)進行洗滌，再用無 水乙醇和超純水洗滌，每次5min，重復(fù)3次；石英晶振在固定物質(zhì)之前在氣相中進行基 礎(chǔ)頻率檢測，固定物質(zhì)之后進行洗滌，氮氣吹干IOmin后在氣相中進行頻率檢測，頻率 變化穩(wěn)定在士 IHz間時計數(shù)；取0.2-2.0mg/ml的SPA溶液10 μ 1滴加于石英晶振上，常溫 下固定10-90min，按上述步驟進行洗滌后取0.2-2.0mg/ml的大腸桿菌0157:H7鼠單克隆 抗體溶液(專利申請?zhí)?00810053955.8) 10 μ 1滴加于石英晶振上，37°C下固定10_90min， 洗滌后用1%BSA封閉，用壓電傳感器檢測頻率做為基頻，根據(jù)圖2和圖3可確定SPA 的最佳固定濃度與時間為1.2mg/ml和40min，大腸桿菌0157:H7鼠單克隆抗體的最佳固 定濃度與時間為1.0mg/ml和60min ；②取20 μ 1信標免疫納米磁顆粒加入Iml梯度稀釋后的的大腸桿菌0157:Η7菌懸 液(9.2 X IOi-AZX 106CFU/ml)和沙門氏菌的菌懸液(7.8 X IO1-Tj X 106CFU/ml)中，輕 輕混勻后，于室溫下孵育15mim，借助超強磁將溶液濃縮至100 μ 1 ；利用帶0.45 μ m濾 膜的離心管(ultrafree-MC microcentrifuge filters, Sigma 公司)1500rpm 離心 IOmin 將多余
的信標免疫納米磁顆粒去除；加入10 μ 1親和素標記膠體金，37°C下孵育20min，用超強 磁去除未結(jié)合的親和素標記膠體金，并將溶液定容到100 μ 1 ；將上述100 μ 1溶液加入到 90(^1的金生長液中反應(yīng)151^11;再借助超強磁將多余的金生長液去除，最后將溶液定容 至Ij 10 μ 1 ；③將步驟(4)②中最后得到的10 μ 1溶液滴加到步驟(4)①中已修飾好的石英 晶振上，并將石英晶振于37°C下反應(yīng)60min后，洗滌后進行頻率的測定，其檢測結(jié)果見 圖4，可知壓電免疫傳感器經(jīng)過信標免疫納米磁顆粒和親和素標記膠體金對檢測信號進行 了多級放大，大腸桿菌0157:H7菌檢測限達到了 23CFU/ml，整個檢測過程控制在4h之 內(nèi)。實施例2大腸桿菌0157:H7純菌懸液的檢測(1)信標免疫納米磁顆粒①納米磁顆粒的制備將0.7mol/L的FeCl3 · 6H20水溶液16mL與1.6mol/L FeCl2 · 4H20水溶液4mL混合，在氮氣條件下，加入4g葡聚糖T_40，混勻，60°C，水浴 20min,在2000rpm的攪拌下，20min內(nèi)，向混合液中滴加5mol/L的氨水40mL，溫度保 持60°C，并始終通氮氣，制成懸液；然后用去離子水透析24h，離心管離心，2100rpm， 15min,保留上清(阻氧避光保存)，所制備的納米磁顆粒粒徑約為200nm，按此方法制 備的納米磁顆粒較易產(chǎn)生聚集，保存時間約1個月左右。②③同實施例1，制備的信標免疫納米磁顆粒的回收率最高為52%。(2) (3) (4)同實施例1，最后檢測大腸桿菌0157:H7菌靈敏度為172CFU/ml。實施例3大腸桿菌0157:H7純菌懸液的檢測(1)信標免疫納米磁顆粒①納米磁顆粒的制備將0.7mol/L的FeCl3 · 6H20水溶液16mL與1.6mol/L FeCl2 · 4H20水溶液4mL混合，在氮氣條件下，加入4g葡聚糖T_40，混勻，60°C，水浴20min，在500rpm的攪拌下，20min內(nèi)，向混合液中滴加5mol/L的氨水40mL，溫度保 持60°C，并始終通氮氣，制成懸液；然后用去離子水透析24h，離心管離心，2100rpm， 15min,保留上清(阻氧避光保存)，所制備的納米磁顆粒粒徑約為lOrnn。②③同實施例1，制備的信標免疫納米磁顆粒的回收率最高為63%。(2) (3) (4)同實施例1，最后檢測大腸桿菌0157:H7菌靈敏度為120CFU/ml。實施例4(1)沙門氏菌純菌懸液的檢測①游離的葡聚糖經(jīng)聚丙烯酰胺葡聚糖S-300凝膠層析柱過濾與葡聚糖納米磁顆 粒分離，洗脫平衡液為pH7.4的O.Olmol/L磷酸鹽緩沖液，收集的顆粒冷凍干燥，使葡 聚糖納米磁顆粒懸液的濃度為8mg/mL;取葡聚糖納米磁顆粒懸液l.OmL，加入20mmol/ LNaIO4水溶液0.25mL，150轉(zhuǎn)/分鐘避光阻氧震蕩6h后，加入2mol/L乙二醇的水溶液 0.21mL終止氧化，pH 7.4的O.Olmol/L磷酸鹽緩沖液4°C透析24h，去除過量的NaIO4, 使葡聚糖納米磁顆粒懸液的濃度為5.5mg/mL ；②取SPA親和純化的沙門氏菌兔多克隆抗體(中國公共衛(wèi)生，2005 ； 21(6) 705-6)和生物素化兔IgGCBBI生物公司購買)按體積比為1 60比例混合，抗體混合溶 液的總體積為0.3ml，兩種抗體的濃度均為0.5mg/mL，將混合好的抗體溶液加入到步驟 (1)①中的ImL納米磁顆粒中，混勻后，放入4°C冰箱過夜(避光)，次日，在上述溶液 中加入BSA(終濃度為1%)進行封閉，過夜，置4°C冰箱備用。其余步驟同實施例1。(4)壓電傳感器的檢測①先將石英晶振用piranha液(濃H2S04/H2023/1，現(xiàn)用現(xiàn)配)進行洗滌，再用無 水乙醇和超純水洗滌，每次5min，重復(fù)3次；石英晶振在固定物質(zhì)之前在氣相中進行基 礎(chǔ)頻率檢測，固定物質(zhì)之后進行洗滌，氮氣吹干IOmin后在氣相中進行頻率檢測，頻率 變化穩(wěn)定在士 IHz間時計數(shù)；取1.2mg/ml的SPA溶液ΙΟμΙ滴加于石英晶振上，常溫下 固定40min ；按上述步驟進行洗滌后取l.Omg/ml的沙門氏菌鼠單克隆抗體溶液(AB公司 沙門氏菌鼠單克隆抗體，貨號為abl3628) 10yl滴加于石英晶振上，37°C下固定60min， 洗滌后用BSA封閉，用壓電傳感器檢測頻率做為基頻；②取20 μ 1信標免疫納米磁顆粒加入Iml梯度稀釋后的的沙門氏菌菌懸液 (8.6 X Iol-S^Xio6CFUZml)和腸球菌的菌懸液(4.2X101-4.2X106CFU/ml)中，輕輕混 勻后，于室溫下孵育15mim，借助超強磁將溶液濃縮至100 μ 1 ；利用帶0.45 μ m濾膜的 離心管(ultrafree-MC microcentrifuge filters, Sigma 公司)1500rpm 離心 IOmin 將多余的
信標免疫納米磁顆粒去除；加入ΙΟμΙ親和素標記膠體金37°C下孵育20min，用超強磁 去除未結(jié)合的親和素標記膠體金，并將溶液定容到ΙΟΟμΙ;將上述ΙΟΟμΙ溶液加入到 90(^1的金生長液中反應(yīng)151^11;再借助超強磁將多余的金生長液去除，最后將溶液定容 到 10 μ 1 ；③將步驟(4)②中最后得到的10 μ 1溶液滴加到步驟⑷①中已修飾好的石英晶 振上，并將石英晶振于37°C下反應(yīng)60min后，洗滌后進行頻率的測定，最后檢測結(jié)果為 35CFU/ml。實施例5
嗜肺軍團菌純菌懸液的檢測(1)信標免疫納米磁顆粒的制備①游離的葡聚糖經(jīng)聚丙烯酰胺葡聚糖S-300凝膠層析柱過濾與葡聚糖納米磁顆 粒分離，洗脫平衡液為pH7.4的O.Olmol/L磷酸鹽緩沖液，收集的顆粒冷凍干燥，使葡 聚糖納米磁顆粒懸液的濃度為8mg/mL;取葡聚糖納米磁顆粒懸液l.OmL，加入20mmol/ LNaIO4水溶液0.25mL，150轉(zhuǎn)/分鐘避光阻氧震蕩6h后，加入2mol/L乙二醇的水溶液 0.21mL終止氧化，pH 7.4的O.Olmol/L磷酸鹽緩沖液4°C透析24h，去除過量的NaIO4, 使葡聚糖納米磁顆粒懸液的濃度為5.5mg/mL ；②取SPA親和純化的嗜肺軍團菌兔多克隆抗體(中國公共衛(wèi)生，2005; 21(6) 705-6)和生物素化兔IgGCBBI生物公司購買)按體積比為1 60比例混合，抗體混合溶 液的總體積為0.3ml，兩種抗體的濃度均為0.5mg/mL，將混合好的抗體溶液加入到步驟 (1)①中的ImL納米磁顆粒中，混勻后，放入4°C冰箱過夜(避光)，次日，在上述溶液 中加入BSA(終濃度為1%)進行封閉，過夜，置4°C冰箱備用。其余步驟同實施例1。(4)壓電傳感器的檢測①先將石英晶振用piranha液(濃H2S04/H2023/1，現(xiàn)用現(xiàn)配)進行洗滌，再用 無水乙醇和超純水洗滌，每次5min，重復(fù)3次；石英晶振在固定物質(zhì)之前在氣相中進行 基礎(chǔ)頻率檢測，固定物質(zhì)之后進行洗滌，氮氣吹干IOmin后在氣相中進行頻率檢測，頻 率變化穩(wěn)定在士 IHz間時計數(shù)；取1.2mg/ml的SPA溶液ΙΟμΙ滴加于石英晶振上，常溫 下固定40min ；按上述步驟進行洗滌后取l.Omg/ml的嗜肺軍團鼠單克隆抗體溶液(AB公 司嗜肺軍團鼠單克隆抗體，貨號為ab8263) 10yl滴加于石英晶振上，37°C下固定60min， 洗滌后用BSA封閉，用壓電傳感器檢測頻率做為基頻；②取20 μ 1信標免疫納米磁顆粒加入Iml梯度稀釋后的的嗜肺軍團菌菌懸液 (Sjxiol-Sjxio6CFlVml)和大腸桿菌的菌懸液(9.3Xiol-MXio6CFUZml)中，輕輕 混勻后，于室溫下孵育15mim，借助超強磁將溶液濃縮至100 μ 1 ；利用帶0.45 μ m濾膜 的離心管(ultrafree-MC microcentrifuge filters, Sigma 公司)1500rpm 離心 IOmin 將多余
的信標免疫納米磁顆粒去除；加入ΙΟμΙ親和素標記膠體金37°C下孵育20min，用超強 磁去除未結(jié)合的親和素標記膠體金，并將溶液定容到100 μ 1 ；將上述100 μ 1溶液加入到 90(^1的金生長液中反應(yīng)151^11;再借助超強磁將多余的金生長液去除，最后將溶液定容 至Ij 10 μ 1 ；③將步驟(4)②中最后得到的10 μ 1溶液滴加到步驟⑷①中已修飾好的石英晶 振上，并將石英晶振于37°C下反應(yīng)60min后，洗滌后進行頻率的測定，最后檢測結(jié)果為 57CFU/ml。實施例6食品樣本加標大腸桿菌0157 7的檢測(1)從天津某菜場購買熟牛肉作為本次實驗的樣本，在無菌操作下分別稱取 25g樣本分成2份進行檢測，其中一份按照GB/T4789.36-2008進行大腸桿菌0157:H7 的檢測；另外一份樣本中加入225ml滅菌生理鹽水進行均質(zhì)后，取2.5ml已知濃度 (2.2X109CFU/ml)的大腸桿菌0157:H7的菌懸液加入，分別在加入大腸桿菌0157:H7之前與之后各取Iml樣本液體利用壓電免疫傳感器進行大腸桿菌0157 7的檢測；(2)樣本利用壓電免疫傳感器進行大腸桿菌0157 7檢測的方法同實施例1中的 步驟(1)_(4)，檢測結(jié)果為未加標的樣本中未檢測出大腸桿菌0157:H7，加標樣本中大 腸桿菌0157 7最低檢測限為55CFU/ml?？梢?，上述基于壓電傳感器檢測致病菌的方法在其他檢測條件不變的情況下， 僅需更換目標抗體和固定在壓電傳感器電極上的抗體即可對各類致病菌進行檢測，是可 以普遍應(yīng)用于各類致病菌的檢測方法。上述參照具體實施方式
對該一種基于壓電傳感器檢測致病菌的方法進行的詳細 描述，是說明性的而不是限定性的，可按照所限定范圍列舉出若干個實施例，因此在不 脫離本發(fā)明總體構(gòu)思下的變化和修改，應(yīng)屬本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種基于壓電傳感器檢測致病菌的方法，其特征在于具體步驟為(1)制備信標免疫納米磁顆粒；(2)制備親和素標記膠體金；(3)制備金生長液，確定親和素標記膠體金在金生長液中的生長時間；(4)壓電傳感器的檢測取信標免疫納米磁顆粒加入到進行梯度稀釋的致病菌的菌懸液中，通過超強磁的吸 引去除非目標菌；將制備好的親和素標記膠體金加入，通過生物素-親和素系統(tǒng)將膠體 金結(jié)合到信標免疫納米磁顆粒上；將連接有信標免疫納米磁顆粒和親和素標記膠體金的 致病菌加入金生長液中，按照步驟(3)確定的生長時間使膠體金得到生長放大，收集該 液體滴加至固定有SPA和致病菌鼠單克隆抗體并用牛血清白蛋白封閉非特異性位點的壓 電傳感器的石英晶振上，觀察壓電傳感器頻率的變化確定待檢測樣本中致病菌的濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于壓電傳感器檢測致病菌的方法，其特征在于具體步 驟為(1)制備信標免疫納米磁顆粒采用化學(xué)共沉淀法制備粒徑為IOnm 200nm的納米磁顆粒，將采用SPA親和純化 的致病菌兔多克隆抗體和相同濃度的生物素標記的兔IgG按體積比為1 60混勻后，取 混合抗體連接到納米磁顆粒上制成信標免疫納米磁顆粒；(2)制備親和素標記膠體金膠體金采用檸檬酸鈉還原法制備粒徑為10mn-20nm的膠體金，將濃度為0.2mg/ mL-1.0mg/mL的親和素連接至膠體金上，即為親和素標記膠體金；(3)制備金生長液，確定親和素標記膠體金在金生長液中的生長時間取氯金酸溶液加入十六烷基三甲基浴溴化胺溶液中混勻，然后置于100°C水浴鍋中加 熱lOmin，顏色變?yōu)榍辶恋狞S色，室溫下冷卻備用；加入抗壞血酸溶液輕輕混勻至金生 長液顏色消失；取不同濃度的親和素標記膠體金溶液于金生長液中進行自生長，利用紫 外分光度度計進行波長掃描確定膠體金在金生長液中的生長時間；(4)壓電傳感器的檢測①石英晶振用piranha液進行洗滌，取SPA溶液固定于壓電傳感器的石英晶振，檢測 頻率變化，確定SPA的固定濃度和時間后，取致病菌鼠單克隆抗體溶液固定于壓電傳感 器的石英晶振，檢測頻率變化，確定致病菌鼠單克隆抗體的固定濃度和時間；②取信標免疫納米磁顆粒加入到進行梯度稀釋的致病菌的菌懸液中，通過超強磁的 吸引去除非目標菌；再借助膜將多余的信標免疫納米磁顆粒離心去除；將步驟(2)中制 備好的親和素標記膠體金加入，通過生物素_親和素系統(tǒng)將膠體金結(jié)合到信標免疫納米 磁顆粒上，然后借助超強磁將未結(jié)合的親和素標記膠體金去除；最后將連接有信標免疫 納米磁顆粒和親和素標記膠體金的致病菌加入金生長液中，按照步驟(3)確定的生長時 間使膠體金得到生長放大，繼續(xù)用超強磁將多余的金生長液去除；③按上述步驟(4)①的固定濃度和固定時間分別將SPA和致病菌鼠單克隆抗體固定 于壓電傳感器的石英晶振上，并用牛血清白蛋白封閉石英晶振上非特異性位點，將步驟 (4)②中最后收集到的液體滴加至石英晶振上，觀察壓電傳感器頻率的變化確定待檢測樣 本中致病菌的濃度。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于壓電傳感器檢測致病菌的方法，其特征在于所述致 病菌為大腸桿菌0157:H7、沙門氏菌或嗜肺軍團菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的基于壓電傳感器檢測致病菌的方法，其特征在于所述 致病菌為大腸桿菌0157:H7。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于壓電傳感器檢測致病菌的方法，其特征在于具體檢 測方法為(1)制備信標免疫納米磁顆粒采用化學(xué)共沉淀法制備粒徑為IOnm 200nm的納米磁顆粒，將采用SPA親和純化 的濃度為0.5mg/mL大腸桿菌0157:H7兔多克隆抗體和相同濃度的生物素標記的兔IgG按 體積比為1 60混勻后，取每0.3mL混合抗體連接到ImL納米磁顆粒上制成信標免疫納 米磁顆粒；(2)制備親和素標記膠體金膠體金采用檸檬酸鈉還原法制備，制備粒徑為18nm的膠體金，將濃度為0.5mg/mL 的親和素連接至膠體金上，即為親和素標記膠體金；(3)制備金生長液，確定膠體金在金生長液中的生長時間取52 μ 1 0.024Μ氯金酸溶液加入5ml 0.1M十六烷基三甲基浴溴化胺(CTAB)溶液中 混勻，然后置于100°C的水浴鍋中加熱lOmin，顏色變?yōu)榍辶恋狞S色，室溫下冷卻備用； 加入50 μ IlM抗壞血酸溶液輕輕混勻至金生長液顏色消失；取每100 μ 1的親和素標記膠 體金溶液于900 μ 1金生長液中進行自生長，其中親和素標記膠體金溶液的濃度為對步驟 (2)中親和素標記膠體金溶液進行對倍稀釋，利用紫外分光度度計進行波長掃描觀察膠體 金在金生長液中的生長時間為15min ；(4)壓電傳感器的檢測①石英晶振用piranha液進行洗滌，取濃度為0.2mg/mL 2.0mg/mL的SPA溶液 10 μ 1固定于壓電傳感器的石英晶振10 90min，取濃度為O.lmg/mL 1.8mg/mL的大 腸桿菌0157:H7鼠單克隆抗體溶液10 μ 1固定于壓電傳感器的石英晶振10 90min ；②取信標免疫納米磁顆粒加入到進行梯度稀釋的大腸桿菌0157:H7的菌懸液中，通 過超強磁的吸引去除非目標菌；再通過0.45 μ m的膜將多余的信標免疫納米磁顆粒離心 去除；將制備好的親和素標記膠體金溶液加入，通過生物素-親和素系統(tǒng)將膠體金結(jié)合 到信標免疫納米磁顆粒上，然后借助超強磁將未結(jié)合的親和素標記膠體金去除；最后將 連接有信標免疫納米磁顆粒和親和素標記膠體金的大腸桿菌0157:H7加入金生長液中， 按照步驟(3)確定的生長時間使膠體金得到生長放大，繼續(xù)用超強磁將多余的金生長液 去除；③按上述步驟(4)①的固定濃度和固定時間分別將SPA和大腸桿菌0157:H7鼠單克 隆抗體固定于壓電傳感器的石英晶振上，并用牛血清白蛋白封閉石英晶振上非特異性 位點；將步驟(4)②中最后收集到的液體滴加至石英晶振上，觀察壓電傳感器頻率的變 化確定待檢測樣本中大腸桿菌0157:H7的濃度。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于壓電傳感器檢測致病菌的方法，其特征在于所述步 驟(1)中的納米磁顆粒粒徑約為50nm，連接的大腸桿菌0157:H7兔多克隆抗體的濃度為 0.5mg/mL ；步驟(2)中親和素的連接量為14yg/ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于壓電傳感器檢測致病菌的方法，其特征在于所述步 驟⑷中SPA的固定濃度和時間為1.2mg/ml、40min ；大腸桿菌0157:H7鼠單克隆抗體 的固定濃度和時間為1.0mg/ml、60min。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種基于壓電傳感器檢測致病菌的方法，通過抗原抗體反應(yīng)(信標免疫磁顆粒)、生物素-親和素系統(tǒng)(金標親和素)和金的自生長技術(shù)(金生長液)，對壓電免疫傳感器的檢測信號進行了多級放大，使得本發(fā)明的檢測靈敏度得到了最大限度提高，其檢測大腸桿菌0157:H7的靈敏度達到了23CFU/ml，該方法具有靈敏度高，特異性強、操作簡便快速等特點，而且只要更換檢測過程中涉及的抗體就可以檢測不同的微生物，在微生物的檢測領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號G01N27/00GK102012384SQ20101055011
公開日2011年4月13日 申請日期2010年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月18日
發(fā)明者李君文, 王新為, 王景峰, 諶志強, 邱志剛, 金敏, 陳照立 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所