專利名稱：一種三維熒光納米顯微成像方法、系統(tǒng)及成像設(shè)備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于顯微成像領(lǐng)域，尤其涉及一種三維熒光納米顯微成像方法、系統(tǒng)及成 像設(shè)備。
背景技術(shù)：
納米分辨熒光成像可以以納米級(jí)的空間分辨率直觀地顯示被標(biāo)記分子在被標(biāo)記 物內(nèi)的空間分布，并能用來(lái)研究被標(biāo)記分子之間的相互作用過(guò)程，可用于生物領(lǐng)域研究細(xì) 胞內(nèi)DNA、RNA與蛋白質(zhì)分子之間的相互作用和運(yùn)動(dòng)規(guī)律。目前常用的成像方法是利用熒光 標(biāo)記物本身的開(kāi)關(guān)效應(yīng)來(lái)進(jìn)行定位的顯微成像技術(shù)，通過(guò)時(shí)分復(fù)用、質(zhì)心定位以及圖像復(fù) 合來(lái)進(jìn)行納米分辨成像，例如，光敏定位顯微(PALM)、隨機(jī)光學(xué)重建顯微(STORM)等等，它 們?cè)诿總€(gè)時(shí)刻獲取稀疏分布的熒光標(biāo)記物的定位信息，然后將不同時(shí)刻獲得的定位信息疊 加，最終實(shí)現(xiàn)高橫向納米分辨。結(jié)合軸向分辨輔助元件或方法，可進(jìn)行三維納米顯微成像。然而，上述方法比較適用于較薄樣品的三維顯微成像，對(duì)于厚度達(dá)到一二十微米 甚至更厚的樣品，由于探測(cè)物鏡非焦平面熒光背景噪聲的影響，其標(biāo)記分子的定位精度較 低，無(wú)法獲取高精度的三維圖像。目前，這些方法大都以結(jié)合全內(nèi)反射熒光顯微(TIRF) 的方式實(shí)現(xiàn)，通過(guò)TIRF只激發(fā)表面的熒光分子，從而有效遏制了非焦平面的熒光信號(hào)，但 TIRF也帶來(lái)一定的局限性，即這種方法只局限于樣品表面IOOnm左右范圍內(nèi)的成像，應(yīng)用 范圍受到很大限制。因此，對(duì)具有一定厚度的樣品進(jìn)行三維納米分辨成像時(shí)，通常的做法 是增大被標(biāo)記分子的稀疏程度，單純依靠軸向分辨以及軸向掃描手段實(shí)現(xiàn)三維納米分辨成 像。但是，不同深度的熒光分子被激發(fā)，不僅降低了軸向定位精度，也影響了成像效率，增加 了厚樣品觀測(cè)的難度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明實(shí)施例的目的在于提供一種三維熒光納米顯微成像方法，旨在解決厚樣品 內(nèi)分子定位精度低，樣品觀測(cè)難的問(wèn)題。本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種三維熒光納米顯微成像方法，所述方法包括下 述步驟產(chǎn)生激發(fā)光；將所述激發(fā)光轉(zhuǎn)換為片狀激發(fā)光束；將所述片狀激發(fā)光束作用于樣品；探測(cè)被作用樣品層內(nèi)熒光標(biāo)記物發(fā)射的熒光；橫向定位，獲取熒光標(biāo)記物的二維位置；軸向定位，獲取熒光標(biāo)記物的軸向位置；三維重構(gòu)，結(jié)合所述的二維位置和軸向位置獲取被作用樣品層的三維納米分辨圖 像；軸向掃描，獲取不同樣品層的三維納米分辨圖像；
獲得完整樣品的三維納米分辨圖像。本發(fā)明實(shí)施例的另一目的在于提供一種三維熒光納米顯微成像系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包 括光源，用于產(chǎn)生激發(fā)光；光路調(diào)整裝置，置于所述光源的輸出光路山，用于將所述激發(fā)光轉(zhuǎn)換成片狀激發(fā) 光束，并將所述片狀激發(fā)光束作用到樣品上；微調(diào)樣品臺(tái)，置于所述光路調(diào)整裝置的輸出光路上，用于放置并軸向移動(dòng)樣品，所 述樣品接受所述片狀激發(fā)光束的作用后發(fā)射熒光；探測(cè)光路裝置，置于所述樣品發(fā)射的熒光的光路上，用于接收并傳導(dǎo)熒光；探測(cè)裝置，置于所述探測(cè)光路裝置的輸出光路上，用于探測(cè)熒光。本發(fā)明實(shí)施例的另一目的在于提供一種包含上述三維熒光納米顯微成像系統(tǒng)的 成像設(shè)備。本發(fā)明實(shí)施例用片狀激發(fā)光束作用于樣品的一薄層，使處于探測(cè)層軸向中心位置 的熒光標(biāo)記物處于稀疏激發(fā)狀態(tài)，遠(yuǎn)離探測(cè)層軸向中心位置的熒光標(biāo)記物免于被激發(fā)，實(shí) 現(xiàn)了厚樣品的軸向選擇性激發(fā)，避免了不同層中處于熒光態(tài)的熒光標(biāo)記物的相互串?dāng)_，并 降低了非探測(cè)層熒光標(biāo)記物發(fā)出的熒光帶來(lái)的離焦背景噪聲，進(jìn)而提高了熒光標(biāo)記物的橫 向及軸向定位精度；通過(guò)軸向掃描獲得不同深度樣品層的三維納米分辨圖像，最終實(shí)現(xiàn)厚 樣品的高精度三維熒光納米顯微成像，使得厚樣品的觀測(cè)更加容易。


圖1是本發(fā)明第一實(shí)施例提供的三維熒光納米顯微成像方法的實(shí)現(xiàn)流程圖；圖2是本發(fā)明第六實(shí)施例提供的雙焦平面差動(dòng)探測(cè)方法的實(shí)現(xiàn)流程圖；圖3是本發(fā)明第十實(shí)施例提供的三維熒光納米顯微成像系統(tǒng)的原理圖；圖4是本發(fā)明第十一實(shí)施例提供的三維熒光納米顯微成像系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)圖；圖5是本發(fā)明第十二實(shí)施例提供的三維熒光納米顯微成像系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)圖；圖6是本發(fā)明第十三實(shí)施例提供的三維熒光納米顯微成像系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)圖。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì) 本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并 不用于限定本發(fā)明。本發(fā)明實(shí)施例用片狀激發(fā)光束作用于樣品，實(shí)現(xiàn)了厚樣品的軸向選擇性激發(fā)，提 高了熒光標(biāo)記物的橫向及軸向定位精度，結(jié)合軸向掃描實(shí)現(xiàn)了完整樣品的三維納米顯微成 像，使厚樣品的觀測(cè)更加容易。 本發(fā)明實(shí)施例提供了 一種三維熒光納米顯微成像方法，所述方法包括下述步驟產(chǎn)生激發(fā)光；將所述激發(fā)光轉(zhuǎn)換為片狀激發(fā)光束；將所述片狀激發(fā)光束作用于樣品；探測(cè)被作用樣品層內(nèi)熒光標(biāo)記物發(fā)射的熒光；
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橫向定位，獲取熒光標(biāo)記物的二維位置；軸向定位，獲取熒光標(biāo)記物的軸向位置；三維重構(gòu)，獲取被作用樣品層的三維納米分辨圖像；軸向掃描，獲取不同樣品層的三維納米分辨圖像；獲得完整樣品的三維納米分辨圖像。本發(fā)明實(shí)施例還提供了一種三維熒光納米顯微成像系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括光源，用于產(chǎn)生激發(fā)光；光路調(diào)整裝置，置于所述光源的輸出光路山，用于將所述激發(fā)光轉(zhuǎn)換成片狀激發(fā) 光束，并將所述片狀激發(fā)光束作用到樣品上；微調(diào)樣品臺(tái)，置于所述光路調(diào)整裝置的輸出光路上，用于放置并軸向移動(dòng)樣品，所 述樣品接受所述片狀激發(fā)光束的作用后發(fā)射熒光；探測(cè)光路裝置，置于所述樣品發(fā)射的熒光的光路上，用于接收并傳導(dǎo)熒光；探測(cè)裝置，置于所述探測(cè)光路裝置的輸出光路上，用于探測(cè)熒光。本發(fā)明實(shí)施例還提供了 一種包含三維熒光納米顯微成像系統(tǒng)的成像設(shè)備。本發(fā)明實(shí)施例以片狀光束作為激發(fā)光作用于樣品的一薄層，使處于探測(cè)層軸向中 心位置的熒光標(biāo)記物處于稀疏激發(fā)狀態(tài)，遠(yuǎn)離探測(cè)層軸向中心位置的熒光標(biāo)記物免于被激 發(fā)，實(shí)現(xiàn)了厚樣品的軸向選擇性激發(fā)，避免了不同層中處于熒光態(tài)的熒光標(biāo)記物的相互串 擾，并降低了非探測(cè)層熒光標(biāo)記物發(fā)出的熒光帶來(lái)的離焦背景噪聲，進(jìn)而提高了熒光標(biāo)記 物的橫向及軸向定位精度；通過(guò)軸向掃描獲得不同深度樣品層的三維納米分辨圖像，最終 實(shí)現(xiàn)厚樣品的高精度三維熒光納米顯微成像，使得厚樣品的觀測(cè)更加容易。以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)現(xiàn)進(jìn)行詳細(xì)描述實(shí)施例一圖1示出了本發(fā)明第一實(shí)施例提供的三維熒光納米顯微成像方法的實(shí)現(xiàn)流程，詳 述如下在步驟SlOl中，產(chǎn)生激發(fā)光；在步驟S102中，將激發(fā)光轉(zhuǎn)換為片狀激發(fā)光束；在步驟S103中，將片狀激發(fā)光束作用于樣品；在步驟S104中，探測(cè)被作用樣品層內(nèi)熒光標(biāo)記物發(fā)射的熒光；在步驟S105中，橫向定位，獲取熒光標(biāo)記物的二維位置；在步驟S106中，軸向定位，獲取熒光標(biāo)記物的軸向位置；在步驟S107中，三維重構(gòu)，結(jié)合所述的二維位置和軸向位置獲取被作用樣品層的 三維納米分辨圖像；在步驟S108中，軸向掃描，獲取不同樣品層的三維納米分辨圖像；在步驟S109中，獲得完整樣品的三維納米分辨圖像。實(shí)施例二 在本發(fā)明實(shí)施例中，激發(fā)光應(yīng)當(dāng)能夠使熒光標(biāo)記物實(shí)現(xiàn)稀疏激發(fā)，其波長(zhǎng)在熒光 標(biāo)記物的激發(fā)譜中激發(fā)較強(qiáng)的譜段選取。激發(fā)光的光源可選擇單色性較好的激光光源。實(shí)施例三在本發(fā)明實(shí)施例中，片狀激發(fā)光束可以通過(guò)下述方法獲取由光源產(chǎn)生的激發(fā)光經(jīng)過(guò)準(zhǔn)直擴(kuò)束后，通過(guò)片狀光束獲取元件形成片狀光束；然后經(jīng)擴(kuò)展焦深元件擴(kuò)大所述片 狀光束的焦深，大焦深的片狀光束通過(guò)照明物鏡，其厚度被大幅度減小，使得該光束在焦深 范圍內(nèi)近似為超薄片狀的平行光束。作為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，片狀激發(fā)光束的焦深的數(shù)量級(jí)高于被作用樣品層在激 發(fā)光路方向上的徑向長(zhǎng)度的數(shù)量級(jí)，片狀激發(fā)光束的厚度低于1微米。實(shí)施例四在本發(fā)明實(shí)施例中，光源發(fā)出的激發(fā)光在進(jìn)行準(zhǔn)直擴(kuò)束之前，可先經(jīng)過(guò)反射鏡與 掃描反射鏡反射，以便調(diào)整激發(fā)光路與探測(cè)光路垂直。實(shí)施例五在本發(fā)明實(shí)施例中，可通過(guò)下述步驟探測(cè)被作用樣品層內(nèi)熒光標(biāo)記物發(fā)射的熒 光通過(guò)探測(cè)物鏡接收樣品發(fā)出的熒光，并將熒光以平行光束輸出；對(duì)平行光束進(jìn)行濾波 以濾除激發(fā)光；然后，改變熒光的光程差，該光程差具體指熒光在與其傳導(dǎo)方向相垂直的二 維方向(XY軸向)上的光程差；最后，熒光經(jīng)成像裝置成像在探測(cè)裝置上。根據(jù)探測(cè)裝置探測(cè)到的熒光強(qiáng)度信號(hào)對(duì)熒光標(biāo)記物進(jìn)行橫向及軸向定位，確定熒 光標(biāo)記物的橫向和軸向位置。在本發(fā)明實(shí)施例中，當(dāng)被作用熒光標(biāo)記物處于探測(cè)物鏡焦平面時(shí)，其發(fā)出的熒光 成像在探測(cè)裝置上的光斑與普通顯微鏡一樣，是一個(gè)圓形；當(dāng)被作用熒光標(biāo)記物不在焦平 面時(shí)，其發(fā)出的熒光成像在探測(cè)裝置上的點(diǎn)擴(kuò)散光斑會(huì)呈現(xiàn)橢圓形狀，其橢圓長(zhǎng)軸的指向 和長(zhǎng)度決定了熒光標(biāo)記物的Z軸離焦量的大小與正負(fù)，其中，正負(fù)代表熒光標(biāo)記物在探測(cè) 物鏡焦平面的上方或下方，大小代表熒光標(biāo)記物離探測(cè)物鏡焦平面的距離，從而可以確定 熒光標(biāo)記物在Z軸的位置。實(shí)施例六在本發(fā)明實(shí)施例中，可通過(guò)雙焦平面差動(dòng)探測(cè)方法獲得熒光標(biāo)記物的軸向位置， 以進(jìn)一步提高軸向定位精度。圖2示出了本發(fā)明第六實(shí)施例提供的雙焦平面差動(dòng)探測(cè)方法的實(shí)現(xiàn)流程圖，詳述 如下通過(guò)下述步驟探測(cè)被作用樣品層內(nèi)熒光標(biāo)記物發(fā)射的熒光在步驟S201中，接收樣品發(fā)出的熒光，并將其轉(zhuǎn)換為平行光束輸出；在步驟S202中，對(duì)平行光束進(jìn)行濾波；在步驟S203中，將平行光束分為兩路，即第一熒光光束和第二熒光光束；在步驟S204中，第一熒光光束通過(guò)第一成像透鏡成像在第一探測(cè)裝置上，第二熒 光光束通過(guò)第二成像透鏡成像在第二探測(cè)裝置上；其中，第一探測(cè)裝置位于第一成像透鏡像焦平面的前方第一距離處，第二探測(cè)裝 置位于第二成像透鏡像焦平面的后方第二距離處；第一距離和第二距離相等，第一成像透 鏡和第二成像透鏡的焦距相等。通過(guò)下述步驟對(duì)熒光標(biāo)記物進(jìn)行軸向定位，獲取其軸向位置在步驟S205中，將第一探測(cè)裝置和第二探測(cè)裝置探測(cè)到的熒光強(qiáng)度信號(hào)差動(dòng)相 減，根據(jù)相減后得到的探測(cè)信號(hào)確定熒光標(biāo)記物的軸向位置。雙焦平面差動(dòng)探測(cè)方法的原理如下所述當(dāng)物面與系統(tǒng)探測(cè)物鏡的焦平面重合時(shí)，由于兩個(gè)探測(cè)裝置分別位于相應(yīng)成像透鏡的像焦平面前后相等距離處，因此，兩個(gè)探測(cè) 裝置上的單分子彌散光斑大小相等，光強(qiáng)相等，輸出的信號(hào)之差為零。當(dāng)物面偏離探測(cè)物鏡 的焦平面一點(diǎn)位移時(shí)，兩探測(cè)裝置上的單分子光斑大小不再相等，輸出的熒光信號(hào)也不同。 根據(jù)兩探測(cè)裝置上每個(gè)單分子橫向質(zhì)心位置處的熒光強(qiáng)度信號(hào)差值的大小與正負(fù)，便可判 斷單分子軸向離焦量的大小與正負(fù)。因此，可使軸向“焦前”、“焦后”偏移放置的兩個(gè)探測(cè) 裝置探測(cè)到的單分子熒光強(qiáng)度信號(hào)差動(dòng)相減，根據(jù)差動(dòng)相減后得到的探測(cè)信號(hào)來(lái)定位分子 的軸向位置，改善軸向定位精度。其中，探測(cè)裝置與相應(yīng)成像透鏡像焦平面之間的距離主要 由探測(cè)物鏡的數(shù)值孔徑和橫向放大倍率決定。在本發(fā)明實(shí)施例中，雙焦平面差動(dòng)探測(cè)方法可實(shí)現(xiàn)10-20nm的軸向定位精度，比 傳統(tǒng)的軸向定位方法提高了 20% -35%。實(shí)施例七在本發(fā)明實(shí)施例中，可通過(guò)二維質(zhì)心定位方法進(jìn)行橫向定位，獲得熒光標(biāo)記物的 二維位置。實(shí)施例八在本發(fā)明實(shí)施例中，軸向掃描的移動(dòng)步長(zhǎng)與作用在樣品上的片狀激發(fā)光束的厚度 相等，確保軸向掃描結(jié)束后，所有軸向上的熒光標(biāo)記物均受到一致的激活次數(shù)。實(shí)施例九在本發(fā)明實(shí)施例中，熒光標(biāo)記物為具有開(kāi)關(guān)效應(yīng)的熒光蛋白分子、熒光染料分子 或熒光量子點(diǎn)。實(shí)施例十圖3示出了本發(fā)明第十實(shí)施例提供的三維熒光納米顯微成像系統(tǒng)的成像原理，詳 述如下光源1產(chǎn)生激發(fā)光；光路調(diào)整裝置2接收激發(fā)光并將其轉(zhuǎn)換為片狀激發(fā)光束；微 調(diào)樣品臺(tái)3位于光路調(diào)整裝置2的輸出光路上，使片狀激發(fā)光束作用在樣品上，樣品內(nèi)的熒 光標(biāo)記物接受片狀激發(fā)光束的作用后發(fā)射熒光；探測(cè)光路裝置4接收熒光，并將其傳導(dǎo)至 探測(cè)裝置5，根據(jù)探測(cè)裝置5探測(cè)的熒光強(qiáng)度信號(hào)確定被作用樣品層內(nèi)熒光標(biāo)記物的橫向 及軸向位置，進(jìn)而獲得被作用樣品層的三維納米分辨圖像。微調(diào)樣品臺(tái)3可軸向移動(dòng)樣品， 通過(guò)獲取不同樣品層的三維納米分辨圖像，可實(shí)現(xiàn)完整樣品的三維納米顯微成像。實(shí)施例H圖4示出了本發(fā)明第十一實(shí)施例提供的三維熒光納米顯微成像系統(tǒng)，為了便于說(shuō) 明，僅示出了與本發(fā)明實(shí)施例相關(guān)的部分。該系統(tǒng)用于完整厚樣品的 精度三維顯微成像。其中光路調(diào)整裝置2包括準(zhǔn)直 擴(kuò)束元件23，在準(zhǔn)直擴(kuò)束元件23的輸出光路上依次設(shè)置片狀光束獲取元件24、擴(kuò)展焦深元 件25及照明物鏡26。微調(diào)樣品臺(tái)3包括軸向平移臺(tái)31和樣品池32。探測(cè)光路裝置4包括探測(cè)物鏡41 ；濾光片42，置于探測(cè)物鏡41的輸出光路上； 柱面透鏡43，置于濾光片42的輸出光路上；成像透鏡44，置于柱面透鏡43的輸出光路上。探測(cè)裝置5包括探測(cè)器51，置于成像透鏡44的像焦平面處。其中，光源1產(chǎn)生的激發(fā)光通過(guò)準(zhǔn)直擴(kuò)束元件23變?yōu)闇?zhǔn)直寬光束，準(zhǔn)直寬光束經(jīng)過(guò)片狀光束獲取元件24形成片狀光束；擴(kuò)展焦深元件25擴(kuò)大片狀光束的焦深，使焦深的數(shù) 量級(jí)高于被作用樣品層在激發(fā)光路方向上的徑向長(zhǎng)度的數(shù)量級(jí)；大焦深的片狀光束經(jīng)照明 物鏡26后形成超薄片狀光束，并作用到樣品池32內(nèi)的樣品上，作用在樣品上的片狀激發(fā)光 束的厚度低于1微米。樣品內(nèi)分布的熒光標(biāo)記物受到超薄片狀光束的作用后發(fā)射熒光，探測(cè)物鏡41收 集熒光，并將其轉(zhuǎn)換為平行光束輸出，平行熒光光束通過(guò)濾光片42后濾除激發(fā)光，然后，經(jīng) 過(guò)柱面透鏡43改變其光程差，該光程差具體指熒光在與其傳導(dǎo)方向相垂直的二維方向(XY 軸向)上的光程差；再通過(guò)成像透鏡44成像在探測(cè)器51上。根據(jù)探測(cè)器51探測(cè)的熒光強(qiáng) 度信號(hào)即可確定被作用樣品層內(nèi)熒光標(biāo)記物的橫向及軸向位置，獲得該樣品層的三維納米 分辨圖像。軸向平移臺(tái)31可軸向移動(dòng)樣品，使片狀激發(fā)光束作用在不同的樣品薄層上，其 軸向移動(dòng)步長(zhǎng)與作用在樣品上的光束厚度相等，實(shí)現(xiàn)完整樣品的軸向掃描，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)完整 樣品的三維熒光納米顯微成像。實(shí)施例十二 圖5示出了本發(fā)明第十二實(shí)施例提供的三維熒光納米顯微成像系統(tǒng)，下面僅對(duì)與 本發(fā)明實(shí)施例相關(guān)的部分作詳細(xì)說(shuō)明。在本發(fā)明實(shí)施例中，所述光路調(diào)整裝置2還可進(jìn)一步包括反射鏡21和掃描反射鏡 22，依次置于光源1和準(zhǔn)直擴(kuò)束元件23之間，且掃描反射鏡22置于照明物鏡26后焦面的 共軛面上，便于調(diào)整激發(fā)光路與探測(cè)光路垂直。實(shí)施例十三在本發(fā)明實(shí)施例中，對(duì)探測(cè)光路裝置4和探測(cè)裝置5作進(jìn)一步改進(jìn)，即將熒光光束 分為兩路分別探測(cè)，可使該系統(tǒng)的軸向定位精度更高。圖6示出了本發(fā)明第十三實(shí)施例提供的三維熒光納米顯微成像系統(tǒng)，下面僅對(duì)與 本發(fā)明實(shí)施例相關(guān)的部分作詳細(xì)說(shuō)明。其中，探測(cè)光路裝置4包括探測(cè)物鏡41，用于接收熒光，并將其調(diào)整為平行光束 輸出；濾光片42，置于探測(cè)物鏡41的輸出光路上；分束鏡45，置于濾光片42的輸出光路上， 用于將熒光分為兩路，即反射熒光和透射熒光；第一成像透鏡46，置于透射熒光的光路上； 第二成像透鏡47，置于反射熒光的光路上；第一成像透鏡46與第二成像透鏡47的焦距相 等；探測(cè)裝置5包括第一探測(cè)器52，置于第一成像透鏡46的像焦平面之前第一距離 處；第二探測(cè)器53，置于第二成像透鏡47的像焦平面之后第二距離處；第一距離與第二距 離相等。所述距離主要由探測(cè)物鏡41的數(shù)值孔徑和橫向放大倍率決定。在本發(fā)明實(shí)施例中，探測(cè)物鏡41收集熒光，并以平行光束輸出，平行熒光光束經(jīng) 濾光片42濾除激發(fā)光，然后被分束鏡45分為透射熒光和反射熒光，透射熒光經(jīng)第一成像透 鏡46成像在第一探測(cè)器52上；反射熒光經(jīng)第二成像透鏡47成像在第二探測(cè)器53上，為標(biāo) 記物的橫向及軸向定位提供源圖像。本發(fā)明實(shí)施例提供的成像系統(tǒng)可使標(biāo)記分子的軸向定位精度得到進(jìn)一步提高。實(shí)施例十四在本發(fā)明實(shí)施例中，片狀光束獲取元件24可選用柱面透鏡。
實(shí)施例十五在本發(fā)明實(shí)施例中，擴(kuò)展焦深元件25可選用圓錐透鏡、軸錐透鏡、相位型光瞳濾 波器或空間光調(diào)制器。實(shí)施例十六在本發(fā)明實(shí)施例中，軸向平移臺(tái)31可選用具有軸向精密移動(dòng)功能的壓電陶瓷樣 品臺(tái)。實(shí)施例十七在本發(fā)明實(shí)施例中，照明物鏡26可選用復(fù)消色差物鏡。實(shí)施例十八在本發(fā)明實(shí)施例中，探測(cè)器51、第一探測(cè)器52和第二探測(cè)器53可選用電子倍增探 測(cè)器。本發(fā)明實(shí)施例用片狀激發(fā)光束作用于樣品的一薄層，實(shí)現(xiàn)了厚樣品的軸向選擇性 激發(fā)，提高了熒光標(biāo)記物的橫向及軸向定位精度；并且，采用雙焦平面差動(dòng)探測(cè)方法進(jìn)行軸 向定位，進(jìn)一步提高了軸向定位精度；避免了處于非探測(cè)層的熒光標(biāo)記物的無(wú)效激發(fā)以及 可能的光漂白，降低了單次成像中無(wú)效成像的熒光標(biāo)記物數(shù)量，提高了成像效率；通過(guò)軸向 掃描獲得不同深度樣品層的三維納米分辨圖像，最終實(shí)現(xiàn)厚樣品的高精度三維納米顯微成 像，使得厚樣品的觀測(cè)更加容易。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
10
權(quán)利要求
一種三維熒光納米顯微成像方法，其特征在于，所述方法包括下述步驟產(chǎn)生激發(fā)光；將所述激發(fā)光轉(zhuǎn)換為片狀激發(fā)光束；將所述片狀激發(fā)光束作用于樣品；探測(cè)被作用樣品層內(nèi)熒光標(biāo)記物發(fā)射的熒光；橫向定位，獲取熒光標(biāo)記物的二維位置；軸向定位，獲取熒光標(biāo)記物的軸向位置；三維重構(gòu)，結(jié)合所述的二維位置和軸向位置獲取被作用樣品層的三維納米分辨圖像；軸向掃描，獲取不同樣品層的三維納米分辨圖像；獲得完整樣品的三維納米分辨圖像。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述將所述激發(fā)光轉(zhuǎn)換為片狀激發(fā)光束的 具體步驟為對(duì)所述激發(fā)光進(jìn)行準(zhǔn)直擴(kuò)束； 將所述準(zhǔn)直擴(kuò)束后的激發(fā)光轉(zhuǎn)換成片狀光束； 擴(kuò)展所述片狀光束的焦深； 進(jìn)一步減小所述片狀光束的厚度。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述片狀激發(fā)光束的焦深的數(shù)量級(jí)高于被 作用樣品層在激發(fā)光路方向上的徑向長(zhǎng)度的數(shù)量級(jí)；所述片狀激發(fā)光束的厚度低于1微 米。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述探測(cè)被作用樣品層內(nèi)熒光標(biāo)記物發(fā)射 的熒光的具體步驟為接收所述樣品發(fā)射的熒光，并將其轉(zhuǎn)換為平行熒光光束；對(duì)所述平行熒光光束進(jìn)行濾波；改變所述經(jīng)過(guò)濾波后的熒光的光程差；將所述經(jīng)過(guò)改變光程差的熒光成像在探測(cè)裝置上；所述軸向定位，獲得熒光標(biāo)記物的軸向位置的具體步驟為根據(jù)所述探測(cè)裝置探測(cè)到的熒光強(qiáng)度信號(hào)確定熒光標(biāo)記物的軸向位置。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述探測(cè)被作用樣品層內(nèi)熒光標(biāo)記物發(fā)射 的熒光的具體步驟為接收所述樣品發(fā)射的熒光，并將其轉(zhuǎn)換為平行熒光光束； 對(duì)所述平行熒光光束進(jìn)行濾波；將經(jīng)過(guò)濾波后的平行熒光光束分為第一熒光光束和第二熒光光束； 將第一熒光光束通過(guò)第一成像透鏡成像在第一探測(cè)裝置上，將第二熒光光束通過(guò)第二 成像透鏡成像在第二探測(cè)裝置上；所述第一探測(cè)裝置位于第一成像透鏡像焦平面的前方第一距離處，所述第二探測(cè)裝置 位于第二成像透鏡像焦平面的后方第二距離處；所述第一距離和第二距離相等，所述第一 成像透鏡和第二成像透鏡的焦距相等；所述軸向定位，獲得熒光標(biāo)記物的軸向位置的具體步驟為將所述第一探測(cè)裝置和第二探測(cè)裝置探測(cè)到的熒光強(qiáng)度信號(hào)差動(dòng)相減，根據(jù)相減后得到的探測(cè)信號(hào)確定熒光標(biāo)記物的軸向位置。
6.一種三維熒光納米顯微成像系統(tǒng)，其特征在于，所述系統(tǒng)包括 光源，用于產(chǎn)生激發(fā)光；光路調(diào)整裝置，置于所述光源的輸出光路山，用于將所述激發(fā)光轉(zhuǎn)換成片狀激發(fā)光束， 并將所述片狀激發(fā)光束作用到樣品上；微調(diào)樣品臺(tái)，置于所述光路調(diào)整裝置的輸出光路上，用于放置并軸向移動(dòng)樣品，所述樣 品接受所述片狀激發(fā)光束的作用后發(fā)射熒光；探測(cè)光路裝置，置于所述樣品發(fā)射的熒光的光路上，用于接收并傳導(dǎo)熒光； 探測(cè)裝置，置于所述探測(cè)光路裝置的輸出光路上，用于探測(cè)熒光。
7.如權(quán)利要求6所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述光路調(diào)整裝置包括準(zhǔn)直擴(kuò)束元件，置于所述光源的輸出光路上，用于將所述光源發(fā)出的激發(fā)光準(zhǔn)直擴(kuò)束 后輸出；片狀光束獲取元件，置于所述準(zhǔn)直擴(kuò)束元件的輸出光路上，用于將所述激發(fā)光轉(zhuǎn)換為 片狀光束；擴(kuò)展焦深元件，置于所述片狀光束獲取元件的輸出光路上，用于擴(kuò)大所述片狀光束的 焦深；照明物鏡，置于所述擴(kuò)展焦深元件的輸出光路上，用于減小所述片狀光束的厚度，并將 其作用到所述樣品上。
8.如權(quán)利要求6所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述探測(cè)光路裝置包括 探測(cè)物鏡，用于接收所述樣品發(fā)射的熒光，并將熒光以平行光束輸出； 濾光片，置于所述探測(cè)物鏡的輸出光路上；柱面透鏡，置于所述濾光片的輸出光路上；成像透鏡，置于所述柱面透鏡的輸出光路上；所述探測(cè)裝置包括探測(cè)器，置于所述成像透鏡的像焦平面處。
9.如權(quán)利要求6所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述探測(cè)光路裝置包括 探測(cè)物鏡，用于接收所述樣品發(fā)射的熒光，并將熒光以平行光束輸出； 濾光片，置于所述探測(cè)物鏡的輸出光路上；分束鏡，置于所述濾光片的輸出光路上，用于將熒光分為反射熒光與透射熒光； 第一成像透鏡，置于透射熒光的光路上； 第二成像透鏡，置于反射熒光的光路上； 所述第一成像透鏡與第二成像透鏡的焦距相等； 所述探測(cè)裝置包括第一探測(cè)器，置于所述第一成像透鏡像焦平面的前方第一距離處； 第二探測(cè)器，置于所述第二成像透鏡像焦平面的后方第二距離處； 所述第一距離與第二距離相等。
10.一種包含權(quán)利要求6至9任一權(quán)利要求的三維熒光納米顯微成像系統(tǒng)的成像設(shè)備。
全文摘要
本發(fā)明適用于顯微成像領(lǐng)域，提供了一種三維熒光納米顯微成像方法、系統(tǒng)及成像設(shè)備，所述方法包括下述步驟產(chǎn)生激發(fā)光；將所述激發(fā)光轉(zhuǎn)換為片狀激發(fā)光束；將所述片狀激發(fā)光束作用于樣品；探測(cè)被作用樣品層內(nèi)熒光標(biāo)記物發(fā)射的熒光；橫向定位，獲取熒光標(biāo)記物的二維位置；軸向定位，獲取熒光標(biāo)記物的軸向位置；三維重構(gòu)，結(jié)合所述的二維位置和軸向位置獲取被作用樣品層的三維納米分辨圖像；軸向掃描，獲取不同樣品層的三維納米分辨圖像；獲得完整樣品的三維納米分辨圖像。本發(fā)明以片狀光束作為激發(fā)光，結(jié)合軸向掃描，實(shí)現(xiàn)了高精度的三維納米顯微成像，適用于生物領(lǐng)域細(xì)胞等厚樣品的三維顯微成像，解決了厚樣品內(nèi)分子定位精度低，樣品觀測(cè)難的問(wèn)題。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101963582SQ20101027973
公開(kāi)日2011年2月2日 申請(qǐng)日期2010年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月13日
發(fā)明者于斌, 屈軍樂(lè), 牛憨笨, 陳丹妮 申請(qǐng)人:深圳大學(xué)