專利名稱：用于檢測(cè)生育相關(guān)人睪丸和附睪表達(dá)305種精子定位蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測(cè)領(lǐng)域，更具體地涉及檢測(cè)生育相關(guān)的、人睪丸和附睪表達(dá)的305 種精子定位蛋白的方法，包括用熒光、酶標(biāo)、銀標(biāo)、生物素、同位素、芯片等標(biāo)記技術(shù)定性和定量地檢測(cè)精子定位蛋白的方法。本發(fā)明還涉及用于檢測(cè)所述精子定位蛋白的蛋白質(zhì)芯片及其應(yīng)用
背景技術(shù)：
男性不育是引起不孕癥的重要因素之一。據(jù)2000年世界衛(wèi)生組織(WHO)報(bào)道全球不育癥約占15%，男方因素約占一半；在歐州一些國(guó)家不育癥高達(dá)30%。導(dǎo)致男子不育的原因非常復(fù)雜廣泛，涉及生殖系統(tǒng)解剖結(jié)構(gòu)和功能、激素調(diào)節(jié)、遺傳物質(zhì)、感染免疫等諸多因素的異常和障礙?，F(xiàn)階段對(duì)這些因素的研究大多停留在單基因水平和基因組水平。然而，機(jī)體真正生理機(jī)能的執(zhí)行者是蛋白質(zhì)，所以上述分子遺傳學(xué)研究并不能反映基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控、蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化以及蛋白質(zhì)的翻譯后修飾等信息，并且細(xì)胞內(nèi)mRNA水平和蛋白質(zhì)的表達(dá)豐度并不完全一致，因此從蛋白質(zhì)水平對(duì)男性不育機(jī)制進(jìn)行研究顯得特別重要。研究表明，男性不育癥不是一種獨(dú)立的疾病，而是多種疾病或多因素綜合作用的結(jié)果。雖然導(dǎo)致男子不育的原因非常復(fù)雜廣泛，然而目前常規(guī)精液檢測(cè)手段卻非常局限，導(dǎo)致人們無法從整體上系統(tǒng)地分析精漿中的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。綜上所述，迄今為止，人們對(duì)人類精子成熟引起的男性不育相關(guān)蛋白的了解尚不深入，更缺乏此類蛋白檢測(cè)方法，因此迫切需要開發(fā)出檢測(cè)男性生育相關(guān)蛋白的有效方法禾口廣品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種有效檢測(cè)男性生育相關(guān)蛋白的方法以及產(chǎn)品。在本發(fā)明的第一方面，提供了一組與人精子成熟、男性生育相關(guān)蛋白的捕獲試劑的用途，其中所述男性生育相關(guān)蛋白是列于表2且不列于表1中的蛋白，其中，所述的捕獲試劑用于制備檢測(cè)男性個(gè)體的男性生育相關(guān)蛋白表達(dá)情況的芯片或試劑盒。在另一優(yōu)選例中，所述的男性生育相關(guān)蛋白包括至少5、10、15、20、25、30、40、50、 60、70、80、90、100、150、200、250、300 種列于表 2 中蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述是試劑是蛋白質(zhì)芯片。在另一優(yōu)選例中，所述的檢測(cè)是定性或定量檢測(cè)。在另一優(yōu)選例中，所述的檢測(cè)是對(duì)男性個(gè)體的精漿樣品進(jìn)行檢測(cè)。在另一優(yōu)選例中，所述的檢測(cè)是對(duì)男性個(gè)體的精子樣品進(jìn)行檢測(cè)。在另一優(yōu)選例中，所述的捕獲試劑是抗體，包括單克隆抗體或多克隆抗體抗體。在另一優(yōu)選例中，所述的抗體具有一種或多種可檢測(cè)的標(biāo)記物。
在另一優(yōu)選例中，所述的標(biāo)記物主要為免疫熒光、酶標(biāo)、銀標(biāo)、生物素、同位素等。在另一優(yōu)選例中，所述的男性個(gè)體是人，尤其是男性不育或婚后1年未育女性的配偶。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種可用于檢測(cè)睪丸或附睪表達(dá)的精子結(jié)合蛋白的芯片，所述的芯片包括固相載體以及位于所述固相載體上的男性生育相關(guān)蛋白的檢測(cè)點(diǎn)，其中所述男性生育相關(guān)蛋白是列于表2且不列于表1中的蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的檢測(cè)點(diǎn)固定有所述的男性生育相關(guān)蛋白的捕獲試劑(如抗體)。在另一優(yōu)選例中，男性生育相關(guān)蛋白包括至少5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、 80、90、100、150、200、250、300 種列于表 2 中蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的固相載體選自下組玻璃片、塑料片、硝酸纖維膜、聚偏氟乙烯膜、微球等載體。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種使用上述芯片鑒別男性不育相關(guān)蛋白的方法， 其中所述男性生育相關(guān)蛋白是列于表2且不列于表1中的蛋白，所述鑒別包括以下步驟a)將來自待檢測(cè)對(duì)象的精漿樣品與包含針對(duì)男性不育相關(guān)蛋白的捕獲試劑的芯片接觸；b)從樣品中捕獲男性不育相關(guān)蛋白并產(chǎn)生第一個(gè)信號(hào)；C)將第一序號(hào)與標(biāo)準(zhǔn)品(包括陽性對(duì)照和陰性對(duì)照)的信號(hào)進(jìn)行比較，獲得定性或定量地確定所述男性不育相關(guān)蛋白的表達(dá)量；d)根據(jù)表達(dá)量確定導(dǎo)致男性不育的候選蛋白。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再
--累述。


圖1.附睪和睪丸蛋白的二維凝膠電泳分離QD)和質(zhì)譜鑒定。其中A.附睪組織蛋白的2D參考圖譜；B.附睪管腔液蛋白的2D參考圖譜；C. HEL-S-128m質(zhì)譜鑒定結(jié)果。圖2.顯示了用pET32b(+)載體構(gòu)建的重組表達(dá)載體模式圖。圖3.顯示了 HEL-S-15*，HEL-S_65p，HEL-S_6a蛋白精子免疫熒光定位分別定位在精子全身，尾部和頂體。圖4.顯示了 HEL-S-15*蛋白具有明顯的抑菌活性。圖5.顯示了 HEL-S_15#蛋白的抗菌活性。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次發(fā)現(xiàn)了在人附睪、睪丸中表達(dá)、與男性生育相關(guān)的多種特異性蛋白，從而確立與不育發(fā)生相關(guān)的重要蛋白質(zhì)群。在此基礎(chǔ)上開發(fā)了檢測(cè)男性生育相關(guān)蛋白的方法和芯片的檢測(cè)工具，從而完成了本發(fā)明。利用本發(fā)明所揭示的男性不育發(fā)生相關(guān)的蛋白質(zhì)群，有助于人們揭示關(guān)鍵蛋白的分子作用機(jī)制和相互作用關(guān)系，從而提供了尋找男性不育原因的創(chuàng)新途徑。男性生育相關(guān)蛋白如本文所用，術(shù)語“男性生育相關(guān)蛋白”指在男性哺乳動(dòng)物(尤其人)的睪丸和/ 或附睪中表達(dá)的，與男性生育相關(guān)的蛋白。一般所述的男性生育相關(guān)蛋白包括保護(hù)精子的蛋白、與精子運(yùn)動(dòng)能力有關(guān)的蛋白、與精子穿卵有關(guān)的蛋白。如本文所用，“哺乳動(dòng)物”指胎生并籍由乳腺哺育后代的動(dòng)物種類，屬于脊椎動(dòng)物的一種代表性的哺乳動(dòng)物包括(但并不限于)，例如人、猴、羊、牛、兔、馬、小鼠、大鼠等，特別地優(yōu)選人?！愄貏e適用于本發(fā)明的男性生育相關(guān)蛋白是睪丸和/或附睪的分泌蛋白，這些分泌蛋白有些存在于精漿中，有些定位在精子上。本發(fā)明的研究提示，這些男性生育相關(guān)蛋白與精子的成熟等過程密切有關(guān)，對(duì)于精子的獲得正常的功能是至關(guān)重要的。如本文所用，術(shù)語“本發(fā)明蛋白”、“本發(fā)明的生育相關(guān)蛋白”、或“本發(fā)明的男性生育相關(guān)蛋白”可互換使用，都指本發(fā)明首次揭示其與男性生育相關(guān)性的睪丸和/或附睪中表達(dá)的在精子上有定位的蛋白。代表性的本發(fā)明蛋白如表2所示。表1已知的在精子上有明確定位的男性生育相關(guān)蛋白
權(quán)利要求
1.一組與人精子成熟、男性生育相關(guān)蛋白的捕獲試劑的用途，其中所述男性生育相關(guān)蛋白是列于表2且不列于表1中的蛋白，其特征在于，所述的捕獲試劑用于制備檢測(cè)男性個(gè)體的男性生育相關(guān)蛋白表達(dá)情況的芯片或試劑盒。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的男性生育相關(guān)蛋白包括至少5、10、 15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300 種列于表 2 中蛋白。
3.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的捕獲試劑是抗體，包括單克隆抗體或多克隆抗體。
4.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述是試劑是蛋白質(zhì)芯片。
5.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的檢測(cè)是定性或定量檢測(cè)。
6.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的檢測(cè)是對(duì)男性個(gè)體的精漿樣品中精子定位蛋白進(jìn)行定性或定量檢測(cè)。
7.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的檢測(cè)是對(duì)男性個(gè)體的精子上的定位蛋白進(jìn)行定性或定量檢測(cè)。
8.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的男性個(gè)體是人，尤其是男性不育或婚后1年未育女性的配偶。
9.一種可用于檢測(cè)睪丸或附睪表達(dá)的精子定位蛋白的芯片，其特征在于，所述的芯片包括固相載體以及位于所述固相載體上的男性生育相關(guān)蛋白的檢測(cè)點(diǎn)，其中所述男性生育相關(guān)蛋白是列于表2且不列于表1中的蛋白。
10.一種使用權(quán)利要求9所述的芯片鑒別男性不育相關(guān)蛋白的方法，其中所述男性生育相關(guān)蛋白是列于表2且不列于表1中的蛋白，所述鑒別包括以下步驟a)將來自待檢測(cè)對(duì)象的精漿樣品與包含針對(duì)男性不育相關(guān)蛋白的捕獲試劑的芯片接觸；b)從樣品中捕獲男性不育相關(guān)蛋白并產(chǎn)生第一個(gè)信號(hào)；c)將第一序號(hào)與標(biāo)準(zhǔn)品(包括陽性對(duì)照和陰性對(duì)照)的信號(hào)進(jìn)行比較，獲得定性或定量地確定所述男性不育相關(guān)蛋白的表達(dá)量；d)根據(jù)表達(dá)量確定導(dǎo)致男性不育的候選蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)人生育相關(guān)的人睪丸和附睪表達(dá)305種精子定位蛋白方法。更具體地，本發(fā)明提供了人精子成熟能夠引起不育相關(guān)的重要蛋白質(zhì)群，還提供了檢測(cè)人精子定位蛋白在精子上和精漿中的定性與定量方法，為男性不育原因的明確診斷提供新途徑。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102262159SQ20101019537
公開日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2010年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月27日
發(fā)明者李建遠(yuǎn) 申請(qǐng)人:李建遠(yuǎn)