專利名稱：膠體金試紙條及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于預(yù)防獸醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，具體是涉及一種一步檢測(cè)雞新城疫和傳染性法 式囊病毒的膠體金試紙條及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
雞新城疫(NewcastleDisease，ND) 一直是給養(yǎng)雞業(yè)帶來重大危害的疫病，被國(guó) 際獸醫(yī)局(OIE)列為A類傳染病，該病對(duì)世界貿(mào)易有較大的商業(yè)影響。傳染性法氏囊病 (IBD)是一種急性高度接觸性傳染病，該病對(duì)雛雞或中雛易感性最強(qiáng)，感染率可達(dá)100%，死 亡率比較高，雞群一經(jīng)感染，就引起大面積死亡，給養(yǎng)殖戶造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。嚴(yán)重影響?zhàn)B 雞業(yè)的發(fā)展。目前，雞病的爆發(fā)已發(fā)生了一些新的變化，以往那種單純發(fā)生某一種疾病的 情況已不多見，取而代之的是幾種疫病混合感染、病毒性疫病、隱性慢性疾病日見增多，呼 吸道病的發(fā)病率超過了腸道病.這些都使雞病日趨復(fù)雜化，給雞病診斷與防治帶來一定的 難度，特別是雞新城疫和傳染性法式囊，病雞的臨床癥狀有很大的差異，不同宿主對(duì)感染后 的反應(yīng)也不一樣，這使診斷更為復(fù)雜和困難，單一臨床和病變不能作為診斷的依據(jù)。對(duì)禽病毒的檢測(cè)方法，主要有病毒分離、血清學(xué)診斷以及分子生物學(xué)方法，但病毒 分離時(shí)間長(zhǎng)，要求條件高，分離率低，而采集患者急性期與恢復(fù)期雙份血清進(jìn)行抗體測(cè)定來 確認(rèn)，又不能及時(shí)進(jìn)行診斷，因此，使這兩種方法在使用中受到很大的限制，而免疫金標(biāo)法 (ImmunochromatographyAssay)是九十年代初發(fā)展起來的，因其快速、操作簡(jiǎn)便、試劑穩(wěn)定、 可室溫儲(chǔ)運(yùn)、不易污染的特點(diǎn)得到廣泛的應(yīng)用。它是免疫親和技術(shù)、印記技術(shù)、免疫標(biāo)記技 術(shù)和層析技術(shù)的組合。將包被抗體、膠體金標(biāo)記抗體固相化，與樣本吸附材料等組合在一 起，制備出免疫層析診斷試條，使用時(shí)只需要把該試條下插入樣品溶液，數(shù)分鐘就可以判斷 結(jié)果。與免疫滲濾法比較，穩(wěn)定性好，操作更簡(jiǎn)便、檢測(cè)更快速，且由于為干試條形式，無需 低溫保存，儲(chǔ)運(yùn)也方便，如果能將試條形式的檢測(cè)禽病毒的方法普及到地農(nóng)戶、養(yǎng)殖戶、基 層及個(gè)人手中，使其盡早發(fā)現(xiàn)疫病，能夠得到及時(shí)有效處理，以便降低經(jīng)濟(jì)損失。但是目前還沒有關(guān)于同時(shí)檢測(cè)雞新城疫和傳染性法式囊病毒的裝置或者檢測(cè)工 具。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種膠體金試紙條及其制備方法和應(yīng)用，可以解決現(xiàn)有技術(shù)存在的 不能同時(shí)檢測(cè)雞新城疫和傳染性法式囊病毒的問題。本發(fā)明的試紙條可以一步檢測(cè)雞新城 疫和傳染性法式囊病毒。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)
一種膠體金試紙條，包括底襯，所述底襯上面的中部粘帖包被膜，所述包被膜中部有一 條包被雞新城疫病毒的抗體的檢測(cè)線、一條包被雞傳染性法式囊病毒的抗體的檢測(cè)線和一 條包被抗鼠IgG抗體的控制線，所述包被膜的上面左右分別粘帖涂覆金標(biāo)抗體的玻璃纖維 膜和吸水紙，所述玻璃纖維膜上面粘貼樣品墊。
本發(fā)明的膠體金試紙條利用現(xiàn)代國(guó)際最先進(jìn)的膠體金免疫層析技術(shù)，通過在試紙 條上同時(shí)設(shè)置包被雞新城疫病毒的抗體的檢測(cè)線、包被雞傳染性法式囊病毒的抗體的檢測(cè) 線和包被抗鼠IgG抗體的控制線，能夠同步檢測(cè)雞新城疫病毒和雞傳染性法式囊病毒，為 地農(nóng)戶、養(yǎng)殖戶、基層及個(gè)人自測(cè)等提供一種同時(shí)檢測(cè)雞新城疫和傳染性法式囊病毒的試 紙條，該試紙條具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)速度快的優(yōu)點(diǎn)，且不需使用儀器設(shè)備，成本低 廉，操作簡(jiǎn)便，能廣泛應(yīng)用于地農(nóng)戶、養(yǎng)殖戶、基層及個(gè)人對(duì)于雞新城疫病毒和雞傳染性法 式囊病毒的檢測(cè)，為及時(shí)發(fā)現(xiàn)疫情，有效的進(jìn)行檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。
進(jìn)一步地，所述包被雞新城疫病毒的抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。進(jìn)一步地，所述包被雞傳染性法式囊病毒的抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。進(jìn)一步地，所述涂覆金標(biāo)抗體的玻璃纖維膜中有由膠體金顆粒標(biāo)記的抗雞新城疫 病毒和抗雞傳染性法式囊病毒的單克隆抗體。一種膠體金試紙條的制備方法，包括如下步驟
1)先制備包被膜，用包被緩沖液稀釋抗雞新城疫的單克隆抗體或多克隆抗體、抗雞傳 染性法式囊病毒的單克隆抗體或多克隆抗體以及抗鼠IgG抗體，并將稀釋后的三種抗體分 別平行地噴于硝酸纖維膜的中部上，三種抗體滲入硝酸纖維膜后分別形成雞傳染性法式囊 病毒的檢測(cè)線、雞新城疫病毒的檢測(cè)線和抗鼠IgG的控制線，制得包被膜；
2)再制備涂敷金標(biāo)抗體的玻璃纖維膜；
3)將包被膜粘貼在底襯上面的中部，在包被膜的上面左右分別粘帖涂覆金標(biāo)抗體的玻 璃纖維膜和吸水紙；
4)涂覆金標(biāo)抗體的玻璃纖維膜上面粘貼樣品墊，做成大板，切割即得膠體金試紙條。膠體金試紙條在一步檢測(cè)雞新城疫和傳染性法式囊病毒中的應(yīng)用。


圖1是本發(fā)明的膠體金試紙條的橫斷面結(jié)構(gòu)示意圖； 其中
1、底襯；2、樣品墊；3、玻璃纖維膜；4、包被膜；5、吸水紙；6、包被雞新城疫病毒的抗體 的檢測(cè)線；7、包被雞傳染性法式囊病毒的抗體的檢測(cè)線；8、包被抗鼠IgG抗體的控制線。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。如圖1所示，一種膠體金試紙條，包括底襯1，底襯1上面的中部粘帖包被膜4，包 被膜4中部有一條包被雞新城疫病毒的抗體的檢測(cè)線6、一條包被雞傳染性法式囊病毒的 抗體的檢測(cè)線7和一條包被抗鼠IgG抗體的控制線8，包被膜4的上面左右分別粘帖涂覆金 標(biāo)抗體的玻璃纖維膜3和吸水紙5，玻璃纖維膜3上面粘貼樣品墊2。本發(fā)明的試紙條可以用于一步檢測(cè)雞新城疫病毒和雞傳染性法式囊病毒。其中，包被雞新城疫病毒的抗體為單克隆抗體、多克隆抗體中的一種或兩種；包被 雞傳染性法式囊病毒的抗體為單克隆抗體、多克隆抗體中的一種或兩種。涂覆金標(biāo)抗體的玻璃纖維膜中有由膠體金顆粒標(biāo)記的抗雞新城疫病毒和抗雞傳 染性法式囊病毒的單克隆抗體。
膠體金試紙條的具體制備方法如下
新城疫病毒的單克隆抗體細(xì)胞株的制備和檢定
慢慢攪動(dòng)含有新城疫病毒的雞胚尿囊液，并加入氯化鈉，使其終濃度為0.5mol/L，再加入10% (重量百分?jǐn)?shù)，下同)的聚乙二醇6000 (PEG6000)，4°C過夜，8000r/min離心30分 鐘，收集病毒沉淀，將病毒沉淀用磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解，4°C過夜，以lOOOOr/min離心1 小時(shí)，所得沉淀即為濃縮的病毒，儲(chǔ)存在-20°C低溫冰箱中備用。從-20°C低溫冰箱取出濃縮的病毒，溶化后給BALB/C小鼠多點(diǎn)皮下注射(0. 5ml / 只)，間隔15天，共免疫3次，融合前3日，在小鼠腹腔以上述濃縮的病毒0. 25ml的抗原量進(jìn) 行攻擊。用含10% (體積百分?jǐn)?shù)，下同)小牛血清的DMEM培養(yǎng)SP2/0細(xì)胞和免疫的BALB/ C小鼠的淋巴細(xì)胞，分別按2X107和2X108比例用聚乙二醇1500 (PEG1500)融合，將融合 孔中的上清液分別加在新城疫病毒抗原包被的聚乙烯96孔扳上，用ELISA法檢測(cè)，確定細(xì) 胞陽(yáng)性孔。將檢測(cè)所得的陽(yáng)性株以有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，將亞克隆所得的單抗細(xì)胞株于 體外進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并進(jìn)行反復(fù)液氮凍存和復(fù)蘇，產(chǎn)生新城疫病毒單克隆抗體陽(yáng)性率100%， 且保持穩(wěn)定分泌抗體的能力，其ELISA效價(jià)達(dá)到1:1000以上。在無菌條件下每只小鼠腹腔 注射液體石蠟0. 5ml，一周后每只小鼠腹腔注射擴(kuò)大培養(yǎng)為0. 2ml含1_3X IO6個(gè)雜交瘤細(xì) 胞。注射細(xì)胞株7-10天后，或小鼠瀕死前一次采集腹水，-20°C下保存。采用硫酸銨沉淀 法粗提，進(jìn)而用HITraprProteinA柱純化，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢定，僅顯示單一蛋白帶。采用 NaSCN競(jìng)爭(zhēng)ELISA實(shí)驗(yàn)，測(cè)定其半數(shù)有效量(ED5tl)的下降值，來間接反映其抗體親合力的大 小。選擇其中親和力較好的細(xì)胞株，用相加ELISA法對(duì)其的抗原結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。傳染性法式囊病毒的單克隆抗體細(xì)胞株的制備和檢定
根據(jù)傳染性法式囊病毒病毒vp2序列構(gòu)建表達(dá)載體，誘導(dǎo)產(chǎn)生vp2蛋白的包涵體，破碎 純化，獲得高純度的傳染性法式囊病毒病毒vp2，儲(chǔ)存在_20°C低溫冰箱中備用。從_20°C低溫冰箱取出濃縮的病毒，溶化后給BALB/C小鼠多點(diǎn)皮下注射(0. 5ml / 只)，間隔15天，共免疫3次，融合前3日，在小鼠腹腔以上述濃縮的病毒0. 25ml的抗原量進(jìn) 行攻擊。用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)SP2/0細(xì)胞和免疫的BALB/C鼠的淋巴細(xì)胞，分別 按2X107和2X108比例用聚乙二醇1500 (PEG1500)融合，將融合孔中的上清液分別加在 雞傳染性法式囊病毒抗原包被的聚乙烯96孔扳上，用ELISA法檢測(cè)，確定細(xì)胞陽(yáng)性孔。將 檢測(cè)所得的陽(yáng)性株以有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，將亞克隆所得的單抗細(xì)胞株于體外進(jìn)行傳代 培養(yǎng)，并進(jìn)行反復(fù)液氮凍存和復(fù)蘇，產(chǎn)生雞傳染性法式囊病毒單克隆抗體陽(yáng)性率100%，且 保持穩(wěn)定分泌抗體的能力，其ELISA效價(jià)達(dá)到1:1000以上。在無菌條件下每只小鼠腹腔 注射液體石蠟0. 5ml，一周后每只小鼠腹腔注射擴(kuò)大培養(yǎng)為0. 2ml含1_3X IO6個(gè)雜交瘤細(xì) 胞。注射細(xì)胞株7-10天后，或小鼠瀕死前一次采集腹水，-20°C下保存。采用硫酸銨沉淀 法粗提，進(jìn)而用HITraprProteinA柱純化，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢定，僅顯示單一蛋白帶。采用 NaSCN競(jìng)爭(zhēng)ELISA實(shí)驗(yàn)，測(cè)定其ED5tl的下降值，來間接反映其抗體親合力的大小。選擇其中 親和力較好的細(xì)胞株，用相加ELISA法對(duì)其的抗原結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。包被膜的制備
包被緩沖液的制備將0. 05M、pH9. 6的碳酸鹽緩沖液(PBS)，用0. 22u膜過濾，置于4°C 備用，有效期為7天。緩沖液的制備的封閉將0. 01M、pH7. 0的PBS，用0. 22u膜濾過，置于4°C備用，有效期為7天。封閉工作液的配制將含2% BSA、2%脫脂奶、0. 01M、pH7. 0的PBS，用0. 22u膜濾
過，置于4°C備用，有效期為3天?？闺u新城疫病毒的檢測(cè)線6的制備調(diào)試噴膜機(jī)，噴液量為25微升/35厘米，用包 被緩沖液稀釋抗雞新城疫病毒的單克隆抗體，濃度為70ug/ml，在硝酸纖維膜中部上劃線， 室溫晾干20分鐘?？闺u傳染性法氏囊病毒檢測(cè)線7的制備調(diào)試噴膜機(jī)，噴液量為25微升/35厘米， 用包被緩沖液稀釋抗雞傳染性法氏囊病毒的單克隆抗體，濃度為70ug/ml，在硝酸纖維膜中 部上劃線，該線與抗雞新城疫病毒檢測(cè)線6平行，兩線間隔5mm，應(yīng)細(xì)致均勻，室溫晾干20分鐘?？刂凭€8的制備調(diào)試噴膜機(jī)，噴液量為25微升/35厘米，用包被緩沖液稀釋抗鼠 IgG抗體，濃度為2mg/ml，在硝酸纖維膜上劃線，該線與抗雞傳染性法氏囊病毒檢測(cè)線7平 行，兩線間隔5mm，應(yīng)細(xì)致均勻，室溫晾干20分鐘。該三線用的液體分別滲入硝酸纖維膜中， 即分別為抗雞新城疫病毒檢測(cè)線6、抗雞傳染性法氏囊病毒檢測(cè)線7和控制線8。包被膜4制備用上述封閉工作液將含有檢測(cè)線6和控制線8的硝酸纖維膜于 37°C封閉60分鐘，取出后置37°C下烘干處理兩小時(shí)，封袋備用。涂覆金標(biāo)抗體的玻璃纖維膜3的制備
氯金酸水溶液的配制將IOg氯金酸用IOOOml雙蒸水溶解，配成1 %的水溶液，置于 4°C備用，有效期為3天。檸檬酸三鈉的配置用雙蒸水溶解檸檬酸三鈉，配成的水溶液，置于4°C備用， 有效期為3天。0. IM碳酸鉀水溶液的配制將13. 8g碳酸鉀用IOOOml用雙蒸水配制成0. IM碳酸 鉀水溶液，用0. 22u膜濾過，置于4°C備用，有效期為7天。標(biāo)記洗滌液的配制將20gBSA用IOOOmlO. 01M、pH7. 0的PBS配置成2% BSA溶液，
用0. 22u膜濾過，置于4°C備用，有效期為15天。金標(biāo)抗體保存液的配置將10gBSA、5g脫脂奶粉、0. 5gNaN3和lmlTween-20在 IOOOmlO. 01M、pH7. 0的PBS中溶解，用0. 22u膜濾過，置于4°C備用，有效期為15天。膠體金的燒制用雙蒸水將氯金酸稀釋成0. 01%，置電爐煮沸，按每100毫升 0. 01 %氯金酸加入4毫升1 %檸檬酸三納，繼續(xù)煮沸，直到液體呈亮紅色即停止加熱，冷卻 至室溫后補(bǔ)足失水。外觀應(yīng)純凈，透亮，無沉淀和漂浮物。金標(biāo)抗體的制備用0. IM碳酸鉀水溶液調(diào)膠體金pH值至7. 6，按20微克抗體 /毫升膠體金加入抗新城疫和傳染性支氣管炎病毒的單克隆抗體，混勻，靜置30分鐘，以 12000rpm離心30分鐘，棄去上清液，沉淀用標(biāo)記洗滌液洗滌兩次，最后一次棄去上清液，將 沉淀用十分之一初始膠體金體積的金標(biāo)抗體保存液溶解，置于4°C備用，有效期為7天。將標(biāo)記好的膠體金均勻地鋪在玻璃纖維膜上，用每毫升溶液鋪10平方厘米，干 燥，封袋，置于4°C備用。膠體金試紙條的制作
底襯1、樣品墊2和吸水紙5是本領(lǐng)域通用的部件。將上述包被膜4、覆金標(biāo)抗體的玻 璃纖維膜3、底襯1、樣品墊2和吸水紙5依次粘貼起來，得到試紙板，最后將該試紙板切割成不同寬度的試紙條即可。 上述的膠體金試紙條在檢測(cè)雞新城疫和傳染性法式囊病毒中的應(yīng)用
本試紙條可以用來檢測(cè)發(fā)病期雞的口腔或者肛門拭子中含有的液體樣品，操作時(shí)，把 發(fā)病期雞的口腔或者肛門拭子中的液體離心分離，將所得的液體滴加在本試紙條的樣品墊 2上，出現(xiàn)的結(jié)果在試紙條的雞新城疫病毒的抗體的檢測(cè)線6、雞傳染性法式囊病毒的抗體 的檢測(cè)線7和控制線8位置上各出現(xiàn)一條紫紅色條帶時(shí)，雞新城疫和傳染性法式囊病毒均 為陽(yáng)性結(jié)果；在試紙條的雞新城疫病毒的抗體的檢測(cè)線6和控制線8位置上各出現(xiàn)一條紫 紅色條帶時(shí)，雞新城疫病毒為陽(yáng)性結(jié)果；在試紙條的雞傳染性法式囊病毒的抗體的檢測(cè)線 7和控制線8位置上各出現(xiàn)一條紫紅色條帶時(shí)，雞傳染性法式囊病毒為陽(yáng)性結(jié)果；僅試紙條 的控制線8位置上出現(xiàn)一條紫紅色條帶時(shí)，為陰性結(jié)果；在試紙條的控制線8位置上未出現(xiàn) 紫紅色條帶時(shí)為無效結(jié)果。以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非是對(duì)本發(fā)明作其它形式的限制，任 何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等 效實(shí)施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所 作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種膠體金試紙條，其特征在于包括底襯，所述底襯上面的中部粘帖包被膜，所述包被膜中部有一條包被雞新城疫病毒的抗體的檢測(cè)線、一條包被雞傳染性法式囊病毒的抗體的檢測(cè)線和一條包被抗鼠IgG抗體的控制線，所述包被膜的上面左右分別粘帖涂覆金標(biāo)抗體的玻璃纖維膜和吸水紙，所述玻璃纖維膜上面粘貼樣品墊。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠體金試紙條，其特征在于所述包被雞新城疫病毒的抗體 為單克隆抗體或多克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠體金試紙條，其特征在于所述包被雞傳染性法式囊病毒 的抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠體金試紙條，其特征在于所述涂覆金標(biāo)抗體的玻璃纖維 膜中有由膠體金顆粒標(biāo)記的抗雞新城疫病毒和抗雞傳染性法式囊病毒的單克隆抗體。
5.一種權(quán)利要求1所述的膠體金試紙條的制備方法，其特征在于包括如下步驟1)先制備包被膜，用包被緩沖液稀釋抗雞新城疫的單克隆抗體或多克隆抗體、抗雞傳 染性法式囊病毒的單克隆抗體或多克隆抗體以及抗鼠IgG抗體，并將稀釋后的三種抗體分 別平行地噴于硝酸纖維膜的中部上，三種抗體滲入硝酸纖維膜后分別形成雞傳染性法式囊 病毒的檢測(cè)線、雞新城疫病毒的檢測(cè)線和抗鼠IgG的控制線，制得包被膜；2)再制備涂敷金標(biāo)抗體的玻璃纖維膜；3)將包被膜粘貼在底襯上面的中部，在包被膜的上面左右分別粘帖涂覆金標(biāo)抗體的玻 璃纖維膜和吸水紙；4)涂覆金標(biāo)抗體的玻璃纖維膜上面粘貼樣品墊，做成大板，切割即得膠體金試紙條。
6.一種權(quán)利要求1所述的膠體金試紙條，其特征在于所述試紙條在一步檢測(cè)雞新城 疫和傳染性法式囊病毒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種膠體金試紙條及其制備方法和應(yīng)用，可以解決現(xiàn)有技術(shù)存在的不能同時(shí)檢測(cè)雞新城疫和傳染性法式囊病毒的問題。技術(shù)方案，一種膠體金試紙條，包括底襯，底襯上面的中部粘帖包被膜，包被膜中部有一條包被雞新城疫病毒的抗體的檢測(cè)線、一條包被雞傳染性法式囊病毒的抗體的檢測(cè)線和一條包被抗鼠IgG抗體的控制線，包被膜的上面左右分別粘帖涂覆金標(biāo)抗體的玻璃纖維膜和吸水紙，玻璃纖維膜上面粘貼樣品墊。本發(fā)明的試紙條可以一步檢測(cè)雞新城疫和傳染性法式囊病毒，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)速度快的優(yōu)點(diǎn)，成本低廉，操作簡(jiǎn)便，能廣泛應(yīng)用于地農(nóng)戶、養(yǎng)殖戶、基層及個(gè)人對(duì)于雞新城疫病毒和雞傳染性法式囊病毒的檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/569GK101819204SQ20101018558
公開日2010年9月1日 申請(qǐng)日期2010年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月28日
發(fā)明者于春梅, 凌紅麗, 王宏華, 王雷, 蔣貽海, 高亞東 申請(qǐng)人:青島康地恩藥業(yè)有限公司;青島寶依特生物制藥有限公司