專利名稱：半定量檢測人全血中他克莫司藥物濃度的膠體金試紙條及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
發(fā)明涉及人全血中他克莫司藥物的檢測，特別涉及一種半定量檢測人全血中他克莫司藥物濃度的膠體金試紙條。
背景技術(shù)：
他克莫司(tacrolimus)是大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑，1989年首次應(yīng)用于臨床。他 克莫司與其結(jié)合蛋白FKBP12相結(jié)合，而在細(xì)胞內(nèi)蓄積產(chǎn)生效用。FKBP12-他克莫司等復(fù)合 物會專一性地結(jié)合以及抑制鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的活性，阻斷T細(xì)胞激活過程，同時還有他克 莫司所不具備的T-細(xì)胞依賴性抗體的生成，阻斷細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，呈現(xiàn)雙重的免疫抑制作 用，其免疫抑制作用較他克莫司強(qiáng)100倍，其臨床上主要用于肝腎等器官移植后的免疫排 斥抑制治療。他克莫司的個體吸收率和清除率差別很大，且用藥劑量與血藥濃度之間缺乏 緊密的相關(guān)性，在高血濃度時有一定的毒性，主要是神經(jīng)毒性、腎毒性和糖代謝異常等。由 于其治療窗窄，給臨床治療增加了相當(dāng)?shù)碾y度，因此需要反復(fù)測定期血中濃度以調(diào)整用藥 劑量。大部分(75% 80% )的他克莫司藥物連結(jié)在紅細(xì)胞上，導(dǎo)致全血藥物濃度較血 漿藥物濃度為高，兩者不相關(guān)，全血和血漿中藥物濃度的分布與多種因素有關(guān)。藥代動力學(xué) 研究表明，他克莫司全血而非血漿濃度能夠更好的表明他克莫司的藥代動力學(xué)特征，故血 液檢測中以該藥品以全血藥物濃度為依據(jù)。目前測定全血Π(506濃度的方法主要有，受體結(jié)合法、高效液相-質(zhì)普測定法 (HPLC-MS)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、微粒子酶聯(lián)免疫測定法(MELA)以及化學(xué)發(fā)光微粒子 免疫法等。其中受體結(jié)合法主要用于藥物研究；液質(zhì)聯(lián)用是目前最準(zhǔn)確、靈敏度最高、具有 特異性的冊506濃度分析方法，最低檢測限為0. 2 μ g/L，但其穩(wěn)定性不是很好且成本較高， 需要大型設(shè)備儀器，仍主要用于科研領(lǐng)域；微粒子酶聯(lián)免疫測定法(MELA)以及化學(xué)發(fā)光微 粒子免疫法(CMIA)是目前最常用的檢測方法，這兩種方法檢測結(jié)果準(zhǔn)確，操作相對簡便， 但是試劑目前均需要進(jìn)口，價格高昂，而且必須配以昂貴的專有設(shè)備使用，因此只適用于一 些大型醫(yī)院使用。目前所用的ELISA試劑盒也依賴進(jìn)口，價格昂貴。使用過程反應(yīng)時間較 長，需要對樣品進(jìn)行酶消化、震蕩等處理，使用不是很方便。基于以上情況，目前僅有一些大型醫(yī)療機(jī)構(gòu)可以進(jìn)行他克莫司藥物濃度的檢測， 遠(yuǎn)離大城市的患者往往需要長途跋涉到達(dá)醫(yī)院或是通過郵寄標(biāo)本的方式才能進(jìn)行此項(xiàng)測 試，費(fèi)時費(fèi)力，而且不能得到及時的檢測。即使在大型醫(yī)院，由于使用大型機(jī)器成本的問題， 往往也是積攢夠一定數(shù)量樣品后，才進(jìn)行檢測，檢測往往被延誤，以至于醫(yī)生不能即使指導(dǎo) 病人用藥。因此市場急切的需要一種快捷簡單、價格低廉、不依賴任何儀器設(shè)備，同時又能 準(zhǔn)備、靈敏的檢測他克莫司濃度范圍的手段，這一手段可以供所有醫(yī)療機(jī)構(gòu)甚至患者自己 使用，為患者提供血藥濃度范圍的基本信息，為是否需要進(jìn)行下一步精確檢測提供依據(jù)。以膠體金試紙條技術(shù)為代表的快速膜檢測技術(shù)作為一種穩(wěn)定和實(shí)用的技術(shù)適合在多樣情況下使用，這類膠體金檢測試紙主要包括一層膜反應(yīng)體系，如圖1所示，膜反應(yīng)體 系由膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜檢測區(qū)以及吸水膜組成，待測樣品與膠體結(jié)合墊上的膠 體金結(jié)合形成膠體金標(biāo)記復(fù)合物，在纖維毛吸作用下泳動到檢測區(qū)，并途經(jīng)檢測區(qū)的檢測 線上包被或固定的檢測底物，如待測樣品中存在與檢測底物識別的靶標(biāo)物質(zhì)，則膠體金標(biāo) 記復(fù)合物將被截獲聚集在檢測區(qū)使檢測線顯示顏色，即檢測呈陽性，如果沒有靶標(biāo)物質(zhì)，則 膠體金標(biāo)記復(fù)合物不會在檢測線聚集，因而不會顯色，即為陰性。在過去的十年里使用該 技術(shù)制備的標(biāo)記物作為檢測系統(tǒng)中的指示試劑使用在檢測敏感癥、傳染病、環(huán)境污染物、毒 品、心梗標(biāo)志物、早孕以及獸醫(yī)等領(lǐng)域。隨著快速診斷技術(shù)進(jìn)步使膠體金結(jié)合物的靈敏度得 到提高，在大多數(shù)快速診斷分析中，檢測下限達(dá)到lng/rnl。如果抗體優(yōu)質(zhì)，可以低到IOpg/ ml。隨著技術(shù)的發(fā)展，檢測靈敏度將可能提高10-100倍。最初大多數(shù)的膠體金檢測試紙條 僅用于定性檢測，只能用于檢測臨床樣本中是否含有超過檢測濃度的特定生物成分存在。 然而在臨床使用中，有很多檢測室需要定量的。由于靈敏度和特異性的提升以及其他輔助 技術(shù)的發(fā)展，用以膠體金試紙條技術(shù)為代表的快速膜檢測技術(shù)進(jìn)行定量或是半定量檢測已 經(jīng)成為可能。這樣的檢測包括三種形式，第一種形式是，簡單根據(jù)測試結(jié)果信號在視覺上的 對比，提供半定量結(jié)果，可分為陰性、弱陽性、中陽性和強(qiáng)陽性。第二種類型，在檢測區(qū)域設(shè) 計多條檢測線，每條檢測線設(shè)計成只結(jié)合已知一定量的分析物，當(dāng)分析物過量或不足量時， 分析物將會和下一條檢測線結(jié)合，這樣會在測試區(qū)產(chǎn)生一個溫度計式的條帶梯度，因此可 以根據(jù)檢測結(jié)果中出現(xiàn)檢測線的多少，判斷樣品中被測物的濃度范圍。在第三種測試類型 中，測試樣品所產(chǎn)生的信號由一個小型的、便攜式的分析儀讀取，并由分析儀將有色的測試 線轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號，從而根據(jù)信號的強(qiáng)弱判斷被測物的量。另外，他克莫司的全血樣品的前處理是他克莫司檢測中的一個重要問題，如前所 述，他克莫司在血液中主要和紅細(xì)胞上的結(jié)合蛋白結(jié)合，因此在他克莫司血液濃度檢測 前，必須對全血樣本進(jìn)行處理，使紅細(xì)胞破裂，他克莫司與其綁定蛋白分離。由于他克莫司 水溶性較差，目前常用有機(jī)溶劑如甲醇、DMSO裂解沉淀法，酶消化法來提取他克莫司，這些 方法都需要使用離心機(jī)對樣品進(jìn)行高速離心以除去沉淀蛋白，這使得他克莫司不能直接在 自動化平臺上檢測，而需要前處理操作。同時這一前處理方式有很多缺點(diǎn)，如所用有機(jī)溶劑 往往有毒性，操作需謹(jǐn)慎，同時這些有機(jī)溶劑易于揮發(fā)，如果在樣品前處理完成后不能及時 檢測，結(jié)果將有較大變化等等。為了實(shí)現(xiàn)他克莫司檢測的完全自動化，同時克服有機(jī)溶劑 提取前處理法的缺點(diǎn)，科學(xué)家已經(jīng)找到一些無需有機(jī)溶劑沉淀和離心的方法。在美國專利 7186518中，作者合成了一個他克莫司的衍生物，該化合物能夠競爭性的與他克莫司結(jié)合蛋 白結(jié)合，將他克莫司從其結(jié)合蛋白中置換出來，但是確不與他克莫司單克隆抗體結(jié)合，研究 表明雷帕霉素也可以起到這樣的作用。因此作者首先將全血樣品用超聲波進(jìn)行破碎，然后 在樣品中加入含一定濃度的他克莫司衍生物的提取液，混合均勻，樣品即可用于檢測，結(jié)果 顯示此法的結(jié)果優(yōu)于有機(jī)溶劑提取法。在美國專利2007/0087396中，作者用分別用非離子 去垢劑如Triton XlOO作為紅細(xì)胞裂解劑，膽酸鹽作為提取劑來處理樣品，處理過的樣品可 以直接用于他克莫司檢測而無需其他任何處理。這兩項(xiàng)技術(shù)使得使用自動化平臺全過程檢 測他克莫司成為可能，同時也為他克莫司的快速半定量檢測提供了樣品處理的方法。目前為止，沒有見到報道高效便捷地半定量檢測全血中他克莫司藥物濃度的方法，也沒有結(jié)合競爭性免疫結(jié)合技術(shù)與膠體金檢測技術(shù)對全血中他克莫司藥物濃度進(jìn)行半定量檢測方面的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明根據(jù)上述領(lǐng)域的空白，提供一種快速半定量檢測全血中他克莫司藥物濃度 的膠體金檢測試紙條。半定量檢測全血中他克莫司藥物濃度的膠體金檢測試紙條，其膜反應(yīng)體系包括膠 體金結(jié)合墊和檢測墊，其特征在于，在膠體金結(jié)合墊上包被有膠體金標(biāo)記的抗他克莫司抗 體；檢測墊設(shè)置有檢測線，所述檢測線上固定有他克莫司-載體蛋白偶聯(lián)物。 所述檢測線為多條且間隔。所述抗他克莫司抗體為單克隆抗體。所述檢測墊上還設(shè)置有質(zhì)控線，所述質(zhì)控線上包被有羊抗鼠抗體IgM。所述膜反應(yīng)層貼附在一層PVC板上。半定量檢測全血中他克莫司藥物濃度的試劑盒，包括外盒體和盒內(nèi)支架，其特征 在于所述盒內(nèi)支架上設(shè)置有試紙條凹槽，試紙條凹槽內(nèi)放置所述膠體金檢測試紙條。所述盒內(nèi)支架上還設(shè)置有若干試劑管孔，所述試劑管孔內(nèi)放置有試劑管，試劑管 中分別盛裝的試劑包括全血處理液。所述盒內(nèi)支架上還設(shè)置有取血針存放孔和采血器存放槽，所述取血針存放孔內(nèi)放 置取血針，采血器存放槽放置有采血器。半定量檢測全血中他克莫司藥物濃度的檢測方法，步驟如下(1)待測血前處理得到待測樣品(2)將待測樣品滴加在上述膠體金檢測試紙條上。所述前處理采用全血處理液，其成分如下4mg/ml EDTA-2K, 1 % Triton X100， 0. 5%脫氧膽酸鈉，0. 05% Proclin300的pH值7. 4的PBS溶液；所述前處理指將待測血加 入到所述全血處理液中，劇烈震蕩1 10分鐘使細(xì)胞破碎。本發(fā)明提供一種半定量檢測全血中他克莫司藥物濃度的膠體金檢測試紙條。其 原理是用膠體金標(biāo)記抗他克莫司抗體，將該膠體金標(biāo)記物包被在膠體金結(jié)合墊上；在檢測 墊的檢測線上包被一定量的他克莫司-載體蛋白偶聯(lián)物，當(dāng)將待檢測全血加到膠體金結(jié)合 墊后，全血中的他克莫司與膠體金標(biāo)記的抗體結(jié)合，該膠體金標(biāo)記復(fù)合物由于不再有結(jié)合 位點(diǎn)，泳動到檢測線時不會被檢測線5上他克莫司-載體蛋白偶聯(lián)物的他克莫司所捕獲而 聚集在檢測線上，如果待測全血中他克莫司藥物濃度不足于完全結(jié)合膠體金標(biāo)的抗體時， 剩余的膠體金標(biāo)抗體泳動到檢測線將會與檢測線上的他克莫司_載體蛋白偶聯(lián)物的他克 莫司結(jié)合，并在檢測線聚集膠體金而顯色；制作該試紙條時，通過定量膠體金墊上包被的抗 體量，即只能夠結(jié)合一定量的他克莫司，通過限制滴加的檢測全血的體積，當(dāng)檢測線不顯色 時，說明滴加的一定體積的全血中他克莫司量是膠體金結(jié)合墊上抗體的結(jié)合位點(diǎn)飽和，這 時，需通過對全血進(jìn)行稀釋，直至檢測線顯色，說明待測血液中他克莫司的濃度在檢測線所 代表的濃度乘上稀釋倍數(shù)所得的濃度以下，即對待測全血進(jìn)行半定量檢測。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了 便捷、經(jīng)濟(jì)、快速半定量檢測全血中他克莫司的目的。本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選在檢測墊上設(shè)置多條間隔檢測線。該優(yōu)選設(shè)計方案使得半定量檢測更為精確。由距離膠體金墊的距離由近到遠(yuǎn)，檢測線顯示陽性時所代表的他克莫司濃度依次減少。本發(fā)明中包被在膠體金墊上的抗體可以是單克隆抗體也可以使多克隆抗體，本發(fā)明優(yōu)選單克隆抗體，以盡量減低檢測過程中交叉反應(yīng)的干擾，提高檢測準(zhǔn)確性。本發(fā)明膠體金檢測試紙條，進(jìn)一步優(yōu)選在檢測墊上設(shè)置質(zhì)控線，所述質(zhì)控線上包 被羊抗鼠抗體IgM.作為監(jiān)測試紙條有效性以及試劑污染的依據(jù)。本發(fā)明膠體金檢測試紙條可以做成將膜反應(yīng)體系貼附在雙面膠一類的載體上，以 減少耗材和成本，又不影響檢測結(jié)果；而本發(fā)明還提供一種將膜反應(yīng)體系貼附在尺寸相應(yīng) 的PVC條上的方案，以適用于某些情況下的檢測需要。本發(fā)明根據(jù)檢測需要，還提供包括上述試紙條的試劑盒，試劑盒盒體內(nèi)設(shè)置盒內(nèi) 支架，支架上設(shè)置對應(yīng)于試紙條存放槽，還可以包括檢測過程中需要的其它試劑和器械的 存放槽。以進(jìn)一步提高本發(fā)明試紙條的實(shí)用性和便捷性。本發(fā)明優(yōu)選盒內(nèi)支架上設(shè)置的其它存放槽為適合于放置試劑管的試劑管槽以及 取血針存放孔和取血器存放槽。這樣試劑盒內(nèi)可以穩(wěn)妥安全地放置檢測中必備的試劑盒器 械。只要購買了本試劑盒就可以在任何地方進(jìn)行檢測。本發(fā)明還提供了檢測方法，檢測方法中提供了優(yōu)選的全血處理液配方及處理方 式。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以采用其他更復(fù)雜的方式進(jìn)行全血處理一樣能現(xiàn)實(shí)本發(fā)明。而本 發(fā)明提供的檢測方法則僅僅是最簡便和高效的一種。綜合而言，用本發(fā)明進(jìn)行他克莫司檢測時無需進(jìn)行有機(jī)溶劑沉淀、離心等步驟，可 以簡便快速、準(zhǔn)確有效的對全血中的他克莫司進(jìn)行半定量，具有高特異性、高靈敏度、高通 量、操作快速簡便、費(fèi)用低廉、不需要任何儀器、適合患者家庭使用等特點(diǎn)


圖1.現(xiàn)有技術(shù)中膠體金試紙條的一般結(jié)構(gòu)示意2.本發(fā)明膠體金檢測試紙條膜層反應(yīng)體系結(jié)構(gòu)示意3.本發(fā)明試劑盒俯視結(jié)構(gòu)示意4a本發(fā)明檢測結(jié)果解讀示意圖一表示他克莫司濃度小于5ng/ml圖4b本發(fā)明檢測結(jié)果解讀示意圖一表示他克莫司濃度在5-lOng/ml之間圖4c.本發(fā)明檢測結(jié)果解讀示意圖一表示他克莫司濃度在10-20ng/ml之間圖4d.本發(fā)明檢測結(jié)果解讀示意圖一他克莫司濃度大于20ng/ml，應(yīng)稀釋后再測
量其中1-膠體金結(jié)合墊，2-檢測墊，3-質(zhì)控線，4-PVC板，5_檢測線，6_膠體金標(biāo)記 的抗他克莫司抗體，7-盒內(nèi)支架，8-試紙條凹槽，9-試劑管孔，10-取血針存放孔，11-采血 器存放槽。
具體實(shí)施例方式如圖2所示，本發(fā)明半定量檢測全血中他克莫司藥物濃度的膠體金檢測試紙條， 其膜反應(yīng)體系包括膠體金結(jié)合墊1和檢測墊2，其特征在于，在膠體金結(jié)合墊1上包被有 膠體金標(biāo)記的抗他克莫司抗體6 ；檢測墊設(shè)置有檢測線5，所述檢測線5上固定有他克莫 司-載體蛋白偶聯(lián)物。運(yùn)用了競爭性免疫學(xué)反應(yīng)及層析技術(shù)將膠體金標(biāo)記的抗他克莫司抗體6包被在膠體金結(jié)合墊1上；在檢測墊2的檢測線5上包被一定量的他克莫司_載體蛋 白偶聯(lián)物的他克莫司，當(dāng)將一定體積的待檢測全血加到膠體金結(jié)合墊1后，全血中的他克 莫司與膠體金墊上的膠體金標(biāo)記的抗他克莫司抗體6結(jié)合，如果待測全血中他克莫司藥物 濃度不足于完全結(jié)合膠體金標(biāo)記的抗他克莫司抗體6時，剩余的膠體金標(biāo)抗體泳動到檢測 線將會與檢測線上的他克莫司-載體蛋白偶聯(lián)物的他克莫司結(jié)合，并在檢測線聚集膠體金 而顯色，這時說明，全血中他克莫司的濃度低于膠體金結(jié)合墊上膠體金標(biāo)抗體所代表的他 克莫司的濃度。如果膠體金結(jié)合墊1上面不再有剩余的閑置的膠體金標(biāo)記的抗他克莫司抗 體6，則結(jié)合了待測全血中他克莫司的膠體金標(biāo)記的抗他克莫司抗體6的復(fù)合物泳動到檢 測線5時不會聚集在檢測線上，因此檢測線不會顯色，這時說明，全血中他克莫司的濃度高 于膠體金結(jié)合墊的結(jié)合能力所代表的他克莫司濃度；這時，如需進(jìn)一步精確他克莫司濃度， 需通過對全血進(jìn)行稀釋后在檢測直至檢測線5顯色，說明待測血液中他克莫司的濃度在檢 測線5所代表的濃度乘上稀釋倍數(shù)所得的濃度與膠體金結(jié)合墊結(jié)合能力所代表的濃度之 間，即實(shí)現(xiàn)了對待測全血進(jìn)行半定量檢測的目的。本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選在檢測墊2上設(shè)置多條間隔檢測線5。該優(yōu)選設(shè)計方案使得半 定量檢測更為精確和簡便。由距離膠體金墊結(jié)合墊1的距離由近到遠(yuǎn)，檢測線顯示陽性時 所代表的他克莫司濃度依次減少，可根據(jù)檢測線5顯色的多少和位置，判斷待測血液中他 克莫司的濃度范圍。本發(fā)明中包被在膠體金結(jié)合墊1上的抗體可以是單克隆抗體也可以使多克隆抗 體，本發(fā)明優(yōu)選單克隆抗體，以盡量減低檢測過程中交叉反應(yīng)的干擾，提高檢測準(zhǔn)確性。本發(fā)明膠體金檢測試紙條，進(jìn)一步優(yōu)選在檢測墊2上設(shè)置質(zhì)控線3，所述質(zhì)控線3 上包被羊抗鼠抗體IgM。以作為監(jiān)測試紙條有效性以及試劑污染的依據(jù)。本發(fā)明膠體金檢測試紙條可以做成將膜反應(yīng)體系貼附在雙面膠一類的載體上，以 減少耗材和成本，又不影響檢測結(jié)果；而本發(fā)明提供一種將膜反應(yīng)體系貼附在尺寸相應(yīng)的 PVC板4上的方案，以適用于某些情況下的檢測需要。本發(fā)明還提供半定量檢測全血中他克莫司藥物濃度的試劑盒，包括外盒體和盒內(nèi) 支架7，其特征在于所述盒內(nèi)支架7上設(shè)置有試紙條凹槽8，試紙條凹槽8內(nèi)放置所述膠體 金檢測試紙條。本發(fā)明提供的試劑盒，盒內(nèi)支架上7設(shè)置對應(yīng)于試紙條凹槽之外，還可以包 括檢測過程中需要的其它試劑和器械的存放槽。以進(jìn)一步提高本發(fā)明試紙條的實(shí)用性和便 捷性。本發(fā)明優(yōu)選所述盒內(nèi)支架7上還設(shè)置有若干試劑管孔9，所述試劑管孔9內(nèi)放置有 試劑管，試劑管中分別盛裝的試劑包括全血處理液、稀釋液。本發(fā)明優(yōu)選盒內(nèi)支架7上設(shè)置的其它存放槽還包括取血針存放孔10和取血器存 放槽11，取血針存放孔10內(nèi)放置取血針，采血器存放槽11放置有采血器。這樣試劑盒內(nèi)可 以穩(wěn)妥安全地放置檢測中必備的試劑和器械。只要購買了本試劑盒就可以在任何地方進(jìn)行 檢測。制備實(shí)驗(yàn)例1.步驟1.他克莫司活化與載體蛋白偶聯(lián)本發(fā)明中他克莫司半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)過程參考美國專利US5164495中的方法，簡單的說，在三乙胺的存在下，將他克莫司分子與琥珀酸干混合，加入催化劑4-二甲基氨基吡啶，反應(yīng)后純化即可得到他克莫司半酯，再經(jīng)過活化，后與載體蛋白反應(yīng)即可得到偶聯(lián)物。本發(fā)明所述他克莫司抗原為他克莫司半抗原與載體蛋白分子的偶聯(lián)物，載體單位 包括牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白等常見載體蛋白。具體操作如下稱取250mg FK506，15mg 琥珀酸酐，6mg 吡啶(4-dimethylaminopyridine)溶于 6. 25ml新蒸餾的二氯甲烷。邊攪拌邊加入42ul三乙胺。室溫繼續(xù)攪拌2小時。以上混合 物用二氯甲烷稀釋到20ml。分別用等量的0. 1當(dāng)量鹽酸、純化水、飽和的氯化鈉各洗一次。 在分液漏斗內(nèi)靜止分層，然后過濾收集下層液(二氯甲烷)。所得到的有機(jī)相放在無水硫酸 鎂上干燥，用磁力攪拌器持續(xù)攪拌30分鐘，然后用砂芯漏斗抽濾以除掉硫酸鎂。用旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)儀濃縮，直至呈輕微黃色泡沫。用少量二氯甲烷重溶并過硅膠色譜柱，二氯甲烷與甲醇按 9 1的比例混合做流動相，收集第一個流出的組分。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上將進(jìn)行干燥，得到淡 黃色Π(506半琥珠酸酯。稱取35mg FK506半琥珠酸酯，5. 4mg N-羥基琥珀酰亞胺和8. 8mg N,N- 二環(huán)己基碳化二亞胺溶于5ml乙酸乙酯，在磁力攪拌器上繼續(xù)攪拌24小時。6000rpm 離心5分鐘以除去中的沉淀物。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上干燥中的上清，得到含有活性酯的反應(yīng)混 合物。上述材料無需進(jìn)一步純化活性。稱取Img活性酯溶于2. 5ml N，N-二甲基甲酰胺。 量取0. 14ml與0.62ml N，N-二甲基甲酰胺混合并逐滴加入到IOml (含IOmg)卵清蛋白中。 用磁力攪拌器于室溫混合2. 5小時，然后加入lmll. 8M Tris0用S印hadex G-25層析純化。步驟2.檢測墊的制備用緩沖液將將步驟1得到的他克莫司_卵清蛋白偶聯(lián)物稀釋到三個不同濃度，由 高到低分別用點(diǎn)膜儀點(diǎn)在硝酸纖維素膜上，每條線點(diǎn)20ul，線寬1mm，線間距5mm，其包被量 代表了能夠檢測出5ng/ml，10/ml，20ng/ml的量。同樣在檢測線后用點(diǎn)膜儀點(diǎn)上200ug/ml 的羊抗鼠IgM作為質(zhì)控線，線寬1mm，距最近檢測線8mm。用1 % BSA進(jìn)行封閉，37°C烘干， 4°C保存步驟3.膠體金結(jié)合墊制備3. 1他克莫司抗體FK506單克隆抗體mouse monoclonal anti-Tacromilus antibody, IgM,FKl,購于 Fitzgerald 公司。3. 2他克莫司單克隆抗體_膠體金復(fù)合物的制備用純化水將1 %氯金酸稀釋成0. 01 %,在磁力攪拌器上加熱攪拌煮沸，每 IOOmlO. 01%氯金酸加入2mll%檸檬酸三鈉，繼續(xù)煮沸至液體呈紅色時停止加熱，冷卻至室 溫，加水至原體積。制備好的膠體金有效期一個月。膠體金標(biāo)記他克莫司單克隆抗體制備在磁力攪拌器上用0. IM碳酸鉀調(diào)膠體金的pH值8. 2，按照l_3ug/ml膠體金加入 他克莫司單抗1^506，繼續(xù)攪拌30min，加入BSA至終濃度1%，靜置30min。13000rpm、4°C 離心30min，棄上清，沉淀用含有0. 08% BSA,0. 吐溫20，0. 3% PVP300,0. 02M硼酸的復(fù) 溶液，PH9. 0洗滌兩側(cè)，用復(fù)溶液重懸沉淀，4°C備用。3. 3將他克莫司單抗-膠體金結(jié)合物結(jié)合物稀釋到一定溶度，放在加樣槽內(nèi)，將結(jié) 合物釋放墊浸入其中l(wèi)min，取出后進(jìn)行真空干燥，即得到膠體金結(jié)合墊。步驟4試紙條組裝
在PVC板上依次黏貼吸水墊、檢測墊和膠體金結(jié)合墊，檢測墊需蓋住膠體金結(jié)合 墊。將以上組裝好的材料切成3mm寬的小條。加塑料盒，真空包裝即得到他克莫司膠體金 試紙條。步驟5全血樣品采取、處理液體美國專利US2007/0087396中，作者分別用非離子去垢劑如Triton X100作為紅細(xì) 胞裂解劑，膽酸鹽作為提取劑來處理樣品，處理過的樣品可以直接用于他克莫司檢測而無 需其他任何處理。本專利中以此專利為基礎(chǔ)，在溶液中同時加入抗凝劑EDTA，這樣溶液即具 有抗凝、裂解、提取三種功能，將此液體放在小瓶內(nèi)，采取一定量的指尖血后，迅速放入前述 有液體的小瓶內(nèi)，劇烈震蕩，即可得到處理好的檢測樣品。樣品處理液為含有EDTA抗凝劑、紅細(xì)胞裂解液以及他克莫司提取液的緩沖液體 系，其中EDTA為抗凝作用，Triton X100為紅細(xì)胞裂解作用，脫氧膽酸鈉他克莫司提取作 用。其具體為含有 4mg/mlEDTA-2K，Triton X100,0. 5%脫氧膽酸鈉，0. 05% Proclin300 的pH值7.4的PBS溶液。配制完成的液體分裝于離心管內(nèi)，每管0.5ml。樣品稀釋液與樣 品處理液相同，當(dāng)樣品中濃度超過檢測線時，可以用樣品稀釋液對樣品進(jìn)行稀釋后再次測 定。實(shí)驗(yàn)例2檢測樣品過程1. 1.樣品處理用采血針和定量吸管取指尖血0. 5ml，迅速加入到含有樣品處理液的離心管內(nèi)，迅 速劇烈震蕩5分鐘，使紅細(xì)胞破裂，他克莫司釋放出來。1. 2.用試紙條檢測用定量塑料管取處理過的樣品120ul滴加在試紙條的樣品孔內(nèi)，開始計時，等待 紅色條帶出現(xiàn)，10分鐘內(nèi)讀值，超過20分鐘，結(jié)果無效。1.3.結(jié)果解釋本試劑采用競爭法，所設(shè)計的三個濃度梯度標(biāo)志線為5ng/ml，10ng/ml, 20ng/ml, 所得結(jié)果解釋為如下當(dāng)出現(xiàn)含質(zhì)控線的四條線時如圖4a，說明他克莫司濃度小于5ng/ml。當(dāng)出現(xiàn)含質(zhì)控線的三條線時如圖4b，說明他克莫司濃度在5-lOng/ml。當(dāng)出現(xiàn)含質(zhì)控線的二條線時如圖4c，說明他克莫司濃度在10-20ng/ml。當(dāng)僅出現(xiàn)質(zhì)控線一條線時如圖4d，說明他克莫司濃度大于20ng/ml，應(yīng)稀釋后再測量。
權(quán)利要求
半定量檢測全血中他克莫司藥物濃度的膠體金檢測試紙條，其膜反應(yīng)體系包括膠體金結(jié)合墊和檢測墊，其特征在于，在膠體金結(jié)合墊上包被有膠體金標(biāo)記的抗他克莫司抗體；檢測墊設(shè)置有檢測線，所述檢測線上固定有他克莫司-載體蛋白偶聯(lián)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的半定量檢測全血中他克莫司藥物濃度的膠體金檢測試紙條， 其特征在于所述檢測線為多條且間隔。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的半定量檢測全血中他克莫司藥物濃度的膠體金檢測試紙條， 其特征在于所述抗他克莫司抗體為單克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的半定量檢測全血中他克莫司藥物濃度的膠體金檢測試紙條， 其特征在于所述檢測墊上還設(shè)置有質(zhì)控線，所述質(zhì)控線上包被有羊抗鼠抗體IgM。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的半定量檢測全血中他克莫司藥物濃度的膠體金檢測試紙條， 其特征在于所述膜反應(yīng)層貼附在一層PVC板上。
6.半定量檢測全血中他克莫司藥物濃度的試劑盒，包括外盒體和盒內(nèi)支架，其特征在 于所述盒內(nèi)支架上設(shè)置有試紙條凹槽，試紙條凹槽內(nèi)放置所述膠體金檢測試紙條。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的半定量檢測全血中他克莫司藥物濃度的試劑盒，其特征在 于所述盒內(nèi)支架上還設(shè)置有若干試劑管孔，所述試劑管孔內(nèi)放置有試劑管，試劑管中分別 盛裝的試劑包括全血處理液、稀釋液。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的半定量檢測全血中他克莫司藥物濃度的試劑盒，其特征 在于所述盒內(nèi)支架上還設(shè)置有取血針存放孔和采血器存放槽，所述取血針存放孔內(nèi)放置 有取血針，采血器存放槽放置有采血器。
9.半定量檢測全血中他克莫司藥物濃度的檢測方法，步驟如下(1)待測血前處理得到待測樣品(2)將待測樣品滴加在權(quán)利要求1 5任一所述膠體金檢測試紙條上。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測方法，所述前處理采用全血處理液，其成分如下4mg/ mlEDTA-2K, 1% Triton ΧΙΟΟ,Ο. 5%脫氧膽酸鈉，0. 05% Proclin300 的 pH 值 7. 4 的 PBS 溶 液；所述前處理指將待測血加入到所述全血處理液中，劇烈震蕩1 10分鐘使細(xì)胞破碎。
全文摘要
本發(fā)明“半定量檢測全血中他克莫司藥物濃度的膠體金檢測試紙條及試劑盒”，屬于醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域。其膜反應(yīng)體系包括膠體金結(jié)合墊和檢測墊，其特征在于，在膠體金結(jié)合墊上包被有膠體金標(biāo)記的抗他克莫司抗體；檢測墊設(shè)置有檢測線，所述檢測線上固定有他克莫司-載體蛋白偶聯(lián)物。檢測時無需進(jìn)行有機(jī)溶劑沉淀、離心等步驟，可以簡便快速、準(zhǔn)確有效的對全血中的他克莫司進(jìn)行半定量檢測。
文檔編號G01N33/558GK101852800SQ201010178299
公開日2010年10月6日 申請日期2010年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月18日
發(fā)明者李全, 焦守恕 申請人:同昕生物技術(shù)(北京)有限公司