專利名稱：基于聚合物微球變化的編碼檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)用檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，主要涉及一種基于聚合物微球變化的編碼檢 測(cè)方法。本發(fā)明是建立在免疫反應(yīng)以及基因雜交特異性反應(yīng)的基礎(chǔ)上，對(duì)編碼技術(shù)的創(chuàng)新， 可同時(shí)實(shí)現(xiàn)多個(gè)待測(cè)樣本或指標(biāo)的檢測(cè)，簡(jiǎn)單、快速、可靠。
背景技術(shù)：
在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，人們對(duì)生命現(xiàn)象的觀察和研究已經(jīng)深入到單細(xì)胞、單分子水 平。生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)是現(xiàn)代生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)發(fā)展的重要手段和實(shí)驗(yàn)工具，尤其是對(duì)感染 性疾病、遺傳性疾病和惡性腫瘤等的臨床診斷具有極其重要的作用。流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry, FCM)是一種在功能水平上對(duì)細(xì)胞或其他生物粒子 定量檢測(cè)和分選的分析方法，在生物床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。細(xì)胞或粒子在激光束的照射下 產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光，這兩種光信號(hào)同時(shí)被前向光電二極管和90°方向的光電倍增管 (PMT)接收。光散射信號(hào)在前向小角度進(jìn)行檢測(cè)，稱為前向散射(forward scatter, FSC)， 這種信號(hào)反映了微球粒徑或體積的大??；90°散射光又稱側(cè)向散射(side scatter, SSC)， 是指與激光束_液流平面垂直的散射光，其信號(hào)強(qiáng)度可反映微球內(nèi)部復(fù)雜程度。檢測(cè)后的 信號(hào)經(jīng)計(jì)算機(jī)處理后即轉(zhuǎn)化為可直觀觀察的一維直方圖或二維散點(diǎn)圖。流式細(xì)胞儀的分辨 率主要取決于儀器本身，常用變異系數(shù)(Cv)來(lái)表示，Cv = d/mX100% (d是分布的標(biāo)準(zhǔn)偏 差，m是分布的平均值)。近年來(lái)，流式細(xì)胞儀在技術(shù)原理和設(shè)計(jì)研制方面無(wú)突破性進(jìn)展，但 在各種功能上卻有了很大提高，尤其是熒光探針的不斷推陳出新，使流式細(xì)胞儀新的參量 分析方面不斷有新的發(fā)展，并使儀器不斷向小型化，操作自動(dòng)化、簡(jiǎn)單化方向發(fā)展。顧忠澤 等(CN1595149A)發(fā)明一種基于編碼微球的微流控生物芯片，是基于流式細(xì)胞術(shù)原理發(fā)展 的一種新的檢測(cè)技術(shù)。編碼技術(shù)是目前用于醫(yī)學(xué)檢測(cè)以及科學(xué)研究的關(guān)鍵技術(shù)，是將待檢測(cè)的信息轉(zhuǎn) 換為微球顏色、粒徑或者磁性等能快速、準(zhǔn)確檢測(cè)的信號(hào)，便于判斷和篩選。Chandler等 (美國(guó)專利，US626822)利用聚苯乙烯納米微球，溶脹吸附熒光物質(zhì)實(shí)現(xiàn)了編碼。顏曉梅等 (CN101392172A)制得了粒徑均一的、羧基化熒光編碼微球。蘇星光等(CN101530766A)發(fā) 明了磁性熒光編碼微球，集磁響應(yīng)與熒光編碼于一身，在應(yīng)用方面具有很大優(yōu)勢(shì)。但是由于 熒光物質(zhì)本身發(fā)光效率和穩(wěn)定性難控制、不同波長(zhǎng)熒光效率差別顯著等引發(fā)的問(wèn)題仍然存 在。目前應(yīng)用較多微球聚合方法主要包括分散聚合、懸浮聚合、乳液聚合、種子聚合、SPG膜 乳化法等。20世紀(jì)八十年代Ugelstad等開(kāi)發(fā)了種子溶脹聚合法，通過(guò)引入惰性溶劑和單體 一起溶脹單分散種子微球，可以用來(lái)制備單分散的聚合物微球。目前對(duì)種子溶脹聚合的理 論和方法已經(jīng)相當(dāng)成熟，通過(guò)二步種子溶脹聚合可以獲得不同系列粒徑、高度均勻的功能 化微球，不僅可以獲得高交聯(lián)度的致密微球，還能獲得介孔或微孔球。由于微球表面帶有功 能基團(tuán)，特別是羧基基團(tuán)，可以與抗體、抗原以及基因片段結(jié)合成為診斷微球。診斷微球基 于免疫反應(yīng)或基因雜交特異性反應(yīng)，特異地識(shí)別待測(cè)物質(zhì)，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)即可準(zhǔn)確 判斷樣品中是否含有該物質(zhì)或診斷患者是否患有某種疾病。
目前很多液相生物芯片的載體微球采用熒光微球，由于微球熒光負(fù)載不均勻、穩(wěn)定性差、容易發(fā)生泄漏、不同熒光波長(zhǎng)的熒光效率不同，且熒光染料的成本較高、過(guò)程復(fù)雜， 在生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)方面應(yīng)用受限；對(duì)微球的要求高，不但要求微球高度均勻，表面官能團(tuán)富集 而且能有效、穩(wěn)定的包埋小分子。如何既能實(shí)現(xiàn)多通量同時(shí)檢測(cè)、又能使操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)信 號(hào)穩(wěn)定性強(qiáng)、區(qū)分度高，且成本低廉的編碼技術(shù)，一直受到研究人員的廣泛關(guān)注。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種易于檢測(cè)、準(zhǔn)確區(qū)分，同時(shí)實(shí)現(xiàn)多通量檢測(cè)的基于聚合物微 球變化的編碼檢測(cè)方法，可廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)、藥學(xué)等生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng) 域。本發(fā)明提供了基于聚合物微球變化的編碼檢測(cè)方法本發(fā)明采用表面偶聯(lián)特異性的抗體、抗原、DNA或RNA片段的一系列不同粒徑和內(nèi) 部結(jié)構(gòu)的聚合物微球，通過(guò)免疫反應(yīng)或基因雜交反應(yīng)特異性識(shí)別待測(cè)樣品中的抗原、抗體、 DNA或RNA片段；用表面攜帶熒光物質(zhì)的分子探針與待測(cè)的抗體、抗原、DNA或RNA片段特異 性偶聯(lián)，使得微球表面呈現(xiàn)熒光顏色；在檢測(cè)儀器中檢測(cè)熒光信號(hào)，與陰性和陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)本 或已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比，判斷待測(cè)樣品是陰性或是陽(yáng)性；在檢測(cè)儀器中對(duì)微球粒徑和內(nèi) 部結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，根據(jù)微球粒徑和內(nèi)部結(jié)構(gòu)與檢測(cè)信息的一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，從而對(duì)待測(cè)物質(zhì) 進(jìn)行準(zhǔn)確判斷。所述的聚合物微球是不同交聯(lián)度的致密微球、介孔或微孔球；微球的粒徑為2 30 μ m,相鄰編碼微球粒徑間隔在1 10 μ m。所述的聚合物微球微球的粒徑優(yōu)選4 16 μ m。所述的聚合物微球?yàn)榫郾揭蚁╊愇⑶颉⒕郾┧狨ヮ愇⑶?、聚苯乙?丙烯酸共 聚微球或聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸共聚微球，分散系數(shù)低于15%。所述的微球表面帶有氨基、羧基或氯甲基官能團(tuán)，表面官能團(tuán)負(fù)載率為0.5 1.5mm0l/g;與蛋白或基因結(jié)合成為診斷微球，從而建立不同微球與不同蛋白或基因的一一 對(duì)應(yīng)關(guān)系。所述的抗體、抗原、DNA或RNA片段是抗結(jié)核桿菌抗體、抗乙肝病毒抗體抗微生物 抗體中的一種或幾種；類風(fēng)濕因子、抗甲狀腺球蛋白抗體自身抗體中的一種或幾種；抗小 鼠抗體、抗兔二抗第二抗體中的一種或幾種；小鼠血清、兔血清動(dòng)物血清抗原類中的一種或 幾種；豬流感病毒NS1基因、胰島素基因微生物體內(nèi)的特異基因、人體或動(dòng)物體內(nèi)基因的轉(zhuǎn) 錄產(chǎn)物其中的一種或幾種。所述的一一對(duì)應(yīng)關(guān)系是表面偶聯(lián)抗體的編碼微球和熒光標(biāo)記的同種抗體，對(duì)應(yīng)檢 測(cè)待測(cè)樣品中的抗原；表面偶聯(lián)抗原的編碼微球和熒光標(biāo)記的同種抗原，對(duì)應(yīng)檢測(cè)待測(cè)樣 品中的抗體；表面偶聯(lián)DNA片段或RNA片段的編碼微球和熒光標(biāo)記相同的DNA或RNA片段， 對(duì)應(yīng)檢測(cè)待測(cè)樣品中的DNA或RNA片段。所述的檢測(cè)儀器可分辨聚合物微球不同粒徑和致密與介孔微球的散射光信號(hào)，優(yōu) 選流式細(xì)胞儀。所述的檢測(cè)儀器其檢測(cè)信號(hào)的變異系數(shù)在20%以下；其前向角散射光信號(hào)最小 分辨尺寸為0. 3μπι ；其側(cè)向角散射光信號(hào)反映微球密微球與介孔微球的散射信號(hào)強(qiáng)；將檢測(cè)信號(hào)檢轉(zhuǎn)化為直觀顯示的一維直方圖和二維散點(diǎn)圖，以精確識(shí)別不同微球，通過(guò)一一對(duì) 應(yīng)的關(guān)系確定待測(cè)物質(zhì)的信息。所述的編碼微球包括1)采用一系列粒徑為 2um、4um、6um、8um、10um、12um、14um、16um、18um、 20 um,22u m、24 um,26u m、28 um,30um的致密微球，通過(guò)檢測(cè)譜圖能明顯區(qū)分，可同時(shí)實(shí) 現(xiàn)16種不同待測(cè)物質(zhì)的同時(shí)檢測(cè)。2)采用一系列粒徑為 2um、4um、6um、8um、10um、12um、14um、16um、18um、 20 um,22u m、24 um,26u m、28 um,30um的致孔微球，通過(guò)檢測(cè)譜圖能明顯區(qū)分，可同時(shí)實(shí) 現(xiàn)16種不同待測(cè)物質(zhì)的同時(shí)檢測(cè)。3)采用 4 ii m、6 ii m、8 ii m、10 ii m、12 ii m、14 ii m、16 ii m粒徑的微球，可編碼 7 種診斷
微球，分別采用致密、致孔兩種不同內(nèi)部結(jié)構(gòu)的微球，可使得微球種類增加一倍；當(dāng)采用不 同交聯(lián)度微球時(shí)，能使得編碼微球種類增加多倍，可實(shí)現(xiàn)多通量檢測(cè)。根據(jù)編碼微球的粒徑以及內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息確定的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，在生物反應(yīng)前后偏差范 圍在0. 2 y m左右，對(duì)檢測(cè)信號(hào)影響很小，能夠保證診斷微球標(biāo)準(zhǔn)粒徑和內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息的可靠性?？傊?，與現(xiàn)有的編碼檢測(cè)技術(shù)相比，本發(fā)明涉及的編碼檢測(cè)方法具有微球粒徑分散 系數(shù)小于8%，內(nèi)部結(jié)構(gòu)多樣；檢測(cè)圖譜峰半峰寬窄，重疊程度小于10%，檢測(cè)信號(hào)區(qū)分度高， 能夠?qū)崿F(xiàn)多個(gè)待測(cè)樣本、多個(gè)指標(biāo)的同時(shí)檢測(cè)；微球表面富集官能團(tuán)，偶聯(lián)生物分子能力強(qiáng)， 能有效地診斷疾病、判斷藥物療效以及實(shí)現(xiàn)對(duì)抗體、抗原、DNA或RNA等的標(biāo)記和識(shí)別。


圖1 雙抗夾心法檢測(cè)的原理2:幻411111、511111、611111致密微球的前向角-側(cè)向角二維散點(diǎn)圖；B)4iim、5iim、6iim致密微球的前向角-個(gè)數(shù)一維直方圖。圖3 :A) 5. 7 ii m、9. 8umU2.3um致孔微球的前向角-側(cè)向角二維散點(diǎn)圖；B)5.7um,9.8umU2.3um致孔微球的前向角-個(gè)數(shù)一維直方圖。圖4 :A) 5.7 iim致密微球、7.3 iim致孔微球、12. 3 iim致密微球的前向角-側(cè)向角 二維散點(diǎn)圖；B)5. 7um致密微球、7. 3 u m致孔微球、12. 3 y m的前向角-個(gè)數(shù)一維直方圖。C) 5. 7 u m致密微球、7. 3 u m致孔微球、12. 3 y m的側(cè)向角-個(gè)數(shù)一維直方圖。
具體實(shí)施例方式下面給出本發(fā)明的實(shí)施例，是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是限制本發(fā)明的范圍。一、編碼微球檢測(cè)方法聚合物微球制備方法可以是分散聚合、乳液聚合、SPG膜乳化法、懸浮聚合、種子聚 合，優(yōu)選二步種子溶脹聚合，通過(guò)改變種子微球粒徑或適當(dāng)改變?nèi)苊浘酆线^(guò)程的單體和添 加劑的比例以獲得粒徑范圍寬的系列微球。微球表面帶有功能基團(tuán)，可以是氨基、羧基、氯 甲基，優(yōu)選羧基，羧基與生物小分子結(jié)合能力強(qiáng)。如分散聚合、乳液聚合、二步種子溶脹聚 合、SPG膜乳化法等均可制備粒徑范圍在2 30 y m的微球，可以是聚甲基丙烯酸-丙烯酸、聚苯乙烯-衣康酸微球、聚苯乙烯-丙烯酸微球、聚丙烯酸-二乙胺微球、聚苯乙烯-氯甲基苯乙烯微球，表面官能團(tuán)負(fù)載率為0. 5 1. 5mmol/g。編碼微球優(yōu)選采用二步種子溶脹聚 合，粒徑范圍優(yōu)選4-16 μ m，表面官能團(tuán)負(fù)載率優(yōu)選0. 7-1. Ommol/g的聚苯乙烯-丙烯酸微 球。實(shí)施例1選取4 μ m致密聚苯乙烯-丙烯酸微球，分散系數(shù)為7. 1 %，表面功能基團(tuán)負(fù)載率為 0. 505mmol/g ；5 μ m致密聚苯乙烯-丙烯酸微球，分散系數(shù)為5. 0%，表面功能基團(tuán)負(fù)載率為 為0. 571mmol/g ；6 μ m致密聚苯乙烯-丙烯酸微球，分散系數(shù)為5. 5 %，表面功能基團(tuán)負(fù)載 率為0. 585mmol/g三種高交聯(lián)度的微球，各5mg，分別用100 μ L PBS緩沖液分散然后超聲， 標(biāo)號(hào)為1、2、3。將1、2、3混合后，超聲分散，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，得到一維直方圖和二維 散點(diǎn)圖，保存并打印結(jié)果，如附圖2。實(shí)施例2選取5. 7 μ m致孔的聚苯乙烯-丙烯酸微球，分散系數(shù)為6. 4%，表面功能基團(tuán)負(fù)載 率為0. 597mmol/g、9.8ym致孔的聚苯乙烯-丙烯酸微球，分散系數(shù)為5.2%，表面功能基團(tuán) 負(fù)載率為0. 633mmol/g、12. 3 μ m致孔的聚苯乙烯-丙烯酸微球，分散系數(shù)為7. 7%，表面功 能基團(tuán)負(fù)載率為0. 693mmol/g，各5mg，分別用100 μ L PBS緩沖液分散然后超聲，標(biāo)號(hào)為1、 2、3。將1、2、3混合后，超聲分散，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，得到一維直方圖和二維散點(diǎn)圖， 保存并打印結(jié)果，如附圖3。實(shí)施例3選取5. 7 μ m致密聚苯乙烯-丙烯酸微球，分散系數(shù)為5. 0 %，表面功能基團(tuán)負(fù)載率 為0、670mmol/g ；7. 3 μ m致孔的聚苯乙烯-丙烯酸微球，分散系數(shù)為5. 2%，表面功能基團(tuán) 負(fù)載率為0. 633mmol/g ； 12. 3 μ m致密聚苯乙烯-丙烯酸微球，分散系數(shù)為5. 5%，表面功能 基團(tuán)負(fù)載率為為0. 700mmol/g ；各5mg，分別用100 μ L PBS緩沖液分散然后超聲，標(biāo)號(hào)為1、 2、3，混合在一起后超聲分散，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，得到一維直方圖和二維散點(diǎn)圖，保存 并打印結(jié)果。如附圖4。二、活性生物分子檢測(cè)實(shí)施例5采用免疫夾心法，即采用表面偶聯(lián)不同檢測(cè)蛋白或基因的聚合物微球(簡(jiǎn)稱檢測(cè) 基元)，與血液中的蛋白或基因相互作用，再用待有熒光標(biāo)記的檢測(cè)蛋白或基因(簡(jiǎn)稱報(bào)告 基元)識(shí)別，通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)粒徑和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的信息判斷血液中含有何種 蛋白或基因，并且根據(jù)流式一維直方圖或二維散點(diǎn)圖顯示，可以建立微球個(gè)數(shù)與待測(cè)物質(zhì) 的定量關(guān)系。1)選取2 μ m致密聚苯乙烯-丙烯酸微球，偶聯(lián)類風(fēng)濕因子制備了診斷微球Α。診 斷微球A用以檢測(cè)樣品中的變性lgG。2)選取16 μ m致密聚苯乙烯-丙烯酸微球，偶聯(lián)抗甲狀腺蛋白抗體制備了診斷微 球B。診斷微球B用以檢測(cè)樣品中的抗甲狀腺蛋白。3)選取30 μ m致密聚苯乙烯-丙烯酸微球，偶聯(lián)抗神經(jīng)原抗體制備了診斷微球B。 診斷微球C用以檢測(cè)樣品中的抗神經(jīng)元蛋白。將A、B兩種種診斷微球混合后對(duì)待測(cè)樣品采用免疫夾心法檢測(cè)，根據(jù)所帶的熒光顏色，與陰性和陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)本比較、判斷。根據(jù)流式譜圖信息，若測(cè)得2 y m粒徑和內(nèi)部結(jié)構(gòu) 信息，則證明樣品中含有變性IgG ；若測(cè)得16i!m粒徑和內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息，則證明樣品中含有 抗甲狀腺蛋白，若測(cè)得30 ym粒徑和內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息，則證明樣品中含有抗神經(jīng)元蛋白，。若 同時(shí)檢測(cè)到2 ii m、16 ii m和30 ii m微球的信息，則證明同時(shí)含有三種物質(zhì)。檢測(cè)圖譜半峰寬 較窄，很容易分辨。實(shí)施例61)選取4 y m致密聚苯乙烯_丙烯酸微球，偶聯(lián)抗結(jié)核桿菌抗體制備了診斷微球
A。診斷微球A用以檢測(cè)樣品中的結(jié)核桿菌，判斷待測(cè)樣品中是含有結(jié)核桿菌。2)選取10 y m致密聚苯乙烯-丙烯酸微球，偶聯(lián)抗艾滋病病毒抗體制備了診斷微 球B。診斷微球B用以檢測(cè)樣品中的艾滋病病毒，判斷待測(cè)樣品中是含有艾滋病病毒。3)選取16 ym致密聚苯乙烯-丙烯酸微球，偶聯(lián)我抗乙肝病毒抗體制備了診斷微 球C。診斷微球C用以檢測(cè)樣品中的乙肝病毒，判斷待測(cè)樣品中是含有乙肝病毒。將A、B、C三種診斷微球混合后對(duì)血液樣本采用免疫夾心法檢測(cè)，根據(jù)所帶的熒光 顏色，與陰性和陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)本比較、判斷。根據(jù)流式譜圖信息，若測(cè)得粒徑和內(nèi)部結(jié)構(gòu) 信息，則證明樣品中含有結(jié)核桿菌；若測(cè)得10 ym粒徑和內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息，則證明樣品中含有 艾滋病病毒；若測(cè)得16ym粒徑和內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息，則證明樣品中含有乙肝病毒。若同時(shí)檢測(cè) 到4 y m、10 y m、16 y m的信息，則證明同時(shí)含有三種物質(zhì)。檢測(cè)圖譜半峰寬較窄，很容易分 辨。實(shí)施例7檢測(cè)原理同上。1)選取4. 1 P m聚苯乙烯-衣康酸微球，偶聯(lián)小鼠血清制備了診斷微球A。診斷微 球A用以檢測(cè)樣品中的抗鼠抗體。2)選取6. 6 ii m聚苯乙烯-衣康酸微球，偶聯(lián)兔血清制備了診斷微球B。診斷微球 B用以檢測(cè)樣品中的抗兔抗體。將A、B兩種種診斷微球混合后對(duì)待測(cè)樣品采用免疫夾心法檢測(cè)，根據(jù)所帶的熒光 顏色，與陰性和陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)本比較、判斷。根據(jù)流式譜圖信息，若測(cè)得4. 粒徑和內(nèi)部結(jié) 構(gòu)信息，則證明樣品中含有抗鼠抗體；若測(cè)得6.6 ym粒徑和內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息，則證明樣品中 含有抗兔抗體。若同時(shí)檢測(cè)到4.1 i!m、6. 6 ym的信息，則證明同時(shí)含有兩種生物分子。檢 測(cè)圖譜半峰寬較窄，很容易分辨。實(shí)施例8檢測(cè)原理同上。1)選取2 ym聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸微球，偶聯(lián)抗乙肝病毒抗體制備了診斷微 球A。診斷微球A用以檢測(cè)樣品中的乙肝病毒。2)選取lOym聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸微球，偶聯(lián)類風(fēng)濕因子制備了診斷微球
B。診斷微球B用以檢測(cè)樣品中的變性IgG。將A、B兩種種診斷微球混合后對(duì)待測(cè)樣品采用免疫夾心法檢測(cè)，根據(jù)所帶的熒光 顏色，與陰性和陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)本比較、判斷。根據(jù)流式譜圖信息，若測(cè)得2 y m粒徑和內(nèi)部結(jié)構(gòu) 信息，則證明樣品中含有乙肝病毒；若測(cè)得10 ym粒徑和內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息，則證明樣品中含有 抗兔抗體。若同時(shí)檢測(cè)到ZiimUOiim的信息，則證明同時(shí)含有兩種生物分子。檢測(cè)圖譜半峰寬較窄，很容易分辨。實(shí)施例9檢測(cè)原理同上。1)選取5 μ m聚苯乙烯-氯甲基苯乙烯微球，偶聯(lián)抗乙肝病毒抗體制備了診斷微球A0診斷微球A用以檢測(cè)樣品中的乙肝病毒。2)選取13 μ m聚苯乙烯-氯甲基苯乙烯微球，偶聯(lián)類風(fēng)濕因子制備了診斷微球B。 診斷微球B用以檢測(cè)樣品中的變性lgG。將A、B兩種種診斷微球混合后對(duì)待測(cè)樣品采用免疫夾心法檢測(cè)，根據(jù)所帶的熒光 顏色，與陰性和陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)本比較、判斷。根據(jù)流式譜圖信息，若測(cè)得5 μ m粒徑和內(nèi)部結(jié)構(gòu) 信息，則證明樣品中含有乙肝病毒；若測(cè)得13μπι粒徑和內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息，則證明樣品中含有 變性lgG。若同時(shí)檢測(cè)到5μπι、13μπι的信息，則證明同時(shí)含有兩種生物分子。檢測(cè)圖譜半 峰寬較窄，很容易分辨。實(shí)施例10檢測(cè)原理同上。1)選取4μπι聚苯乙烯-丙烯酸微球，表面官能團(tuán)負(fù)載率為0.5mmol/g，偶聯(lián)抗乙 肝病毒抗體制備了診斷微球A。診斷微球A用以檢測(cè)樣品中的乙肝病毒。2)選取ΙΟμπι聚苯乙烯-丙烯酸微球，表面官能團(tuán)負(fù)載率為0.7mmol/g，偶聯(lián)抗甲 狀腺球蛋白制備了診斷微球B。診斷微球B用以檢測(cè)樣品中的甲狀腺球蛋白。將A、B兩種種診斷微球混合后對(duì)待測(cè)樣品采用免疫夾心法檢測(cè)，根據(jù)所帶的熒光 顏色，與陰性和陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)本比較、判斷。根據(jù)流式譜圖信息，若測(cè)得4μπι粒徑和內(nèi)部結(jié)構(gòu) 信息，則證明樣品中含有乙肝病毒；若測(cè)得ΙΟμπι粒徑和內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息，則證明樣品中含有 甲狀腺球蛋白。若同時(shí)檢測(cè)到4μπι、10μπι的信息，則證明同時(shí)含有兩種生物分子。檢測(cè)圖 譜半峰寬較窄，很容易分辨。實(shí)施例11檢測(cè)原理同上。1)選取4μπι聚苯乙烯-丙烯酸微球，表面官能團(tuán)負(fù)載率為l.Ommol/g，偶聯(lián)抗乙 肝病毒抗體制備了診斷微球A。診斷微球A用以檢測(cè)樣品中的乙肝病毒。2)選取ΙΟμπι聚苯乙烯-丙烯酸微球，表面官能團(tuán)負(fù)載率為1. 5mmol/g，偶聯(lián)抗結(jié) 核桿菌抗體制備了診斷微球B。診斷微球B用以檢測(cè)樣品中的結(jié)核桿菌。將A、B兩種種診斷微球混合后對(duì)待測(cè)樣品采用免疫夾心法檢測(cè)，根據(jù)所帶的熒光 顏色，與陰性和陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)本比較、判斷。根據(jù)流式譜圖信息，若測(cè)得4μπι粒徑和內(nèi)部結(jié)構(gòu) 信息，則證明樣品中含有乙肝病毒；若測(cè)得ΙΟμπι粒徑和內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息，則證明樣品中含有 結(jié)核桿菌。若同時(shí)檢測(cè)到4μπι、10μπι的信息，則證明同時(shí)含有兩種生物分子。檢測(cè)圖譜交 叉重疊少，易于分辨。實(shí)施例12檢測(cè)原理同上。選取3 μ m聚苯乙烯-二乙胺微球，偶聯(lián)抗小鼠二抗制備了診斷微球A ；選取13 μ m 聚苯乙烯_ 二乙胺微球，偶聯(lián)抗兔二抗制備了診斷微球B，將兩種診斷微球混合在一起。對(duì) 待測(cè)樣品采用免疫夾心法檢測(cè)，根據(jù)所帶的熒光顏色，與陰性和陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)本比較、判斷。根據(jù)流式圖譜能很好的區(qū)分A、B，A和B粒徑不同，差別顯著。實(shí)施例13檢測(cè)原理同上。分別制備了表面偶聯(lián)豬流感病毒NS1基因片段的5. 7 μ m致密聚苯乙烯-丙烯酸微球A、表面偶聯(lián)胰島素基因片段的5. 7 μ m致孔聚苯乙烯-丙烯酸微球B，將兩種診斷微球 混合在一起。對(duì)待測(cè)樣品采用免疫夾心法檢測(cè)，根據(jù)所帶的熒光顏色，與陰性和陽(yáng)性對(duì)照標(biāo) 本比較、判斷。根據(jù)流式圖譜能很好的區(qū)分A、B，A和B粒徑相同但內(nèi)部結(jié)構(gòu)差別顯著。若測(cè)得5. 7μπι粒徑和致孔結(jié)構(gòu)信息，則證明樣品中含有互補(bǔ)的豬流感病毒基因 片段；若測(cè)得5. 7 μ m粒徑和致密結(jié)構(gòu)信息，則證明樣品中含有互補(bǔ)的胰島素基因片段。若 同時(shí)檢測(cè)到兩種內(nèi)部結(jié)構(gòu)的信息，則證明同時(shí)含有兩種生物分子。檢測(cè)圖譜半峰寬較窄，很 容易區(qū)分。實(shí)施例14檢測(cè)原理同上。分另Ij 選取粒徑為 2 μ m、4 μ m、6 μ m、8 μ m、10 μ m、12 μ m、14 μ m、16 μ m、18 μ m、 20μπι、22μπι、24μπι、26μπι、28μπι、30μπι的致密聚苯乙烯-丙烯酸微球，表面分別偶聯(lián)16 種不同的抗體、抗原、DNA或RNA片段，得到16種不同的診斷微球，建立粒徑和內(nèi)部結(jié)構(gòu)與 抗體、抗原、DNA或RNA片段的一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，可同時(shí)檢測(cè)16種不同待測(cè)物質(zhì)，在檢測(cè)圖譜 能明顯區(qū)分。實(shí)施例I5檢測(cè)原理同上。分另Ij 選取粒徑為 2 μ m、4 μ m、6 μ m、8 μ m、10 μ m、12 μ m、14 μ m、16 μ m、18 μ m、 20μπι、22μπι、24μπι、26μπι、28μπι、30μπι的致孔聚苯乙烯-丙烯酸微球，表面分別偶聯(lián)16 種不同的抗體、抗原、DNA或RNA片段，得到16種不同的診斷微球，建立粒徑和內(nèi)部結(jié)構(gòu)與 抗體、抗原、DNA或RNA片段的一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，可同時(shí)檢測(cè)16種不同待測(cè)物質(zhì)，在檢測(cè)圖譜 能明顯區(qū)分。實(shí)施例I6檢測(cè)原理同上。分別選取粒徑為4 μ m、8 μ m、12 μ m、16 μ m的致密和致孔微球，表面分別偶聯(lián)8種 不同的抗體、抗原、DNA或RNA片段，得到8種不同的診斷微球，建立粒徑和內(nèi)部結(jié)構(gòu)與抗體、 抗原、DNA或RNA片段的一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，可同時(shí)檢測(cè)8種不同待測(cè)物質(zhì)。粒徑間隔較大且內(nèi) 部結(jié)構(gòu)區(qū)別顯著，容易區(qū)分。實(shí)施例17檢測(cè)原理同上。制備了表面偶聯(lián)類風(fēng)濕因子的5. 7 μ m致密聚苯乙烯-丙烯酸微球分別對(duì)兩份含 有不同濃度的變異IgG的樣品1和2，進(jìn)行雙抗夾心法檢測(cè)。根據(jù)流式圖譜顯示，兩份樣品 檢測(cè)粒徑均在5. 7 μ m左右，但是變異IgG的濃度高的樣品譜峰明顯高于濃度低的樣品。根 據(jù)這一特點(diǎn)，可制得標(biāo)準(zhǔn)樣品，以不同濃度的待測(cè)樣和標(biāo)樣的比較判斷患者所處的時(shí)期。本發(fā)明公開(kāi)和揭示粒徑和內(nèi)部結(jié)構(gòu)編碼微球的檢測(cè)技術(shù)，可通過(guò)借鑒本文公開(kāi)內(nèi) 容。盡管本發(fā)明的基于聚合物微球粒徑和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的編碼檢測(cè)方法已通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法改動(dòng)，更具體地說(shuō)，所有相類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，他們 都被視為包括在本發(fā)明精神、范圍和內(nèi)容中。
權(quán)利要求
基于聚合物微球變化的編碼檢測(cè)方法，其特征在于采用表面偶聯(lián)特異性抗體、抗原、DNA或RNA片段的一系列不同粒徑和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的聚合物微球，通過(guò)免疫反應(yīng)或基因雜交反應(yīng)特異性地識(shí)別待測(cè)樣品中的抗原、抗體、DNA或RNA片段；用表面攜帶熒光物質(zhì)的分子探針與待測(cè)的抗體、抗原、DNA或RNA片段特異性偶聯(lián)，使得微球表面呈現(xiàn)熒光顏色；在檢測(cè)儀器中檢測(cè)熒光信號(hào)，與陰性和陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)本或已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比，判斷待測(cè)樣品是陰性或是陽(yáng)性；在檢測(cè)儀器中對(duì)微球粒徑和內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，根據(jù)微球粒徑和內(nèi)部結(jié)構(gòu)與檢測(cè)信息的一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，從而對(duì)待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確判斷。
2.如權(quán)利要求1所述編碼檢測(cè)方法的聚合物微球，其特征在于聚合物微球是不同交 聯(lián)度的致密微球、介孔或微孔球；微球的粒徑為2 30 ym，相鄰編碼微球粒徑間隔在1 10 u m。
3.如權(quán)利要求2所述的聚合物微球，其特征在于聚合物微球微球的粒徑優(yōu)選4 16 u m。
4.如權(quán)利要求2或3所述的聚合物微球，其特征在于聚合物微球?yàn)榫郾揭蚁╊愇⑶?、?丙烯酸酯類微球、聚苯乙烯_丙烯酸共聚微球或聚甲基丙烯酸甲酯_丙烯酸共聚微球，分散 系數(shù)低于15%。
5.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于微球表面帶有氨基、羧基或氯甲基官能 團(tuán)，表面官能團(tuán)負(fù)載率為0. 5 1. 5mmol/g ；與蛋白或基因結(jié)合成為診斷微球，從而建立不 同微球與不同蛋白或基因的一一對(duì)應(yīng)關(guān)系。
6.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述的抗體、抗原、DNA或RNA片段是抗 結(jié)核桿菌抗體、抗乙肝病毒抗體抗微生物抗體中的一種或幾種；類風(fēng)濕因子、抗甲狀腺球蛋 白抗體自身抗體中的一種或幾種；抗小鼠抗體、抗兔二抗第二抗體中的一種或幾種；小鼠 血清、兔血清動(dòng)物血清抗原類中的一種或幾種；豬流感病毒NSi基因、胰島素基因微生物體 內(nèi)的特異基因、人體或動(dòng)物體內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物其中的一種或幾種。
7.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于表面偶聯(lián)抗體的編碼微球和熒光標(biāo)記的 同種抗體，對(duì)應(yīng)檢測(cè)待測(cè)樣品中的抗原；表面偶聯(lián)抗原的編碼微球和熒光標(biāo)記的同種抗原， 對(duì)應(yīng)檢測(cè)待測(cè)樣品中的抗體；表面偶聯(lián)DNA片段或RNA片段的編碼微球和熒光標(biāo)記相同的 DNA或RNA片段，對(duì)應(yīng)檢測(cè)待測(cè)樣品中的DNA或RNA片段。
8.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于檢測(cè)儀器是分辨聚合物微球不同粒徑和 致密與介孔微球的散射光信號(hào)。
9.如權(quán)利要求8所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述的檢測(cè)儀器為流式細(xì)胞儀，流式細(xì) 胞儀檢測(cè)信號(hào)的變異系數(shù)在20%以下；前向角散射光信號(hào)最小分辨尺寸為0. 3pm ；側(cè)向角 散射光信號(hào)反映微球密微球與介孔微球的散射信號(hào)強(qiáng)；將檢測(cè)信號(hào)檢轉(zhuǎn)化為直觀顯示的一 維直方圖和二維散點(diǎn)圖，以精確識(shí)別不同微球，通過(guò)一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系確定待測(cè)物質(zhì)的信息。
全文摘要
本發(fā)明是基于聚合物微球變化的編碼檢測(cè)方法。采用表面偶聯(lián)特異性的抗體、抗原、DNA或RNA片段的一系列不同粒徑和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的聚合物微球，通過(guò)免疫或基因雜交反應(yīng)特異性識(shí)別待測(cè)樣品中的抗原、抗體、DNA或RNA片段；用表面攜帶熒光物質(zhì)的分子探針與待測(cè)抗體、抗原、DNA或RNA片段特異性偶聯(lián)；在檢測(cè)儀器中檢測(cè)熒光信號(hào)，與陰性和陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)本或已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比，判斷待測(cè)樣品是陰性或陽(yáng)性；在檢測(cè)儀器中對(duì)微球粒徑和內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，根據(jù)微球粒徑和內(nèi)部結(jié)構(gòu)與檢測(cè)信息的一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，從而對(duì)待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確判斷。本發(fā)明是建立在免疫以及基因雜交特異性反應(yīng)的基礎(chǔ)上，對(duì)編碼技術(shù)的創(chuàng)新，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)多個(gè)待測(cè)樣本或指標(biāo)的檢測(cè)，簡(jiǎn)單、快速、可靠。
文檔編號(hào)G01N33/68GK101846672SQ20101016566
公開(kāi)日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2010年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月7日
發(fā)明者宋濤, 常津, 張琦, 李云紅, 逯超亮 申請(qǐng)人:天津大學(xué)