專利名稱：：用于冠心病診斷的血管過氧化物酶elisa試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及血管過氧化物酶(VP01)蛋白及抗體，特別涉及用于冠心病診斷的包含VP01蛋白及抗體ELISA試劑盒。
背景技術(shù)：
：冠心病是嚴(yán)重危害人類健康的常見病，在我國冠心病的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)，心肌梗死已成為我國病人主要死因之一，且其發(fā)病出現(xiàn)明顯低齡化趨勢(shì)。動(dòng)脈粥樣硬化是冠心病的病理生理基礎(chǔ)，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及氧化應(yīng)激、脂質(zhì)代謝紊亂，炎癥反應(yīng)等，其中脂質(zhì)過氧化是近來的研究熱點(diǎn)。髓過氧化物酶(MPO)存在于中性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞中，MPO可以氧化低密度脂蛋白(LDL)成為氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)，是目前已知的一種催化脂質(zhì)過氧化的重要酶類。臨床研究表明，血液和單核細(xì)胞中的MPO水平與急性冠脈綜合征的發(fā)生以及胸痛存在明顯的正相關(guān)，目前，MPO已成為動(dòng)脈粥樣硬化內(nèi)皮功能不全及急性冠脈綜合征預(yù)后的一個(gè)重要的預(yù)測(cè)因子。血管過氧化物酶(VPO)是一種新的過氧化物酶，其與MPO在結(jié)構(gòu)上有44.5%的同一性。VPO存在兩種形式，其中VP01主要在人體的心臟和血管中表達(dá)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明旨在通過對(duì)VP01的進(jìn)一步研究，提供一種VP01融合蛋白，以及抗人VP01多克隆抗體，并在此基礎(chǔ)上提供一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、使用方便、快速的定量檢測(cè)人血清、血漿、腦脊液或其他人組織勻漿中的血管過氧化物酶濃度的ELISA試劑盒，用于冠心病臨床診斷。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的詳細(xì)技術(shù)方案為以含VPOl基因(NCBI的geneID:69675)的質(zhì)粒為模板，根據(jù)原核表達(dá)載體pEGX_4T_2的GST閱讀框架設(shè)計(jì)引物，使VP01基因的編碼區(qū)閱讀框與GST的閱讀框架一致，并使引物帶有Sail和Notl酶切位點(diǎn)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，切膠后，經(jīng)凝膠回收線性的4.9kb的VP01編碼區(qū)片段；用所述PCR回收產(chǎn)物及pEGX-4T-2載體進(jìn)行Sail和Notl雙酶切，產(chǎn)生匹配的粘末端，之后將pEGX_4T_2載體與VP01基因連接，構(gòu)建成符合閱讀框的GST-VP01融合基因；用含融合基因的pEGX-4T-2-VP01質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，挑選陽性菌落，提取純化獲得重組融合蛋白。以上述VPOl融合蛋白免疫溫血?jiǎng)游锖?，制備出抗人VPOl多克隆抗體。—種血管過氧化物酶ELISA試劑盒，包括樣品稀釋液、酶底物顯色液、濃縮洗滌液、封閉液和終止反應(yīng)液，還包括上述VP01融合蛋白、上述的抗人VP01抗體包被的酶標(biāo)板，以及酶標(biāo)記二抗。發(fā)明人首次在冠心病患者血清中發(fā)現(xiàn)VP01的表達(dá)升高，同時(shí)在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)VP01可以氧化LDL成為ox-LDL，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成。VP01與MP0相似，具備作為冠心病診斷和治療的生化標(biāo)記物的特點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明用生物工程方法制備出VP01融合蛋白及抗人VP01抗體，并建立ELISA試劑盒，用ELISA方法直接測(cè)定樣品中的VP01含量，用于冠心病的風(fēng)險(xiǎn)篩查和診斷。該試劑盒檢測(cè)靈敏度小于5.Ong/ml，劑量-反應(yīng)曲線的線性相關(guān)系數(shù)>0.980，具有簡便、快捷、靈敏、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，為體外診斷定量檢測(cè)血管過氧化物酶提供了有效的手段。圖1是VP01融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)的電泳圖；圖2是VP01融合蛋白提取純化的電泳圖；圖3是VP01劑量(濃度)-反應(yīng)(吸光度)曲線。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。實(shí)施例1:血管過氧化物酶ELISA試劑盒的制備1.VP01標(biāo)準(zhǔn)品的制備據(jù)原核表達(dá)載體pEGX-4T-2的GST閱讀框架設(shè)計(jì)引物，使VP01基因的編碼區(qū)閱讀框與GST的閱讀框架一致。以含VP01基因的質(zhì)粒為模板(0.1iig)，以分別帶有Sail和NotI醇切位點(diǎn)的弓l物Forward:5'-gatagtcgacatcacctggaacaaggatgg_3':Reverse:5'_這tgcggccgctggctectagacacgttcac-3，各lO咖ol進(jìn)行擴(kuò)增，切膠后，經(jīng)凝膠回收線性的4.9kb的載體，即為VP01編碼區(qū)片段。用上述PCR回收產(chǎn)物及pEGX-4T-2載體進(jìn)行Sail和NotI雙酶切，產(chǎn)生匹配的粘末端，之后將pEGX-4T-2載體與VP01基因連接，構(gòu)建成符合閱讀框的GST-VP01融合基因。用含融合基因的pEGX-4T-2-VP01質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，小量制備質(zhì)粒DNA，并以Sail和NotI雙酶切鑒定是否含插入片段，含插入片段的陽性克隆質(zhì)粒DNA純化后，經(jīng)DNA自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序證實(shí)其序列正確性。單個(gè)陽性菌落接種入含氨卞青霉素(lOOiig/ml)的2mlLB培養(yǎng)液中，37。C，過夜培養(yǎng)。將400ii1過夜培養(yǎng)物分別接種到40ml含氨卞青霉素(100yg/ml)的LB培基中，于37t:培養(yǎng)7h，加入IPTG至終濃度為lmmol/L，37°C，培養(yǎng)2.5h，轉(zhuǎn)移至50ml離心管中。室溫12000Xg離心10min，去盡上清，置于冰上，重懸于預(yù)冷的600ii1的PBS中。加入終濃度為100iig/ml的溶菌酶、10iig/mlDNaseI，用液氮和溫水介導(dǎo)的反復(fù)凍融法破膜，11000rpm離心10min，收集上清。重懸GSTMicroSpin純化柱中的樹脂，打開蓋及底蓋，置于干凈的1.5ml的離心管中，735Xg離心lmin，棄液體，蓋上底蓋，柱中加入600yl的細(xì)菌裂解液。蓋緊上蓋，輕輕混勻，置于室溫510min后打開蓋及底蓋，置于干凈的1.5ml的離心管中，735Xg離心lmin，再用400iUPBS用相同的方法洗滌2次。柱中加入200yl的谷胱苷肽洗脫液，蓋緊上蓋，輕輕混勻，置于室溫510min。735Xg離心lmin收集流出液。誘導(dǎo)后的菌液超聲破碎裂解后，SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)R-250染色鑒定其純度為99%;剩余部分菌液離心，用QIAGEN公司Ni-NTAAgarose試劑盒進(jìn)行重組融合蛋白純化，將沉淀的菌體重懸于5mLBufferB中，超聲破碎一凍溶處理4次；超聲破碎每次10s，間歇15S，10次/周期。4°C12000r/min離心30min，收集上清，加入用BufferB平衡過的Ni-NTA瓊脂糖珠，4。C輕柔振蕩30min;用漂洗緩沖液BufferC、D依次清洗Ni-NTA瓊脂糖珠，最后用BufferE對(duì)Ni-NTA瓊脂糖珠進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)(參見圖1和圖2)。2.抗人VPOl抗體的制備將含有1.Omg/mlVPOl溶液1.Oml與相同體積的完全Freund's佐劑混勻，完全乳化后，從純系新西蘭白兔背部的四個(gè)不同部位各皮下注射0.5ml;4周后，每只白兔皮下注射入濃度為1.Omg/ml的VPOl溶液1.Oml與相同體積不完全Freund's佐劑混勻完全乳化的乳液，加強(qiáng)免疫；2周后進(jìn)行第二次加強(qiáng)免疫；第二次加強(qiáng)免疫10天后從白兔的耳緣靜脈處放血，收集約40ml的靜脈血。以后每隔2周進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，每次加強(qiáng)免疫后10天采血，直至血量明顯減少，抗體滴度下降為止。將兔血在室溫下靜置數(shù)小時(shí)接著置于4t:下過夜，使之產(chǎn)生血凝塊，用消毒過的木棒將血凝塊從附壁處刮下，4t:5000g離心20min，收集血清，-2(TC下貯存待純化。純化抗人VPOl抗體(1)將所有需要的材料取出平衡至室溫；(2)葡萄球菌蛋白A-S印haroseCL-4B(Amershampharmaciabiotech)凝膠在0.05mol/lTris_Hcl+0.05olINaCIpH8.6緩沖溶液(緩沖液A)中浸泡24h后脫氣裝入一根10ml的蛋白A凝膠柱，然后用5倍柱體積的0.05mol/lTris-HCL緩沖液(pH7.5)平衡柱；(3)抗血清樣品4。C下3000rpm離心15min后，取上清液以5ml/min的速度上柱;(4)用10倍柱體積的0.05mol/lTris-HCL+O.5mol/lNaCl，pH8.0的緩沖液(緩沖液B)清洗柱，流速為3ml/10min，用A280nm監(jiān)控洗滌液；(5)基線恢復(fù)后，用5倍柱體積的0.lmol/1乙酸緩沖液+0.05mol/LNaCl，pH3.0(緩沖液C)洗脫抗體，洗脫液收集后，立即加入1/5收集體積的pH9.0的0.05mol/lTris-HCL緩沖液中和，混勻；(6)加入適量的PEG20000濃縮抗體溶液，然后對(duì)PBS透析24小時(shí)，中間換液3次；透析后的抗體液-2(TC下保存；(7)將親和色譜柱再生、平和后待下次使用。測(cè)定抗體效價(jià)(1)用包被液將純化的VPOl蛋白稀釋至1.Oug/ml濃度，以lOOul/孔體積包被96孔酶標(biāo)板，3%BSA溶液封閉，4t:放置過夜；(2)將上述制得的純化抗人VPOl抗體稀釋后，以100ul/孔加入以上包被的96孔酶標(biāo)板中，每個(gè)樣品平行做兩份，PBS作為陰性對(duì)照；(3)37t:下孵育30min后洗板三次，最后排干；(4)樣品和標(biāo)準(zhǔn)孔中各自加入100ulAP-羊抗兔IgG(l:2500，Promega公司)，37。C孵育30min，再洗板三次，排干;(5)每孔加入PNPP酶底物顯色液100ul。室溫孵育15-30min;(6)每孔加入100ullmol/LH2S04終止液終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀的450nm波長下測(cè)出各孔的吸光度值；(7)以標(biāo)準(zhǔn)品系列的各平均吸光度值對(duì)其相應(yīng)效價(jià)計(jì)算出劑量_反應(yīng)曲線，將樣品的平均吸光度值代入劑量_反應(yīng)曲線計(jì)算出自制純化的VPOl抗體效價(jià)為1:10000。3.建立ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線(1)抗體工作濃度的選擇為確定制備的VPOl抗體和包被抗體的最佳工作濃度，采用方陣法進(jìn)行滴定。以陰性對(duì)照A450值<0.1，VPOl檢測(cè)抗體的A450值為1.0是的稀釋度為最佳工作濃度，以此標(biāo)準(zhǔn)確定檢測(cè)抗體的最佳工作濃度為1:iooo，抗體稀釋度在1:2000時(shí)仍能較好的反映出抗原量在7-103ng/ml之間的變化，因此最佳工作濃度為i:2000。以方陣法確定的最佳濃度配比稀釋VPOl抗體，加入倍比稀釋度已知濃度的抗原，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，參見圖3。(2)敏感度試驗(yàn)以方陣法所確定的最佳濃度配比檢測(cè)梯度稀釋度VPOl抗原，得本方法敏感度。當(dāng)VPOl抗原為7ng/ml時(shí)陽性/陰性(P/N值)>2.1，故該ELISA敏感度5為7ng/ml，見表1。表1不同濃度VP01蛋白ELISA的反應(yīng)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(3)特異度試驗(yàn)以新建立的ELISA進(jìn)行BSA、MP0與VP01抗體特異性檢測(cè)，沒有發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)。(4)檢出限的測(cè)定檢測(cè)下限可達(dá)7ng/ml，線性測(cè)定范圍在7-103ng/ml。(5)精確度測(cè)定三份不同血清樣本同批連續(xù)測(cè)定8次，批內(nèi)平均CV為6.4%和9.0%，平均皮內(nèi)變異系數(shù)為7.7%;三份樣本分6次測(cè)定，其批間CV分別為5.6%和6.1%，平均批件變異系數(shù)為5.8%。4.VP01試劑盒的制備(1)本發(fā)明的血管過氧化物酶ELISA試劑盒組成包括抗人VP01抗體、酶標(biāo)記抗體、VP01標(biāo)準(zhǔn)品、樣品稀釋液、PNPP酶底物顯色液、濃縮洗滌液和終止反應(yīng)液；其中抗體抗人VP01多克隆抗體；堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,AP)標(biāo)記二抗底物顯色液4-硝基苯基磷酸二鈉鹽(p-nitrophenylphospheyl，PNPP)樣品稀釋液100mmol/LpH9.6的碳酸鹽緩沖液中含有3.03gNa2C03，6.0gNaHC03濃縮洗滌液:100,1/LpH7.4-7.6的磷酸鹽緩沖液中含有1.16gNa2HP04，0.lgKC10.lgK3P04，4.0gNaCl封閉液100mmol/LpH7.4-7.6的磷酸鹽緩沖液中含有5%BSA，O.5%Tween-20;終止反應(yīng)液1.0mol/LH2S04所述酶標(biāo)板為96孔(12條8孔或8條12孔)。(2)血管過氧化物酶定量檢測(cè)的ELISA試劑盒的使用a)酶標(biāo)板條安裝酶標(biāo)板條平衡至室溫后，開啟包裝袋，去除所需數(shù)目的酶標(biāo)板條，牢固地安裝在酶標(biāo)板框架上。不需要的酶標(biāo)板置于包裝袋上，驅(qū)氣密封好，放在2-『C下貯存。b)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品及樣品孵育①用包被液稀釋蛋白標(biāo)準(zhǔn)品及樣品后加入到相應(yīng)的酶標(biāo)板孔中；其中，蛋白標(biāo)準(zhǔn)品濃度稀釋為100、50、25、12.5、6.25、3.12、1.56ng/mL以建立標(biāo)準(zhǔn)劑量_反應(yīng)曲線?？瞻卓字兄患尤雔OOul樣品稀釋液；②用酶標(biāo)板蓋蓋好，在37t:下孵育60分鐘。吸走或倒空孔中液體，用自動(dòng)洗板儀洗板，2次后拍干。c)封閉用100mmol/LpH7.4-7.6的磷酸鹽緩沖液中含有5%BSA，O.5%Tween-20的封閉液孵育60分鐘，吸走或倒空孔中液體，用自動(dòng)洗板儀洗板，2次后拍干。d)抗人VP01抗體孵育將抗人VP01抗體稀釋至10ug/ml，每個(gè)酶標(biāo)板孔加入lOOul孵育60分鐘，吸走或倒空孔中液體，用自動(dòng)洗板儀洗板，3次后拍干。e)酶標(biāo)記抗體孵育①倒酶標(biāo)記抗體溶液于容器中，用移液器每孔加入lOOul酶標(biāo)記抗體溶液；②蓋好酶標(biāo)板，在37t:下孵育反應(yīng)用60分鐘；洗板4次后拍干。f)底物反應(yīng)顯色每孔加入PNPP酶底物顯色液，輕輕晃搖30秒鐘，室溫靜置反應(yīng)15分鐘。g)終止反應(yīng)檢測(cè)每孔加入lOOul終止反應(yīng)液，20分鐘內(nèi)在酶標(biāo)儀的450nm波長下測(cè)出每孔的吸光度值。h)結(jié)果計(jì)算計(jì)算重復(fù)孔的平均吸光度值；以標(biāo)準(zhǔn)溶液系列的平均吸光度值的對(duì)數(shù)值對(duì)相應(yīng)濃度的對(duì)數(shù)值進(jìn)行線性回歸，構(gòu)建劑量-反應(yīng)曲線；由樣品重復(fù)孔的平均吸光度值從劑量-反應(yīng)曲線計(jì)算出加入樣品液中的VP01含量。實(shí)施例2:試劑盒精密度(CV%)的檢測(cè)分析隨機(jī)抽取三份體檢的血液樣本制成血清后，用上述VPOl試劑盒的使用方法測(cè)定并計(jì)算出樣本的VP01濃度和方法的分析內(nèi)精密度，檢測(cè)結(jié)果如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>檢測(cè)結(jié)果表明，應(yīng)用本發(fā)明的試劑盒的檢測(cè)精密度符合ELISA質(zhì)量指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)要求，分析靈敏度小于5.Ong/ml，適用于實(shí)際臨床檢測(cè)。實(shí)施例3:試劑盒臨床應(yīng)用檢測(cè)應(yīng)用本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)451例年齡38-75歲的人群，其中正常對(duì)照組95例(男42例、女53例)，穩(wěn)定性心絞痛(StableAnginaPectories，SAP)組191例(男95例，女96例)，急性心肌梗死組(AcuteCoronarySyndrome,ACS)組165例(男82例、女83例)血清中VP01水平，結(jié)果如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注*:與對(duì)照組相比，P<0.01;#與穩(wěn)定型心絞痛組相比，P<0.01。結(jié)果提示血液中VPOl濃度升高可作為冠心病患者病情嚴(yán)重程度的指標(biāo)。權(quán)利要求一種VPO1融合蛋白，其特征在于通過以下制備方法獲得以含VPO1基因的質(zhì)粒為模板，根據(jù)原核表達(dá)載體pEGX-4T-2的GST閱讀框架設(shè)計(jì)引物，使VPO1基因的編碼區(qū)閱讀框與GST的閱讀框架一致，并使引物帶有SalI和NotI酶切位點(diǎn)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，切膠后，經(jīng)凝膠回收線性的4.9kb的VPO1編碼區(qū)片段；用所述PCR回收產(chǎn)物及pEGX-4T-2載體進(jìn)行SalI和NotI雙酶切，產(chǎn)生匹配的粘末端，之后將pEGX-4T-2載體與VPO1基因連接，構(gòu)建成符合閱讀框的GST-VPO1融合基因；用含融合基因的pEGX-4T-2-VPO1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，挑選陽性菌落，提取純化獲得重組融合蛋白。2.如權(quán)利要求1所述的VPOl融合蛋白，其特征在于所述引物為Forward:5'-gatagi￡￡^￡atcacctggaacaaggatgg_3';Reverse:5'-atgcggccgctggctgctagacacgttcac_3'。3.—種抗人VPOl多克隆抗體，其特征在于以權(quán)利要求1或2所述的VPOl融合蛋白免疫溫血?jiǎng)游锖?，制備的多克隆抗體。4.如權(quán)利要求3所述的抗人VP01多克隆抗體，其特征在于所述溫血?jiǎng)游餅樾挛魈m白兔。5.—種血管過氧化物酶ELISA試劑盒，包括樣品稀釋液、酶底物顯色液、濃縮洗滌液、封閉液和終止反應(yīng)液，其特征在于還包括如權(quán)利要求1或2所述的VPOl融合蛋白、權(quán)利要求3或4所述的抗人VPOl抗體包被的酶標(biāo)板，以及酶標(biāo)記二抗。6.如權(quán)利要求5所述的ELISA試劑盒，其特征在于由以下試劑組成VPOl標(biāo)準(zhǔn)品濃度為1000ng/ml的VPOl融合蛋白；抗人VPOl多克隆抗體；堿性磷酸酶標(biāo)記二抗；顯色液4-硝基基磷酸二鈉鹽；樣品稀釋液100mmol/LpH9.6的碳酸鹽緩沖液中含有3.03gNa^O^6.OgNaHC03;濃縮洗滌液100,1/LpH7.4-7.6的磷酸鹽緩沖液中含有1.16gNa2HP04，0.lgKCl，O.lgK3P04，4.OgNaCl;封閉液:100,1/LpH7.4-7.6的磷酸鹽緩沖液中含有1%BSA，O.5%Tween-20;終止反應(yīng)液1.Omol/L的H2S04。7.權(quán)利要求1或2所述的VPOl融合在冠心病診斷中的應(yīng)用。8.權(quán)利要求3或4所述的抗人VP01多克隆抗體在冠心病診斷中的應(yīng)用。9.權(quán)利要求5或6所述的血管過氧化物酶ELISA試劑盒在冠心病診斷中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種用于冠心病診斷的血管過氧化物酶ELISA試劑盒，發(fā)明人制備VPO1融合蛋白，以及抗人VPO1多克隆抗體，并在此基礎(chǔ)上提供一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、使用方便、快速的定量檢測(cè)人血清、血漿、腦脊液或其他人組織勻漿中的血管過氧化物酶濃度的ELISA試劑盒。用ELISA方法直接測(cè)定樣品中的VPO1含量，用于冠心病的風(fēng)險(xiǎn)篩查和診斷，該試劑盒檢測(cè)靈敏度小于5.0ng/ml，劑量-反應(yīng)曲線的線性相關(guān)系數(shù)＞0.980，具有簡便、快捷、靈敏、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，為體外診斷定量檢測(cè)血管過氧化物酶提供了有效的手段。文檔編號(hào)G01N33/573GK101792746SQ20101010213公開日2010年8月4日申請(qǐng)日期2010年1月28日優(yōu)先權(quán)日2010年1月28日發(fā)明者張國剛,成光杰,曹淑紅,柏勇平,石瑞正,陳嘉申請(qǐng)人:中南大學(xué)