專利名稱：評價(jià)細(xì)胞狀態(tài)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及評價(jià)細(xì)胞狀態(tài)的方法，例如對進(jìn)行了分化誘導(dǎo)的干細(xì)胞或前體細(xì)胞的分化水平進(jìn)行評價(jià)的方法，特別是對誘導(dǎo)分化成了心肌細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞的干細(xì)胞或前體細(xì)胞的分化水平進(jìn)行評價(jià)的方法。
背景技術(shù)：
隨著細(xì)胞工程學(xué)、再生醫(yī)療的發(fā)展，需要定量性地且迅速地對細(xì)胞的狀態(tài)進(jìn)行評價(jià)的方法。以往廣泛利用由特定的基因、蛋白質(zhì)的表達(dá)水平來評價(jià)細(xì)胞狀態(tài)的方法。以下舉出一例。從二十世紀(jì)七十年代起，對干細(xì)胞(例如作為iPS細(xì)胞、ES細(xì)胞等已知)、前體細(xì)胞的分化誘導(dǎo)進(jìn)行了研究。直至二十世紀(jì)九十年代，主要通過使用特異性抗體的組織染色、流式細(xì)胞術(shù)來檢測表達(dá)蛋白質(zhì)，由此對該細(xì)胞的分化水平進(jìn)行研究。因此， 僅得到半定量性的信息。但是，2000年以后，通常使用定量性的RT-PCR法，可以絕對定量性地檢測分化時(shí)特異性的基因轉(zhuǎn)錄(非專利文獻(xiàn)1)。但是，進(jìn)行細(xì)胞分化時(shí)，存在雖然進(jìn)行轉(zhuǎn)錄未翻譯的基因，暗示基因的轉(zhuǎn)錄水平并非直接反映分化水平(非專利文獻(xiàn)2)。還存在通過對分化誘導(dǎo)后釋放到培養(yǎng)基中的特異性蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測來進(jìn)行分化水平的絕對定量的方法(專利文獻(xiàn)1)。但是，檢測特異性的蛋白質(zhì)時(shí)，檢測靈敏度有可能變差。而且，不存在適當(dāng)?shù)姆置诘鞍踪|(zhì)時(shí)，有必要導(dǎo)入報(bào)道基因(專利文獻(xiàn)2)。[專利文獻(xiàn) 1]日本特開 2OO7-M8873(P2OO7-M8873A) [專利文獻(xiàn) 2]日本特開 2007_374；34 (P2007-37434A) W02004/058687 Bustin, S. A. J Mol Endocrinol. 25: 69-193 (2000) [非專利文獻(xiàn) 2] Wen, J. et al. , J Cellular Biochem 102: 149-160 (2007) [非專利文獻(xiàn)3]現(xiàn)代化學(xué)、東京化學(xué)同人、435、55-61 (2007) M. Yamaguchi et al.，ABSTRACTS 24th International Carbohydrate Symposium. Oslo, Norway 27. July-1. August, 2008. C-P040
上述專利文獻(xiàn)1、2和3以及非專利文獻(xiàn)1 4的全部記載內(nèi)容特別作為公開在本文中引用。

發(fā)明內(nèi)容
如上所述，細(xì)胞的狀態(tài)，例如伴隨著細(xì)胞分化的基因轉(zhuǎn)錄變化的跟蹤通常定量性優(yōu)異，但是未必反映細(xì)胞的狀態(tài)(非專利文獻(xiàn)2)。另一方面，作為翻譯產(chǎn)物的蛋白質(zhì)的檢測，在檢測分化等細(xì)胞的狀態(tài)的方面，可以成為準(zhǔn)確的評價(jià)基準(zhǔn)。但是沒有適當(dāng)?shù)奶禺惪贵w或其檢測靈敏度不優(yōu)異時(shí)，難以進(jìn)行定量性的分析，結(jié)果廣泛使用性降低。因此，本發(fā)明欲解決的課題在于，發(fā)現(xiàn)替代基因、蛋白質(zhì)的細(xì)胞狀態(tài)、例如分化水平的新指標(biāo)，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)可以盡可能定量性地掌握該新指標(biāo)的方法，且提供使用該新指標(biāo)，掌握分化成了特定細(xì)胞的細(xì)胞的分化水平的方法。本發(fā)明中，著眼于根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)的變化，例如分化狀態(tài)的變化，而其糖鏈表達(dá)譜 (Π 7 r ^ ^ )可以定量性地變化(非專利文獻(xiàn)4)。以往的糖鏈結(jié)構(gòu)的分類方法是基于其生物合成路徑而分為高甘露糖型、雜合型、 復(fù)合型三種。但是本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，如圖5所示，若劃分雜合型和復(fù)合型，則不能判定細(xì)胞的分化。比率表示百分率(%)、全部(total)表示表達(dá)量(pmol)。通過質(zhì)量分析來確定糖鏈結(jié)構(gòu)的方法中，是雜合型還是復(fù)合型，存在僅通過一次分析不能確定的結(jié)構(gòu)。對于這種結(jié)構(gòu)， 在圖5的圖中表示為N/I。因此，本發(fā)明中，基于由西村等人開發(fā)的高速全面的(網(wǎng)羅的)糖鏈富集技術(shù) (glyC0bl0tting(糖印跡)法)(專利文獻(xiàn)3、非專利文獻(xiàn)3)，由細(xì)胞的狀態(tài)變化，例如由分化前后的細(xì)胞全面地捕捉糖鏈，通過MALDI-T0F/MS等質(zhì)量分析技術(shù)弄清存在于各細(xì)胞中的糖鏈的定量性的表達(dá)譜?；诖?，聯(lián)系細(xì)胞的分化水平(細(xì)胞的分化階段或類型)，發(fā)現(xiàn)變動的糖鏈。即，鑒定成為分化標(biāo)志的糖鏈或變動的糖鏈，確立靈敏度、特異性都高，定量性地判定分化水平的方法。進(jìn)而發(fā)現(xiàn)，基于其中得到的信息，導(dǎo)入糖鏈類型的概念，由此可以將細(xì)胞亞類化，基于此，完成可以定量性地判定細(xì)胞分化的程度的本發(fā)明(圖6)。具體地說，作為糖鏈的分類方法，分為高甘露糖型和除此之外(非高甘露糖)的類型兩種，進(jìn)而將非高甘露糖型分為(1)平分的有無、( 巖藻糖的個數(shù)(0、1或2以上)、(3) 唾液酸的有無以及修飾的種類、⑷支鏈度0或3以上)的類別，由此可以定量性地判定細(xì)胞的分化。根據(jù)本發(fā)明，通過在靈敏度以及特異性方面超過現(xiàn)有方法或具有互補(bǔ)優(yōu)越性的方法，可以對細(xì)胞的狀態(tài)，例如前體細(xì)胞、干細(xì)胞等的分化水平，即品質(zhì)定量性地進(jìn)行判定、管理。進(jìn)一步地，可以對干細(xì)胞等的分化水平進(jìn)行高靈敏度且定量性的測定，由此品質(zhì)和安全性管理的系統(tǒng)提高，可以期待對再生醫(yī)療的貢獻(xiàn)。


[圖1-1]表示實(shí)施例1中得到的各糖鏈的表達(dá)量的表達(dá)譜。[圖1-2]對由實(shí)施例1中得到的表達(dá)譜，根據(jù)糖鏈類型(單-Fuc、雙-Fuc、 非-Fuc、高甘露糖)，亞類化而表現(xiàn)出來的結(jié)果進(jìn)行說明。括弧內(nèi)的數(shù)值表示所檢測的糖鏈種類。[圖1-3]表示實(shí)施例1中得到的進(jìn)行分化誘導(dǎo)后的細(xì)胞和未進(jìn)行分化誘導(dǎo)而培養(yǎng)的細(xì)胞的免疫細(xì)胞染色結(jié)果。[圖2-1]表示實(shí)施例2中得到的各糖鏈的表達(dá)量的表達(dá)譜。[圖2-2]對由實(shí)施例2中得到的表達(dá)譜，根據(jù)糖鏈類型(平分、平分以外、高甘露糖)，亞類化而表現(xiàn)出來的結(jié)果進(jìn)行說明。括弧內(nèi)的數(shù)值表示所檢測的糖鏈種類。[圖2-3]表示對于實(shí)施例2中得到的進(jìn)行分化誘導(dǎo)后的細(xì)胞和分化前的細(xì)胞的免疫細(xì)胞染色結(jié)果。[圖3-1]表示實(shí)施例3中得到的各糖鏈的表達(dá)量的表達(dá)譜。PeakNo. 68為內(nèi)標(biāo)的峰。[圖3-2]表示實(shí)施例3中得到的各糖鏈的表達(dá)量的表達(dá)譜(圖3-1的縱軸放大)。[圖3-3]對由實(shí)施例3中得到的表達(dá)譜，根據(jù)分化前后的糖鏈類型(平分、平分以外、高甘露糖)，亞類化而表現(xiàn)出來的結(jié)果進(jìn)行說明。[圖4-1]表示實(shí)施例4中得到的各糖鏈的表達(dá)量的表達(dá)譜。PeakNo. M為內(nèi)標(biāo)的峰。[圖4-2]表示實(shí)施例4中得到的各糖鏈的表達(dá)量的表達(dá)譜(圖4-1的縱軸放大)。[圖4-3]對由實(shí)施例4中得到的表達(dá)譜，根據(jù)分化前后的糖鏈類型(單-Fuc、 雙-Fuc、非-Fuc、高甘露糖)，亞類化而表現(xiàn)出來的結(jié)果進(jìn)行說明。[圖4-4]對由實(shí)施例4中得到的表達(dá)譜，根據(jù)分化前后的糖鏈類型(單-SA、 雙-SA、非-SA、單-GC、雙-GC、高甘露糖)，亞類化而表現(xiàn)出來的結(jié)果進(jìn)行說明。[圖5]以往的根據(jù)高甘露糖型、雜合型、復(fù)合型的糖鏈結(jié)構(gòu)的分類方法的例子。 比率表示百分率(%)、全部表示表達(dá)量(pmol)。[圖6]實(shí)施例1和2中得到的本發(fā)明的方法中表示細(xì)胞分化的程度的結(jié)果。比率表示百分率(%)、全部表示表達(dá)量(pmol)。
具體實(shí)施例方式[用于評價(jià)細(xì)胞狀態(tài)的糖鏈的類別確定方法]
本發(fā)明的第一實(shí)施方式是用于評價(jià)細(xì)胞狀態(tài)的糖鏈的類別確定方法。該方法包括以下步驟
(1-1)獲取狀態(tài)變化前的細(xì)胞中含有的N-鍵合型糖鏈的獲取定量性的表達(dá)譜， (1-2)獲取狀態(tài)變化后的細(xì)胞中含有的N-鍵合型糖鏈的定量性的表達(dá)譜， (1-3)抽出在上述兩種定量性的表達(dá)譜中存在量之間存在變動的糖鏈組中的至少一部分，
(1-4)將抽出的糖鏈組中含有的各糖鏈，基于糖鏈類型，分為高甘露糖型和非高甘露糖型的類別，且將非高甘露糖型進(jìn)一步分為(1)平分的有無、( 巖藻糖的個數(shù)(0、1或2以上)、⑶唾液酸的有無以及⑷支鏈度O或3以上)的類別，
(1-5)由上述五種類別中，確定至少一種適合于評價(jià)細(xì)胞狀態(tài)的糖鏈的類別。本發(fā)明的上述糖鏈類別確定方法中的細(xì)胞變化，除了干細(xì)胞或前體細(xì)胞的分化之外，還可以舉出細(xì)胞分裂、形態(tài)變化、細(xì)胞死亡、癌化等，但是本發(fā)明不限于它們。此外，細(xì)胞的狀態(tài)包狀細(xì)胞的靜態(tài)和動態(tài)(經(jīng)時(shí)性的狀態(tài)變化)。對于上述(1-1) (1-5)的各步驟，在后述的用于評價(jià)分化水平的糖鏈的類別確定方法中，以用于評價(jià)分化水平的糖鏈的類別確定為例進(jìn)行說明。[評價(jià)細(xì)胞狀態(tài)的方法]
本發(fā)明的第二實(shí)施方式是評價(jià)細(xì)胞狀態(tài)的方法。該方法是使用在上述作為本發(fā)明的第一實(shí)施方式的糖鏈類別確定方法中確定的糖鏈類別的至少一種，評價(jià)細(xì)胞狀態(tài)的方法。作為本發(fā)明的第二實(shí)施方式的評價(jià)細(xì)胞狀態(tài)的方法包括(2-1)獲取狀態(tài)變化前后的細(xì)胞中含有的N-鍵合型糖鏈的定量性的表達(dá)譜， (2-2)由上述定量性的表達(dá)譜中，對于通過權(quán)利要求1中記載的方法確定的糖鏈類別的至少一種，求出該類別中含有的糖鏈(組)的存在量或存在比率的狀態(tài)變化的前后變化。對于作為本發(fā)明的第二實(shí)施方式的細(xì)胞狀態(tài)評價(jià)方法，在后述的評價(jià)進(jìn)行了分化誘導(dǎo)的干細(xì)胞或前體細(xì)胞的分化水平的方法中，以評價(jià)分化水平的方法為例進(jìn)行說明。[用于評價(jià)干細(xì)胞或前體細(xì)胞的分化水平的糖鏈的類別的確定方法]
本發(fā)明的第三實(shí)施方式是用于評價(jià)進(jìn)行了分化誘導(dǎo)的干細(xì)胞或前體細(xì)胞的分化水平的糖鏈類別的確定方法。該方法包括以下步驟
(3-1)獲取在不存在分化誘導(dǎo)劑的條件下培養(yǎng)的干細(xì)胞或前體細(xì)胞中含有的N-鍵合型糖鏈的定量性的表達(dá)譜，
(3-2)獲取在分化誘導(dǎo)劑的存在下培養(yǎng)的干細(xì)胞或前體細(xì)胞中含有的N-鍵合型糖鏈的定量性的表達(dá)譜，
(3-3)抽出上述兩種定量性的表達(dá)譜中存在量有變動的糖鏈組中的至少一部分， (3-4)將抽出的糖鏈組中含有的各糖鏈，基于糖鏈類型，分為高甘露糖型和非高甘露糖型的類別，且將非高甘露糖型進(jìn)一步分為(1)平分的有無、( 巖藻糖的個數(shù)(0、1或2以上)、⑶唾液酸的有無以及⑷支鏈度O或3以上)的類別，
(3-5)由上述五種類別中，確定至少一種適合于評價(jià)干細(xì)胞或前體細(xì)胞的分化水平的糖鏈的類別。步驟(3-1)和(3-2)
步驟(3-1)中，獲取在不存在分化誘導(dǎo)劑的條件下培養(yǎng)的干細(xì)胞或前體細(xì)胞中含有的 N-鍵合型糖鏈的定量性的表達(dá)譜。步驟(3-2)中，獲取在分化誘導(dǎo)劑的存在下培養(yǎng)的干細(xì)胞或前體細(xì)胞中含有的N-鍵合型糖鏈的定量性的表達(dá)譜。步驟(3-1)和(3- 可以依次進(jìn)行或同時(shí)并行進(jìn)行。依次進(jìn)行時(shí)，可以先實(shí)施任意一個步驟。本發(fā)明還包括以下的其它實(shí)施方式，“干細(xì)胞”指的是具有多能性或多分化能力的細(xì)胞。作為“干細(xì)胞”的例子，可以舉出例如胚胎干細(xì)胞、組織干細(xì)胞、生物體干細(xì)胞(生體幹細(xì)胞)或人工多能性干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)。但是，只要是具有多能性或多分化能力的細(xì)胞， 則不限于上述例子。本發(fā)明還包括以下的其它實(shí)施方式?！扒绑w細(xì)胞”是將上述干細(xì)胞進(jìn)行分化誘導(dǎo)而成的細(xì)胞，且為具有多能性的細(xì)胞。若將干細(xì)胞進(jìn)行分化誘導(dǎo)則根據(jù)分化的程度，有未分化的程度低于干細(xì)胞，但是依然具有多能性的細(xì)胞。本發(fā)明中，將這些細(xì)胞統(tǒng)稱為“前體細(xì)胞”。“前體細(xì)胞”只要是具有多能性的細(xì)胞，則不特別限定。實(shí)施例1和實(shí)施例2中使用的 P19CL6、P19C6細(xì)胞株都為前體細(xì)胞。上述“干細(xì)胞”和“前體細(xì)胞”可以來自動物，例如可以為哺乳類、魚類等。作為哺乳類的例子，可以舉出人、小鼠、大鼠、綿羊、豬、猴等，作為魚類的例子，可以舉出鏘、斑馬魚等，但是不限于這些例子。本發(fā)明的第三實(shí)施方式中，在不存在或存在分化誘導(dǎo)劑的條件下進(jìn)行的干細(xì)胞或前體細(xì)胞的培養(yǎng)中，作為干細(xì)胞或前體細(xì)胞的培養(yǎng)方法，可以用公知的方法進(jìn)行。對分化誘導(dǎo)劑不特別限定，可以根據(jù)干細(xì)胞或前體細(xì)胞的種類適當(dāng)選擇。其中，本發(fā)明的第一實(shí)施方式由于是用于評價(jià)干細(xì)胞或前體細(xì)胞的分化水平的糖鏈的類別確定方法，因此，從糖鏈類別的確定容易方面考慮，優(yōu)選使用分化誘導(dǎo)的效果高、能可靠地產(chǎn)生分化誘導(dǎo)的分化誘導(dǎo)劑。但是，根據(jù)分化誘導(dǎo)劑的種類，分化水平(細(xì)胞的分化階段或類型)有可能不同，因此并非總是優(yōu)選使用能可靠地產(chǎn)生分化誘導(dǎo)的分化誘導(dǎo)劑，可以根據(jù)目的分化水平而靈活運(yùn)用是不言而喻的。此外，培養(yǎng)中的分化誘導(dǎo)劑的種類可以為一種或組合多種，此外，培養(yǎng)(培養(yǎng)基)中的分化誘導(dǎo)劑的濃度也可以適當(dāng)選擇。對于經(jīng)培養(yǎng)的干細(xì)胞或前體細(xì)胞，對細(xì)胞中含有的N-鍵合型糖鏈實(shí)施分離、純化處理，獲取分離、純化后的N-鍵合型糖鏈的定量性的表達(dá)譜是適當(dāng)?shù)?。N-鍵合型糖鏈的分離和純化，從不會遺漏N-鍵合型糖鏈且可以迅速地分離、純化的觀點(diǎn)考慮，優(yōu)選例如通過專利文獻(xiàn)3和非專利文獻(xiàn)3中記載的糖印跡法進(jìn)行。定量性的表達(dá)譜，以與分化誘導(dǎo)劑一起培養(yǎng)的干細(xì)胞或前體細(xì)胞的分化達(dá)到某種程度以上，即分化的進(jìn)展達(dá)到明顯的程度進(jìn)行是適當(dāng)?shù)?。其中，分化進(jìn)展達(dá)到明顯的程度，根據(jù)細(xì)胞的種類、分化誘導(dǎo)劑的種類、培養(yǎng)的條件等不同而變動，因此在考慮這些條件的基礎(chǔ)上來適當(dāng)確定是合適的。定量性的表達(dá)譜，優(yōu)選通過使用分離、純化過的N-鍵合型糖鏈，利用 MALDI-TOF/MS (matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight/ mass spectrometry)或 LC-ESI/SSI-TOF/MS (liquid chromatography-electrospray ionization/sonic spray ionization-time of flight/ mass spectrometry)來得至Ij0通過使用MALDI-TOF/MS或LC-ESI/SSI-TOF/MS，迅速且高精度地對N-鍵合型糖鏈進(jìn)行定量， 從而可以獲取定量性的表達(dá)譜。步驟(3-3)和(3-4)
步驟(3-3)中，抽出在上述步驟(3-1)和(3-2)中分別得到的兩種定量性的表達(dá)譜中存在量之間有變動的糖鏈組中的至少一部分，進(jìn)而在步驟(3-4)中，將步驟(3- 中抽出的糖鏈組中含有的各糖鏈，基于糖鏈類型，分為高甘露糖型和非高甘露糖型的類別，且將非高甘露糖型進(jìn)一步分為(1)平分的有無、(2)巖藻糖的個數(shù)(0、1或2以上)、(3)唾液酸的有無以及⑷支鏈度O或3以上)的類別。本發(fā)明人通過實(shí)驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，作為用于評價(jià)干細(xì)胞或前體細(xì)胞的分化水平的糖鏈的類別，可以舉出上述五種類別。定量性的表達(dá)譜中的糖鏈組，有時(shí)根據(jù)細(xì)胞的種類以及分化的方向和程度不同而不同，但是通常為幾十 一百幾十(百數(shù)十)程度。從其中抽出存在量根據(jù)分化水平變動的糖鏈組中的至少一部分，且將抽出的糖鏈組，基于上述糖鏈類型分為五種類別。步驟(3-5)
步驟(3-5)中，由上述五種類別中，確定至少一種適合于評價(jià)細(xì)胞狀態(tài)的糖鏈的類別。 適合于評價(jià)細(xì)胞狀態(tài)的糖鏈的類別，例如可以是將在不存在分化誘導(dǎo)劑的條件下培養(yǎng)的干細(xì)胞或前體細(xì)胞中，存在量或存在比率的經(jīng)時(shí)性變動不顯著，而在分化誘導(dǎo)劑的存在下培養(yǎng)的干細(xì)胞或前體細(xì)胞中，存在量或存在比率的經(jīng)時(shí)性變動顯著的糖鏈分類的類別。其中選擇、確定的糖鏈的類別，在后述的評價(jià)進(jìn)行了分化誘導(dǎo)的干細(xì)胞或前體細(xì)胞的分化水平的方法中，可以用作分化水平的評價(jià)指標(biāo)。[評價(jià)進(jìn)行了分化誘導(dǎo)的干細(xì)胞或前體細(xì)胞的分化水平的方法]
本發(fā)明的第四實(shí)施方式是評價(jià)進(jìn)行了分化誘導(dǎo)的干細(xì)胞或前體細(xì)胞的分化水平的方法。該方法包括以下步驟(4-1)經(jīng)時(shí)性地獲取在分化誘導(dǎo)劑的存在下培養(yǎng)的干細(xì)胞或前體細(xì)胞中含有的N-鍵合型糖鏈的定量性的表達(dá)譜，
(4-2)由上述定量性的表達(dá)譜中，對于由本發(fā)明的第三實(shí)施方式的方法確定的糖鏈類別的至少一種，求出該類別中含有的糖鏈(組)的存在量或存在比率的經(jīng)時(shí)性變化。步驟1)
步驟中，在分化誘導(dǎo)劑的存在下培養(yǎng)的干細(xì)胞或前體細(xì)胞中含有的N-鍵合型糖鏈的定量性的表達(dá)譜的獲取，可以與上述步驟(3-2)同樣地實(shí)施。但是，步驟中，定量性的表達(dá)譜是經(jīng)時(shí)性地獲取的。具體地說，隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移，對培養(yǎng)物進(jìn)行取樣，由取樣的培養(yǎng)物分離、純化N-鍵合型糖鏈，獲取該N-鍵合型糖鏈的定量性的表達(dá)譜。定量性的表達(dá)譜的經(jīng)時(shí)性獲取在培養(yǎng)開始后進(jìn)行至少一次，優(yōu)選進(jìn)行兩次以上，例如可以為2次、 3次或4次，但是也可以進(jìn)行超過4次。步驟0-2)
步驟G-2)中，對于由本發(fā)明的第三實(shí)施方式的方法確定的糖鏈的類別的至少一種， 求出定量性的表達(dá)譜中上述類別中含有的糖鏈(組)的存在量或存在比率的經(jīng)時(shí)性變化。通過本發(fā)明的第三實(shí)施方式的糖鏈類別確定方法，發(fā)現(xiàn)可以用作以下說明的心肌分化水平評價(jià)方法和神經(jīng)細(xì)胞分化水平評價(jià)方法中使用的分化標(biāo)志的糖鏈類型(糖鏈類別)。具體說明如實(shí)施例中所述，作為可以用于心肌分化水平評價(jià)方法的分化標(biāo)志，發(fā)現(xiàn)可以使用選自具有1個巖藻糖的類型的糖鏈組、具有2個巖藻糖的類型的糖鏈組中的至少一種。此外，作為可以用于神經(jīng)細(xì)胞分化水平評價(jià)方法的分化標(biāo)志，發(fā)現(xiàn)可以使用選自具有平分結(jié)構(gòu)的類型的糖鏈組、不具有平分結(jié)構(gòu)的類型的糖鏈組中的至少一種。以下對使用上述發(fā)現(xiàn)的分化標(biāo)志的分化水平評價(jià)方法進(jìn)行說明。[心肌分化水平評價(jià)方法]
本發(fā)明的第五實(shí)施方式是評價(jià)干細(xì)胞或前體細(xì)胞的心肌分化水平的方法。該方法包括
(5-1)經(jīng)時(shí)性地獲取在心肌分化誘導(dǎo)劑的存在下培養(yǎng)的干細(xì)胞或前體細(xì)胞中含有的 N-鍵合型糖鏈的定量性的表達(dá)譜，
(5-2)求出選自上述定量性的表達(dá)譜中具有1個巖藻糖的類型的糖鏈組的存在量或存在比率、具有2個巖藻糖的類型的糖鏈組的存在量或存在比率和高甘露糖型的糖鏈組的存在量或存在比率中的至少一種。步驟(5-1)
作為心肌分化誘導(dǎo)劑，可以舉出例如二甲基亞砜(DMS0)、催產(chǎn)素等。N-鍵合型糖鏈的定量性的表達(dá)譜的經(jīng)時(shí)性獲取可以與上述第三實(shí)施方式的步驟(3-2)同樣地進(jìn)行，但是所使用的分化誘導(dǎo)劑為心肌分化誘導(dǎo)劑。本發(fā)明的方法中使用的干細(xì)胞或前體細(xì)胞如上述第一實(shí)施方式所述，但是特別優(yōu)選為P19CL6細(xì)胞、ES細(xì)胞、iPS細(xì)胞等。步驟(5-2)
求出選自定量性的表達(dá)譜中具有1個巖藻糖的類型的糖鏈組的存在量或存在比率、具有2個巖藻糖的類型的糖鏈組的存在量或存在比率和高甘露糖型的糖鏈組的存在量或存在比率中的至少一種。本發(fā)明中，基于這些中任意一種糖鏈組的存在量或存在比率，可以評價(jià)心肌分化水平，但是優(yōu)選基于這三種糖鏈組的存在量或存在比率綜合性地進(jìn)行評價(jià)。具有一個巖藻糖的類型的糖鏈組例如為表1中的化3、化19、化31。具有兩個巖藻糖的類型的糖鏈組例如為表1中的化20、化28、化34。高甘露糖型的糖鏈組例如為表1中的化5、化8、化14。如實(shí)施例1所示，在小鼠的前體細(xì)胞中，上述定量性的表達(dá)譜中具有一個巖藻糖的類型的糖鏈組的存在量或存在比率因培養(yǎng)而增大的細(xì)胞，心肌分化水平提高。同樣地，具有兩個巖藻糖的類型的糖鏈組的存在量或存在比率因上述培養(yǎng)而減少的細(xì)胞，心肌分化水
平提尚。[分化成神經(jīng)細(xì)胞的分化水平評價(jià)方法(1)]
本發(fā)明的第六實(shí)施方式是對來自小鼠的干細(xì)胞或前體細(xì)胞的分化成神經(jīng)細(xì)胞的分化水平進(jìn)行評價(jià)的方法。該方法包括
(6-1)對于在誘導(dǎo)分化成神經(jīng)細(xì)胞的分化誘導(dǎo)劑的存在下培養(yǎng)的干細(xì)胞或前體細(xì)胞中含有的N-鍵合型糖鏈，經(jīng)時(shí)性地獲取定量性的表達(dá)譜，
(6-2)求出選自上述定量性的表達(dá)譜中具有平分結(jié)構(gòu)的類型的糖鏈組的存在量或存在比率、不具有平分結(jié)構(gòu)的類型的糖鏈組的存在量或存在比率中的至少一種。步驟(6-1)
作為誘導(dǎo)分化成神經(jīng)細(xì)胞的分化誘導(dǎo)劑，可以舉出例如視黃酸、DMSO等。N-鍵合型糖鏈的定量性的表達(dá)譜的經(jīng)時(shí)性獲得可以與上述第一實(shí)施方式的步驟(3-2)同樣地進(jìn)行，但是所使用的分化誘導(dǎo)劑為誘導(dǎo)分化成神經(jīng)細(xì)胞的分化誘導(dǎo)劑。本發(fā)明的方法中使用的干細(xì)胞或前體細(xì)胞如上述第一實(shí)施方式所述，但是特別優(yōu)選為P19細(xì)胞、P19C6細(xì)胞、ES細(xì)胞、iPS細(xì)胞等。步驟(6-2)
求出選自定量性的表達(dá)譜中具有平分結(jié)構(gòu)的類型的糖鏈組的存在量或存在比率、不具有平分結(jié)構(gòu)的類型的糖鏈組的存在量或存在比率和高甘露糖型的糖鏈組的存在量或存在比率中的至少一種。本發(fā)明中，基于這些中的任意一種糖鏈組的存在量或存在比率，可以評價(jià)分化成神經(jīng)細(xì)胞的分化水平，但是優(yōu)選基于這三種糖鏈組的存在量或存在比率綜合性地進(jìn)行評價(jià)。平分結(jié)構(gòu)指的是具有平分GIcNAC的糖鏈的結(jié)構(gòu)。已知若在骨架的糖鏈結(jié)構(gòu)中附加平分GlcNAc，則分支不會進(jìn)一步伸長或糖鏈不會被切斷。此外，對糖鏈結(jié)構(gòu)附加平分GlcNAc的反應(yīng)通過被稱為GnT-III的酶來催化。Qkeck, Y.，et al.，Trends in Glycoscience and Glycotechnology 13: 167-176)(該文獻(xiàn)的全部記載特別作為公開在本文中引用。)
具有平分結(jié)構(gòu)的類型的糖鏈組例如為表2中的化15、化45、化64。不具有平分結(jié)構(gòu)的類型的糖鏈組例如為表2中的化17、化21、化68。高甘露糖型的糖鏈組與上述第五實(shí)施方式中說明的相同。如實(shí)施例2所示，在小鼠的前體細(xì)胞中，上述具有平分結(jié)構(gòu)的類型的糖鏈組的存在量或存在比率因培養(yǎng)而增大的細(xì)胞，分化成神經(jīng)細(xì)胞的分化水平提高。進(jìn)一步地，上述不具有平分結(jié)構(gòu)的類型的糖鏈組的存在量或存在比率因培養(yǎng)而減少的細(xì)胞，分化成神經(jīng)細(xì)胞的分化水平提高。此外，上述高甘露糖型的糖鏈組的存在量或存在比率因上述培養(yǎng)而減少的細(xì)胞，分化成神經(jīng)細(xì)胞的分化水平提高。如實(shí)施例3所示，在小鼠的ES細(xì)胞中，上述具有平分結(jié)構(gòu)的類型的糖鏈組的存在量或存在比率因培養(yǎng)而增大的細(xì)胞，分化成神經(jīng)細(xì)胞的分化水平提高。進(jìn)一步地，上述不具有平分結(jié)構(gòu)的類型的糖鏈組的存在量或存在比率因培養(yǎng)而減少的細(xì)胞，分化成神經(jīng)細(xì)胞的分化水平提高。此外，高甘露糖型的糖鏈組的存在量或存在比率因上述培養(yǎng)而減少的細(xì)胞， 分化成神經(jīng)細(xì)胞的分化水平提高。[分化成神經(jīng)細(xì)胞的分化水平評價(jià)方法(2)]
本發(fā)明的第七實(shí)施方式是對來自人的干細(xì)胞或前體細(xì)胞的分化成神經(jīng)細(xì)胞的分化水平進(jìn)行評價(jià)的方法。該方法包括
(7-1)經(jīng)時(shí)性地獲取在誘導(dǎo)分化成神經(jīng)細(xì)胞的分化誘導(dǎo)劑的存在下培養(yǎng)的干細(xì)胞或前體細(xì)胞中含有的N-鍵合型糖鏈的定量性的表達(dá)譜，
(7-2)求出選自上述定量性的表達(dá)譜中具有一個巖藻糖的類型的糖鏈組的存在量或存在比率、不具有唾液酸的類型的糖鏈組的存在量或存在比率和高甘露糖型的糖鏈組的存在量或存在比率中的至少一種的經(jīng)時(shí)性變化。步驟(7-1)
作為誘導(dǎo)分化成神經(jīng)細(xì)胞的分化誘導(dǎo)劑，與步驟(6-1)同樣地，可以舉出例如視黃酸、 DMSO等。N-鍵合型糖鏈的定量性的表達(dá)譜的經(jīng)時(shí)性獲取可以與上述第一實(shí)施方式的步驟 (3-2)同樣地進(jìn)行，但是所使用的分化誘導(dǎo)劑是誘導(dǎo)分化成神經(jīng)細(xì)胞的分化誘導(dǎo)劑。本發(fā)明的方法中使用的來自人的干細(xì)胞或前體細(xì)胞如上述第一實(shí)施方式所述，但是特別優(yōu)選為ES細(xì)胞、iPS細(xì)胞等。步驟(7-2)
求出選自定量性的表達(dá)譜中具有一個巖藻糖的類型的糖鏈組的存在量或存在比率、不具有唾液酸的類型的糖鏈組的存在量或存在比率和高甘露糖型的糖鏈組的存在量或存在比率中的至少一種的經(jīng)時(shí)性變化。本發(fā)明中，基于這些中的任意一種糖鏈組的存在量或存在比率，可以評價(jià)分化成神經(jīng)細(xì)胞的分化水平，但是優(yōu)選基于這三種糖鏈組的存在量或存在比率，綜合性地進(jìn)行評價(jià)。具有一個巖藻糖的類型的糖鏈、不具有唾液酸的類型的糖鏈和高甘露糖型的糖鏈例如可以為實(shí)施例4的表4所示的糖鏈。如實(shí)施例4所示，在人的ES細(xì)胞中，具有一個巖藻糖的類型的糖鏈組的存在量或存在比率因培養(yǎng)而增大的細(xì)胞，分化成神經(jīng)細(xì)胞的分化水平提高。進(jìn)一步地，不具有唾液酸的類型的糖鏈組(Non-SA)的存在量或存在比率因培養(yǎng)而增大的細(xì)胞，分化成神經(jīng)細(xì)胞的分化水平提高。此外，高甘露糖型的糖鏈組的存在量或存在比率因上述培養(yǎng)而減少的細(xì)胞， 分化成神經(jīng)細(xì)胞的分化水平提高。第五實(shí)施方式 第七實(shí)施方式中，在實(shí)施例中，各糖鏈組的存在量或存在比率的經(jīng)時(shí)性變化的趨勢得到關(guān)注，通過得到以及積累與各糖鏈組的存在量或存在比率的經(jīng)時(shí)性變化和分化的階段或類型的關(guān)系相關(guān)的信息，由各糖鏈組的存在量或存在比率，還可以定量性地掌握分化的階段或類型。例如，在再生醫(yī)療中使用分化細(xì)胞時(shí)，在安全性方面優(yōu)選不含有未分化狀態(tài)的細(xì)胞。因此，準(zhǔn)確地掌握通過培養(yǎng)得到的細(xì)胞的分化階段是重要的。此外，確認(rèn)分化為目的細(xì)胞也是重要的，因此要求準(zhǔn)確地掌握分化的類型。通過本發(fā)明的方法還可以由各糖鏈組的存在量或存在比率來定量性地掌握分化的階段或類型。
實(shí)施例以下通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行更具體的說明。細(xì)胞糖組學(xué)試驗(yàn)方案(夕’，4 -笑夕7 口卜- —卟)_ 實(shí)施例中使用的細(xì)胞糖組學(xué)(glycomics)按照以下的試驗(yàn)方案實(shí)施。<細(xì)胞裂解液的制備和N-聚糖(N-Glycan)的游離>
在IOmM EDTA/PBS中，使用細(xì)胞刮棒從皿中回收細(xì)胞，用PBS進(jìn)行洗滌?！ぜ尤?%(終濃度)TritonX-100，在冰上溫育1小時(shí)，使細(xì)胞增溶溶解?！?加入80%(終濃度)丙酮，在一 20°C下溫育一晚，使蛋白質(zhì)級分沉淀?！るx心后，用乙腈洗滌沉淀，完全除去丙酮?！⒊恋盹L(fēng)干后，加入含有0.2%PHM(1-丙磺酸，2_羥基_3_肉豆蔻酰胺 (myristamido))的80mM的碳酸氫銨50 μ L，60°C下培養(yǎng)10分鐘，使其增溶溶解。·向增溶溶解后的蛋白質(zhì)級分中加入終濃度為IOmM的DTT，60°C下進(jìn)行還原反應(yīng) 30分鐘?！ぜ尤?0mM的碘乙酰胺，在室溫、遮光條件下溫育30分鐘，由此將通過6.還原的
氨基酸殘基烷基化。·加入800U胰蛋白酶，37°C下溫育一晚?！?90°C下使胰蛋白酶失活10分鐘，加入2U的肽-N-聚糖酶F，使N-鍵合型糖鏈游離。·對于游離的糖鏈，加入15pmol的A2 amide Glycan作為內(nèi)標(biāo)后，用真空離心蒸發(fā)濃縮器(SpeedVac)濃縮，使終容量為20 μ L?！刺怯≯E〉
通過使用BlotGlyco H(住友^一夕7 ^卜株式會社)的糖印跡法富集上述10.中得到的N-鍵合型糖鏈。該方法根據(jù)下述文獻(xiàn)中記載的方法實(shí)施。具體的方法如以下的文獻(xiàn)所示。以下的四篇文獻(xiàn)的全部記載特別作為公開在本文中引用。 · Furukawa J--i.，et al.， Anal.Chem.4·1094-1101 (2008) Baudino L.，etal.， J. Immunol.，181:4107--4112(2008) Baudino L.，etal.， J. Immunol.，181:6664--6669(2008) Uematsu R.，etal.，Mol. Cell. Proteom.，inpress(2008)
<使用BlotGlyco H珠的糖印跡>
通過肽-N-聚糖酶F進(jìn)行游離，加入15pmol的A2 amide Glycan作為內(nèi)標(biāo)后，用真空離心蒸發(fā)濃縮器(SpeedVac)濃縮，使N-鍵合型糖鏈的終容量為20 μ L，將該N-鍵合型糖鏈加入到BlotGlyco H珠5mg中?！は?.中加入含有乙酸的乙腈180 μ L?！?80°C下靜置45分鐘?！び煤?M鹽酸胍的16. 6mM碳酸氫銨溶液、純水、含有1%三乙胺的甲醇溶液各200 μ L洗滌珠各2次。·加入含有10%乙酸酐的甲醇溶液100 μ L，室溫下靜置30分鐘?！こト芤汉?，用IOmM鹽酸、甲醇、二嚅烷各200 μ L洗滌珠各2次?！ぜ尤牒蠭OOmM的3-甲基1-對甲苯基三氮烯的二嚿烷溶液100 μ L，60°C下靜置1小時(shí) 1. 5小時(shí)。·依次用二嚅烷、純水、甲醇、純水各200 μ L進(jìn)行洗滌?！ぜ尤牒?0 μ L的20mM氨基氧基-WR和2%乙酸的乙腈180 μ L?！?80°C下靜置45分鐘?！び?00 μ L的純水溶出。實(shí)施例1
將來自小鼠胎兒性癌細(xì)胞的細(xì)胞P19CL6誘導(dǎo)分化成心肌細(xì)胞，進(jìn)行未分化和分化后的細(xì)胞的糖組學(xué)。將3. 7X105cells/6cm皿(dish)的來自小鼠胎兒性癌細(xì)胞的細(xì)胞P19CL6接種到含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，對于分化誘導(dǎo)組，添加1% 二甲基亞砜(DMSO)后進(jìn)行培養(yǎng)，對于對照組，不添加任何物質(zhì)直接進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)開始后第16天，確認(rèn)分化誘導(dǎo)組全部搏(拍動)后，將兩組細(xì)胞回收，通過上述糖印跡(Glycoblotting)法進(jìn)行細(xì)胞中的全部N-鍵合型糖鏈的捕捉、純化。對于相當(dāng)于200 μ g的全部細(xì)胞蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，通過 MALDI-T0F/MS獲取定量性的表達(dá)譜。圖1_1所示的各糖鏈的表達(dá)量，使用通過與作為內(nèi)標(biāo)加入的已知量的低聚糖的譜圖上的面積比來算出的糖鏈的絕對定量值。由該結(jié)果可以確認(rèn)發(fā)現(xiàn)有顯著變動的42種糖鏈。伴隨著分化，具有一個Fuc的類型的糖鏈中，對于11種結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)增加趨勢，而對于具有2個Fuc的糖鏈類型的6種結(jié)構(gòu)，在分化誘導(dǎo)組中發(fā)現(xiàn)顯著減少。如此根據(jù)糖鏈類型進(jìn)行亞類化，由此可以定量性地判定細(xì)胞分化的水平(圖1-2)。另外，對于進(jìn)行分化誘導(dǎo)后的細(xì)胞和未進(jìn)行分化誘導(dǎo)而培養(yǎng)的細(xì)胞，在以下的條件下進(jìn)行免疫細(xì)胞染色。結(jié)果如圖1-3所示，僅在進(jìn)行分化誘導(dǎo)后的細(xì)胞中，確認(rèn)心肌細(xì)胞中作為特異性蛋白質(zhì)的心肌肌球蛋白的表達(dá)，在未進(jìn)行分化誘導(dǎo)而培養(yǎng)的細(xì)胞中，未發(fā)現(xiàn)該蛋白的表達(dá)。由此可知，僅進(jìn)行分化誘導(dǎo)后的細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞。1次抗體MF20小鼠單克隆抗心肌肌球蛋白(mouse monoclonal anti-sarcomere myosin)
2 次抗體HRP-聚合物結(jié)合抗 IgG(HRP-polymer conjugated anti-IgG) 顯色基質(zhì)二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine (DAB))
進(jìn)一步地，對于進(jìn)行分化誘導(dǎo)后的細(xì)胞和未進(jìn)行分化誘導(dǎo)而培養(yǎng)的細(xì)胞，進(jìn)行搏動的確認(rèn)(目視評價(jià))。結(jié)果在未進(jìn)行分化誘導(dǎo)的組中，未觀察到搏動，而在存在分化誘導(dǎo)的組中，約80%的細(xì)胞中觀察到搏動。另外，發(fā)現(xiàn)有顯著變動的42種糖鏈、具有一個Fuc的類型的11種糖鏈、具有2個 Fuc的類型的6種糖鏈、高甘露糖型的糖鏈分別如下所述。具有一個Fuc的類型的糖鏈組為表1中化2、化3、化6、化10、化12、化15、化16、 化19、化M、化25、化27、化30、化31、化33、化36、化37、化39、化40、化41、化42。具有2個Fuc的類型的糖鏈組為表1中化20、化22、化觀、化四、化34、化35、化38。
高甘露糖型的糖鏈為化5、化8、化14、化17。[表1]
權(quán)利要求
1.糖鏈類別的確定方法，該方法是用于評價(jià)細(xì)胞狀態(tài)的糖鏈的類別確定方法，其特征在于，獲取狀態(tài)變化前的細(xì)胞中含有的N-鍵合型糖鏈的定量性的表達(dá)譜， 獲取狀態(tài)變化后的細(xì)胞中含有的N-鍵合型糖鏈的定量性的表達(dá)譜， 抽出在所述兩種定量性的表達(dá)譜中存在量之間有變動的糖鏈組中的至少一部分， 將抽出的糖鏈組中含有的各糖鏈，基于糖鏈類型，分為高甘露糖型和非高甘露糖型的類別，且將非高甘露糖型進(jìn)一步分為(1)平分的有無、( 巖藻糖的個數(shù)(0、1或2以上)、 ⑶唾液酸的有無以及⑷支鏈度O或3以上)的類別，由所述五種類別中，確定至少一種適合于評價(jià)細(xì)胞狀態(tài)的糖鏈的類別。
2.細(xì)胞狀態(tài)評價(jià)方法，該方法是評價(jià)細(xì)胞的狀態(tài)的方法，其特征在于， 獲取狀態(tài)變化前后的細(xì)胞中含有的N-鍵合型糖鏈的定量性的表達(dá)譜，由所述定量性的表達(dá)譜中，對于通過權(quán)利要求1所述的方法確定的糖鏈類別的至少一種，求出該類別中含有的糖鏈(組)的存在量或存在比率的狀態(tài)變化的前后變化。
3.糖鏈類別的確定方法，該方法是用于評價(jià)進(jìn)行了分化誘導(dǎo)的干細(xì)胞或前體細(xì)胞的分化水平的糖鏈的類別確定方法，其特征在于，獲取在不存在分化誘導(dǎo)劑的條件下培養(yǎng)的干細(xì)胞或前體細(xì)胞中含有的N-鍵合型糖鏈的定量性的表達(dá)譜，獲取在分化誘導(dǎo)劑的存在下培養(yǎng)的干細(xì)胞或前體細(xì)胞中含有的N-鍵合型糖鏈的定量性的表達(dá)譜，抽出所述兩種定量性的表達(dá)譜中的存在量有變動的糖鏈組中的至少一部分， 將抽出的糖鏈組中含有的各糖鏈，基于糖鏈類型，分為高甘露糖型和非高甘露糖型的類別，且將非高甘露糖型進(jìn)一步分為(1)平分的有無、( 巖藻糖的個數(shù)(0、1或2以上)、 ⑶唾液酸的有無以及⑷支鏈度0或3以上)的類別，由所述五種類別中，確定至少一種適合于評價(jià)干細(xì)胞或前體細(xì)胞的分化水平的糖鏈類別。
4.分化水平評價(jià)方法，該方法是評價(jià)進(jìn)行了分化誘導(dǎo)的干細(xì)胞或前體細(xì)胞的分化水平的方法，其特征在于，經(jīng)時(shí)性地獲取在分化誘導(dǎo)劑的存在下培養(yǎng)的干細(xì)胞或前體細(xì)胞中含有的N-鍵合型糖鏈的定量性的表達(dá)譜，由所述定量性的表達(dá)譜中，對于由權(quán)利要求3所述的方法確定的糖鏈類別的至少一種，求出該類別中含有的糖鏈(組)的存在量或存在比率的經(jīng)時(shí)性變化。
5.評價(jià)心肌分化水平的方法，該方法是評價(jià)干細(xì)胞或前體細(xì)胞的心肌分化水平的方法，包括經(jīng)時(shí)性地獲取在心肌分化誘導(dǎo)劑的存在下培養(yǎng)的干細(xì)胞或前體細(xì)胞中含有的N-鍵合型糖鏈的定量性的表達(dá)譜，求出選自所述定量性的表達(dá)譜中具有1個巖藻糖的類型的糖鏈組的存在量或存在比率、具有2個巖藻糖的類型的糖鏈組的存在量或存在比率和高甘露糖型的糖鏈組的存在量或存在比率中的至少一種的經(jīng)時(shí)性變化。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述具有1個巖藻糖的類型的糖鏈組的存在量或存在比率因所述培養(yǎng)而增大的細(xì)胞，心肌分化水平提高。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述具有2個巖藻糖的類型的糖鏈組的存在量或存在比率因所述培養(yǎng)而減少的細(xì)胞，心肌分化水平提高。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述高甘露糖型的糖鏈組的存在量或存在比率因所述培養(yǎng)而減少的細(xì)胞，心肌分化水平提高。
9.評價(jià)分化成神經(jīng)細(xì)胞的分化水平的方法，該方法是對來自小鼠的干細(xì)胞或前體細(xì)胞分化成神經(jīng)細(xì)胞的分化水平進(jìn)行評價(jià)的方法，包括經(jīng)時(shí)性地獲取在誘導(dǎo)分化成神經(jīng)細(xì)胞的分化誘導(dǎo)劑的存在下培養(yǎng)的干細(xì)胞或前體細(xì)胞中含有的N-鍵合型糖鏈的定量性的表達(dá)譜，求出選自所述定量性的表達(dá)譜中具有平分結(jié)構(gòu)的類型的糖鏈組的存在量或存在比率、 不具有平分結(jié)構(gòu)的類型的糖鏈組的存在量或存在比率和高甘露糖型的糖鏈組的存在量或存在比率中的至少一種的經(jīng)時(shí)性變化。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述具有平分結(jié)構(gòu)的類型的糖鏈組的存在量或存在比率因所述培養(yǎng)而增大的細(xì)胞，分經(jīng)成神經(jīng)細(xì)胞的分化水平提高。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述不具有平分結(jié)構(gòu)的類型的糖鏈組的存在量或存在比率因所述培養(yǎng)而減少的細(xì)胞，分化成神經(jīng)細(xì)胞的分化水平提高。
12.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述高甘露糖型的糖鏈組的存在量或存在比率因所述培養(yǎng)而減少的細(xì)胞，分化成神經(jīng)細(xì)胞的分化水平提高。
13.評價(jià)分化成神經(jīng)細(xì)胞的分化水平的方法，該方法是對來自人的干細(xì)胞或前體細(xì)胞分化成神經(jīng)細(xì)胞的分化水平進(jìn)行評價(jià)的方法，包括經(jīng)時(shí)性地獲取在誘導(dǎo)分化成神經(jīng)細(xì)胞的分化誘導(dǎo)劑的存在下培養(yǎng)的干細(xì)胞或前體細(xì)胞中含有的N-鍵合型糖鏈的定量性的表達(dá)譜，求出選自所述定量性的表達(dá)譜中具有一個巖藻糖的類型的糖鏈組的存在量或存在比率、不具有唾液酸的類型的糖鏈組的存在量或存在比率和高甘露糖型的糖鏈組的存在量或存在比率中的至少一種的經(jīng)時(shí)性變化。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述具有一個巖藻糖的類型的糖鏈組的存在量或存在比率因所述培養(yǎng)而增大的細(xì)胞，分化成神經(jīng)細(xì)胞的分化水平提高。
15.如權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述不具有唾液酸的類型的糖鏈組的存在量或存在比率因所述培養(yǎng)而增加的細(xì)胞，分化成神經(jīng)細(xì)胞的分化水平提高。
16.如權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述高甘露糖型的糖鏈組的存在量或存在比率因所述培養(yǎng)而減少的細(xì)胞，分化成神經(jīng)細(xì)胞的分化水平提高。
17.如權(quán)利要求1 16中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述N-鍵合型糖鏈通過糖印跡法進(jìn)行了分離和純化。
18.如權(quán)利要求1 17中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述定量性的表達(dá)譜通過 MALDI-T0F/MS 或 LC-ESI/SSI-TOF/MS 得到。
19.如權(quán)利要求3 18中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，干細(xì)胞為胚胎干細(xì)胞、組織干細(xì)胞、生物體干細(xì)胞或人工多能性干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)。
20.如權(quán)利要求3 18中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，前體細(xì)胞為將干細(xì)胞分化誘導(dǎo)而成的細(xì)胞，且為具有多能性的細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供替代基因、蛋白質(zhì)的細(xì)胞狀態(tài)、分化水平的新指標(biāo)，定量性地掌握該指標(biāo)的方法，使用該指標(biāo)掌握特定的細(xì)胞狀態(tài)、分化水平的方法。用于評價(jià)細(xì)胞狀態(tài)的糖鏈類別的確定方法。獲取狀態(tài)變化前的細(xì)胞的N-鍵合型糖鏈的定量性的表達(dá)譜，獲取狀態(tài)變化后的細(xì)胞中含有的N-鍵合型糖鏈定量性的表達(dá)譜，抽出在上述兩種定量性的表達(dá)譜中存在量之間存在變動的糖鏈組，將抽出的糖鏈組中含有的各糖鏈，基于糖鏈類型，分為高甘露糖型和非高甘露糖型，(1)平分的有無、(2)巖藻糖的個數(shù)(0、1或2以上)、(3)唾液酸的有無以及(4)支鏈度(2或3以上)的類別，由上述五種類別中，確定至少一種適合于評價(jià)細(xì)胞狀態(tài)的糖鏈類別。使用所確定的糖鏈類別的細(xì)胞狀態(tài)、細(xì)胞分化的評價(jià)方法。
文檔編號G01N27/62GK102224417SQ200980146398
公開日2011年10月19日 申請日期2009年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月21日
發(fā)明者天野麻穗, 武川泰啟, 西村紳一郎 申請人:國立大學(xué)法人北海道大學(xué)