專利名稱：生物樣本的反復染色的制作方法
生物樣本的反復染色相關申請的交叉引用本申請請求享有2008年4月2日提交的美國專利申請?zhí)?2/061，044的優(yōu)先權； 該申請的全部公開內容通過引用結合到本文中。
背景技術：
對于多元應用而言，組織樣本或組織微陣列(TMA)需要利用多個分子探針來染 色，以便定量或定性地研究蛋白質表達或空間分布。染色過程典型地使用容易出錯的耗時 的人工技術來執(zhí)行。染色過程中所使用的試劑常很昂貴，且具有有限的貯藏壽命，因而需要 特殊的處理技術。存在使用微觀流槽(flow cell)來作為用于組織樣本的反應腔室，或用來監(jiān)測在 流動狀態(tài)下的細胞活動的自動系統(tǒng)。然而，此類系統(tǒng)并未良好地適于在缺少流槽內樣本的 環(huán)境控制的組織樣本處理中使用，且需要人工干預。試劑(例如，熒光試劑)穿過流槽的流體流率很難控制，因為流動流可在小容積腔 室內造成紊流，移動或破壞樣本。另外，周邊的外部加熱(例如，來自加熱的顯微鏡物臺) 可造成封閉樣本的非均勻加熱。因此，溫度跨越樣本而變化。此外，重復的試劑制備、樣本 移除和更換到物臺上以采集圖像需要樣本重新排列，且降低了再生性。發(fā)明簡述本發(fā)明一般地涉及便于對來自成像應用的生物樣本進行反復染色的自動方法及
直ο在一些實施例中，該方法包括以下步驟提供包含生物樣本的小容積流槽，將染色 劑施加到生物樣本上，結合至少兩種前體試劑來形成活化脫色劑，而其中活化脫色劑的分 解速率大于或類似于脫色反應速率，以及使脫色劑以大于活化脫色劑分解速率的流率在生 物樣本上流動。染色、結合和流動的過程可反復地重復。在一些實施例中，提供了一種用于生物樣本的反復染色的裝置，且該裝置包括與 預混器成流體連通的流槽，其中，該預混器的體積容量小于流槽的體積容量的大約五倍。在一些實施例中，流槽包括構造成容納組織樣本的底座；熱電元件；位于底座與 熱電元件之間的墊圈；與預混器成流體連通的入口端口 ；以及出口端口 ；其中，底座和熱電 元件中的一者或兩者包括圖像采集窗口。流槽還可包括脫氣器和壓電元件。附圖簡述

圖1示出了代表性的流槽裝置。圖2示出了與流槽裝置一起使用的脫氣器。圖3示出了將壓電元件用作預混器對漂白試劑的反應時間的改善。
具體實施例方式以下詳細說明為示范性的，且并非旨在限制本申請的發(fā)明和本發(fā)明的用途。此外， 并不受通過在附圖的以下詳述的本發(fā)明的在先背景中呈現的任何理論來限制。
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為了更為清楚和簡明地描述和指出要求得到專利保護的本發(fā)明的主題，將向以下 說明和所附權利要求中的特殊用語提供以下定義。單數形式〃 一〃、‘‘一個〃和〃該〃包括復數對象，除非上下文明確地另外規(guī)定。 如整個說明書和權利要求中在此使用的近似性語言可用于修飾任何數量表達，其可容許數 量表達變化，而不會導致其所涉及的基本功能變化。因此，諸如"大約"的用語所修飾的值 不限于所指定的精確值。除非另外指出，否則隨后將在說明書和權利要求中使用的表示成 分數量、諸如分子量的性質、反應條件的所有數字都應理解為在所有情況下都由用語"大 約"修飾。因此，除非相反地指出，否則以下說明書和所附權利要求中所闡明的數字參數為 近似值，其可取決于本發(fā)明設法獲得的所期望的性能而變化。至少各數字參數應當鑒于報 告的有效數字的數目和通過應用普通舍入技術來分析。如本文所使用的用語"生物樣本"是指從生物對象上獲得的樣本，包括生物組織 樣本或活體內或活體外獲得的流體源。這些樣本可為但不限于從包括人在內的哺乳動物分 離的組織、片段和細胞。如本文所使用的用語"發(fā)光團"是指表現出發(fā)光的化合物，發(fā)光包括化學發(fā)光、 生物發(fā)光、磷光和光致發(fā)光。典型的實例包括但不限于發(fā)光氨、光澤精、二氫化吖啶、吖啶酯 和二氧烷，以及熒光團。如本文所使用的用語"氧化劑"或"氧化試劑"是指實質上使發(fā)光團失活的漂 白試劑。代表性的氧化劑包括活性氧類、羥基、單態(tài)氧、過氧化氫或臭氧如過氧化氫、高錳酸 鉀、重鉻酸鈉、溴水、碘_碘化鉀，或叔丁基過氧化氫。本發(fā)明涉及一種自動系統(tǒng)和方法，其通過消除對傳送樣本(例如，在流槽內的滑 片上的組織樣本)的需要來以最少的操作人員干預進行工作。所公開的系統(tǒng)和方法還消除 了使樣本在染色構件與成像構件之間位移的需要。染色構件的自動化最大限度地減小了試劑體積和試劑在系統(tǒng)內的停留時間這兩 者，從而節(jié)省了昂貴的試劑，如熒光標記的抗體，且最大限度地減少了試劑分解或副反應。 其還減小了試劑計量中的變化，且可減少試劑交叉污染的發(fā)生。成像構件的自動化消除或 減少了與圖像對準和染色后再安裝樣本相關的步驟。圖像配準的改善便于形成準確的合成 圖像?？赏ㄟ^計算機控制連續(xù)染色所涉及的一個或多個工藝步驟(如添加染色試劑和 氧化劑)來實現自動化。在流槽系統(tǒng)結合到組合的樣本處理和圖像采集系統(tǒng)中的情況下， 圖像采集構件(例如，顯微鏡或照相機)還可由軟件來控制，該軟件例如為如用LabVIEW或 C寫成的程序。驢本文所提供的裝置用于執(zhí)行所公開的方法。因此，本文所提供的是流槽及包括流 槽與預混器的系統(tǒng)。在如圖1中所示的一個實施例中，流槽可包括構造成位于組織樣本上方的包圍的 流動腔室。該流槽可包括固體支承-容納部件10、具有構造成用以容納位于滑片12上的 組織樣本的中心開口的墊圈11、罩蓋14、入口端口 15和出口端口 16，其中，當滑片位于滑片 容納部件中且墊圈夾在滑片與罩蓋之間時，流槽限定封閉的腔室。由于流動腔室被包圍在 流槽內，最大限度地減小了流體的蒸發(fā)，且因此最大限度地減小了試劑的損失。另外，封閉
5構造改善了溫度控制。流槽可為模塊化單元，該模塊化單元適于配合到標準顯微鏡物臺上。作為備選，流 槽可為包括顯微鏡物臺的一體式單元。在一些實施例中，流槽可固定在顯微鏡物臺上來用 于成像過程。這容許了樣本在沒有人工干預的情況下暴露于全系列試劑，從而有可能消除 樣本在在顯微鏡物臺上的重新排列，以用于圖像采集或配準。這對于多元的染色和成像特 別有用，因為在各染色步驟之后采集的圖像可重疊來形成合成圖像。流槽可用于包括流體控制子系統(tǒng)和溫度控制子系統(tǒng)的系統(tǒng)中，流體控制子系統(tǒng)和 溫度控制子系統(tǒng)用來控制在流槽的內部腔室中的流體輸送和溶液溫度。在一個實施例中， 流體控制系統(tǒng)還可包括儲槽、流動傳感器、混合腔室和脫氣器，以便在注入流槽之前制備一 種或多種試劑。此類系統(tǒng)的優(yōu)點是免除了預混和儲存可能具有有限的穩(wěn)定性或貯藏壽命的 試劑的需要。流體控制系統(tǒng)與流動的入口端口和出口端口成流體連通。滑片容納部件在一些實施例中，流槽可包括構造成用來容納位于諸如玻璃滑片的固體支承件上 的組織樣本的滑片容納部件。滑片保持件適合一定范圍的化學變化和溫度變化。在一個實 施例中，滑片保持件可由底座和用于將滑片固定在腔室中的銷釘或凸片系統(tǒng)構成。墊圈流槽包括具有中心開口的墊圈，該中心開口構造成用來容納位于滑片上的組織樣 本。墊圈可由可變形的化學上惰性的橡膠或塑料制成，其保持應用于流動腔室的液體。墊 圈可選為包括用于入口端口和出口端口的開口。墊圈的中心開口的尺寸可設置為最大化圖 像采集窗口的視場。當放置到流槽中時，墊圈的寬度、長度和深度可各自變化，以達到流槽 的預定內部容積。在一些實施例中，墊圈的寬度和長度的尺寸可設置成符合標準組織切片 滑片或微陣列基底。例如，在一個實施例中，墊圈的中心開口可容納20mm寬且30mm長的組 織微陣列。入口端口和出口端口入口端口和出口端口優(yōu)選放置成遠離圖像采集窗口。因此，入口端口和出口端口 可位于墊圈中或罩蓋上。入口端口和出口端口典型地在尺寸上匹配，使得流入速率和流出 速率等同，以獲得穿過樣本的所期望的流率。溫度控制進一步參看圖1，溫度控制單元還可包括用于溫度控制的熱電物臺17和用于溫度 測量的RTD/熱敏電阻。對于其中溫度控制單元的底部表面與流體直接接觸的構造而言，接 觸表面18可由耐化學制品的材料制成，如不銹鋼或鈦?？蚣?9還可用于定位溫度控制單 元的構件。在一些實施例中，溫度控制單元結合到罩蓋中，以便在溫度控制單元(例如，珀耳 帖疊層(Peltier stack))與滑片之間形成的內部腔室由溫度控制器直接加熱，而非通過組 織滑片加熱。該構造解放了組織滑片的后側來用于成像。脫氣器在一些實施例中，本發(fā)明還包括用于協助從流槽中除去氣體的方法。如圖2中所 示，諸如非晶體含氟聚合物或聚二甲硅氧烷(PDMS)的氣體可滲透薄膜20可用來分隔氣體 排出通路21和包含樣本23的流體腔室22。在此類構造中，反壓力或真空的應用使系統(tǒng)通風，且除去腔室中的過多氣體。
歴 在一些實施例中，本發(fā)明還可包括壓電元件，該壓電元件連接到流動腔室上，且能 夠通過將低壓電信號轉換成聲能而在流動腔室中產生振動。在優(yōu)選實施例中，壓電元件可 由陶瓷、石英(Si02)或鈦酸鋇(BaTi03)構成。壓電元件的構造提供了超聲波攪拌，且影響 穿過流動腔室的試劑的流動曲線。這在其中所期望的染色反應有擴散限制且流槽幾何形狀 阻止常規(guī)機械混合的情形中特別有利。計算機處理單元計算機可控制流槽系統(tǒng)的各種構件，例如包括熱控制單元、預混器、振動單元和 泵。在流槽系統(tǒng)結合到組合的樣本處理和圖像采集系統(tǒng)中的情況下，圖像采集構件(例如， 顯微鏡或照相機)也可由計算機控制。^^本文還提供了用于處理和采集來自粘附在固體支承件上的生物樣本(例如，固定 到顯微鏡滑片上的組織切片)的圖像的方法。該方法包括使用為具體應用所選擇的裝置的 各種備選實施例的步驟。共同擁有的US2008-0118944中描述了用于反復處理生物樣本的 典型方法，該申請結合在本文中。一種代表性的方法包括(a)將生物樣本定位在流槽中，生物樣本例如為顯微鏡 滑片上的組織切片；(b)以容許發(fā)光團與樣本之間有充分的接觸時間的方式將熒光標記或 發(fā)光團應用到樣本上，該接觸時間通常在30至60分鐘的范圍內，取決于所使用的標記的濃 度和類型；(c)施加清洗溶液，例如適合的緩沖溶液，以便將任何游離的熒光標記或發(fā)光團 洗掉；(d)采集標記樣本的圖像；(e)通過施加氧化劑來施加化學試劑以破壞步驟(b)中的 發(fā)光團，此處使用連續(xù)流動工藝將氧化劑溶液施加到樣本上，氧化劑使發(fā)光團實質上失活， 以便最小化流槽內的非層流和停留時間，導致1至5分鐘的平均停留時間；(f)可選地采集 樣本的圖像，以及(g)重復步驟(b)-(f)至少一次。各施加步驟可通過使含有特定試劑的溶液在位于流槽內的生物樣本上流動來實 現?？煽刂埔韵聟祦硖岣叻磻?，且從而減小試劑消耗(1)流槽的內部容積；(2)流槽的 內部溫度；(3)混合氧化溶液組成部分(例如，過氧化氫和碳酸氫鈉)的時機；(4)溶液在其 通過樣本時的攪拌程度；以及(5)除去氣泡或流槽的脫氣。這些參數的適當調節(jié)還可減小 樣本的降解，容許單個樣本產生更多數據。自動脫色步驟容許操作人員在保持原有配準的同時再探測單個樣本。添加氧化劑 導致了生物樣本脫色，因為發(fā)光團所產生的信號基本上被除去了。不論脫色是通過化學地 改變發(fā)光團還是通過分離而實現的，信號都減少了至少80%，而優(yōu)選大于90%。信號的該 減少可測量為相對于染色生物制品的初始絕對亮度的在特定波長下的染色后亮度，以對于 由脫色步驟引起的背景信號或自體熒光的伴隨減少而進行調整。流槽內部腔室容積小容積的流槽保存貴重的試劑。在試劑擴散為速率確定步驟時，流動應與內部腔 室容積相關聯。例如，到流槽的流體輸送可基于腔室的體積容量來調整，以容許快速、完全 地沖洗腔室。流槽提供了用于測試樣本的固體支承件。流槽尺寸基于所使用的固體支承件而受到約束。流槽的高度基于樣本的厚度。在樣本為組織切片的情況下，其可具有在大約5μπι 至大約IOOym之間的厚度。該組織切片可占據20mm乘以30mm的面積。這導致了在IOyL 至1000 μ L的范圍內的小的內部腔室容積，優(yōu)選為50 μ L至200 μ L。在從流槽上大致除去試劑之前，可發(fā)生分解。流動腔室中的紊流改善了表面反應 性，且便于除去試劑副產物(例如，氧氣)。因此，在一些實施例中，腔室可包括生成紊流的 攪拌元件(例如，聲學壓電構件)。內部腔室溫度盡管一些微陣列染色過程在20°C至100°C之間進行，但一些系統(tǒng)可能以緊密公差 要求高得多或低得多的溫度。涉及染色的吸收和解吸過程取決于溫度，且因此在一些實施 例中，在發(fā)生化學交互作用的情況下在整個樣本的表面上提供均勻的溫度。例如，可將層疊的熱電元件引入腔室中或腔室上，其中，流過元件的電流可通過輻 射加熱腔室內的流體來在特定溫度范圍內調節(jié)腔室溫度。一些系統(tǒng)可能需要+/_5°C的溫度 公差，而其它的可能具有緊得多或較為寬松的溫度公差。在一些實施例中，熱電元件可選地 包含熱沉來吸收和耗散熱量，以便于溫度調節(jié)。預混器和混合時機用于多元染色的試劑可具有有限的貯藏壽命，此處試劑的有效性隨著時間而減 弱。這在通過混合兩種或多種溶液來開始化學反應而制成的試劑可能經歷部分分解或沉淀 時發(fā)生。這可導致形成氣體和其它不期望的副產物。在一些實施例中，通過剛好在試劑引 入流槽中之前使用預混器分散反應物來在分子水平上完全地混合溶液?；旌蠒r間應當足夠 長，以便生成試劑，且受到充分限制來防止分解。位于流槽上游的預混器可基于腔室設計或管路設計。腔室設計可包括具有入口端 口和出口端口且包含機械混合器的小容器。管路設計可包括Y型適配器，化學試劑以預定 流率被驅使進入該Y型適配器。作為備選，管路設計可包括物理屏障(例如，位于管路內的 微孔或球形膜片)或生成紊流的噴嘴。預混器容許化學試劑在引入流槽之前混合。流槽的體積容量基于化學試劑的分解 速率和穿過流動腔室的化學試劑或其反應產物所期望的流率確定。給定溫度下的過氧化物溶液的分解速率等于-dC/dt = kC，此處C為過氧化物濃 度，t為時間，而k為一級速率常數。一級反應的半衰期與初始濃度無關，且計算為tl/2 = In(2)/k。第η級反應的半衰期也可確定，且表示為t1/2 = 2^-1/(n-l)k[A0]n^10流槽內的駐留時間限制為小于試劑的半衰期。因此，流槽的體積容量由以下確定 Vp < (V/t) (tl/2)，此處，(Vp)為流槽的體積容量，而(V/t)為流率。生成氫過氧化物陰離子的氧化劑如過氧化氫溶液在5分鐘的制備內分解且形成 氧氣。典型地，流槽的體積容量可從1至1000 μ L變化，優(yōu)選為50 μ L至500 μ L。為了確保 試劑在流槽中的平均停留時間小于5分鐘，流率優(yōu)選從50 μ L/min至500 μ L/min變化。應 用Vp < (V/t) (tl/2)，預混器的體積容量限制為5至5000 μ L，優(yōu)選為250 μ L M 2500 μ L。試劑儲槽預混器與一個或多個試劑儲槽成流體連通。試劑儲槽用作試劑在輸送至預混器之 前的儲存裝置。流動控制器容許將計量數量的試劑傳送至預混器?？梢砸韵嗬^順序或并行 地進行一種以上的試劑的輸送，從而容許準確計量試劑和減小試劑的交叉污染。
圖像采集窗口所公開的方法可在包括流槽的系統(tǒng)中執(zhí)行，該流槽構造成使得能夠通過圖像采集 窗口來加強對樣本的接近。圖像采集窗口可由基底限定，樣本設置在基底上(例如，顯微鏡 滑片)，或基底可包括滑片容納部件下側上的透光材料。因此，可使用流槽來執(zhí)行本發(fā)明的方法，在流槽中，輔助裝置如加熱元件或攪拌元 件(例如，聲學壓電構件)定位成遠離圖像采集窗口，聯接到照相機上的顯微鏡可通過圖像 采集窗口來在各種處理階段期間采集樣本的圖像?？刂品磻獎恿υ谝粋€實施例中，在預混器中制備3ml的過氧化氫緩沖溶液(3% H2O2，pHIO)。預 混器設計成與流槽物理連通，以便利用連續(xù)流動來將新近制備的緩沖過氧化物引入流動腔 室中，其中在腔室內的駐留時間小于5min。典型的流率為250μ L/min，而流動腔室的容積 小于250 μ L0腔室還包括壓電元件。如圖3中所示，這些條件將反應時間減少至與人工染色過程相比的大約三分之 一，在人工染色過程中，樣本在容器中處理，且對于每5min的駐留時間攪拌大約lOsec。提 高反應性可歸因于活化脫色劑的新近制備(分解較少)，以及在平衡反應中連續(xù)除去副產 物。協調的預混和最佳流率還通過過氧化氫在基本溶液中的分解而減少了原位形成的氧氣 泡的總量。盡管鑒于特定實施例在上文中描述了本發(fā)明，但如本領域的技術人員很清楚的那 樣，可制作出本發(fā)明的一些修改和變型，而不脫離所附權利要求中所闡明的其精神和范圍。
權利要求
一種生物樣本的反復染色的自動方法，包括(a)提供包含生物樣本的小容量流槽；(b)施加染色劑；(b)結合至少兩種前體試劑來形成活化脫色劑，其中，所述活化脫色劑的分解速率大于或類似于所述脫色反應速率；(d)使所述脫色劑以大于所述活化脫色劑的分解速率的流率在所述生物樣本上流動；以及(e)可選地重復步驟(b) (d)至少一次。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括通過圖像采集窗口來觀 察由所述染色的生物樣本生成的所述信號，以及可選地測量生成的所述信號的亮度值，以 及使所述信號與生物標記的特殊標注相關聯。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述活化脫色劑包括氧化劑。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述氧化劑選自過氧化氫、溴水、碘_碘化 鉀和叔丁基過氧化氫的緩沖溶液。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，一種前體試劑包括過氧化氫，而另一種前 體試劑為氫氧化鈉。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述活化脫色劑形成在與所述流槽流體 連通的混合腔室中。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述活化脫色劑通過使穿過與所述流槽 流體連通的通道的各前體試劑的流動流匯合而形成，并且其中，所述通道可選地包含用以 增強各前體試劑的所述流動流的混合的物理屏障。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述染色劑為發(fā)光團。
9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括振動所述流槽來加強混 合的步驟。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，使用附接到所述流槽上的壓電元件來施 加所述振動，其中，電能轉換成聲能。
11.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括使所述流槽的內部溫度 升高到環(huán)境溫度以上，以加強染色或脫色。
12.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括通過所述流槽的真空通 風來減少所述流槽內的氣泡形成。
13.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括將所述活化脫色劑的前 體試劑從一個或多個試劑儲槽傳送至所述預混器，其中，所述前體試劑以預定濃度輸送至 所述預混器。
14.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述一個或多個步驟(b)-(e)由處理器 控制。
15.一種用于生物樣本的反復染色的自動裝置，包括與預混器流體連通的流槽，其中， 所述預混器的體積容量小于所述流槽的體積容量的大約五倍。
16.根據權利要求15所述的裝置，其特征在于，所述流槽的體積容量在IyL至 1000 μ L之間，而所述預混器的體積容量小于5 μ L至5000 μ L0
17.根據權利要求15所述的裝置，其特征在于，所述流槽的體積容量在50μL至 500 μ L之間，而所述預混器的體積容量小于250 μ L至2500 μ L之間。
18.根據權利要求15所述的裝置，其特征在于，所述預混器還包括泵和紊流生成器，以 增加至少兩種前體試劑的混合。
19.根據權利要求18所述的裝置，其特征在于，所述紊流生成器為混合噴嘴、多孔過濾 器、球形阻擋件或微孔。
20.根據權利要求15所述的裝置，其特征在于，所述流槽包括構造成用來容納組織樣 本的底座；熱電元件；位于所述底座與所述熱電元件之間的墊圈；與所述預混器流體連通 的入口端口 ；以及出口端口 ；其中，所述底座和所述熱電元件中的一者或兩者包括圖像采 集窗口。
21.根據權利要求20所述的裝置，其特征在于，所述裝置還包括用來除去所述流槽內 存在的氣體的脫氣器。
22.根據權利要求20所述的裝置，其特征在于，所述裝置還包括附接到所述流槽上的 壓電元件，并且其中，所述壓電元件能夠通過將電能轉化成聲能來在所述流槽內產生振動。
23.根據權利要求15所述的裝置，其特征在于，所述裝置還包括與所述預混器流體連 通的試劑儲槽。
24.根據權利要求23所述的裝置，其特征在于，所述裝置還包括預混器控制器和試劑 流動控制器。
25.根據權利要求24所述的裝置，其特征在于，所述預混器控制器、所述試劑流動控制 器和附接到所述熱電元件上的可選的溫度控制器與處理器結合，并且其中，所述處理器配 置成用來控制所述裝置的一個或多個運行參數。
全文摘要
提供了便于對成像應用的生物樣本反復染色的自動方法及裝置。該方法包括以下步驟提供包含生物樣本的小容積流槽，將染色劑施加到生物樣本上，結合至少兩種前體試劑來形成活化脫色劑，而其中活化脫色劑的分解速率大于或類似于脫色反應速率，以及使脫色劑以大于活化脫色劑分解速率的流率在生物樣本上流動。染色、結合和流動的過程是可反復地重復的。本文還公開了用于生物樣本反復染色的裝置，其包括與預混器流體連通的流槽，其中，預混器的體積容量小于流槽的體積容量的大約五倍。
文檔編號G01N1/10GK101983327SQ200980112550
公開日2011年3月2日 申請日期2009年4月1日 優(yōu)先權日2008年4月2日
發(fā)明者A·蘇德, F·金蒂, J·B·福廷, M·C·蒙塔爾托, M·J·格德斯, R·J·菲爾金斯, 田維誠, 謝軍 申請人:通用電氣公司