專利名稱：一種評(píng)價(jià)或選擇對(duì)斑具有預(yù)防或緩解作用的制劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種評(píng)價(jià)或選擇對(duì)斑具有預(yù)防或緩解作用的制劑的方法。
背景技術(shù)：
斑是一種隨著老化產(chǎn)生的色素沉著，往往形成于暴露在太陽下的皮膚區(qū)域。通常 認(rèn)為斑是由長(zhǎng)期反復(fù)暴露在陽光下造成的。據(jù)報(bào)道，在病灶皮膚位置的表皮角質(zhì)形成細(xì)胞 中，一些在表皮黑色素細(xì)胞中激活黑色素合成的細(xì)胞因子的分泌物增加(非專利文獻(xiàn)1 3)。至今，已報(bào)道了對(duì)于由紫外線引起的暫時(shí)性色素沉著的機(jī)理所進(jìn)行的各種研究結(jié) 果(非專利文獻(xiàn)4)。而另一方面，被認(rèn)為是由紫外線照射導(dǎo)致的慢性大量色素沉著(例如 老年斑)的機(jī)理還未闡明。近年來，研究人員致力于慢性大量色素沉著的機(jī)理研究，對(duì)于老年斑進(jìn)行了全面 基因表達(dá)分析研究(非專利文獻(xiàn)5)，或使用人體色素皮膚組織對(duì)相關(guān)因素的鑒定進(jìn)行研究 (專利文獻(xiàn)1) 。已證明紫外線誘導(dǎo)的色素沉著和慢性大量色素沉著之間在某些功能性分子表達(dá) 方面存在區(qū)別。例如，已報(bào)道由于單劑量紫外線照射人體，IL-Ia基因表達(dá)增加(非專利 文獻(xiàn)6)，而在老年斑病灶皮膚中IL-I α基因表達(dá)降低(非專利文獻(xiàn)2)。此外，已發(fā)現(xiàn)單劑量紫外線照射和連續(xù)紫外線照射之間在功能性表達(dá)方式上存在 差別(非專利文獻(xiàn)6)。因此，其明顯表明，慢性大量色素沉著所涉及的機(jī)理不同于暫時(shí)性色 素沉著的機(jī)理。另外，老年斑等慢性大量色素沉著是隨著老化而發(fā)展的，慢性大量色素沉著可能 產(chǎn)生于沒有過度暴露在太陽下的皮膚區(qū)域中。因此，除了紫外線照射，其它因素也可能促使 老年斑產(chǎn)生(非專利文獻(xiàn)7)。從而，需要指出老年斑等慢性大量色素的機(jī)理不同于由紫外線照射產(chǎn)生的暫時(shí)性 色素沉著的機(jī)理。ρ53基因是公知的腫瘤抑制基因。ρ53基因的活化涉及多種癌癥的惡變、預(yù)后或轉(zhuǎn) 移，這表明Ρ53在抑制惡性轉(zhuǎn)變中起重要作用。近年來，已經(jīng)確認(rèn)阿片-促黑素細(xì)胞皮質(zhì)素原(pro-opiomelanocortin，P0MC)基 因是P53轉(zhuǎn)錄目標(biāo)。已報(bào)道p53通過激活POMC基因的轉(zhuǎn)錄，在紫外線照射引起的暫時(shí)性色 素沉著方面具有非常突出的作用，然而P53并不涉及基礎(chǔ)色素沉著(非專利文獻(xiàn)8)。在非 紫外線引起的大量色素沉著的幾個(gè)實(shí)例中，觀察到紫外線模擬P53活化也會(huì)導(dǎo)致大量色素 沉著，例如，用具有DNA損傷作用的足葉乙甙或5-氟尿嘧啶等藥物進(jìn)行的處理，這表明p53 也關(guān)系到非紫外線引起的色素沉著(非專利文獻(xiàn)8)。另外，用于表皮的p53活化劑應(yīng)該能有效治療或預(yù)防增殖、癌前或紫外線誘導(dǎo)的 皮膚疾病(專利文獻(xiàn)2)。然而，沒有任何觀察能夠說明斑與p53活性、p53基因和p53基因的轉(zhuǎn)錄目標(biāo)(以下，稱為“p53目標(biāo)基因”)、或它們的表達(dá)產(chǎn)物之間的關(guān)系。專利文獻(xiàn)1 JP3943490專利文獻(xiàn)2 JP1999-506755非專禾丨J 文獻(xiàn) 1 Saishin Hifukagaku Taikei Vol. 8, Dyschromia, Nakayama ShotenCo. , Ltd非專利文獻(xiàn) 2 =Kadono S.，et al. (2001) J. Invest. Dermatol. 116 :571_577非專利文獻(xiàn) 3 =Hattori H.，et al. (2004) J. Inves. Dermatol. 122 1256—1265
非專禾Ij 文獻(xiàn) 4 :Enk CD. , et al. (2004) Photodermatol. Photoimmunol. Photomed. 20 129-137非專利文獻(xiàn)5 =Aoki H.，et al. (2007) Br. J. Dermatol. 156 1214-1223非專利文獻(xiàn)6 =Seite S.，et al. (2004) Photochem. Photobiol. 79 :265_271非專利文獻(xiàn)7 =Unver N.，et al. (2006) Br. J. Dermatol. 155 119-128非專利文獻(xiàn)8 :Cui R.，et al. (2007) Cell 128,853-86
發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明提供以下內(nèi)容1) 一種評(píng)價(jià)或選擇對(duì)斑具有預(yù)防或緩解作用的制劑的方法，其包括對(duì)抑制表皮細(xì) 胞中的P53活性的物質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，或者對(duì)抑制表皮細(xì)胞中的p53基因、p53目標(biāo)基因或它們 的表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平的物質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)。2) 一種評(píng)價(jià)或選擇對(duì)斑具有預(yù)防或緩解作用的制劑的方法，包括以下步驟(1) (4)(1)接觸步驟，使測(cè)試物質(zhì)接觸表皮細(xì)胞，其中，該表皮細(xì)胞中具有P53活性，或者 具有在所述表皮細(xì)胞中表達(dá)的P53基因、p53目標(biāo)基因或它們的表達(dá)產(chǎn)物。(2)測(cè)定步驟，測(cè)定表皮細(xì)胞中的p53活性，或者測(cè)定表皮細(xì)胞中的p53基因、p53 目標(biāo)基因或它們的表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平。(3)比較步驟，將步驟(2)中測(cè)量的活性或表達(dá)水平與沒有接觸測(cè)試物質(zhì)的對(duì)照 表皮細(xì)胞中的P53活性、或者沒有接觸測(cè)試物質(zhì)的對(duì)照表皮細(xì)胞中的p53基因、p53目標(biāo)基 因或它們的表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平進(jìn)行比較。(4)選擇步驟，基于在步驟(3)中獲得的結(jié)果，選擇測(cè)試物質(zhì)作為對(duì)斑具有預(yù)防或 緩解作用的制劑，該測(cè)試物質(zhì)抑制P53活性，或者抑制p53基因、p53目標(biāo)基因或它們的表 達(dá)物質(zhì)的表達(dá)水平。3)—種評(píng)價(jià)或選擇用于調(diào)節(jié)SCF或內(nèi)皮素-1表達(dá)的調(diào)節(jié)劑的方法，其包括對(duì)抑制 表皮細(xì)胞中的P53活性的物質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，或者對(duì)抑制表皮細(xì)胞中的p53基因、p53目標(biāo)基因 或它們的表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平的物質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)。4) 一種分析皮膚斑的狀況的方法，其包括基于人體表皮細(xì)胞中的p53活性、或者 人體表皮細(xì)胞中的P53基因、p53目標(biāo)基因或它們的表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平，來確定皮膚斑形 成的發(fā)展程度或緩解程度。


圖1表示p53在人體皮膚組織中的表達(dá)。圖2表示⑶KNlA (p21)基因、GADD45A基因和MDM2基因在人體表皮組織中的表達(dá)。圖3表示用5-氟尿嘧啶(5-FU)處理的SCF(KITLG)基因和內(nèi)皮素_1基因在培養(yǎng) 的表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)水平變化。圖4表示用pifithrin-α (PFT)處理的SCF(KITLG)基因和內(nèi)皮素_1基因在培養(yǎng) 的表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)水平變化。圖5是表示與沒用pifithrin-α (PFT)處理相比較，用pifithrin-α (PFT)處理 后的三維培養(yǎng)皮膚替代物中，黑色素含量變化的圖表。圖6表示與沒用pifithrin- α (PFT)處理相比較，用pifithrin- α (PFT)處理后 的器官培養(yǎng)的光線性花瓣?duì)钌匕叩钠つw組織中，酪氨酸酶基因、SCF(KITLG)基因和內(nèi)皮 素-1基因的表達(dá)水平變化。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供一種評(píng)價(jià)或選擇對(duì)斑具有預(yù)防或緩解作用的制劑的方法。該方法可以 實(shí)現(xiàn)可靠有效地篩選制劑的候補(bǔ)物質(zhì)。本發(fā)明還提供一種分析斑狀況的方法。本發(fā)明人對(duì)斑形成的詳細(xì)機(jī)理進(jìn)行了分子水平的研究，并發(fā)現(xiàn)在斑形成的皮膚 組織表皮細(xì)胞(角質(zhì)形成細(xì)胞)中，ρ53基因、ρ53目標(biāo)基因或它們的產(chǎn)物的表達(dá)水平大幅 增加；進(jìn)而發(fā)現(xiàn)Ρ53活性、或者ρ53基因、ρ53目標(biāo)基因或它們的產(chǎn)物的表達(dá)水平可用作評(píng) 價(jià)或選擇對(duì)斑具有預(yù)防或緩解作用的制劑的指標(biāo)，或用作分析斑狀況的指標(biāo)。本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)可靠有效地評(píng)價(jià)或選擇對(duì)斑具有預(yù)防或緩解作用的制劑。本發(fā)明 還實(shí)現(xiàn)客觀評(píng)價(jià)斑形成的發(fā)展程度或緩解程度。在此，所謂的術(shù)語“斑”通常不僅指老年斑，而且包括由于長(zhǎng)期沉積在皮膚上出現(xiàn) 的褐色或深褐色的色素沉著點(diǎn)、或其它色素如黑色素。例如，可以列舉出光線性花瓣?duì)钌?斑(pigmentatio petaloidesactinica)、雀斑、漂斑禾口黃褐斑。眾所周知“p53基因”作為腫瘤抑制基因，是癌癥中最頻繁突變的基因。P53基因的 表達(dá)產(chǎn)物發(fā)揮激活基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子的作用，其參與例如細(xì)胞周期調(diào)控、誘導(dǎo)凋亡、DNA 修復(fù)和細(xì)胞衰老。已知P53基因的異常導(dǎo)致p53目標(biāo)基因量(失活)的降低，從而使細(xì)胞 惡性轉(zhuǎn)變。p53目標(biāo)基因有許多，例如包括參與DNA修復(fù)和細(xì)胞周期調(diào)控的GADD45A基因， 參與DNA修復(fù)的p53R2基因和XPC基因，參與細(xì)胞周期調(diào)控的CDKNlA (p21基因)、14-3-3 δ 基因和cdc25C基因，參與p53功能性調(diào)控的MDM2基因和細(xì)胞周期蛋白質(zhì)G基因，參與細(xì)胞 凋亡的BAX基因、PUMA基因和PIG3基因。本發(fā)明的各個(gè)方法可以使用上述任意基因的表達(dá)產(chǎn)物，例如，p53蛋白質(zhì)、Gadd45a 蛋白質(zhì)、P53R2蛋白質(zhì)、XPC蛋白質(zhì)、p21蛋白質(zhì)、Mdm2蛋白質(zhì)和Bax蛋白質(zhì)。在下述實(shí)施例中，從人體老年斑皮膚區(qū)域收集皮膚組織，進(jìn)行p53蛋白質(zhì)表達(dá)分 析時(shí)，在老年斑附近幾乎沒有觀察到P53表達(dá)，而從老年斑的表皮中發(fā)現(xiàn)p53表達(dá)的大量 增加。另外，從健康男性的斑、斑附近(前臂外側(cè))或防曬區(qū)域(上臂內(nèi)側(cè))的皮膚收 集表皮，進(jìn)行P53目標(biāo)基因的表達(dá)分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)較之斑附近和防曬區(qū)域，p53目標(biāo)基因如⑶ΚΝ1Α(ρ21)基因、GADD45A基因和MDM2基因在斑中的表達(dá)水平顯著增加。用已知的p53活化劑5-氟尿嘧啶處理培養(yǎng)得到的人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，進(jìn)行基 因表達(dá)分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)SCF(KITLG)基因和內(nèi)皮素-1基因的表達(dá)水平顯著增加。然而，用p53 抑制劑pifithrin-α (PFT)處理細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)SCF(KITLG)基因和內(nèi)皮素_1基因的表達(dá)水 平顯著降低。將PFT加入由正常人體表皮細(xì)胞(角質(zhì)形成細(xì)胞)和色素細(xì)胞(黑色素)組成的 三維培養(yǎng)皮膚替代物中時(shí)，皮膚替代物中黑色素的含量隨著PFT處理呈濃度依賴性降低。 而將PFT加入人體光線性花瓣?duì)钌匕咂鞴倥囵B(yǎng)組織中時(shí)，酪氨酸酶基因和SCF(KITLG)基 因的表達(dá)水平顯著降低，酪氨酸酶基因和SCF(KITLG)基因在黑色素生成中起到 重要作用。 同樣，內(nèi)皮素-1基因表達(dá)也具有顯著降低的趨勢(shì)。已知SCF(干細(xì)胞因子)是C-kit受體 的配體，在造血干細(xì)胞等細(xì)胞的表面表達(dá)；而且SCF是膜結(jié)合生長(zhǎng)因子，促進(jìn)造血細(xì)胞的生 長(zhǎng)和分化。近年來，已闡明了 c-kit不僅在造血細(xì)胞表面，而且在肥大細(xì)胞、黑色素細(xì)胞或 生殖細(xì)胞表面表達(dá)(J. Exp. Med.，183，2681-2686，1996)。最近還有報(bào)道，在轉(zhuǎn)基因小鼠中， SCF表達(dá)僅僅在皮膚上，通過肥大細(xì)胞誘導(dǎo)和黑色素細(xì)胞的生長(zhǎng)，黑色素生成增加(J.Exp. Med.，187，1565-1573，1998)。因此，SCF被認(rèn)為與皮膚中黑色素過量生成有很大關(guān)系。2006年，報(bào)道了關(guān)于人體基因組中p53轉(zhuǎn)錄目標(biāo)基因的綜合研究結(jié)果(Cell，124， 207-219,2006)。該報(bào)道指出，確認(rèn)了 SCF(KITLG)基因?yàn)樾碌膒53目標(biāo)基因，通過將5-氟尿 嘧啶加入HCT116細(xì)胞(例如，人體結(jié)腸癌細(xì)胞株)中來誘導(dǎo)SCF基因的表達(dá)水平。然而， P53和SCF在皮膚或表皮組織中的關(guān)系還未闡明。已知內(nèi)皮素-1作為生成于表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞因子，紫外線照射后內(nèi) 皮素-1增加，其表明內(nèi)皮素-1與表皮中黑色素的過量生成(Pigment Cell Res.，10， 218-228,1997)有很大關(guān)系。已證實(shí)上述細(xì)胞因子在慢性色素沉著病變中過表達(dá)，并且這些細(xì)胞因子顯著促進(jìn) 色素沉著(Am. J. Pathol.，165，2099-2109，2004)。上述發(fā)現(xiàn)表明，表皮細(xì)胞中的p53活性、或者表皮細(xì)胞中的p53基因、p53目標(biāo)基 因或它們的表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平與慢性色素沉著的上游機(jī)制有很大關(guān)系，慢性色素沉著導(dǎo) 致斑形成。因此，這些數(shù)據(jù)表明，抑制P53活性或表達(dá)的物質(zhì)可以用作對(duì)斑具有預(yù)防或緩解 作用的制劑，或用作調(diào)節(jié)SCF或內(nèi)皮素-1表達(dá)的調(diào)節(jié)劑，并且基于p53活性、或者基于p53 基因、P53目標(biāo)基因或它們的表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平，可以評(píng)價(jià)或選擇對(duì)斑具有預(yù)防或緩解作 用的制劑、或調(diào)節(jié)SCF或內(nèi)皮素-1表達(dá)的制劑?；趐53活性、或者基于p53基因、p53目 標(biāo)基因或它們的表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平，可以分析皮膚中斑的狀況(例如，斑形成發(fā)展程度 或緩解程度)。1)評(píng)價(jià)或選擇對(duì)斑具有預(yù)防或緩解作用制劑的方法該方法選擇一種物質(zhì)作為候補(bǔ)，該物質(zhì)抑制表皮細(xì)胞中的p53活性、或者抑制表 皮細(xì)胞中的P53基因、p53目標(biāo)基因或它們的表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平。對(duì)于使用的表皮細(xì)胞沒有特別限制，只要它源于動(dòng)物的表皮細(xì)胞，并且該表皮細(xì) 胞中具有p53活性、或者p53基因、p53目標(biāo)基因或它們的表達(dá)產(chǎn)物在該表皮細(xì)胞中表達(dá)。 優(yōu)選較之正常表皮細(xì)胞，表皮細(xì)胞中的基因或蛋白質(zhì)表達(dá)水平增加。所用的表皮細(xì)胞可以 包含于皮膚組織，或從皮膚組織分離得到，或源于正常的表皮細(xì)胞或建立的表皮細(xì)胞系的細(xì)胞(例如，HaCaT細(xì)胞)。表皮細(xì)胞的來源動(dòng)物可以是非人類的動(dòng)物(例如，嚙齒動(dòng)物如大鼠、小鼠或豚 鼠)，但優(yōu)選人類。表皮細(xì)胞的來源組織可以列舉出從活體組織手術(shù)切除的皮膚組織；從活體組織手 術(shù)切除、再移植入其它動(dòng)物的皮膚組織，例如免疫缺陷小鼠；由表皮細(xì)胞和其它構(gòu)成皮膚的 細(xì)胞組成的培養(yǎng)皮膚替代物；或者從免疫缺陷小鼠或其它動(dòng)物再組成的皮膚。在此，“p53活性”表明蛋白質(zhì)活性水平，可以列舉出p53蛋白質(zhì)激活目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄 的能力，蛋白質(zhì)改性例如磷酸化或乙?；哪芰?。在此，“抑制P53活性的物質(zhì)”是指一種進(jìn) 行調(diào)控的物質(zhì)，例如，如上所述，具有激活轉(zhuǎn)錄或蛋白質(zhì)改性的能力的物質(zhì)。在此，“抑制p53基因或p53目標(biāo)基因表達(dá)水平的物質(zhì)”是指一種對(duì)與構(gòu)成p53基 因或p53目標(biāo)基因的多核苷酸互補(bǔ)的mRNA的表達(dá)進(jìn)行抑制、或促進(jìn)mRNA降解的物質(zhì)?！耙?制它們的表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平的物質(zhì)”是指一種對(duì)P53基因或p53目標(biāo)基因(例如，p53蛋 白質(zhì))表達(dá)產(chǎn)物的水平進(jìn)行抑制、或促進(jìn)表達(dá)產(chǎn)物降解從而抑制表達(dá)水平的物質(zhì)。
具體而言，在本發(fā)明的評(píng)價(jià)或選擇方法中，通過下列步驟，基于p53基因或p53目 標(biāo)基因來選擇候補(bǔ)物質(zhì)。(Ia)接觸步驟，使測(cè)試物質(zhì)接觸表皮細(xì)胞，其中，p53基因或p53目標(biāo)基因在該表 皮細(xì)胞中表達(dá)。(2a)測(cè)定步驟，測(cè)定接觸了測(cè)試物質(zhì)表皮細(xì)胞中的p53基因或p53目標(biāo)基因的表 達(dá)水平。(3a)比較步驟，將步驟(2a)中測(cè)量的表達(dá)水平與沒有接觸測(cè)試物質(zhì)的對(duì)照表皮 細(xì)胞中的相應(yīng)基因的表達(dá)水平進(jìn)行比較。(4a)選擇步驟，基于步驟(3a)中獲得的結(jié)果，選擇測(cè)試物質(zhì)作為對(duì)斑具有預(yù)防或 緩解作用的試劑，該測(cè)試物質(zhì)抑制P53基因或p53目標(biāo)基因的表達(dá)水平。在步驟(Ia)中，表皮細(xì)胞接觸測(cè)試物質(zhì)可以采用如下步驟通過將測(cè)試物質(zhì)溶解 在溶劑(例如，乙醇、DMSO或水)中，制備測(cè)試物質(zhì)溶液(0. 0001 10w/v% )，接著將該溶 液(在使用前，適當(dāng)稀釋)用于表皮細(xì)胞或培養(yǎng)表皮細(xì)胞的培養(yǎng)基。可以采用公知方法檢測(cè)或定量測(cè)定基因表達(dá)，如使用從上述組織中制備的RNA、或 從RNA轉(zhuǎn)錄的互補(bǔ)多核苷酸，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)。具體而言，在本發(fā)明的評(píng)價(jià)或選擇方法中，通過下列步驟，基于p53基因或p53目 標(biāo)基因表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平來選擇候補(bǔ)物質(zhì)。(Ib)接觸步驟，使測(cè)試物質(zhì)接觸表皮細(xì)胞，其中，p53基因或p53目標(biāo)基因的表達(dá) 產(chǎn)物在該表皮細(xì)胞中表達(dá)。(2b)測(cè)定步驟，測(cè)定表皮細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平。(3b)比較步驟，將步驟(2b)中測(cè)量的表達(dá)水平與沒有接觸測(cè)試物質(zhì)的對(duì)照表皮 細(xì)胞中的相應(yīng)基因的表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平進(jìn)行比較。(4b)選擇步驟，基于步驟(3b)中獲得的結(jié)果，選擇測(cè)試物質(zhì)作為對(duì)斑具有預(yù)防或 緩解作用的試劑，該測(cè)試物質(zhì)抑制表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平。在步驟(Ib)中，采用與上述步驟(Ia)類似的方法，進(jìn)行表皮細(xì)胞和測(cè)試物質(zhì)的接觸。在步驟(2b)中，可以采用公知技術(shù)定量測(cè)定表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平，例如，使用識(shí)別表達(dá)產(chǎn)物的抗體(例如，抗P53抗體、抗p21抗體、抗Gadd45a抗體或抗Mdm2抗體)，進(jìn)行 免疫印跡。如下所示進(jìn)行免疫印跡使用識(shí)別表達(dá)產(chǎn)物的第一抗體和、與第一抗體結(jié)合并用 放射性同位素(例如，125I)、熒光物質(zhì)或酶(例如，辣根過氧化物酶(HRP))標(biāo)記過的第二抗 體，再采用輻射儀、熒光檢測(cè)器或類似儀器測(cè)量來自標(biāo)記物質(zhì)的信號(hào)。抗體可以是單克隆抗體或用表達(dá)產(chǎn)物作為免疫原制備的多克隆抗體。抗體可以是 保證識(shí)別表達(dá)產(chǎn)物的市售品，或通過動(dòng)物(例如，大鼠或小鼠)免疫接種制備。具體而言，在本發(fā)明的評(píng)價(jià)或選擇方法中，通過下列步驟，基于p53活性來選擇候 補(bǔ)物質(zhì)。(Ic)接觸步驟，使測(cè)試物質(zhì)接觸具有P53活性的表皮細(xì)胞。(2c)測(cè)定步驟，測(cè)定表皮細(xì)胞中的p53活性。(3c)比較步驟，將步驟(2c)中測(cè)定的p53活性與沒有接觸測(cè)試物質(zhì)的對(duì)照表皮細(xì) 胞中的P5 3活性進(jìn)行比較。(4c)選擇步驟，基于在步驟(3c)中獲得的結(jié)果，選擇測(cè)試物質(zhì)作為對(duì)斑具有預(yù)防 或緩解作用的試劑的步驟，該測(cè)試物質(zhì)抑制P53活性。在步驟(Ic)中，采用與上述步驟(Ia)類似的方法，進(jìn)行表皮細(xì)胞和測(cè)試物質(zhì)的接 觸。在步驟(2c)中，可以通過公知技術(shù)定量測(cè)定p53活性。例如，使用對(duì)反映p53活 化的P53蛋白質(zhì)改性進(jìn)行識(shí)別的抗體(例如，抗磷酸化p53抗體或抗乙酰化p53抗體)，進(jìn) 行免疫印跡。可以測(cè)定P53蛋白質(zhì)中的一個(gè)或多個(gè)改性(磷酸化或乙?；?位置，也可以 檢測(cè)作為P53改性位置識(shí)別的各種改性位置。如下所示進(jìn)行免疫印跡使用對(duì)反映p53活化的p53蛋白質(zhì)改性進(jìn)行識(shí)別的第一 抗體和、與第一抗體結(jié)合并用放射性同位素(例如，125I)、熒光物質(zhì)或酶(例如，辣根過氧化 物酶(HRP))標(biāo)記過的第二抗體，采用輻射儀、熒光檢測(cè)器或類似儀器測(cè)量來自標(biāo)記物質(zhì)的信號(hào)。抗體可以是單克隆抗體或用上述改性蛋白質(zhì)作為免疫原制備的多克隆抗體?？贵w 可以是保證識(shí)別上述改性位置的市售品，或通過動(dòng)物(例如，大鼠或小鼠)免疫接種制備。在步驟(2c)中，可以通過其它公知技術(shù)，進(jìn)行p53活性的定量測(cè)定，例如，采用從 具有P53活性表皮細(xì)胞中提取的細(xì)胞提取物和含有特異結(jié)合p53的序列并用放射性同位素 (例如，32P)或熒光物質(zhì)標(biāo)記過的DNA片段，進(jìn)行凝膠轉(zhuǎn)移測(cè)定。進(jìn)行凝膠轉(zhuǎn)移測(cè)定的過程如下所示將從具有P53活性的表皮細(xì)胞中提取的細(xì)胞 提取物與含有特異結(jié)合P53序列并用放射性同位素(例如，32p)或熒光物質(zhì)標(biāo)記過的DNA片 段混合；培養(yǎng)混合物，再將該混合物用于聚丙烯酰胺凝膠電泳分析；采用輻射儀、熒光檢測(cè) 器或類似儀器測(cè)量來自標(biāo)記物質(zhì)的信號(hào)。從文獻(xiàn)或現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫可以獲得特異結(jié)合p53的序列。可以通過傳統(tǒng)的公知技術(shù)制 備DNA片段。在步驟(2c)中，可以通過其它公知技術(shù)，進(jìn)行p53活性的定量測(cè)定，例如，在具有 P53活性的表皮細(xì)胞中引入報(bào)告基因(質(zhì)粒)，該報(bào)告基因具有含有結(jié)合p53序列的表達(dá)啟 動(dòng)子，進(jìn)行報(bào)告基因試驗(yàn)。
進(jìn)行報(bào)告基因試驗(yàn)的過程如下所示在具有p53活性的表皮細(xì)胞中引入報(bào)告基因 (質(zhì)粒)，該報(bào)告基因具有基因表達(dá)酶，例如螢火蟲熒光素酶，和含有結(jié)合P53序列的表達(dá)啟 動(dòng)子；通過檢測(cè)器測(cè)定熒光密度或由于酶促反應(yīng)產(chǎn)生的顏色變化。報(bào)告基因(質(zhì)粒)可以通過傳統(tǒng)的公知技術(shù)制備。如上所述，基于定量測(cè)定的p53活性、或定量測(cè)定的p53基因、p53目標(biāo)基因的表 達(dá)水平或它們的表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平，可以選擇測(cè)試物質(zhì)作為抑制P53活性、或者抑制p53 基因、P53目標(biāo)基因或p53蛋白質(zhì)的表達(dá)水平的物質(zhì)。具體而言，當(dāng)較之對(duì)照表皮細(xì)胞中相 應(yīng)的活性或表達(dá)水平，已測(cè)定的P53活性或表達(dá)水平被顯著抑制時(shí)，選擇測(cè)試物質(zhì)作為抑 制P 53活性或p53表達(dá)的物質(zhì)。2)分析斑狀況的方法根據(jù)本發(fā)明的分析斑狀況的方法，可以如下所示來分析斑的狀況，例如，如果觀察 到斑中的活性或表達(dá)水平比正常表皮細(xì)胞中相應(yīng)的活性或表達(dá)水平高的話，測(cè)定該斑位置 處的表皮細(xì)胞中是否有P53活性、或者p53基因、p53目標(biāo)基因或它們的表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水 平。將正常皮膚位置用作對(duì)照，該正常皮膚位置可以是斑附近位置，也可以是防曬的位置， 以及可以是具有相對(duì)較少斑的位置。具體而言，當(dāng)斑點(diǎn)位置處的表皮細(xì)胞中的p53活性、或者斑點(diǎn)位置處的表皮細(xì)胞 中的P53基因、p53目標(biāo)基因或它們的表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平高于正常位置(對(duì)照)表皮細(xì) 胞中相應(yīng)的活性或表達(dá)水平時(shí)，可以測(cè)定皮膚上斑形成的發(fā)展程度或緩解程度，從而可以 分析皮膚斑的狀況。用于分析的測(cè)試樣品可以是通過皮膚切片(例如，鉆取活組織檢查)得到的皮膚 組織，或通過例如吸皰法得到的表皮組織。測(cè)試樣品可以是通過例如酶處理或熱處理，從收 集的皮膚組織中分離得到的表皮組織，或可以來源于收集得到的皮膚或表皮組織的器官培 養(yǎng)物。即，測(cè)試樣品可以是從皮膚或表皮組織分離得到的表皮細(xì)胞，或適當(dāng)培養(yǎng)得到的表皮 細(xì)胞。實(shí)施例實(shí)施例1在本實(shí)施例中，通過免疫組織化學(xué)法分析在人體皮膚組織中的p53表達(dá)。從有老年斑的人體皮膚收集皮膚組織，制備組織的石蠟切片。除去石蠟后，在 REAL 目標(biāo)修復(fù)溶液(Target Retrieval Solution，DAKO產(chǎn)品)中95°C下熱處理每個(gè)組 織切片45分鐘，從而激活抗原。室溫下冷卻30分鐘后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗組織切 片，然后后用0.3% H2O2溶液處理30分鐘。用PBS沖洗后，用10%正常山羊血清(Nichirei Bioscience產(chǎn)品)室溫下封閉組織切片1小時(shí)，然后在組織切片中加入已用封閉液稀釋 100倍的小鼠抗人體P53抗體(D0-7，DAKO產(chǎn)品)(第一抗體)，接著，將切片在4°C下靜置 一晚。用PBS沖洗后，將過氧化物酶標(biāo)記過的抗小鼠IgG多克隆抗體(Fab’ ) (Nichirei Bioscience產(chǎn)品)(第二抗體)加入組織切片，接著在室溫下靜置切片30分鐘。用PBS沖 洗后，通過用HistoMark TrueB lue Peroxidase System(KPL產(chǎn)品)使組織切片進(jìn)行酶 促反應(yīng)。觀察顏色變化后，加水終止反應(yīng)，接著用NUCLEAR FAST RED (Vector Laboratories 的產(chǎn)品)使組織切片復(fù)染。用自來水沖洗10分鐘后，用甘油和蓋玻片密封染色后的組織切 片，通過顯微鏡和成像裝置(Carl Zeiss的產(chǎn)品)得到染色后組織圖像。
如圖1所示，在老年斑附近位置幾乎沒有觀察到p53表達(dá)，而在老年斑位置的表皮中觀察到P53表達(dá)水平大幅增加(染藍(lán)色位置)。實(shí)施例2在本實(shí)施例中，分析人體表皮組織中p53目標(biāo)基因的表達(dá)。首先，按照吸皰法，從健康男性成人皮膚得到斑位置、斑位置附近(前臂外側(cè))、或 防曬區(qū)域(上臂內(nèi)側(cè))的表皮。具體而言，消毒每個(gè)試驗(yàn)位置，用1.0 2. 5mm直徑的注射 器(Terumo Corporation產(chǎn)品)接觸皮膚表面，接著通過泵抽吸大約1 2小時(shí)，從真皮中 分離得到表皮。用消毒剪刀隔離分離后的表皮，制備源于試驗(yàn)體的樣品。用PBS沖洗已制備的表皮組織樣品，再轉(zhuǎn)移進(jìn)含有RNAlater (QIAGEN產(chǎn)品)的 試管中(ImL)，接著在4°C下靜置一晚。之后，用PBS沖洗組織切片，采用RNeasy微試劑盒 (QIAGEN產(chǎn)品)按照慣用方法制備總RNA。使合成的RNA溶液的等分試樣(Iyg)逆轉(zhuǎn)錄，從而合成cDNA。按照慣用方法， 米用用于 RT-PCR 的 SuperScript III First-Strand SynthesisSystem(Invitrogen Corporation產(chǎn)品)和Peltier熱循環(huán)儀(MJ Research, Inc.產(chǎn)品)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。按照定量PCR，使用TaqMan探針，將上述合成得到的cDNA用于基因表達(dá)分析。 TaqMan 基因表達(dá)分析產(chǎn)品(ρ/Ν 4331182) (AppliedBiosystems產(chǎn)品)用于檢測(cè)ρ53 目標(biāo)基因的特異性探針和引物。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法直接定量每個(gè)基因的表達(dá)水平，再用內(nèi)部 對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)基因RPLPO (檢測(cè)編號(hào)Hs99999902_ml)的表達(dá)水平校正每個(gè)基因的表達(dá)水平。 在常規(guī)條件下通過序列檢測(cè)器進(jìn)行反應(yīng)(ABI PRISM 7500RealTime PCR System, Applied Biosystems 產(chǎn)品)。具體而言，在本實(shí)施例中，測(cè)定CDKNlA (p21)基因(檢測(cè)編號(hào)Hs00355782_ml)、 GADD45A基因(檢測(cè)編號(hào)Hs00169255_ml)和MDM2基因(檢測(cè)編號(hào)Hs01066938_ml)的表 達(dá)水平。這些基因是通常公知的p53目標(biāo)基因。用于測(cè)量這些基因的表達(dá)水平的探針和引物可以是用于基因表達(dá)定量分析的市 售品。針對(duì)目標(biāo)基因的探針和引物可以是設(shè)計(jì)制備的。具體而言，這樣的基因特異性探針和 引物可以是基于從數(shù)據(jù)庫獲得的基因序列數(shù)據(jù)，用設(shè)計(jì)軟件(例如，引物設(shè)計(jì)軟件(Primer Express) (Applied Biosystems 產(chǎn)品))設(shè)計(jì)的。如圖2所示，作為公知的p53目標(biāo)基因的⑶KNlA(p21)基因、GADD45A基因或MDM2 基因在斑的位置處顯著增加。實(shí)施例3從Kurabo Industries Ltd.購買源于新生兒包皮的人體表皮細(xì)胞，在37°C、5% (v/v) CO2氣氛下，在無血清基礎(chǔ)生長(zhǎng)培養(yǎng)基(EpiLife，KuraboIndustries Ltd.產(chǎn)品)中預(yù) 培養(yǎng)。將預(yù)培養(yǎng)的表皮細(xì)胞接種進(jìn)6孔培養(yǎng)板(Falcon產(chǎn)品)(1. OX IO5細(xì)胞/孔)。24小 時(shí)之后，在不包含BPE(牛垂體腺提取物)和hEGF(人體表皮生長(zhǎng)因子)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培 養(yǎng)細(xì)胞。24小時(shí)之后，加入通常公知的p53活化劑5-氟尿嘧啶(5-FU，Calbiochem產(chǎn)品)，其 濃度為1 10μ g/mL。處理48小時(shí)后，用TRIzol 試劑(Invitrogen Corporation產(chǎn)品) 提取總RNA。具體而言，用PBS沖洗培養(yǎng)板每個(gè)孔，在孔中加入TRIzol 試劑(ImL)。將該混 合物倒入1. 5mL試管中，在其中加入氯仿(200 μ tL)，將混合物徹底攪拌，接著以15，OOOrpm 轉(zhuǎn)速離心15分鐘。將由此產(chǎn)生的上層液體轉(zhuǎn)移進(jìn)干凈的1.5mL試管中，在其中加入異丙醇；接著，攪拌，以12，OOOrpm轉(zhuǎn)速離心10分鐘。抽出上層清液，在沉淀中加入75%乙醇(ImL)； 接著，以8，500rpm轉(zhuǎn)速離心5分鐘。通過抽吸除去上層清液，將沉淀溶解在dH20中(15 30口1^)，制備總1 ·。使如上所述提取得到的總RNA逆轉(zhuǎn)錄，從而合成cDNA，通過定量PCR，使用TaqMan 探針，將這樣合成的cDNA用于基因表達(dá)分析。在本實(shí)施例中，具體而言，測(cè)定SCF(KITLG) 基因(檢測(cè)編號(hào)Hs00241497_ml)和內(nèi)皮素_1基因(檢測(cè)編號(hào)Hs00174961_ml)的表達(dá)水 平。本實(shí)施例中所用的基因表達(dá)分析的詳細(xì)步驟與實(shí)施例2中的步驟相似。如圖3所示，在培養(yǎng)的表皮細(xì)胞中，通常公知的p53活化劑5-氟尿嘧啶(5_FU)顯 著誘導(dǎo)SCF(KITLG)基因或內(nèi)皮素-ι基因的表達(dá)。實(shí)施例4從Kurabo Industries Ltd.購買源于新生兒包皮的人體表皮細(xì)胞，在37°C、5% (v/v)CO2氣氛下，在無血清基礎(chǔ)生長(zhǎng)培養(yǎng)基(EpiLife，KuraboIndustries Ltd.產(chǎn)品)中 預(yù)培養(yǎng)。將預(yù)培養(yǎng)的表皮細(xì)胞接種進(jìn)6孔培養(yǎng)板(Falcon產(chǎn)品)(1. OX IO5細(xì)胞/孔)。24 小時(shí)之后，在不包含BPE(牛垂體腺提取物)和hEGF(人體表皮生長(zhǎng)因子)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基 中培養(yǎng)細(xì)胞。24小時(shí)之后，加入通常公知的p53抑制劑pifithrin-α (PFT，Calbiochem產(chǎn) 品)，其濃度為1 10 μ Μ。培養(yǎng)24小時(shí)后，用TRIzol 試劑(Invitrogen Corporation 產(chǎn)品)提取總RN A。使如此提取得到的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，從而合成cDNA，通過定量PCR， 使用TaqMan探針，將這樣合成的cDNA用于基因表達(dá)分析。在本實(shí)施例中，具體而言，測(cè)定 SCF(KITLG)基因和內(nèi)皮素-1基因的表達(dá)水平。本實(shí)施例中所用的基因表達(dá)分析的詳細(xì)步 驟與實(shí)施例2或3中的步驟相似。如圖4所示，在培養(yǎng)的表皮細(xì)胞中，通常公知的p53抑制劑pifithrin-α (PFT)使 SCF(KITLG)基因或內(nèi)皮素-ι基因表達(dá)顯著降低。實(shí)施例5從Kurabo Industries Ltd.購買三維培養(yǎng)皮膚模型(MEL-300A)。拿到產(chǎn)品后馬上 將組織杯轉(zhuǎn)移進(jìn)6孔培養(yǎng)板(Falcon產(chǎn)品)，在37°C、5% (v/v) CO2氣氛下，在長(zhǎng)期維持培養(yǎng) 基(ΕΡΙ-100-ΝΜΜ-113,KuraboIndustries Ltd.產(chǎn)品)(ImL)中培養(yǎng)一夜。之后，加入通常的 P53抑制劑pifithrin-α (PFT)；接著,培養(yǎng)14天。在滅菌不銹鋼墊圈(KuraboIndustries Ltd.產(chǎn)品)中靜置組織杯，并使用長(zhǎng)期維持培養(yǎng)基(5mL)進(jìn)行培養(yǎng)。每三天換培養(yǎng)基。培 養(yǎng)后，用鑷子從組織杯中取出皮膚組織，用PBS沖洗三次，用5% (v/v)三氯乙酸沖洗一次， 用乙醚和乙醇的混合物(體積比1 3)沖洗一次。將洗滌后的皮膚組織在50°C下培養(yǎng)2 小時(shí)，使組織干燥。將該組織溶解于2N氫氧化鈉水溶液中(2N) (200 μ L)，以15，OOOrpm轉(zhuǎn) 速離心15分鐘?；厥张囵B(yǎng)物上層清液，在405nm處測(cè)量吸光度，計(jì)算組織中的黑色素含量。 圖5表示對(duì)照中的相對(duì)黑色素含量(100% )。如圖5所示，pifithrin-α (PFT)(例如，通常公知的ρ53抑制劑)以PFT劑量依 賴性的方式降低三維培養(yǎng)皮膚模型中的黑色素含量。實(shí)施例6通過St印hens&Associates(Carrollton，TX)合約實(shí)驗(yàn)室，募集有斑的受試 者。一名負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)室的皮膚科醫(yī)生用活組織檢查環(huán)鉆(直徑4mm)從兩名56歲白人 女性受試者的肩膀(每個(gè)受試者兩個(gè)位置)收集有光線性花瓣?duì)钌匕叩钠つw組織樣品。將收集到的皮膚活檢樣品浸入DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco，s Modifed Eagle，Medium)， 使其保持在4 10°C運(yùn)送至美國(guó)生物科學(xué)實(shí)驗(yàn)室辛辛那提分部。收集到有光線性花瓣 狀色素斑的皮膚組織樣品后24小時(shí)內(nèi)，用一次性手術(shù)刀將每個(gè)樣品切成兩半。一半樣 品在含有10 μ Mpifithrin- α (PFT) (ρ53抑制劑)的DMEM中器官培養(yǎng)，另一半在不含 pifithrin-α (PFT)的 DMEM 中器官培養(yǎng)。切開膠原海綿(Avitene Ultrafoam，MedChem 產(chǎn) 品，Inc.Woburn，ΜΑ)，使其內(nèi)部成為良好的器官培養(yǎng)皿(BD Bioscience (San Jose, CA)), 在海綿中心開孔(直徑3mm)。將光線性花瓣?duì)钌匕呓M織樣品放入孔中，使樣品表面與海 綿表面齊平后，實(shí)施器官培養(yǎng)。器官培養(yǎng)皿的外部孔充滿PBS(5mL)，在37°C、5% CO2氣氛 下在培養(yǎng)箱中進(jìn)行器官培養(yǎng)。實(shí)施器官培養(yǎng)后24小時(shí)、48小時(shí)更換培養(yǎng)基。實(shí)施器官培 養(yǎng)后72小時(shí)，用70°C熱水處理光線性花瓣?duì)钌匕呓M織樣品1分鐘，從RNAlater (Qiagen， Valencia, CA)中只回收表皮。
用RNeasy微試劑盒(Qiagen)提取總RNA，按照慣用方法，用ThermoScript RT-PCR Systems(Invitrogen, Carlsbad, CA)合成 cDNA。從TaqMan 基因表達(dá)試驗(yàn)(Applied Biosystems)得到酪氨酸酶mRNA、SCF (KITLG) mRNA和內(nèi)皮素-ImRNA的特異性探針(檢測(cè) 編號(hào)Hs00165976_ml，Hs00241497_ml 和 Hs00174961_ml)，通過 ABIPRISM 7300 序列檢測(cè)系 統(tǒng)(Applied Biosystems)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR。用內(nèi)部對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)基因RPLPO(檢測(cè)編號(hào) Hs99999902_ml)校正每個(gè)基因的表達(dá)水平。相對(duì)于對(duì)照斑樣品中基因的表達(dá)水平(作為 1)，計(jì)算PFT處理后的斑樣品中每個(gè)基因的表達(dá)水平。如圖6所示，通過抑制p53，顯著降低酪氨酸酶基因或SCF(KITLG)基因的表達(dá)，內(nèi) 皮素-1的表達(dá)趨向顯著降低。
權(quán)利要求
一種評(píng)價(jià)或選擇對(duì)斑具有預(yù)防或緩解作用的制劑的方法，其包括對(duì)抑制表皮細(xì)胞中的p53活性的物質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，或者對(duì)抑制表皮細(xì)胞中的p53基因、p53目標(biāo)基因或它們的表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平的物質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)。
2.一種評(píng)價(jià)或選擇對(duì)斑具有預(yù)防或緩解作用的制劑的方法，其包括以下步驟(1) (4)(1)接觸步驟，使測(cè)試物質(zhì)接觸表皮細(xì)胞，其中，所述表皮細(xì)胞中具有P53活性，或者具 有在所述表皮細(xì)胞中表達(dá)的P53基因、p53目標(biāo)基因或它們的表達(dá)產(chǎn)物；(2)測(cè)定步驟，測(cè)定表皮細(xì)胞中的p53活性，或者測(cè)定表皮細(xì)胞中的p53基因、p53目標(biāo) 基因或它們的表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平；(3)比較步驟，將步驟(2)中測(cè)量的活性或表達(dá)水平與沒有接觸測(cè)試物質(zhì)的對(duì)照表皮 細(xì)胞中的P53活性、或者沒有接觸測(cè)試物質(zhì)的對(duì)照表皮細(xì)胞中的p53基因、p53目標(biāo)基因或 它們的表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平進(jìn)行比較；(4)選擇步驟，基于步驟(3)中獲得的結(jié)果，選擇抑制p53活性的測(cè)試物質(zhì)、或者抑制 p53基因、p53目標(biāo)基因或它們的表達(dá)物質(zhì)的表達(dá)水平的測(cè)試物質(zhì)作為對(duì)斑具有預(yù)防或緩 解作用的制劑。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，p53目標(biāo)基因?yàn)檫x自GADD45A基因、 ⑶ΚΝ1Α(ρ21)基因和MDM2基因中的至少1種基因。
4.一種評(píng)價(jià)或選擇用于調(diào)節(jié)SCF或內(nèi)皮素-1表達(dá)的調(diào)節(jié)劑的方法，其包括對(duì)抑制表皮 細(xì)胞中的P53活性的物質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，或者對(duì)抑制表皮細(xì)胞中的p53基因、p53目標(biāo)基因或它 們的表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平的物質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)。
5.一種分析皮膚斑的狀況的方法，其包括通過比較人體表皮細(xì)胞中的p53活性、或者 人體表皮細(xì)胞中的P53基因、p53目標(biāo)基因或它們的表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平與對(duì)照表皮細(xì)胞 中的P53活性、或者對(duì)照表皮細(xì)胞中的p53基因、p53目標(biāo)基因或它們的表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水 平，確定皮膚斑形成的發(fā)展程度或緩解程度。
全文摘要
本發(fā)明提供一種評(píng)價(jià)或選擇對(duì)斑具有預(yù)防或緩解作用的制劑的方法。該方法實(shí)現(xiàn)可靠有效地篩選制劑的候補(bǔ)物質(zhì)，預(yù)測(cè)斑形成，分析皮膚斑的狀況。本發(fā)明的評(píng)價(jià)或選擇對(duì)斑具有預(yù)防或緩解作用的制劑的方法，包括對(duì)抑制表皮細(xì)胞中的p53活性的物質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，或者對(duì)抑制表皮細(xì)胞中的p53基因、p53目標(biāo)基因或它們的表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平的物質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)。
文檔編號(hào)G01N33/50GK101971025SQ20098010791
公開日2011年2月9日 申請(qǐng)日期2009年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月6日
發(fā)明者八谷輝, 天野恭子, 村瀬大樹 申請(qǐng)人:花王株式會(huì)社