專利名稱：組織特定區(qū)域的捕獲方法用電動切割刀的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
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本發(fā)明涉及一種從組織中捕獲特定區(qū)域的方法及專用設(shè)備，尤其是一種操 作簡單、成本低，可有效防止細胞交叉污染的組織特定區(qū)域的捕獲方法及專用 設(shè)備。
背景技術(shù)：
細胞分子遺傳學(xué)尤其是基因組學(xué)研究是生命科學(xué)領(lǐng)域重要的組成部分。它 要解決的核心問題包括基因組的構(gòu)成、遺傳規(guī)律和多樣性，不同生理和病理 狀態(tài)下的基因組表達特點和在時空上的調(diào)節(jié)以及借助生物信息學(xué)的手段對上述 分析的數(shù)據(jù)進行儲存、加工和分析。從而在基因組和蛋白質(zhì)組學(xué)水平全面揭示 與生命的發(fā)生、發(fā)展和演變密切相關(guān)的基因。
雖然國內(nèi)外該研究領(lǐng)域進展十分迅速，但也面臨某些技術(shù)問題，其中十分
引人注目的是與體外培養(yǎng)的、由單一類型細胞組成的細胞系不同，取自體內(nèi)
組織/器官的標本存在多種細胞成分，即便是同一個標本的不同區(qū)域，組織的構(gòu) 成也有明顯的差異。各類組織中都有多種細胞成分存在，這很容易造成提取到 的核酸和蛋白樣本出現(xiàn)細胞間的交叉污染。由于不同細胞的基因表達特點有明 顯差異，因此很容易導(dǎo)致實驗結(jié)果出現(xiàn)偏差。另外，目前的組織處理方法也很 難保證用于上游基因組學(xué)檢測和下游侯選基因核實的組織樣本來源于(基本) 相同的細胞群體，致使實驗結(jié)果缺乏對應(yīng)性，明顯增加了侯選基因核實的工作 量。為此，人們越發(fā)感到，原位的組織和分子病理學(xué)觀察與組織特定區(qū)域的核 酸和蛋白提取是互為補充，相得益彰的關(guān)系，應(yīng)當(dāng)在一個組織塊上同步完成。 只有這樣，才能提高實驗設(shè)計的嚴謹性，保證課題研究的科學(xué)性、可信性和高 效性。
為了捕獲組織特定區(qū)域，人們已做了種種努力。其中，頗為有效的方式是
美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)科學(xué)家Emmert-Buck等人發(fā)明的激光捕獲顯微切割技術(shù)(Laser Capture Microdissection, LCM)。其基本原理是，在顯微鏡下選擇組織切片內(nèi)的特定區(qū)域，用激光束將其與主體分離，經(jīng)特殊濾膜把它移至試管中做進一步處理(如DNA、 RNA和蛋白提取)。該技術(shù)的準確性很高，但操作復(fù)雜，耗時較長，特別是在常溫下操作容易造成RNA降解，而且，LCM的最大捕獲直徑僅有0.6mm，故每次采集的組織/細胞數(shù)量十分有限，即便經(jīng)過多次捕獲也未必能滿足諸如基因表達譜分析、Northern或Western印記分析等實驗的基本用量。如若采用高效方法對提取到的核酸樣本加以擴增，則很容易造成假陽性的結(jié)果，進-一步增加了結(jié)果核實的工作量。另外，LCM的專用設(shè)備十分昂貴(60-80萬元)，它的實驗輔助用品和消耗材料也價格不菲，從而明顯增加了項目研究的實驗成本。所以，該設(shè)備雖問世十余年，但研究人員大多"望價卻步"，加之所能捕獲的樣本量較少，致使其應(yīng)用范圍十分有限。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的操作復(fù)雜、耗時長、成本高、樣本產(chǎn)出量少等技術(shù)問題，提供一種經(jīng)濟實用、簡便易行、工作效率高和樣本產(chǎn)出量大的組織特定區(qū)域的捕獲方法和專用設(shè)備。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是 一種組織特定區(qū)域的捕獲方法，其特征在于有
如下步驟
a. 從冰凍組織塊上取切片置于顯微鏡下選定目的區(qū)域；
b. 用標定筆在冰凍組織切片的正面標定目的區(qū)域；
e.在冰凍組織切片的背面涂信息轉(zhuǎn)移膜液體并用水性筆在信息轉(zhuǎn)移膜上鏡像標出目的區(qū)域；
e.將冰凍組織切片的信息轉(zhuǎn)移膜面與冰凍組織塊吻合相貼，然后再將冰凍組織切片取下；
d.用切割刀沿冰凍組織上的目的區(qū)域標志進行切割，在冰凍條件下切片分離后收集目的區(qū)域。
所述的信息轉(zhuǎn)移膜液體是按下列組分、重量及方法配制而成椰子油18~22、蓖麻油5~9、牛脂11 15、糖12~14、氫氧化鈉20 24、酒精8 12、蘇打0.3-0.7、水28 30，將椰子油、蓖麻油、牛脂投入容器中加熱至75 85"C，另將氫氧化鈉、蘇打溶于水后徐徐加入所加熱的油料中，攪拌使之皂化，待皂液透明，加入糖和酒精。
一種組織特定區(qū)域的捕獲方法用標定筆，有筆芯l，筆芯l的上端設(shè)有顯微鏡標準接口2，中部設(shè)有彈性染料瓶3，下端是與彈性染料瓶3相接的標定頭4，與筆芯1外接有筆套5。
所述的彈性染料瓶3的中部為螺紋狀彈性收縮體；所述的標注頭4為設(shè)有金屬芯，金屬芯外套有長度略長于金屬芯的彈性減壓套。
一種組織特定區(qū)域的捕獲方法用電動切割刀，有筆式殼體6，筆式殼體6內(nèi)前端置有電機7，電機7的輸出軸與置于筆式殼體6外的銑刀8相接，在筆式殼體6內(nèi)還設(shè)有電池9，電池9通過開關(guān)10與電機7相接。
所述電機7與電機9之間有彈性線圈11，開關(guān)10設(shè)置在筆式殼體6的后端，開關(guān)10與電池9之間有彈性線圈12。
本發(fā)明可實現(xiàn)目的區(qū)域的精確定位，采用獨特的方法將組織切片上的定位信息可靠地轉(zhuǎn)移到組織塊的相應(yīng)部位，而后使用專用的電動組織切割刀對目的組織區(qū)域加以切割，使其在切片的過程中與組織主體分離并在完全冷凍的狀態(tài)下以手工的方式將其快速收集到試管中進行樣本提取。具有如下優(yōu)點
1. 可避免其它實驗方法出現(xiàn)的組織塊在常溫下長時間操作使標本溶化導(dǎo)致樣本變質(zhì)或降解的現(xiàn)象發(fā)生；
2. 對母體組織的破壞甚微，在滿足從特定組織區(qū)域精確地提取到高質(zhì)量、高產(chǎn)出的核酸和蛋白質(zhì)樣本的同時，剩余組織還可以用于其他研究目的；
3. 工作效率高、獲取的樣本量大，實驗成本明顯降低；
4. 所用設(shè)備成本低，經(jīng)濟實用、操作簡便、易于推廣，既能用在諸如基因組和蛋白質(zhì)組學(xué)等高端領(lǐng)域研究，也可以在日常的科研以及臨床分子診斷中應(yīng)用，提高了科學(xué)研究的科學(xué)性、可信性、先進性和高效性。


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圖1為本發(fā)明實施例標定筆的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為本發(fā)明實施例切割刀的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實施例方式
下面將結(jié)合

本發(fā)明的具體實施方式
。實施例1:
一種組織特定區(qū)域的捕獲方法，其特征在于有如下步驟
a.在液氮中從冰凍組織塊上取切片，組織形態(tài)學(xué)染色，切片的大小以適合
臺式顯微鏡觀察為宜。冰凍組織可以是新鮮的冰凍組織，也可以是石蠟包埋組
織標本或者多聚甲醛固定的標本；
5b. 將切片置于顯微鏡下觀察，選定目的點(spot)或目的區(qū)域(reqion);
c. 在冰凍組織切片的正面，用筆對目的點(spot)或目的區(qū)域(reqion)處著色，即標定目的區(qū)域；
d. 在冰凍組織切片的背面涂信息轉(zhuǎn)移膜液體，待信息轉(zhuǎn)移膜液體風(fēng)干(20秒左右)后，用水性筆在信息轉(zhuǎn)移膜上鏡像標出目的點或目的區(qū)域，信息轉(zhuǎn)移膜液體必須是能在切片上成膜且與冰凍組織相貼時可以轉(zhuǎn)移至冰凍組織上。
e. 將冰凍組織切片的信息轉(zhuǎn)移膜面與冰凍組織塊(-25~-30°C)吻合相貼，然后再將冰凍組織切片取下；
f. 用切割刀沿冰凍組織(-30 -50°C)上的目的區(qū)域標志的外緣做寬度小于0.2mm，深度為0.2 0.3mm的切割，約5ym的連續(xù)切片，目的區(qū)域便與組織主體分離，收集目的區(qū)域?？蓪⒛康膮^(qū)域置于含樣本提取液的離心管中，用常規(guī)方法制備核酸(DNA， RNA)和蛋白樣本。
實施例2:
本發(fā)明實施例2所用標定筆如圖1所示有筆芯1，筆芯1的上端設(shè)有顯微鏡標準接口2，中部設(shè)有彈性染料瓶3，下端是與彈性染料瓶3相接的標定頭4，與筆芯1外接有筆套5。彈性染料瓶3可以用彈性材料制成，也可以將中部加工成螺紋狀彈性收縮體，標注頭4為設(shè)有金屬芯，金屬芯外套有直徑為0.5mm、長度比金屬芯略長的彈性減壓套，如硬質(zhì)塑料套，起緩沖減壓的作用。本發(fā)明實施力所用電動切割刀如圖2所示有筆式殼體6，筆式殼體6內(nèi)前端置有電機7，電機7的輸出軸與置于筆式殼體6外的銑刀8相接，在筆式殼體6內(nèi)還設(shè)有電池9，電池9通過開關(guān)10與電機7相接?？梢允窃陔姍C7與電機9之間有彈性線圈ll，開關(guān)10設(shè)置在筆式殼體6的后端，開關(guān)10與電池9之間有彈性線圈12。
方法具體步驟如下
a. 制備信息轉(zhuǎn)移膜，待用。按重量比取椰子油18~22、蓖麻油5~9、牛脂11 15、糖12 14、氫氧化鈉20-24、酒精8 12、蘇打0.3-0.7、水28 30;將椰子油、蓖麻油、牛脂投入容器中加熱至75~85°C，再將氫氧化鈉、蘇打溶于水后徐徐加入所加熱的油料中，攪拌使之皂化，待皂液透明，加入糖和酒精，攪拌均勻，置入軟質(zhì)的擠壓容器中待用；
b. 從液氮中取出冰凍組織制成切片，組織形態(tài)學(xué)染色，切片的大小以適合臺式顯微鏡觀察為宜。冰凍組織可以是新鮮的冰凍組織，也可以是石蠟包埋組織標本或者多聚甲醛固定的標本；
c. 將切片置于顯微鏡下觀察，選定目的點(spot)或目的區(qū)域(r叫ion);
d. 在冰凍組織切片的正面，用安裝在顯微鏡上的標定筆對準目的點(spot)或目的區(qū)域(r叫ion)處，使標定筆的標定頭4與目的點或目的區(qū)域相接觸，壓迫彈性染料瓶3，彈性染料瓶3中的染料便在目的點或目的區(qū)域著色，即標定目的區(qū)域；
e. 在冰凍組織切片的背面涂信息轉(zhuǎn)移膜液體并用刮刀刮平，待信息轉(zhuǎn)移膜液體風(fēng)干(20秒左右)后，用水性筆在信息轉(zhuǎn)移膜上鏡像標出目的點或目的區(qū)域；
f. 將冰凍組織切片的信息轉(zhuǎn)移膜面與冰凍組織塊(-25~-30°C)吻合相貼，然后再將冰凍組織切片取下，此時，信息轉(zhuǎn)移膜貼在冰凍組織塊上，明顯地顯示出目的點或目的區(qū)域；
g. 按動電動切割刀開關(guān)，電機與電源相接，銑刀轉(zhuǎn)動，用電動切割刀沿冰凍組織上的目的區(qū)域標志進行切割，切割深度可以通過調(diào)節(jié)銑刀的長度來控制。目的區(qū)域組織在連續(xù)切片時便與組織主體自動分離，收集目的區(qū)域?？蓪⒛康膮^(qū)域置于含樣本提取液的離心管仲，用常規(guī)方法制備核酸((DNA， RNA)和蛋白樣本。
權(quán)利要求
1.一種組織特定區(qū)域的捕獲方法用電動切割刀，其特征在于有筆式殼體(6)，筆式殼體(6)內(nèi)前端置有電機(7)，電機(7)的輸出軸與置于筆式殼體(6)外的銑刀(8)相接，在筆式殼體(6)內(nèi)還設(shè)有電池(9)，電池(9)通過開關(guān)(10)與電機(7)相接。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述組織特定區(qū)域的捕獲方法用電動切割刀，其特征在于所述電機(7)與電機(9)之間有彈性線圈(11)，開關(guān)(10)設(shè)置在筆式殼體(6)的后端，開關(guān)(10)與電池(9)之間有彈性線圈(12)。
全文摘要
本發(fā)明公開一種組織特定區(qū)域的捕獲方法，有如下步驟從冰凍組織塊上取切片置于顯微鏡下選定目的區(qū)域；用標定筆在冰凍組織切片的正面標定目的區(qū)域；在冰凍組織切片的背面涂信息轉(zhuǎn)移膜液體并用水性筆在信息轉(zhuǎn)移膜上鏡像標出目的區(qū)域；將冰凍組織切片的信息轉(zhuǎn)移膜面與冰凍組織塊吻合相貼，然后再將冰凍組織切片取下；用切割刀沿冰凍組織上的目的區(qū)域標志進行切割，在冰凍條件下切片分離后收集目的區(qū)域。所用的專用設(shè)備是標定筆、電動切割刀，標定筆有筆芯(1)，筆芯(1)的上端設(shè)有顯微鏡標準接口(2)，中部設(shè)有彈性染料瓶(3)，下端是與彈性染料瓶(3)相接的標定頭(4)，與筆芯(1)外接有筆套(5)?？杀苊馄渌鼘嶒灧椒ǔ霈F(xiàn)的組織塊在常溫下長時間操作使標本溶化導(dǎo)致樣本變質(zhì)或降解的現(xiàn)象發(fā)生，剩余組織還可以用于其他研究目的。
文檔編號G01N1/04GK101672730SQ200910179398
公開日2010年3月17日 申請日期2006年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月14日
發(fā)明者佳 劉, 孔慶友, 媛 孫, 殊 文, 宏 李 申請人:大連醫(yī)科大學(xué)