專利名稱：采用反遷移高親和性嵌入染料通過電泳分離和檢測核酸的制作方法
技術領域：
本發(fā)明總體上涉及通過電泳分離和檢測核酸。具體而言，本發(fā)明涉及采用反遷移嵌入染料進行的電泳。
背景技術：
從液體生物樣品中分離和檢測脫氧核糖核酸(DNA)的各種各樣的方法在本領域是公知的。其中一種技術為電泳，包括當帶電物質溶解或懸浮于有電流通過的電解液中時，其發(fā)生遷移。已知電泳的各種常規(guī)形式，包括自由區(qū)帶電泳，凝膠電泳，等電聚焦，等速電泳，和毛細管電泳。
按照慣例，核酸的分離和識別已通過凝膠電泳在諸如瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠的聚合物凝膠上完成。聚合物凝膠的制備類型和大小多種多樣，而且孔隙度也是千變萬化，因此聚合物凝膠具有廣泛用途。然而，由于時間上缺乏穩(wěn)定性，聚合方法的難再現(xiàn)性，介質的易碎性以及分離后的檢測等缺陷，凝膠電泳通常不適于大規(guī)模和高速應用方面(H,T. Chang禾口 E.S. Yeung, J. Chromatogr. B (1995) 669, 113)。
毛細管電泳(CE)在電泳分析核酸中代表了重要改進。例如，因為CE是在直徑非常小的管(通常50-100 um)中進行的，導致局部焦耳熱減少，因此可以施加比常規(guī)電泳系統(tǒng)大10-100倍的電場。這使電泳速度，分辨率和再現(xiàn)性都得以提高。此外，CE還提供了在柱檢測途徑，包括紫外(UV)分光光度計，電流測定，電導測定，激光誘導熒光檢測(LIF)或熱光學檢測。進一步，由于CE提供了方便的在線注射，檢測和實時數(shù)據(jù)分析，其還特別適用于自動化。
由于注射到典型CE分析中的樣品量較小，因此CE的實際應用高度依賴于靈敏的檢測系統(tǒng)(J. Skeidsvoll和P.M. Ueland, AnalyticalBiochemistry, (1995) 231, 359-365)。已有若干報道，當采用熒光嵌入染料或嵌入劑時，通過CE-LIF對DNA分析可獲得高的靈敏度。嵌入劑是平面型分子，其置于核酸堿基對或類似結構之間。嵌入劑與DNA或RNA結合后，其熒光增加了數(shù)倍，從而可檢測少量核酸(U.S.專利5，734，058)。
溴化乙錠(EB)是在凝膠電泳和毛細管電泳中最常用的DNA嵌入劑。據(jù)報道，除了熒光特性外，EB還對雙鏈DNA (dsDNA)提供高的CE分辨率(Id.; H.-T. Chang和E.S. Yeung,同上)。通過EB獲得的高分辨率CE分離已歸結于當形成EB-DNA復合物時DNA電泳遷移率的降低。這種遷移率的降低隨著DNA分子量的增加而增加(A.Guttman和N. Cooke, Anal. Chem. (1991) 63, 2038-2042)。然而，由于EB與DNA的結合相對較弱(Kdiss=l(T6M"),因此用EB檢測DNA的靈敏度是低的。 一般而言，檢測極限在凝膠lmmX5mm的條帶上為約1 ng的雙鏈DNA (dsDNA) (U.S.專利5,312,921)。
近來，非對稱花菁染料噻唑橙(TO; 4-[3-甲基-2，3-二氫-(苯并-1，3-噻唑)-2-亞乙基]-喹啉錠碘化物)己經提示作為EB的替代物(U.S.專利5,312,921)。盡管該染料對DNA具有較高的親和性，并且比EB靈敏度高10倍(Skeidsvoll & Ueland，同上)，但它卻不能提供與EB—樣的DNA分離性能。例如，盡管EB濃度不影響DNA分離，但當采用TO日寸，DNA分離的質量對DNA和染料的比率非常敏感。有報道，當DNA和染料的比率超出9:1時，DNA峰形大大變糟。結果，但采用TO時，觀察到峰形變寬，以及峰高相對較低。對峰寬一種可能的解釋是
TO不僅嵌入而且結合到分離的DNA鏈上。此外，過量的TO有可能使DNA雙螺旋結構去穩(wěn)定，從而導致峰形變寬(H.E. Schwartz和K丄Ulfelder, Anal. Chem. 1992, 64, 1737-1740)。
自從發(fā)現(xiàn)TO用作核酸染料以來，已經對TO及其trimethine同系物進行了若干改進，以提供與DNA結合更緊及水溶性更高的染料(U.S.專利5,321,130和U.S.專利5，312，921)。這些染料通常包括對染料的喹啉錠(quinolinium)部分加以改性，并且相當昂貴。
總而言之，一些諸如EB的常規(guī)嵌入染料提供了高的DNA分辨率，但其親和性和DNA檢測靈敏度卻較低。另一方面，其他諸如TO的常規(guī)嵌入染料提供了高的檢測靈敏度，卻不能提供理想的分辨率。因此，仍需要開發(fā)高分辨率/高靈敏度技術用于檢測樣品中的DNA，尤其是在DNA以極低濃度存在的地方。
發(fā)明概述
鑒于上述常規(guī)電泳系統(tǒng)存在的缺陷，本發(fā)明的目的是提供用于分離和檢測核酸的高分辨率/高靈敏度的電泳方法。尤其希望提供一種在毛細管電泳中可實施的方法。
通過提供一種電泳系統(tǒng)，使得其中的核酸從陰極向陽極遷移而高親和性嵌入染料以反向遷移，本發(fā)明實現(xiàn)了上述這些及其他目的。因此，本發(fā)明的一個方面涉及通過電泳分離和檢測樣品中所含的核酸的方法。所述方法包括
(a) 提供具有陽極端和陰極端的電泳系統(tǒng)；
(b) 將樣品上樣到系統(tǒng)的陰極端；
(c) 通過電極兩端施加電壓，讓核酸在高分辨率緩沖液存在下從陰
極端向陽極端遷移，從而分離樣品中所含的核酸，其中高分辨率緩沖
液的分辨率在271bp和282bp4)X174 Hae III核酸片段之間至少為2.0;(d) 將高親和性嵌入染料上樣到系統(tǒng)的陽極端，其中嵌入染料具有
正電荷，以及DNA親和常數(shù)至少為1(^M.1，以及其中嵌入染料在電極兩端施加的電壓下從陽極端向陰極端遷移，并且與分離的核酸形成復合物；以及
(e) 檢測復合物。
高親和性嵌入染料可選自噻唑橙(TO)， SYBR Green I， TO-PRO-l碘化物，TO-PRO-3碘化物，禾P TO-PRO-5碘化物(Molecular Probes;www.probes.com)。高分辨率緩沖液可包含高分辨率嵌入染料，其中高分辨率嵌入染料的分辨率在271bp和282bp 4>X174 Hae III核酸片段之間至少為2.0。在一個實施方案中，高分辨率染料選自溴化乙錠(EB)，碘化丙錠(PI)，和吖啶橙(Acidine Orange)(鹽酸鹽)。
本發(fā)明的另一方面包括通過毛細管電泳(CE)分離和檢測樣品中所含的核酸的方法。所述方法包括
(a) 提供具有陽極端和陰極端的毛細管，其中所述毛細管充滿了高分辨率緩沖液，所述緩沖液的分辨率在271bp和282bp 4X174 Hae III核酸片段之間至少為2.0;
(b) 將樣品上樣到毛細管的陰極端；
Cc)通過在兩電極之間施加電壓，讓核酸在高分辨率緩沖液存在下
從陰極端向陽極端遷移，從而分離樣品中所含的核酸；
(d) 將高親和性嵌入染料上樣到毛細管的陽極端，其中嵌入染料具
有正電荷，以及DNA親和常數(shù)至少為106M"，以及其中嵌入染料在電極兩端施加的電壓下從陽極端向陰極端遷移，并且與分離的核酸形成復合物；以及
(e) 檢測復合物。
本發(fā)明的另一方面涉及采用多嵌入染料通過CE和激光誘導熒光檢測(CE-LIF)分離和檢測樣品中所含的核酸的方法。所述方法包括(a)提供具有陽極端和陰極端的毛細管，其中 述毛細管充滿了含有高分辨率嵌入染料的凝膠緩沖液，所述嵌入染料的分辨率在271bp和282bp4)X174 Hae III核酸片段之間至少為2.0;
(b) 將樣品上樣到毛細管的陰極端；
(c) 通過在兩電極之間施加電壓，讓核酸在高分辨率緩沖液存在下從陰極端向陽極端遷移，從而分離樣品中所含的核酸；
(d) 將高親和性嵌入染料上樣到毛細管的陽極端，其中嵌入染料具有正電荷，以及DNA親和常數(shù)至少為1(^M—1，以及其中嵌入染料在電極兩端施加的電壓下從陽極端向陰極端遷移，并且與分離的核酸形成復合物；以及
(e) 檢測復合物。
在另一方面，本發(fā)明提供了通過電泳從樣品中分離和檢測核酸的試劑盒。所述試劑盒包括
含有高分辨率嵌入染料的凝膠緩沖液，所述嵌入染料的分辨率在271bp和282bp4)X174HaelII核酸片段之間至少為2.0;以及
高親和性嵌入染料，其具有正電荷以及DNA親和常數(shù)至少為
本發(fā)明比常規(guī)方法在經濟和技術上提供了許多優(yōu)勢。本發(fā)明結合了核酸分離的高分辨率以及高的檢測靈敏度和可靠性。此外，本發(fā)明的方法不需要任何新的儀器，可隨意采用現(xiàn)有的電泳系統(tǒng)。例如，本發(fā)明方法可與市售的CE系統(tǒng)相結合使用，這些CE系統(tǒng)諸如，但不限于，CEQ 2000 DNA分析系統(tǒng)，P/ACETM MDQ毛細管電泳系統(tǒng)，Paragon CZE 2000毛細管電泳系統(tǒng)(Beckman Coulter, Inc., Fullerton，CA) ， ABI的Prism 310基因分析儀，3100基因分析儀，3700 DNA分析儀(http:〃home.applied biosystems.com) ， Agilent 2100生化分析儀(www.agilent.com)。
此外，由于采用高分辨率緩沖液和高親和性染料的系統(tǒng)，可以采用大量現(xiàn)有和新開發(fā)的高親和性嵌入染料，而不管其在電泳中的分辨力。結果，該系統(tǒng)的靈敏度和分辨率可方便地用于解決各種應用中的問題。
參照下列說明書，結合附圖，本發(fā)明的上述及其它特征以及獲得這些特征的方式將變得更為清晰，并且最易被理解。這些附圖僅是本發(fā)明的典型實施方案，并不限制其范圍。
附圖描述


圖1示出了利用兩個嵌入染料，其中一個為高分辨率嵌入染料，
而另一個為高親和性嵌入染料，通過CE-LIF分離和檢測核酸。
圖2示出了利用EB和SYBR Green I嵌入染料通過CE-LIF對DNA
進行分析的圖譜(electropherogram)。
圖3示出了利用EB和TO嵌入染料通過CE-LIF對DNA進行分
析的圖譜。
發(fā)明詳述
本發(fā)明提供了新的高分辨率分離和高親和性檢測核酸的電泳方法。這些新方法是基于下列預料之外的發(fā)現(xiàn)通過采用高分辨率緩沖液和反遷移高親和性嵌入染料的系統(tǒng)，可實現(xiàn)優(yōu)良的電泳分離和檢測核酸。
因此，本發(fā)明的一方面提供了通過電泳分離和檢測樣品中所含的
核酸的方法。所述方法包括
(a) 提供具有陽極端和陰極端的電泳系統(tǒng)；
(b) 將樣品上樣到系統(tǒng)的陰極端；
(C)通過在電極兩端施加電壓，讓核酸在高分辨率緩沖液存在下從陰極端向陽極端遷移，從而分離樣品中所含的核酸，其中高分辨率緩沖液的分辨率在271bp和282bp4)X174 Hae III核酸片段之間至少為
2.0;
(d)將高親和性嵌入染料上樣到系統(tǒng)的陽極端，其中嵌入染料具有正電荷，以及DNA親和常數(shù)至少為106M"，以及其中嵌入染料在電極兩端施加的電壓下從陽極端向陰極端遷移，并且與分離的核酸形成復合物；以及
(e)檢測復合物。
本發(fā)明的電泳系統(tǒng)不局限于任何特定的類型。上述方法基本上適用于任何類型的電泳，包括但不限于，自由區(qū)帶電泳，凝膠電泳，等電聚焦，等速電泳，和CE。本發(fā)明的電泳系統(tǒng)可以是任何電泳裝置。例如，本發(fā)明方法可與市售的CE系統(tǒng)相結合使用，這些CE系統(tǒng)諸如，但不限于，CEQTM2000 DNA分析系統(tǒng)，P/ACETMMDQ毛細管電泳系統(tǒng)，Paragon CZE 2000毛細管電泳系統(tǒng)(Beckman Coulter, Inc.,Fullerton, CA) ， ABI的Prism 310基因分析儀，3100基因分析儀，3700DNA分析儀(http:〃home.applied biosvstems.com) ， Agilent 2100生化分析儀(www.agilent.com)。通常，電泳裝置中所施加的電壓梯度為100-1000 V/cm。
在本發(fā)明中，除了核酸混合物外，樣品可包括分離核酸和/或制備樣品中所用的諸如緩沖液，溶劑，限制性酶的其他成分以及其他試劑。本發(fā)明對這類附加成分的數(shù)目和種類沒有任何限制。此外，在本發(fā)明中，PCR反應產物可直接導入電泳系統(tǒng)中而無需對DNA樣品進行任何預處理。例如，乙醇沉淀，復溶于甲酰胺以及熱處理PCR反應產物以生成單鏈DNA樣品都是不必須的。
核酸可衍生自各種來源，諸如病毒，細菌和真核生物的DNA和RNA?；蛘?，核酸可以是合成的寡聚體。核酸可選自核酸片段，擴增的DNA， cDNA，單鏈DNA，雙鏈DNA，肽核酸(PNA) ， RNA和mRNA。在一個實施方案中，核酸片段的大小為10-100,000個堿基對。核酸的量一般在電泳所用的常量范圍內。
如本發(fā)明所定義，"嵌入染料"通常為平面型芳香族環(huán)形發(fā)色團分子，所述發(fā)色團分子通過插入在雙螺旋堿基對之間以可逆、非共價方式與核酸結合。本發(fā)明中優(yōu)選的嵌入染料包括熒光染料。本領域已
知眾多嵌入染料。 一些非限制性的例子包括PICO GREEN (P-7581，Molecular Probes) ， EB (E-8751, Sigma)，碘化丙錠(P-4170, Sigma)，吖啶橙(A-6014, Sigma) ， 7-氨基放線菌素D (A-1310, MolecularProbes)，花菁染料(如，TOTO, YOYO, BOBO,和POPO) ， SYTO，SYBR Green I， SYBR Green II， SYBRDX， OliGreen, CyQuant GR，SYTOX Green, SYT09， SYTOIO， SYT017， SYBR14， FUN-l， DEADRed,碘化己錠，二氫乙錠，乙錠同型二聚體，9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶，DAPI， DIPI， n引哚染料，咪唑染料，放線菌素D，羥基痗脒，以及LDS751 (U.S.專利6,210,885)。
嵌入染料的區(qū)別在于其對DNA的親和性。為本發(fā)明的目的，"高親和性嵌入染料"的DNA親和常數(shù)至少為1(^M'1。為了在電泳過程中確保本發(fā)明的高親和性嵌入染料從陽極向陰極遷移，也要求其具有正電荷。在一個實施方案中，高親和性嵌入染料選自噻唑橙(TO)， SYBRGreen I， TO-PRO-1碘化物，TO-PRO-3碘化物，和TO-PRO-5碘化物(Molecular Probes; www.probes.com)。
在核酸分離步驟(c)之前，可將高親和性嵌入染料上樣到電泳系統(tǒng)中。此外，在核酸分離步驟(c)之后，但在分離的核酸抵達檢測裝
置或在電泳裝置的陽極端退出分離介質(諸如凝膠)之前，也可將高親和性嵌入染料上樣到電泳系統(tǒng)中。
本發(fā)明的高分辨率緩沖液可以是任何溶液或凝膠，只要其能提供
所需的核酸分辨率在271bp和282bp 4>X174 Hae III核酸片段之間至少為2.0。合適的高分辨率緩沖液的例子包括但不限于Tris-硼酸-EDTA(TBE)緩沖液，Tris-乙酸-EDTA (TAE)緩沖液，和MOPS-Tris。在
一個實施方案中，高分辨率緩沖液也包括嵌入染料。高分辨率緩沖液的嵌入染料優(yōu)選為高分辨率嵌入染料。為本發(fā)明的目的，"高分辨率
10嵌入染料"提供的分辨率在271bp和282bp巾X174 Hae III核酸片段之 間至少為2.0。例如，高分辨率染料可以是EB，碘化丙錠(PI)，或吖 啶橙。
在一個實施方案中，在電泳之前，核酸用高分辨率嵌入染料染色。 染料與DNA的比率優(yōu)選為每IO個堿基對有大約2個染料分子。在另 一實施方案中，高分辨率嵌入染料包括在色譜流動相中。有利的是， 許多這樣的染料(如EB)具有很少或完全沒有內在的熒光，僅在嵌入 到多核苷酸時才真正顯示熒光。
在陰極和陽極之間施加電壓之后，核酸在向陽極遷移的同時分離 在高分辨率緩沖液中。與此同時，高親和性嵌入染料的分子由于其帶 有正電荷以反方向從陽極向陰極遷移。 一旦反遷移高親和性染料的分 子與分離的核酸相接觸，它們就與核酸形成復合物。優(yōu)選的是，DNA 電荷的絕對值大于高親和性嵌入染料，以致新復合物的總電荷為陰性， 從而復合物移向陽極。
在高分辨率緩沖液包括高分辨率嵌入染料的實施方案中，在陰極 和陽極之間施加電壓后，核酸與高分辨率嵌入染料的分子形成復合物。 這些復合物攜帶負電荷，并以從陰極向陽極的方向遷移。與此同時， 高親和性嵌入染料的分子由于其帶有正電荷以反方向從陽極向陰極遷 移。 一旦反遷移高親和性染料的分子與分離的核酸和高分辨率染料的 復合物相接觸，高親和性染料的分子就會取代高分辨率染料的分子。 為了確保這種取代生效，高親和性染料的DNA親和性應比高分辨率染 料要高。取代的結果是在核酸和高親和性染料的分子之間形成新的負 電荷復合物，并向陽極遷移。
任何常規(guī)檢測系統(tǒng)可用于檢測高親和性嵌入染料和分離的核酸的 復合物。這些檢測系統(tǒng)的例子包括但不限于激光誘導熒光(LIF)檢測 以及254nm處的UV檢測。取決于所用的特定高親和性嵌入染料，激發(fā)光將選擇在染料的主要吸收條帶內。例如，當采用TO或SYBR Green I高親和性嵌入染料時，釆用氬離子激光誘導熒光，可在520nm處檢測 熒光。
在本發(fā)明的一個實施方案中，核酸的分離和檢測通過毛細管電泳 (CE)進行。本發(fā)明中的術語"毛細管電泳"以其標準含義使用，并 表示在相對低體積系統(tǒng)中操作的電泳分離，這些系統(tǒng)諸如窄孔塑料管， 玻璃毛細管，或平行板之間的液體薄膜。
在優(yōu)選的實施方案中，采用毛細管。毛細管通常為中空管，其能 單獨保留用于電泳的水溶液。正常情況下，管徑為5-500ixm，確切極 限依賴于表面特征和溶液中存在的組分。CE毛細管的長度變化范圍較 寬，但在大多數(shù)情況下，應為5-100 cm。市售或定制的毛細管(柱) 可用于本發(fā)明中。例如，各種大小的毛細管可從Polymicro Technology (Tucson， Arizona)購買。在實施例1和2所述的一個實施方案中，由 Polymicro Technology (Tucson, Arizona)制造的毛細管具有100 U m的 內徑和27 cm的長度。
盡管許多材料可用于形成毛細管，但一般采用熔融石英毛細管。 通常，熔融石英毛細管覆蓋有外保護涂層以使其增加機械力量，這是 因為裸露熔融石英極其脆弱。去除這種涂層的一小部分以形成檢測用 窗。將該窗對準在檢測器的光學中心。將不同的物質共價結合(涂層) 到毛細管壁上，通過化學法可使毛細管的內表面改性。這些涂層可用 于各種各樣的目的，諸如減少樣品吸收，或改變毛細管壁上的離子電 荷。然而，應該理解，本發(fā)明不限于任何特定類型的毛細管。例如， 在一個實施方案中，采用了聚乙烯醇(PVA)涂層的石英毛細管。
在CE分離中，毛細管充滿緩沖液，并且各端浸沒在盛有同樣緩 沖液的小瓶中。被分析物的樣品通過電動(electrokinesis)或壓力注射 在一端，并將電場100-700 V/cm施加在毛細管的兩端。由于施加的電場，被分析物混合物遷移通過毛細管，不同的電泳遷移率驅趕各個組 分進入分離的條帶。在毛細管的另一端，各個分離的被分析物進行檢
測和定量分析。在本發(fā)明中，CE可以這種或任何其他方便的方式操作。 因此，本發(fā)明有利地使用常規(guī)CE方式，并不需要對標準CE裝置進行 任何修改。
核酸的量為電泳的常用量，范圍0.1-100 ug/ml。在一個實施方案 中，樣品釆用10 u g/ml的4X174 Hae III核酸片段(Sigma Co., St. Louis, MO)。
檢測由CE分離的核酸可通過任何已知的常規(guī)技術來實現(xiàn)，諸如 LIF和254nm處的UV檢測(靈敏度基本上降低)。在優(yōu)選的實施方 案中，雜交部分的檢測通過在柱LIF檢測技術完成。
因此，本發(fā)明的另一方面是提供通過CE分離和檢測樣品中所含 的核酸的方法，所述包括
(a) 提供具有陽極端和陰極端的毛細管，其中所述毛細管充滿了高 分辨率緩沖液，所述緩沖液的分辨率在271bp和282bp4>X174 Hae III 核酸片段之間至少為2.0;
(b) 將樣品上樣到毛細管的陰極端；
(C)通過在兩電極之間施加電壓，讓核酸在高分辨率緩沖液存在下 從陰極端向陽極端遷移，從而分離樣品中所含的核酸；
(d) 將高親和性嵌入染料上樣到毛細管的陽極端，其中嵌入染料具 有正電荷，以及DNA親和常數(shù)至少為1(^M—1，以及其中嵌入染料在電 極兩端施加的電壓下從陽極端向陰極端遷移，并且與分離的核酸形成 復合物；以及
(e) 檢測復合物。
用于CE的高分辨率緩沖液可以是任何緩沖液或凝膠，只要其能 提供所需的核酸分辨率在271bp和282bp4)X174 Hae III核酸片段之間
13至少為2.0。在優(yōu)選的實施方案中，電泳毛細管充滿高分辨率凝膠。例 如，在一個實施方案中，采用聚丙烯酰胺可替換的凝膠或固定的凝膠。 在另一實施方案中，線性聚丙烯酰胺用作高分辨率凝膠。
高分辨率緩沖液或凝膠也可包括高分辨率嵌入染料。例如，高分
辨率染料可以是EB，碘化丙錠(PI)或吖啶橙。在實施例1和2中所 述的一個實施方案中，毛細管充滿混合有EB (終濃度為30nM)的聚 環(huán)氧乙烷(PEO)凝膠。
帶有正電荷和DNA親和常數(shù)至少為106M"的高親和性嵌入染料 可用于本發(fā)明中。例如，高親和性嵌入染料可選自TO， SYBRGreenI， TO-PRO-l碘化物，T0-PR0-3碘化物，和TO-PRO-5碘化物(Molecular Probes; www.probes.com)。
在核酸分離步驟(c)之前，可將高親和性嵌入染料上樣到電泳系 統(tǒng)(毛細管)中。此外，在核酸分離步驟(c)之后，但在分離的核酸
抵達檢測裝置或在電泳裝置的陽極端退出毛細管之前，也可將高親和 性嵌入染料上樣到電泳系統(tǒng)中。
在一個實施方案中，毛細管充滿緩沖液，其一端浸沒在陰極池中， 而另一端浸沒在陽極池中。兩個池都充滿同樣的緩沖液。然后，上樣 步驟(d)可包括將高親和性嵌入染料加入到充滿陽極緩沖液的陽極池 中，或在用陽極緩沖液填充陽極池之前預先將高親和性嵌入染料與陽 極緩沖液混合。 一旦在陰極和陽極之間施加了電壓，帶正電荷的高親 和性染料將進入毛細管，并且向陰極遷移。此外，高親和性嵌入染料 也可直接注射到毛細管的陽極端。
根據(jù)本發(fā)明的教導，雖然可采用高分辨率緩沖液，但在一個實施 方案中，高親和性緩沖液包括高親和性嵌入染料。因此，本發(fā)明提供
了采用多嵌入染料通過CE-LIF分離和檢測樣品中所含的核酸的方法。所述方法包括
(a) 提供具有陽極端和陰極端的毛細管，其中所述毛細管充滿了含 有高分辨率嵌入染料的凝膠緩沖液，所述嵌入染料的分辨率在271bp 和282bp4>X174 Hae III核酸片段之間至少為2.0;
(b) 將樣品上樣到毛細管的陰極端；
(c) 通過在兩電極之間施加電壓，讓核酸在高分辨率緩沖液存在下 從陰極向陽極遷移，從而分離樣品中所含的核酸；
(d) 將高親和性嵌入染料上樣到毛細管的陽極端，其中嵌入染料具 有正電荷，以及DNA親和常數(shù)至少為106M—、以及其中嵌入染料在電 極兩端施加的電壓下從陽極端向陰極端遷移，并且與分離的核酸形成 復合物；以及
(e) 檢測復合物。
圖l示出了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的方法。如圖la所示，毛 細管1，進口 (陰極端)2以及出口 (陽極端)3充滿含有低親和性、 高分辨率嵌入染料(HRID)的緩沖液。毛細管的出口與出口 (陽極) 池4流體連通。毛細管的進口與進口 (陰極)池5流體連通。陽極池 充滿含有高親和性嵌入染料(HAID)的出口緩沖液。核酸樣品通過進 口 2注射到毛細管中。
在電壓施加在陰極和陽極之間后，形成DNA-HRID復合物并且移 向陽極。與此同時，HAID分子由于其帶有正電荷以反方向從陽極向陰 極遷移(圖lb)。
一旦反遷移HAID分子與分離的DNA-HRID復合物發(fā)生接觸，與 HRID比較，由于反遷移HAID分子的DNA親和性較高，它們就會取 代DNA復合物中的HRID。其結果是形成新的DNA-HAID復合物(圖 lc)。
由于DNA電荷的絕對值大于HAID，因此新復合物的總電荷是負的，并且復合物移向陽極。 一旦這些新形成的復合物抵達檢測窗，它 們就可通過常規(guī)檢測方法之一加以檢測(圖ld)。
如果應用需要，檢測的核酸條帶可從嵌入的熒光染料中抽提和分 離出來。任何標準方法可用于這種抽提。這種方法對本領域專業(yè)技術 人員來說是公知的，在此不再贅述。
在另一方面，本發(fā)明提供了通過電泳從樣品中分離和檢測核酸的
試劑盒。所述試劑盒包括
含高分辨率嵌入染料的凝膠緩沖液，所述嵌入染料的分辨率在
271bp和282bp4)X174HaelII核酸片段之間至少為2.0;以及
高親和性嵌入染料，其具有正電荷以及DNA親和常數(shù)至少為 106M-1。
下列實施例旨在闡述而非限制本發(fā)明的范圍。盡管這些實施例是 典型的可用的實施方案，但也可由本領域技術人員所公知的其他方法 替代。實際上，本領域技術人員基于本發(fā)明的教導，無需太多的試驗， 就可很容易地想象和得出進一步的實施方案。
實施例 實施例1
CE設置
內徑為100 u m、長度為27 cm的毛細管(Polymicro Technology, Tucson, Arizona)用于下列研究中。毛細管用前涂有聚乙烯醇(PVA)。 EB， SYBR Green I禾口 TO購自Molecular Probes (Eugene, Oregon)。
凝膠基質用購自AldrichCo. (Milwaukee, Wisconsin)的聚環(huán)氧乙 烷(PEO)制備。簡而言之，PEO凝膠的制備如下。室溫下將2.5gPEO (平均分子量4,000,000)和2g PEO (平均分子量900,000)攪拌下緩 慢(過夜)加入到445 ml的水中。然后，向上述溶液中加入50 ml的
16250 mM MOPS-Tris pH 7.55和325 u 1的10% NaN3。所得凝膠室溫下 儲存。
將PEO凝膠與EB (終濃度為30uM)混合制備沖洗緩沖液。將 PEO凝膠與SYBR Green I (1:500稀釋)混合制備出口緩沖液。在另一 試驗中，將PEO凝膠與TO (終濃度為3 n g/ml)混合制備出口緩沖液。
DNA樣品為小X174/Hae III核酸片段(Sigma Co., St. Louis, MO)。
DNA的注射濃度為10ug/ml。在5.4kV下注射10秒。將PEO凝 膠與EB(終濃度為30 y M)混合制備沖洗緩沖液。將PEO凝膠與SYBR Green I (1:500稀釋)混合制備出口緩沖液。在另一試驗中，將PEO 凝膠與TO (終濃度為3wg/ml)混合制備出口緩沖液。施加的電壓梯 度為100-400 V/cm。
實施例2
采用兩種嵌入染料通過CE-LIF進行DNA分析
毛細管充滿含有PEO凝膠和EB的凝膠緩沖液。出口電極小瓶(陽 極)充滿含有PEO凝膠和SYBR Green I或TO的出口緩沖液。DNA 樣品從陰極注射到毛細管中。在電壓施加在陰極和陽極之間后，形成 DNA-EB復合物，并且移向陽極。與之同時，SYBR Green I或TO分 子由于其帶有正電荷以反方向從陽極向陰極遷移。
一旦反遷移SYBR Green I或TO分子與分離的DNA-EB復合物發(fā) 生接觸，與EB比較，由于反遷移分子的DNA親和性較高，它們就取 代DNA復合物中的EB。其結果是形成新的DNA-SYBR Green I或 DNA-TO復合物。由于DNA電荷的絕對值大于SYBR Green I和TO，
因此新復合物的總電荷是負的，并且復合物移向陽極。 一旦這些新形 成的復合物抵達檢測窗，染料就被氬離子激光激發(fā)，并且在波長520 nm 處檢測。CE-LIF與EB和SYBR Green I的結果示于圖2。 CE-LIF與EB和TO組合的結果示于圖3中。
圖2和3中的結果表明，通過采用高分辨率嵌入染料(如EB)分 離核酸和采用高親和性嵌入染料(如SYBR Green I或TO)檢測分離 的核酸，本發(fā)明實現(xiàn)了核酸的快速、高分辨率/高靈敏度分析。
權利要求
1.一種通過電泳分離和檢測樣品中核酸的試劑盒，所述試劑盒包括含高分辨率嵌入染料的凝膠緩沖液，所述嵌入染料的分辨率在271bp和282bp φX174Hae III核酸片段之間至少為2.0；以及高親和性嵌入染料，其具有正電荷以及DNA親和常數(shù)至少為106M-1。
2. 權利要求1的試劑盒，其中高親和性嵌入染料選自噻唑橙(TO) ， SYBR Green I， TO-PRO-1碘化物，TO-PRO-3碘化物，和TO-PRO-5碘化物。
3. 權利要求1的試劑盒，其中高分辨率染料選自溴化乙錠(EB)，碘化丙錠(PI)，和吖啶橙(鹽酸鹽)。
全文摘要
本發(fā)明提供了新的高分辨率分離和高靈敏度檢測核酸的電泳方法。所述方法包括在電泳系統(tǒng)中采用高分辨率緩沖液和反遷移高親和性嵌入染料以實現(xiàn)優(yōu)良的分離和檢測核酸。本發(fā)明還提供了通過電泳從樣品中分離和檢測核酸的試劑盒。所述試劑盒包括含高分辨率嵌入染料的凝膠緩沖液，所述嵌入染料的分辨率在271bp和282bpφX174 Hae III核酸片段之間至少為2.0，并且包括高親和性嵌入染料，其具有正電荷以及DNA親和常數(shù)至少為10⁶M^-1。
文檔編號G01N33/50GK101560567SQ20091012695
公開日2009年10月21日 申請日期2003年4月16日 優(yōu)先權日2002年4月19日
發(fā)明者劉明孫, 陳夫泰 申請人:貝克曼考爾特公司