專利名稱：：堆肥中生物酶基因多樣性的分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種基因多樣性的方法，尤其涉及一種堆肥微生物總DNA中基因多樣性的分析方法。
背景技術(shù)：
：堆肥是利用微生物對(duì)可生物降解固體廢物進(jìn)行分解，從而對(duì)其實(shí)現(xiàn)最終處理的一種系統(tǒng)，因此，充分認(rèn)識(shí)其中的微生物學(xué)原理能為改進(jìn)處理工藝、提高處理效率提供依據(jù)。對(duì)堆肥進(jìn)行微生物群落研究的傳統(tǒng)方法主要是微生物培養(yǎng)和純種分離技術(shù)。因?yàn)榄h(huán)境中的絕大多數(shù)微生物無法通過培養(yǎng)方法進(jìn)行研究，而且堆肥中微生物種類繁多，常處于動(dòng)態(tài)變化狀態(tài)，培養(yǎng)研究無法反映系統(tǒng)中微生物種群的動(dòng)態(tài)變化，因此，這樣的研究方法無法滿足堆肥微生物學(xué)研究的要求。分子生態(tài)學(xué)技術(shù)正是一種能不依賴于微生物分離培養(yǎng)而對(duì)其進(jìn)行研究的新技術(shù)。目前，分子生態(tài)學(xué)研究已經(jīng)涉及至U環(huán)境科學(xué)研究的眾多領(lǐng)域，包括在堆肥微生物分子生態(tài)學(xué)方面的研究。變性梯度凝膠電泳(denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)正是其中應(yīng)用最為廣泛的一項(xiàng)技術(shù)，其原理是DNA進(jìn)行電泳時(shí)使用具有化學(xué)變性劑梯度的聚丙烯酰胺凝膠，該凝膠能夠有區(qū)別地解鏈PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。長度相同而在堿基序列上存在差異的不同DNA在進(jìn)行變性梯度凝膠電泳時(shí)，會(huì)在各自相應(yīng)的變性劑濃度下變性，發(fā)生空間構(gòu)型的變化。DNA雙鏈一旦解鏈，DNA分子形成端部的叉狀或中間的環(huán)形，其在聚丙烯酰胺凝膠中的電泳速度將會(huì)急劇下降；以至停留在其相應(yīng)的不同變性劑梯度位置，染色后可以在凝膠上呈現(xiàn)為分開的條帶，這樣便能將具有相同長度而序列有差異的DNA分子分離開。該技術(shù)可以分辨具有相同或相近分子量的目的片段序列差異，可以用于檢測(cè)單一堿基的變化和遺傳多樣性以及PCR擴(kuò)增DNA片段的多態(tài)性。目前，對(duì)環(huán)境中功能基因的分離和多樣性的研究還要結(jié)合構(gòu)建克隆文庫的方法，但是該方法卻不適合對(duì)堆肥過程中多種功能基因的分離和多樣性的研究，其原因在于構(gòu)建一個(gè)克隆文庫必須一次性挑取幾十甚至上百個(gè)克隆子，而堆肥又是一個(gè)不斷變化的動(dòng)態(tài)過程，因此，如果要對(duì)堆肥過程中的多個(gè)功能基因進(jìn)行分離以及進(jìn)行后續(xù)的多樣性研究就必須構(gòu)建多個(gè)克隆文庫，這不僅大大增加了工作量，一定程度上還會(huì)增加實(shí)驗(yàn)成本。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種高通量、低成本、簡便直觀的堆肥中生物酶基因多樣性的分析方法，以便于更好地表征堆肥中具有降解功能(例如木質(zhì)素的降解等)的微生物種群。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案為一種堆肥中生物酶基因多樣性的分析方法，包括以下步驟首先提取堆肥中的微生物總DNA,該微生物總DNA的提取過程又包括樣品的脫腐、DNA的粗提和DNA的純化三個(gè)步驟；然后利用PCR擴(kuò)增程序?qū)μ囟ㄉ锩富蜻M(jìn)行擴(kuò)增；再在lxTAE緩沖液中，6(TC恒溫、100V恒壓條件下運(yùn)行變性梯度凝膠電泳12~14h;最后對(duì)變性梯度凝膠電泳圖譜進(jìn)行分析，確定所述堆肥中特定生物酶基因的多樣性。上述的堆肥中生物酶基因多樣性的分析方法，具體包括以下步驟-(1)提取堆肥中的微生物總DNA樣品的脫腐向待提取DNA的堆肥樣品中以815ml/g堆肥的用量加入去腐緩沖液，然后置于60~65'C的水浴中保溫38min，保溫期間可將樣品與去腐緩沖液輕輕攪勻，再以30005000xg離心57min，去上清；重復(fù)本步驟直至離心后的上清顏色與所述去腐緩沖液的顏色無明顯差異(一般重復(fù)12次即可滿足要求)；DNA的粗提將上述脫腐后的樣品置于液氮中保持35min，然后以60~65'C的溫度解凍15-20min;以1.0~1.5ml/g堆肥的用量加入DNA提取緩沖液，并在37'C溫度下以20(K250rpm振蕩4560min;然后以100~150td/g堆肥的用量加入十二烷基硫酸鈉溶液(簡稱SDS，其W/V濃度優(yōu)選為10%)得混合液，65'C水浴1.01.5h，水浴時(shí)可每隔1015min上下輕輕顛倒一次；再加入與所述混合液等體積的氯仿-異戊醇試劑(氯仿與異戊醇的V/V為24:1)，搖勻后(至乳狀)以8000~12000xg離心至沉淀完全，回收水相；往回收的水相中加入0.6倍水相體積的異丙醇并沉淀l2h，以10000~13000xg速度離心815min;離心后的沉淀以0.8~1.5ml/g堆肥的用量加入預(yù)冰冷的乙醇溶液(V/V為70。/。)進(jìn)行洗滌，以1000013000xg速度離心35min,然后以500~1000pl/g堆肥的用量將洗滌后的堆肥樣品溶于TE緩沖液中，得到粗提的DNA溶液；DNA的純化用試劑盒對(duì)上述粗提的DNA溶液進(jìn)行純化，在純化產(chǎn)物中加入終濃度為0.25~0.5pg/ml的核糖核酸酶A(RnaseA)，37'C水浴中消化30^40min以除去RNA,得到純化后的堆肥微生物總DNA;(2)PCR擴(kuò)增生物酶基因選用一對(duì)用于特定生物酶基因PCR擴(kuò)增的簡并引物，并在其上游引物的5'端加上GC發(fā)卡結(jié)構(gòu)(GC發(fā)卡結(jié)構(gòu)主要作用是使PCR產(chǎn)物的一側(cè)產(chǎn)生一個(gè)高熔點(diǎn)區(qū)，使相應(yīng)的感興趣的序列處于低熔點(diǎn)區(qū)，從而有利于DGGE對(duì)擴(kuò)增出來的基因序列進(jìn)行分離)；再利用PCR擴(kuò)增程序?qū)υ撎囟ㄉ锩富蜻M(jìn)行擴(kuò)增；由于擬分析的特定生物酶基因的不同，在PCR引物的設(shè)計(jì)和選用上會(huì)存在差異，對(duì)于研究較多的生物酶基因的引物可直接通過查閱文獻(xiàn)獲得；而對(duì)于研究較少的生物酶基因的引物可自行通過專業(yè)軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)；(3)變性梯度凝膠電泳電泳在通用突變檢測(cè)系統(tǒng)中進(jìn)行，所用膠濃度為10%(質(zhì)量濃度)的聚丙烯酰胺(配制膠的溶液含有丙烯酰胺、N，N'-甲叉雙丙烯酰胺和50xTAE，最后加滅菌雙蒸水補(bǔ)足至所需的濃度)，變性梯度為30%~60%;電泳運(yùn)行后的凝膠用SYBRGreenI染色2030min，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)拍照得到DNA指紋圖譜；(4)變性梯度凝膠電泳圖譜分析將變性梯度凝膠電泳條帶切下，用無菌水清洗，并用TE緩沖液(一般為20~30pL)將所述條帶浸泡過夜；以浸泡出的DNA溶液為模板，以步驟(2)中的簡并引物(不帶GC發(fā)夾結(jié)構(gòu))作為擴(kuò)增用引物，利用PCR擴(kuò)增程序擴(kuò)增條帶中所述特定生物酶基因片段；用試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物，然后將該產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序和Blast比對(duì)，確定所述堆肥中特定生物酶基因的多樣性。上述技術(shù)方案中，所述的特定生物酶基因優(yōu)選為漆酶(丄wca^)基因，其對(duì)應(yīng)的所述簡并引物和GC發(fā)卡結(jié)構(gòu)如下上游引物5'-CAYTGGCAYGGNTTYTTYCA-3'下游引物5'-GRCTGTGGTACCAGAANGTNCC-3'GC發(fā)卡結(jié)構(gòu)5，國CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGG-3'。上述技術(shù)方案中，所述PCR擴(kuò)增程序?yàn)槠鹗?5t:預(yù)變性5min;94'C變性lmin，50°C引物復(fù)性lmin，72。C引物延伸lmin，35個(gè)循環(huán)；72。C延伸5min。上述技術(shù)方案中，所述去腐緩沖液是由作為溶質(zhì)的三羥甲基氨基甲烷鹽酸(Tris-HCl)、焦磷酸鈉(Na4P207)、乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、氯化鈉(NaCl)、曲拉通X-100(TritonX-100)與溶劑水配制而成，各溶質(zhì)組分在去腐緩沖液中的濃度分別為三羥甲基氨基甲烷鹽酸50~100mM焦磷酸鈉100~150mM乙二胺四乙酸二鈉50-100mM聚乙烯吡咯垸酮0.5~1.0%W/V氯化鈉100~200mM6曲拉通X-1000.02~0.06%V/V。以上配制得到的去腐緩沖液的pH值一般保持在10.0左右。上述技術(shù)方案中，所述DNA提取緩沖液是由作為溶質(zhì)的Tris緩沖液、乙二胺四乙酸(EDTA)、磷酸鈉(Na3P04)、氯化鈉(NaCl)、十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)、蛋白酶K與溶劑水配制而成，各溶質(zhì)組分在DNA提取緩沖液中的濃度分別為Tris緩沖液0.1-0.15M乙二胺四乙酸0.1-0.15M磷酸鈉0.1~0.12M氯化鈉l-1.5M十六垸基三甲基溴化胺1~2%W/V蛋白酶K0.1~0.2mg/ml。以上配制得到的DNA提取緩沖液的pH值一般保持在8.0左右。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明應(yīng)用的DGGE技術(shù)是一種可以不依賴于挑取克隆且操作簡單的分子生態(tài)學(xué)技術(shù)，該技術(shù)用于本發(fā)明的分析環(huán)境樣品功能基因多態(tài)性具有以下優(yōu)勢(shì)1)高通量，低成本可一次性分析多個(gè)樣品，無需構(gòu)建多個(gè)克隆，省去了挑取克隆的繁瑣步驟，可以最大程度地提高研究者的工作效率，節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本；2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果直觀通過DGGE指紋圖譜，研究者可以直觀地看到編碼某種特定生物酶的所有功能基因多樣性分布、變化規(guī)律及各基因的相對(duì)豐度。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，本發(fā)明的方法首先對(duì)堆肥樣品中的腐殖酸和其它雜質(zhì)進(jìn)行洗脫，這樣既減少了腐殖酸類物質(zhì)的污染，又避免了這些物質(zhì)對(duì)后續(xù)DNA提取過程的干擾；據(jù)此，本發(fā)明專門配制了一種新的去腐緩沖液，該去腐緩沖液中含有的Na4P207、Na2EDTA、PVP等均具有較好的脫腐功能，并優(yōu)化了各組分的濃度配比，使本發(fā)明的去腐緩沖液能夠達(dá)到理想的脫腐效果，為后續(xù)DNA的提取和純化步驟提供了保證和支持。在本發(fā)明的DNA提取步驟中，本發(fā)明還配制了一種能有效提取微生物總DNA的DNA提取緩沖液；為了盡可能避免DNA在提取中的機(jī)械損傷，提取過程僅采用液氮與6(K65'C之間凍融的方法以提高微生物細(xì)胞的裂解效率，從而保持了DNA較好的完整性；為了使蛋白酶K的作用更好地發(fā)揮，本發(fā)明還將DNA提取緩沖液與堆肥樣品在37'C下振蕩溫浴4560min，這樣既保證了其處于酶催化的最適溫度，又可以與樣品充分接觸；在DNA提取步驟中加入的氯仿-異戊醇試劑能夠抽提掉大部分細(xì)胞裂解產(chǎn)生的蛋白質(zhì)和糖類物質(zhì)；可見由于綜合采用了生物、化學(xué)、物理相結(jié)合的方法，使堆肥中的微生物細(xì)胞在蛋白酶K、SDS和CTAB等物質(zhì)作用下盡可能地裂解，充分釋放其中的核酸物質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)了DNA產(chǎn)量的最大，獲得了片段長度比較單一的DNA;經(jīng)過純化后，堆肥中提取的DNA產(chǎn)量相比于現(xiàn)有技術(shù)，提高了40%以上；同時(shí)，腐殖質(zhì)類物質(zhì)的產(chǎn)量大大減少，幾乎去除了堆肥中所有的腐殖酸類物質(zhì)。正是因?yàn)楸景l(fā)明的上述改進(jìn)，使得從堆肥中提取和純化的DNA具有產(chǎn)量大、純度高、質(zhì)量好等明顯優(yōu)勢(shì)，這為本發(fā)明結(jié)合應(yīng)用DGGE技術(shù)以全面、快速地分析堆肥中微生物的多樣性及功能基因提供了更好的條件和基礎(chǔ)。圖1為本發(fā)明實(shí)施例中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖片；其中M為DNA分子量標(biāo)記DNAMarderV(從Tiangen生物公司購買的)，1、2、3分別代表三個(gè)平行堆肥樣品，數(shù)字表示DNA的大小，單位是bp。圖2為本發(fā)明實(shí)施例中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物漆酶基因的DGGE圖譜及l(fā)號(hào)泳道中a、b、c所指的三個(gè)條帶測(cè)序結(jié)果；圖左側(cè)為漆酶基因的DGGE圖譜，1、2、3分別代表三個(gè)平行的堆肥樣品。具體實(shí)施例方式實(shí)施例-本實(shí)施例的分析方法擬分析的堆肥樣品取自一個(gè)20L的實(shí)驗(yàn)規(guī)模的堆肥裝置，堆肥材料主要包括稻草1.074kg、菜葉0.9kg、樹葉0.216kg、麩皮0.24kg和土壤0.721kg,采樣點(diǎn)為堆肥表面以下3cm，一共取三個(gè)樣品(分別編號(hào)為l、2、3)，每個(gè)樣品lg，取樣時(shí)間是在堆肥處理12d(為堆肥腐熟期樣品)，溫度為38。C，pH值為8.32，含水率為58%，有機(jī)質(zhì)含量為20.3%。其中，pH值用玻璃電極法測(cè)定，含水率在105'C下重復(fù)烘烤至恒重測(cè)定，有機(jī)質(zhì)含量根據(jù)重鉻酸鉀法測(cè)定。采用本發(fā)明的分析方法對(duì)上述堆肥樣品進(jìn)行堆肥中漆酶基因多樣性的分析，具體包括以下步驟1、提取堆肥中的微生物總DNA(1)樣品的脫腐向每個(gè)堆肥樣品(lg)中分別加入10ml的去腐緩沖液，然后置于60'C的水浴中保溫5min，保溫期間用玻璃棒將堆肥樣品與去腐緩沖液輕輕攪勻，再以5000xg離心5min，去上清；重復(fù)兩次本步驟的洗滌與離心過程，至離心后的上清顏色與去腐緩沖液的顏色無明顯差異；本步驟中用到的去腐緩沖液是由作為溶質(zhì)的Tris-HCl、Na4P207、Na2EDTA、PVP、NaCl、TritonX-lOO與溶劑水配制而成，各溶質(zhì)組分在去腐緩沖液中的濃度分別為Tris-HCl100mMNa4P207100mMNa2EDTA100mMPVP1.0%W/VNaCl120mMTritonX-1000.06%V/V。(2)DNA的粗提將上述洗滌脫腐后的樣品置入液氮中保持5min,然后以60~65'C的溫度解凍20min;加入lmlDNA提取緩沖液，并在37'C恒溫條件下以200rpm振蕩45min;然后加入100pl的十二垸基硫酸鈉溶液(W/V為10。/。)得混合液，65'C水浴1.5h，水浴時(shí)每隔15min上下輕輕顛倒一次；水浴結(jié)束后再加入與所得混合液等體積的氯仿-異戊醇試劑(氯仿與異戊醇的V/V為24:1),搖勻至乳狀后以9000xg離心至沉淀完全，回收水相；往回收的水相中加入0.6倍水相體積的異丙醇并沉淀1.5h，以13000xg速度離心iomin;離心后的沉淀用lml預(yù)冰冷的乙醇溶液(V/V為70。/Q)進(jìn)行洗滌，以10000xg速度離心3min，然后溶于500pL的TE緩沖液中，得到粗提的DNA溶液；本步驟中用到的DNA提取緩沖液是由作為溶質(zhì)的Tris緩沖液、EDTA、Na3P04、NaCl、CTAB、蛋白酶K與溶劑水配制而成，各溶質(zhì)組分在DNA提取緩沖液中的濃度分別為；Tris緩沖液0.1MEDTA0.1MNa3P040.1MNaCl1.5MCTAB1%W/V蛋白酶K0.2mg/ml。(3)DNA的純化用Universal通用型DNA純化回收試劑盒(Tiangen，北京)對(duì)上述粗提的DNA溶液進(jìn)行純化，在純化產(chǎn)物中加入終濃度為0.5pg/ml的核糖核酸酶A,37'C水浴中消化30min以除去RNA,得到純化后的堆肥微生物總DNA。2、PCR擴(kuò)增生物酶基因(1)PCR擴(kuò)增引物的選用通過査閱文獻(xiàn)選擇適合堆肥中漆酶基因PCR擴(kuò)增的簡并引物，并在上游引物的5'端加上GC發(fā)卡結(jié)構(gòu)，如下所示上游弓I物5'-CAYTGGCAYGGNTTYTTYCA-3'下游引物5'-GRCTGTGGTACCAGAANGTNCC-3'GC發(fā)卡結(jié)構(gòu)5'隱CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGG-3，擴(kuò)增片段約為200bp;(2)PCR擴(kuò)增體系PCR反應(yīng)體系(50nL)包括純化后的堆肥微生物總DNA2nL、dNTP0.2mMeach、上下游引物各0.8pM、10xBuffer(withMgCl2)5pL、ra《DNA聚合酶(Tiangen,北京)2.5U，然后加去離子水補(bǔ)足至50nL;(3)PCR擴(kuò)增條件如下預(yù)變性95'C5min變性94°Clmin，退火50°Clmin「35個(gè)循環(huán)延伸72°Clmin」后延伸72°C5min;(4)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2。/。(W/V)的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)每個(gè)堆肥樣品取3jiL點(diǎn)入瓊脂糖凝膠孔中進(jìn)行電泳，檢測(cè)結(jié)果如圖l所示，從檢測(cè)結(jié)果來看，該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列長度約為200bp，與漆酶基因的序列長度基本一致，這能作為PCR擴(kuò)增得到漆酶基因的初證。3、變性梯度凝膠電泳電泳在DCodeSystem通用突變檢測(cè)系統(tǒng)(Bio-Rad，USA)中進(jìn)行，所用膠濃度為10%的聚丙烯酰胺(配制膠的溶液含有丙烯酰胺24.3313g、N，N'-甲叉雙丙烯酰胺0.6688g和50xTAE5mL，最后加滅菌雙蒸水補(bǔ)足至終體積250mL);變性梯度為30%~60%(100。/。的變性劑為7M的尿素和40%的去離子甲酰胺)；每個(gè)堆肥樣品取30^L上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行DGGE電泳，在lxTAE緩沖液中，60C恒溫、100V恒壓條件下運(yùn)行12h，凝膠用SYBRGreenI染色2030min,經(jīng)GelDoc2000凝膠成像系統(tǒng)(BioRad，USA)拍照得到DNA指紋圖譜。4、DGGE圖譜條帶分析(1)選擇DGGE圖譜上任一泳道上的三個(gè)條帶(見圖2中的條帶a、b、c)，分別用無菌水清洗，然后用25pLTE溶液將其浸泡過夜；(2)以浸泡出來的DNA溶液為模板，PCR擴(kuò)增其中的漆酶基因片段，引物采用不帶GC發(fā)夾結(jié)構(gòu)的上述步驟(2)中的簡并引物，擴(kuò)增模板使用10pl，其它擴(kuò)增條件和程序與上述步驟2的PCR反應(yīng)相同；(3)用純化試劑盒(Tiangen，北京)純化PCR產(chǎn)物；(4)DGGE圖譜條帶分析結(jié)果如圖2所示，圖2左側(cè)為漆酶基因的DGGE圖譜，泳道條帶所在位置的多樣性即表示樣品中漆酶基因的多樣性，處于同一水平位置的條帶則代表同一個(gè)基因類型；從圖2中可以看出三個(gè)平行堆肥樣品中漆酶基因多樣性較為一致；為了進(jìn)一步證實(shí)泳道中的條帶即代表漆酶基因，將l號(hào)泳道中a、b、c所指的三個(gè)條帶分別測(cè)序，測(cè)序結(jié)果見圖2右側(cè)的基因序列表，其中數(shù)字表示堿基數(shù)目，字母表示堿基序列。(5)將測(cè)序結(jié)果與Genbank數(shù)據(jù)庫中的基因序列進(jìn)行比較，找出同源性最高的序列，與Genbank數(shù)據(jù)庫中的基因序列Blast比對(duì)結(jié)果見下表l:表l:Blast比對(duì)結(jié)果表<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>從上表l的同源性比對(duì)結(jié)果可以看出，與三個(gè)序列同源性最高的序列均為漆酶基因，因此推測(cè)得到的基因均為漆酶基因或與漆酶基因相關(guān)。<110>湖南大學(xué)<120>堆肥中生物酶基因多樣性的分析方法<160>3<210>1<211>20bp<212>DNA<213>人工序列<400>1caytggcayggnttyttyca20<210>2<211>22bp<212>DNA<213>人工序列<400>2grctgtggtaccagaangtncc22<210>3<211>37bp<212>DNA<213>人工序列<400>3cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacggg3權(quán)利要求1、一種堆肥中生物酶基因多樣性的分析方法，包括以下步驟首先提取堆肥中的微生物總DNA，該微生物總DNA的提取過程又包括樣品的脫腐、DNA的粗提和DNA的純化三個(gè)步驟；然后利用PCR擴(kuò)增程序?qū)μ囟ㄉ锩富蜻M(jìn)行擴(kuò)增；再在1×TAE緩沖液中，60℃恒溫、100V恒壓條件下運(yùn)行變性梯度凝膠電泳12～14h；最后對(duì)變性梯度凝膠電泳圖譜進(jìn)行分析，確定所述堆肥中特定生物酶基因的多樣性。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的堆肥中生物酶基因多樣性的分析方法，具體包括以下步驟(1)提取堆肥中的微生物總DNA樣品的脫腐向待提取DNA的堆肥樣品中以815ml/g堆肥的用量加入去腐緩沖液，然后置于60~65。C的水浴中保溫38min，再以3000~5000xg離心57min，去上清；重復(fù)本步驟直至離心后的上清顏色與所述去腐緩沖液的顏色無明顯差異；DNA的粗提將上述脫腐后的樣品置于液氮中保持35min,然后以60~65'C的溫度解凍15-20min;以1.0~1.5ml/g堆肥的用量加入DNA提取緩沖液，并在37'C溫度下以200250rpm振蕩4560min;然后以100-150pl/g堆肥的用量加入十二烷基硫酸鈉溶液得混合液，65'C水浴1.01.5h;再加入與所述混合液等體積的氯仿-異戊醇試劑，搖勻后以800012000xg離心至沉淀完全，回收水相；往回收的水相中加入0.6倍水相體積的異丙醇并沉淀12h,以10000-13000xg速度離心815min;離心后的沉淀以0.81.5ml/g堆肥的用量加入預(yù)冰冷的乙醇溶液進(jìn)行洗滌，以1000(M3000xg速度離心35min，然后以500~1000pl/g堆肥的用量將洗滌后的堆肥樣品溶于TE緩沖液中，得到粗提的DNA溶液；DNA的純化用試劑盒對(duì)上述粗提的DNA溶液進(jìn)行純化，在純化產(chǎn)物中加入終濃度為0.25~0.5^g/ml的核糖核酸酶A，37'C水浴中消化30~40min,得到純化后的堆肥微生物總DNA;(2)PCR擴(kuò)增生物酶基因選用一對(duì)用于特定生物酶基因PCR擴(kuò)增的簡并引物，并在其上游引物的5'端加上GC發(fā)卡結(jié)構(gòu)；再利用PCR擴(kuò)增程序?qū)υ撎囟ㄉ锩富蜻M(jìn)行擴(kuò)增(3)變性梯度凝膠電泳電泳在通用突變檢測(cè)系統(tǒng)中進(jìn)行，所用膠濃度為10%的聚丙烯酰胺；變性梯度為30%~60%;電泳運(yùn)行后的凝膠用SYBRGreenI染色2030min，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)拍照得到DNA指紋圖譜；(4)變性梯度凝膠電泳圖譜分析將變性梯度凝膠電泳條帶切下，用無菌水清洗，并用TE緩沖液將所述條帶浸泡過夜；以浸泡出的DNA溶液為模板，以所述簡并引物作為擴(kuò)增用引物，利用PCR擴(kuò)增程序擴(kuò)增條帶中所述特定生物酶基因片段；用試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物，然后將該產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序和Blast比對(duì)，確定所述堆肥中特定生物酶基因的多樣性。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的堆肥中生物酶基因多樣性的分析方法，其特征在于所述的特定生物酶基因?yàn)槠崦竌accwe)基因。4、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的堆肥中生物酶基因多樣性的分析方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增程序?yàn)槠鹗?5'C預(yù)變性5min;94'C變性lmin，5(TC引物復(fù)性lmin，72'C引物延伸lmin，35個(gè)循環(huán)；72。C延伸5min。5、根據(jù)權(quán)利要求2所述的堆肥中生物酶基因多樣性的分析方法，其特征在于所述去腐緩沖液是由作為溶質(zhì)的三羥甲基氨基甲垸鹽酸、焦磷酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉、聚乙烯吡咯烷酮、氯化鈉、曲拉通X-100與溶劑水配制而成，各溶質(zhì)組分在去腐緩沖液中的濃度分別為-三羥甲基氨基甲烷鹽酸50~100mM焦磷酸鈉100~150mM乙二胺四乙酸二鈉50~100mM0.5~1.0%W/V100~200mM0.02~0.06%V/V。6、根據(jù)權(quán)利要求2所述的堆肥中生物酶基因多樣性的分析方法，其特征在于所述DNA提取緩沖液是由作為溶質(zhì)的Tris緩沖液、乙二胺四乙酸、磷酸鈉、氯化鈉、十六烷基三甲基溴化胺、蛋白酶K與溶劑水配制而成，各溶質(zhì)組分在DNA提取緩沖液中的濃度分別為聚乙烯吡咯垸酮氯化鈉曲拉通X-100Tris緩沖液乙二胺四乙酸磷酸鈉氯化鈉十六垸基三甲基溴化胺蛋白酶K0.1~0.15M0.1~0.15M0.1~0.12M1~1.5M1~2%W/V0.1~0.2mg/mlc全文摘要本發(fā)明公開了一種堆肥中生物酶基因多樣性的分析方法，包括以下步驟首先提取堆肥中的微生物總DNA，該提取過程又包括樣品的脫腐、DNA的粗提和DNA的純化三個(gè)步驟；然后利用PCR擴(kuò)增程序?qū)μ囟ㄉ锩富蜻M(jìn)行擴(kuò)增；再在1×TAE緩沖液中，60℃恒溫、100V恒壓條件下運(yùn)行變性梯度凝膠電泳12～14h；最后對(duì)變性梯度凝膠電泳圖譜進(jìn)行分析，確定所述堆肥中特定生物酶基因的多樣性。本發(fā)明的分析方法具有高通量、低成本、簡便直觀等優(yōu)點(diǎn)，以便于更好地表征堆肥中具有降解功能的微生物種群。文檔編號(hào)G01N27/447GK101550449SQ200910043399公開日2009年10月7日申請(qǐng)日期2009年5月14日優(yōu)先權(quán)日2009年5月14日發(fā)明者曾光明,鳳李,貞李,楊春平,楊朝暉,婕梁,勇肖,范長征申請(qǐng)人:湖南大學(xué)