專利名稱：利用熒光光譜擬合定量測量熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率的測量方法，具體涉及一種利用熒光光譜擬合定量測量熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率的方法。

背景技術(shù)：
基于熒光的各種技術(shù)已經(jīng)成為在活體細(xì)胞中實時檢測細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡和增殖的分子調(diào)控機(jī)制的重要技術(shù)。熒光光譜技術(shù)被廣泛應(yīng)用于化學(xué)合成物以及蛋白質(zhì)成分和結(jié)構(gòu)的分析，也被廣泛應(yīng)用于腫瘤特征、中藥成分以及中藥作用機(jī)理的分析。熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)技術(shù)是一種用于定量測量兩個不同發(fā)光基團(tuán)間距離的技術(shù)。FRET是通過分子間的電偶極相互作用將供體激發(fā)態(tài)能量轉(zhuǎn)移到受體激發(fā)態(tài)的過程，它是一種非輻射的能量越遷。當(dāng)FRET發(fā)生時，供體熒光減弱，而受體熒光增強，如果能夠準(zhǔn)確測量受體增加的熒光強度和供體減少的熒光強度，就可以準(zhǔn)確測量FRET效率。但是，由于供體和受體的發(fā)射光譜通常交叉在一起，并且目前廣泛應(yīng)用于生物研究的激光共聚焦掃描顯微鏡的最短波長為458nm，會將供體和受體同時激發(fā)，導(dǎo)致實際測量時很難將激發(fā)串?dāng)_和發(fā)射串?dāng)_消除，所以必須對測量的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理以便消除各種串?dāng)_帶來的影響。目前已有多種計算FRET效率的方法，Gordon[Gordon G W，Berry G，Liang X H，Levine B，Herman B.Quantitative fluorescence resonanceenergy transfer measurements using fluorescence microscopy.BiophysicalJournal，1998，742702-2713.]提出了一種可以修正發(fā)射串?dāng)_的定量計算FRET效率的方法，采用三組不同的濾光片，分別測量分離的供體和受體以及供體-受體對在三組濾片組時的熒光強度，所以該方法非常復(fù)雜。另外，此方法不適用于固定的供體-受體對，因為很難得到分離的供體和受體。陳[Chen T S，ZengS Q，Luo Q M.Fitting of fluorescence resonance energy transfer efficiencyby means of emission spectra of donor-acceptor pair. Acta PhotonicaSinica，2001，30300-303.]提出了一種定量測量FRET效率的方法，該方法利用選擇性激發(fā)供體時供體-受體對的發(fā)射譜信息，通過擬合定量獲得FRET效率。但目前廣泛應(yīng)用于生物領(lǐng)域研究的激光共聚焦掃描顯微鏡等通常配置氬離子激光器，其最短激發(fā)波長為458nm，該激發(fā)光難以選擇性激發(fā)供體，因此以上方法不適用于存在激發(fā)串?dāng)_的情況。


發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有FRET效率測量方法中存在的激發(fā)串?dāng)_和發(fā)射串?dāng)_問題，本發(fā)明的目的是提供一種新穎的通過擬合供體-受體對的熒光光譜來定量測量FRET效率的方法。
本發(fā)明通過以下的技術(shù)方案來實現(xiàn)一種利用熒光光譜擬合定量測量熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率的方法，包括以下具體步驟 一種利用熒光光譜擬合定量測量熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率的方法，包括以下具體步驟 (1)測量活細(xì)胞在供體-受體對轉(zhuǎn)染前后的熒光發(fā)射光譜，得到純的供體-受體對的熒光發(fā)射光譜SPmeasure(λ)； 測量熒光發(fā)射光譜時的激發(fā)波長438±20nm，發(fā)射光譜在470-580nm范圍掃描； (2)分別測量供體和受體的熒光發(fā)射光譜，并歸一化得到受體標(biāo)準(zhǔn)發(fā)射光譜SPa(λ)和供體標(biāo)準(zhǔn)發(fā)射光譜SPd(λ)，利用以下公式得到理論發(fā)射光譜SPnorm(λ) SPnorm(λ)＝SPnew(λ)/max(SPnew(λ))， 其中， SPnew(λ)＝xφASPa(λ)+(1-x)φD[(1-E)*b*SPd(λ)+EφA*SPa(λ)/φD]， 其中， E是能量共振轉(zhuǎn)移效率，x為激發(fā)串?dāng)_，φD是供體的量子產(chǎn)額(對于ECFPφD＝0.40)，φA是受體的量子產(chǎn)額，(對于VenusφA＝0.57)， (3)然后計算不同E和x時，SPnorm(λ)和SPmeasure(λ)之間的標(biāo)準(zhǔn)偏差，E和x從0遍歷至1，固定取值步長，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)偏差最小時即得到熒光能量共振轉(zhuǎn)移效E和激發(fā)串?dāng)_x。
為更好的實現(xiàn)本發(fā)明 上述供體-受體對使用SACT3?；贔RET原理構(gòu)建的SACT3質(zhì)粒由一個青色熒光蛋白(ECFP)供體、一個黃色熒光蛋白(YFP)的突變體(Venus)受體以及二者之間連接的一段包含caspase-3切割底物DEVD的序列組成，主要用于檢測caspase-3的活化。
所述步驟(1)中，掃描光譜的步長為2nm，每一個點連續(xù)測量25次取平均。
本發(fā)明的基本原理如下 對于激光共聚焦顯微鏡，通常其最短激發(fā)波長為458nm，會導(dǎo)致供體和受體同時激發(fā)，而我們通常需要選擇性的激發(fā)供體。在本發(fā)明中，我們利用了歸一化的供體和受體的熒光發(fā)射譜，通過擬合測量得到的熒光光譜定量來分析能量共振轉(zhuǎn)移效率。
首先，我們設(shè)總的激發(fā)光強為I0，而用于激發(fā)受體的光強為xI0，因此通過直接激發(fā)受體得到的熒光強度為Ia-d Ia-d＝xI0φA(1) 這里φA是受體的量子產(chǎn)額，(對于VenusφA＝0.57)。而直接激發(fā)供體產(chǎn)生的熒光強度Id+a Id+a＝(1-E)Id-a+φAEId-a/φD(2) 這里Id-a是沒有受體存在時激發(fā)供體產(chǎn)生的熒光強度，E是能量共振轉(zhuǎn)移效率，φD是供體的量子產(chǎn)額(對于ECFPφD＝0.40)。因為Id-a＝(1-x)I0φD，把它代入(2)，我們得到 Id+a＝(1-x)I0φD[(1-E)+φAE/φD](3) 因此存在激發(fā)串?dāng)_時，總的熒光強度為 I＝Ia-d+Id+a ＝Ia-d+(1-x)I0φD[(1-E)+φAE/φD](4) 通過(1)式，我們得到I0＝Ia-d/(xφA)，代入(5)式 我們設(shè)歸一化的供體和受體的標(biāo)準(zhǔn)譜為SPd (λ)和SPa(λ)。并且標(biāo)準(zhǔn)譜的波長間隔為2nm。通過(5)得到存在激發(fā)串?dāng)_時的熒光發(fā)射譜為 這里 由于(6)式兩邊的積分范圍相同，所以我們可以設(shè)定如下式子成立 由于在我們的發(fā)明中僅僅需要考慮歸一化的發(fā)射譜，所以在(6)式兩邊同時乘以xφA，而不會改變光譜SP(λ)的形狀。我們用SPnew(λ)代替SP(λ)，因此SPnew(λ)可以表示為 SPnew(λ)＝xφASPa(λ)+(1-x)φD[(1-E)*b*SPd(λ)+EφA*SPa(λ)/φD](8) 我們通過max(SPnew(λ))來歸一化(7)式，這里max(SPnew(λ))代表SPnew(λ)的最大值，因此歸一化的發(fā)射光譜可以表示為SPnorm(λ) SPnorm(λ)＝SPnew(λ)/max(SPnew(λ))(9) 然后我們計算不同E和x時SPnorm(λ)和實驗得到的熒光發(fā)射譜SPmeasure(λ)之間的標(biāo)準(zhǔn)偏差(E和x都是從0到1)。通過最小二乘法擬合我們能夠得到熒光能量共振轉(zhuǎn)移效E和激發(fā)串?dāng)_x。擬合時E和x都是從0遍歷到1，固定取值步長，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)偏差最小時，此時對應(yīng)的E和x的值就是熒光能量共振轉(zhuǎn)移效E和激發(fā)串?dāng)_率x。
相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下的有益效果 本發(fā)明可以有效解決由于光譜激發(fā)串?dāng)_和發(fā)射串?dāng)_而導(dǎo)致很難定量測量FRET效率的問題。通過實時測量供體-受體的熒光光譜，運用本方法可以定量獲得供體-受體對之間的FRET效率，從而可以監(jiān)測蛋白的激活程度。另外由于FRET效率還可以反映蛋白之間的結(jié)合程度，運用本發(fā)明可以定量監(jiān)測活細(xì)胞中蛋白質(zhì)之間的相互作用。



圖1是未經(jīng)過星孢菌素處理的活細(xì)胞中SCAT3的光譜。
圖2是經(jīng)過星孢菌素處理12小時后活細(xì)胞中SCAT3的光譜。
圖3是未轉(zhuǎn)染SCAT3的活細(xì)胞的光譜。
圖4是未經(jīng)過星孢菌素處理的活細(xì)胞中SCAT3減去背景光譜之后的光譜。
圖5是經(jīng)過星孢菌素處理12小時后活細(xì)胞中SCAT3減去背景光譜之后的光譜。
圖6是歸一化的供體的熒光光譜。
圖7是歸一化的受體的熒光光譜。
圖8是表示未經(jīng)過星孢菌素處理的活細(xì)胞中SCAT3的光譜減去背景光譜并歸一化得到的SPmeasure(λ)與公式(8)擬合得到的結(jié)果，其FRET效率為25.4％。+++表示實驗數(shù)據(jù)，---表示擬合數(shù)據(jù)。
圖9是表示經(jīng)過星孢菌素處理12小時的活細(xì)胞中SCAT3的光譜減去背景光譜并歸一化得到的SPmeasure(λ)與公式(8)擬合得到的結(jié)果，其FRET效率為4.5％。+++表示實驗數(shù)據(jù)，---表示擬合數(shù)據(jù)。

具體實施例方式 下面結(jié)合附圖和實施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
1、質(zhì)粒來源 質(zhì)粒SCAT3質(zhì)粒購自德國默克公司。
2、細(xì)胞培養(yǎng) 人類肺腺癌細(xì)胞(ASTC-a-1)生長在含10％新生牛血清，50units/ml的青霉素和50g/ml的鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，待生長到70-85％匯合后用胰蛋白酶消化傳代，以1×104個細(xì)胞/孔間隔接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每皿500μl培養(yǎng)液，接種后放入培養(yǎng)箱(37℃，5％CO2)繼續(xù)培養(yǎng)。通過脂質(zhì)體將SCAT3質(zhì)粒轉(zhuǎn)然到ASTC-a-1細(xì)胞中，利用G418對轉(zhuǎn)染了SCAT3的細(xì)胞進(jìn)行篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)SCAT3的ASTC-a-1細(xì)胞[Wu Y X，Xing D，Chen W R.Single cell FRET imagingfor determination of pathway of tumor cell apoptosis induced byphotofrin-PDT.Cell Cycle，2006，5729-734.；Wu Y X，Xing D，Luo S M，Tang Y H，Chen Q.Detection of caspase-3 activation in single cells byfluorescence resonance energy transfer during photodynamic therapyinduced apoptosis.Cancer Letter，2006，235239-247.]。
3、熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率的測量。
利用G418對轉(zhuǎn)染了SCAT3的細(xì)胞進(jìn)行篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)SCAT3的ASTC-a-1細(xì)胞。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)了SCAT3的ASTC-a-1細(xì)胞接種到96孔板中培養(yǎng)24h，然后更換培養(yǎng)液后每孔加入100L濃度為1mol/L的星孢菌素。然后用自動微孔檢測儀(infinite M200，Tecan，Austria)測量活細(xì)胞內(nèi)供體-受體對的熒光發(fā)射光譜。激發(fā)波長438±20nm，發(fā)射光譜在470-580nm范圍掃描，掃描光譜步長為2nm，每一個點連續(xù)測量25次取平均。測量得到的光譜如圖1和圖2所示圖1是未經(jīng)過星孢菌素處理的活細(xì)胞中SCAT3的光譜。圖2是經(jīng)過星孢菌素處理12小時后活細(xì)胞中SCAT3的光譜。
(1)測量沒有轉(zhuǎn)染SCAT3細(xì)胞的對應(yīng)發(fā)射光譜作為背景光譜。激發(fā)波長438±20nm，發(fā)射光譜在470-580nm范圍掃描，掃描光譜步長為2nm，每一個點連續(xù)測量25次取平均。測量所得的背景光譜如圖3所示。
(2)將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)了供體-受體對的細(xì)胞的熒光光譜減去背景光譜并歸一化，即得到了純的供體-受體對的熒光光譜SPmeasure(λ)，如圖4和5所示。
(3)測量供體和受體的發(fā)射光譜，并歸一化得到受體標(biāo)準(zhǔn)發(fā)射光譜SPa(λ)和供體標(biāo)準(zhǔn)發(fā)射光譜SPd(λ)，供體和受體的歸一化發(fā)射光譜如下圖6和圖7所示。
利用以下公式得到理論發(fā)射光譜SPnorm(λ) SPnorm(λ)＝SPnew(λ)/max(SPnew(λ))， 其中， SPnew(λ)＝xφASPa(λ)+(1-x)φD[(1-E)*b*SPd(λ)+EφA*SPa(λ)/φD]， 其中E是能量共振轉(zhuǎn)移效率，x為激發(fā)串?dāng)_，φD是供體的量子產(chǎn)額(對于ECFPφD＝0.40)，φA是受體的量子產(chǎn)額，(對于VenusφA＝0.57) 本實例中b＝0.60.所以 SPnew(λ)＝0.57x*SPa(λ)+0.4(1-x)
SPnorm(λ)＝SPnew(λ)/max(SPnew(λ)) (4)然后計算不同E和x時SPnorm(λ)和實驗得到的熒光發(fā)射譜SPmeasure(λ)之間的標(biāo)準(zhǔn)偏差(E和x都是從0到1)。擬合時E和x都是從0遍歷到1，取值步長為0.01，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)偏差最小時即得到熒光能量共振轉(zhuǎn)移效E和激發(fā)串?dāng)_x。
基于以上計算，測量得到的未經(jīng)過STS處理以及經(jīng)STS處理12小時的活細(xì)胞中SCAT3的光譜減去背景光譜并歸一化得到的SPmeasure(λ)與SPnorm(λ)擬合得到的結(jié)果如圖8和9所示。
從本實例看出，經(jīng)過星孢菌素處理12小時后的細(xì)胞中的SCAT3的FRET效率E更小，說明經(jīng)過星孢菌素處理后，細(xì)胞內(nèi)的caspase3被激活，導(dǎo)致SCAT3被切割，使SCAT3的FRET效率E降低。而caspase3被激活，則細(xì)胞會不可逆轉(zhuǎn)的進(jìn)入凋亡，所以可以通過本發(fā)明可以檢測細(xì)胞的凋亡。
另外，本實例的結(jié)果可以通過熒光壽命成像顯微鏡證實。對穩(wěn)定表達(dá)SCAT3的活細(xì)胞的用星孢菌素進(jìn)行處理，在未處理和處理12小時后進(jìn)行熒光壽命成像實驗，得到的FRET效率E分別為24.4％和3.7％，與用本發(fā)明得到的結(jié)果基本一致。
權(quán)利要求
1、一種利用熒光光譜擬合定量測量熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率的方法，包括以下具體步驟
(1)測量活細(xì)胞在供體-受體對轉(zhuǎn)染前后的熒光發(fā)射光譜，得到純的供體-受體對的熒光發(fā)射光譜SPmeasure(λ)；
測量熒光發(fā)射光譜時的激發(fā)波長438±20nm，發(fā)射光譜在470-580nm范圍掃描；
(2)分別測量供體和受體的熒光發(fā)射光譜，并歸一化得到受體標(biāo)準(zhǔn)發(fā)射光譜SPa(λ)和供體標(biāo)準(zhǔn)發(fā)射光譜SPd(λ)，利用以下公式得到理論發(fā)射光譜SPnorm(λ)
SPnorm(λ)＝SPnew(λ)/max(SPnew(λ))，
其中，
SPnew(λ)＝xφASPa(λ)+(1-x)φD[(1-E)*b*SPd(λ)+EφA*SPa(λ)/φD]，
其中，
E是能量共振轉(zhuǎn)移效率，x為激發(fā)串?dāng)_，φD是供體的量子產(chǎn)額，φA是受體的量子產(chǎn)額，
(3)然后計算不同E和x時，SPnorm(λ)和SPmeasure (λ)之間的標(biāo)準(zhǔn)偏差，E和x從0遍歷至1，固定取值步長，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)偏差最小時即得到熒光能量共振轉(zhuǎn)移效E和激發(fā)串?dāng)_x。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用熒光光譜擬合定量測量熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率的方法，其特征在于所述供體-受體對為SACT3，其包括青色熒光蛋白ECFP作為供體和黃色熒光蛋白YFP的突變體Venus作為受體。
3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用熒光光譜擬合定量測量熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率的方法，其特征在于所述步驟(1)中，掃描光譜時的步長為2nm，每一個點連續(xù)測量25次取平均。
全文摘要
本發(fā)明涉及熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率的測量方法，具體提供了一種利用熒光光譜擬合定量測量熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率的方法。該方法的步驟包括首先測量得到細(xì)胞內(nèi)供體-受體對的熒光發(fā)射譜；進(jìn)而利用歸一化的供體、受體的熒光發(fā)射譜，得到供體-受體對的擬合熒光光譜；最后計算實驗光譜與擬合光譜在最接近時的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率。通過本發(fā)明的方法可以有效解決由于光譜激發(fā)串?dāng)_和發(fā)射串?dāng)_而導(dǎo)致很難定量測量FRET效率的問題，從而可以更準(zhǔn)確地監(jiān)測蛋白的激活程度以及活細(xì)胞中蛋白質(zhì)之間的相互作用。
文檔編號G01N33/566GK101551332SQ20091003947
公開日2009年10月7日 申請日期2009年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月14日
發(fā)明者陳同生, 王龍祥 申請人:華南師范大學(xué)