專利名稱：呼出的粒子的采集和測量的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在動(dòng)物，特別是哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人類呼吸的過程中呼出的粒子。粒子的 性質(zhì)和數(shù)量能夠指示某種醫(yī)學(xué)狀態(tài)。因此，這些粒子能夠被采集，按照大小或質(zhì)量被分類并 且它們可被用于一種或多種醫(yī)學(xué)狀態(tài)的診斷中。
背景技術(shù)：
人類呼吸道每天面對至少7-8立方米的空氣，并且有一個(gè)先進(jìn)的生物系統(tǒng)用來解 除吸入粒子和氣體的毒性。第一道抵御吸入物質(zhì)的防線是覆蓋在整個(gè)呼吸道上的呼吸道內(nèi) 襯粘液(RTLF)，其中含有幾個(gè)重要的抗氧化系統(tǒng)。RTLF中另外一個(gè)重要成分是表面活性 劑，其含有用于減小表面張力的化合物，但也參與天然的免疫。已經(jīng)顯示在呼吸道炎癥條件下RTLF的成分會(huì)發(fā)生改變。當(dāng)RTLF中的抗氧化劑和 吸入的氧化劑之間的平衡被打亂時(shí)，氧化應(yīng)激將啟動(dòng)炎癥過程。這種炎癥過程，雖然形式非 常多樣，但是是在從哮喘到肺癌的大多數(shù)呼吸道疾病發(fā)展過程中的共有的主要早期事件。導(dǎo)致所有呼吸道疾病的病理生理過程目前還不完全清楚。其背后的一個(gè)原因是人 體內(nèi)的那些過程難以監(jiān)測。為了評(píng)估例如不同接觸劑量的作用，現(xiàn)行的方法僅限于測量肺 功能、呼出的一氧化氮、誘導(dǎo)的痰或者對支氣管肺泡灌洗(BAL)或支氣管鏡活檢進(jìn)行分析。現(xiàn)有的這些方法要么是過分侵入的，例如支氣管鏡檢，因此不適用于較大規(guī)模研 究，而應(yīng)確保較大規(guī)模研究對不同接觸劑量的易感性是高度可變的。另外，支氣管鏡檢和誘 導(dǎo)的痰還都與一定的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)，特別是在敏感人群中，例如在具有先前已經(jīng)存在的心肺 系統(tǒng)疾病或哮喘的人群中。呼出的氣體中的一氧化氮似乎在很大程度上只是反映過敏性炎 癥，因此當(dāng)研究其他呼吸道疾病時(shí)價(jià)值有限。另一方面，寧愿肺功能對患者是無害的，但是 無法提供有關(guān)疾病的根本機(jī)制方面的信息。其他所用的方法包括體外研究，它們只能對人類呼吸道復(fù)雜的環(huán)境進(jìn)行有限的概 括。同樣的情況在很大程度上對動(dòng)物研究也適用，其中雖然與人類基因高度一致，但是各種 基因的表達(dá)在實(shí)質(zhì)上不同。最近，引入了一種新的方法，叫做呼出的呼吸氣冷凝液(EBC)采集，也就是呼出的 水蒸氣通過低溫被冷凝，其中可以鑒別揮發(fā)性和非揮發(fā)性化合物。相信在EBC中發(fā)現(xiàn)的非 揮發(fā)性物質(zhì)源于在呼吸道內(nèi)形成的粒子。這些粒子是在呼吸、說話或咳嗽時(shí)在呼吸系統(tǒng)中 產(chǎn)生的，并且已經(jīng)被人們所觀察到，直到目前為止，這些粒子被研究了主要是因?yàn)樗鼈兛梢?充當(dāng)運(yùn)輸傳染性物質(zhì)的載體。目前還不清楚這些粒子是如何形成的，但一種似是而非的機(jī) 制可能是由于中心呼吸道中支氣管的橫截面積急劇減小，從而其中呼出的氣體形成湍流。 第二種假設(shè)是當(dāng)肺周邊中的呼吸道打開時(shí)，由RTLF形成了粒子。在疾病狀態(tài)下，粒子的形 成可能會(huì)因?yàn)橥牧鞯脑鰪?qiáng)和/或RTLF物理特性的改變而得到提高。在WO 02/082977中給 出了一個(gè)這樣的例子。采集呼出的呼吸氣冷凝液(EBC)與許多嚴(yán)重的方法學(xué)上的困難相關(guān)聯(lián)，這些困難 例如是用水稀釋會(huì)使得感興趣物質(zhì)的濃度非常低、被來自口腔中的物質(zhì)高度污染、個(gè)體內(nèi)的高變化系數(shù)以及存在于EBC中的揮發(fā)性物質(zhì)的采樣效率非常低。因此需要一種更好的非侵入性方法來檢測和監(jiān)控對呼吸系統(tǒng)的有害健康的效果。用來克服與EBC分析相關(guān)的方法學(xué)上的一些困難的一種到目前為止尚未驗(yàn)證的方法是直 接對呼出的粒子進(jìn)行采樣和分析。確定采集的粒子的數(shù)量和大小的能力也將給出有關(guān)呼吸 道狀態(tài)的特定信息。不同大小的粒子級(jí)分分布的測量目前只有幾篇公開發(fā)表的核查呼出的液滴(即粒子)的研究。Papineni 禾口 Rosenthal[J Aerosol Med 10 (2) 105—16]禾口 Edwards 等人[Proc NatlAcad Sci USA 101 (50) :17383_8]測量了若干濃度的人類呼出粒子，并描述了主體間 的差異很大，但是其濃度普遍遠(yuǎn)低于在典型的室內(nèi)空氣中測得的。也有一些關(guān)于呼出的粒 子的大小分布的資料。必須假設(shè)液滴的主要成分是水，這樣粒子大小將隨周圍空氣的相對 濕度(RH)的變化而快速變化。Papineni和Rosenthal采用的研究RH的影響的方法并不能 讓人信服，因?yàn)樗麄冇眉t外燈加熱空氣來改變RH。Edwards等人并沒有在他們的研究中認(rèn) 真考慮RH。粒子大小可以用間接手段，如鏡檢干燥的液滴或采用低尺寸分辨率的光散射方 法。因此，在這種情況下有必要對呼出氣溶膠的濃度變化和大小分布作更多的研究。最近對于人類氣溶膠形成的興趣與日俱增，主要在用來檢測它們的感染的可能性 的可能性范圍。US 2005/0073683 和 Anal. Chem. 2005，77，4734-4741 描述了一種用于鑒別 預(yù)先形成的氣溶膠粒子的實(shí)時(shí)檢測方法和系統(tǒng)。該方法的目的在于通過將正和負(fù)質(zhì)譜與也 將被開發(fā)的參考質(zhì)譜比較來即時(shí)檢測含有傳染性物質(zhì)或“威脅劑”的氣溶膠。該方法并不 是為了診斷或監(jiān)測人類呼吸道狀態(tài)而被開發(fā)的，而且其顯著低的敏感性也阻礙了對非常低 濃度的物質(zhì)，例如一些呼出粒子中的物質(zhì)的檢測。目前還缺乏容易監(jiān)測呼吸道的方法。諸如支氣管肺泡灌洗和痰誘導(dǎo)這樣的侵入性 方法對患者是有害的，并且不允許頻繁采樣。發(fā)明概述由于對呼出的空氣中的生物標(biāo)記物進(jìn)行測量是非侵入性的并能夠?qū)崿F(xiàn)重復(fù)采樣， 其可用于對疾病的早期檢測并對疾病發(fā)展和治療反應(yīng)進(jìn)行監(jiān)控。這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)成功地用于 揮發(fā)性物質(zhì)，尤其重要地用于作為過敏性哮喘標(biāo)記物的呼出的NO。非揮發(fā)性化合物是由氣溶膠粒子運(yùn)輸?shù)?，氣溶膠粒子被認(rèn)為源于呼吸道上皮粘 液。這已經(jīng)被我們的初步數(shù)據(jù)證實(shí)了。這些化合物可以提供有關(guān)在呼吸道中病理生理學(xué)過 程的基本的原理和特定的信息。很少有關(guān)于在呼出的呼吸氣中的內(nèi)源性粒子的研究。在呼 吸道中粒子形成的機(jī)制和準(zhǔn)確位置是不清楚的，而且還沒有關(guān)于粒子的化學(xué)組成的具體分 析。發(fā)展了一種對呼出的呼吸氣中的粒子進(jìn)行采樣和分析的新技術(shù)。用于確定主體的 醫(yī)學(xué)狀態(tài)的方法包括下列步驟a.采集由所述主體呼出的粒子；b.依據(jù)所述的粒子質(zhì)量或大小對所述的粒子進(jìn)行分類，和g.分析所述粒子的化學(xué)成分，這樣允許確定該主體的醫(yī)學(xué)狀態(tài)。此外，在該方法中還可包括如下步驟c.依據(jù)所述粒子的質(zhì)量或大小對所述粒子進(jìn)行分類來獲得所述粒子的粒子分布譜；d.比較由所述主體呼出的粒子的粒子分布譜和參考粒子分布譜；e.記錄所述主體的粒子分布譜和所述參考粒子分布譜之間的相似性和/或偏差； 并且f.將主體的和參考粒子分布譜之間的相似性和/或偏差歸因于所述主體中的一 個(gè)或多個(gè)醫(yī)學(xué)狀態(tài)；并且任選地，
g.分析所述粒子的化學(xué)成分。所述醫(yī)學(xué)狀態(tài)可以選自支氣管哮喘、囊性纖維化、慢性阻塞性肺疾病(COPD)J^ 質(zhì)性肺疾病、結(jié)節(jié)病、在系統(tǒng)性疾病例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)中的肺部負(fù)擔(dān)、肺部感染例 如肺炎、細(xì)菌定居或病毒感染。所述參考粒子分布譜可從不具有給定醫(yī)學(xué)狀態(tài)的主體獲得，并且步驟e.涉及記 錄所述主體的粒子分布譜和參考粒子分布譜之間的偏差。備選地，該參考粒子分布譜來自 具有給定醫(yī)學(xué)狀態(tài)的病人，并且步驟e.涉及記錄所述主體和所述病人的粒子分布譜之間 的相似性，導(dǎo)致對該主體的所述給定醫(yī)學(xué)狀態(tài)的診斷。本發(fā)明同樣提供了一種用于提供呼出的呼吸氣粒子的粒子分布譜的方法，該方法 包括下列步驟a.采集由主體呼出的粒子；和b.依據(jù)粒子的大小或質(zhì)量對所述粒子進(jìn)行分類以獲得所述粒子的粒子分布譜。在另一種方法中，可以使用慣性沖擊器(inertial impactor)依據(jù)粒子的質(zhì)量對 所述粒子進(jìn)行分類，或使用粒子計(jì)數(shù)器依據(jù)粒子的大小對所述粒子進(jìn)行分類。該沖擊器應(yīng)當(dāng)具有進(jìn)口和出口，并且包括多個(gè)平臺(tái)，安排這些平臺(tái)使得包括粒子 (P)的氣流(A)通過入口進(jìn)入沖擊器并在通過所述出口離開之前依次通過每個(gè)平臺(tái)；其中通過具有孔的隔離物使每個(gè)平臺(tái)與相鄰平臺(tái)相分隔，該孔引導(dǎo)氣流(A)朝向 采集盤，安排每個(gè)采集盤的主面使其基本上垂直于該氣流(A)的流動(dòng)方向；從而，呼出的粒子以氣流㈧形式穿過所述慣性沖擊器；使得引導(dǎo)主要的氣流(A) 依次朝向在每個(gè)平臺(tái)中的每個(gè)采集盤；使得至少位于第一平臺(tái)中的第一采集盤采集第一質(zhì) 量粒子，而至少位于第二平臺(tái)中的第二采集盤采集第二質(zhì)量粒子。在依據(jù)粒子質(zhì)量或大小進(jìn)行分類后，對粒子進(jìn)行分析。在從采集盤上首先沖洗 或不從采集盤上首先沖洗的情況下，通過至少一種分析技術(shù)對粒子進(jìn)行分析，所述分析技 術(shù)選自飛行時(shí)間二次離子質(zhì)譜(T0F-SIMS)、基質(zhì)輔助的激光解吸電離質(zhì)譜(MALDI-MS)、 基于標(biāo)記抗體的生化檢測或方案、定量的PCR分析、電子掃描顯微鏡(SEM)、氣相色譜質(zhì)譜 (GC-MS)、液相色譜質(zhì)譜(LC-MS)、表面等離子體共振(SPR)、熒光光譜、TOC(總有機(jī)物含量) 分析、元素分析以及電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)。本發(fā)明同樣涉及一種用于對呼出的粒子進(jìn)行采集和分類的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括a.具有第一和第二開口的容器；b.與容器的第一開口相連接的雙向接口 ；c.具有進(jìn)口和出口的慣性沖擊器，該沖擊器包括多個(gè)平臺(tái)，安排該平臺(tái)使得包括 粒子(P)的氣流(A)通過入口進(jìn)入沖擊器，并在通過所述出口離開沖擊器之前依次穿過每 個(gè)平臺(tái)；
其中通過具有孔的隔離物使每個(gè)平臺(tái)與相鄰平臺(tái)相分隔，該孔引起主要?dú)饬?A) 朝向采集盤，安排每個(gè)采集盤的主面使其基本上垂直于氣流(A)的流動(dòng)方向；該慣性沖擊器的入口被連接到所述容器的第一開口。對呼出粒子的測量和分析應(yīng)滿足如下要求·非侵入性·能夠在人體中重復(fù)測量·遵循肺部的各種病理生理過程，包括抗氧化系統(tǒng)、蛋白表達(dá)、脂質(zhì)模式的變化以 及粒子大小和濃度的差異的動(dòng)力學(xué)?！び糜诜乔秩胄缘罔b別用于診斷或監(jiān)控疾病的新生物標(biāo)記物的平臺(tái)，所述疾病包 括a)呼吸道疾病例如ο 哮喘ο慢性阻塞性肺疾病ο間質(zhì)性肺疾病ο 肺癌ο呼吸道感染ο系統(tǒng)性疾病例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡SLE、硬皮病和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的肺部負(fù)擔(dān)。b)系統(tǒng)性疾病例如ο心脈管疾病ο糖尿病ο新陳代謝綜合癥ο高膽固醇血癥 監(jiān)測插管病人·監(jiān)測接觸·鑒別藥理學(xué)治療的新靶標(biāo)·鑒別對于某種接觸或疾病具有增加的遺傳易感性的個(gè)體附圖的簡要說明

圖1舉例說明依據(jù)本發(fā)明的慣性沖擊器；圖2舉例說明用于采集呼出的粒子的系統(tǒng)；圖3顯示來自一個(gè)對照主體的粒子斑的正(圖3A)和負(fù)(圖3B) TOF-SIMS光譜；圖4是具有來自一個(gè)對照主體的呼出粒子的一個(gè)斑點(diǎn)的TOF-SIMS圖；圖5顯示呼出粒子(0. 5-2. Oym)的濃度和時(shí)間的關(guān)系圖；圖6顯示在對健康主體和患有哮喘或囊性纖維化主體的先導(dǎo)研究中的比值 (CN+CNO)/POf ；優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述在第一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種確定主體的醫(yī)學(xué)狀態(tài)的方法。詞“確定”以其最廣的范圍來理解；也就是對醫(yī)學(xué)狀態(tài)的存在(定性)和/或程度(定量)進(jìn)行評(píng)估。此 外，“確定”也指通過對主體可能具有的任何易感性的確定以獲得給定醫(yī)學(xué)狀態(tài)。術(shù)語“醫(yī)學(xué)狀態(tài)”不應(yīng)當(dāng)局限地僅僅理解為疾病或障礙。它同樣涉及以非診斷方式對健康主體的醫(yī)學(xué)狀態(tài)的研究，例如下列情形-處于藥物治療或藥品影響下(例如麻醉測試)，亦如接觸化學(xué)物質(zhì)(例如污染 物、職業(yè)危險(xiǎn)物)的主體；-參與鍛煉或健康項(xiàng)目的主體(例如確定主體的體質(zhì)或健康)；-健康主體，其具有發(fā)展為某種疾病或障礙的易感性；-健康主體，其可能發(fā)展成某種疾病或障礙，或者對特定接觸具有更少耐受力的遺 傳易感性?？梢员粦?yīng)用本發(fā)明方法的主體為動(dòng)物，特別是哺乳動(dòng)物，尤其是人類。主要參考人 類描述本發(fā)明。在第二實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于提供呼出的呼吸氣粒子的粒子分布譜 的方法。在本發(fā)明的兩種方法中的第一步驟均涉及采集由主體呼出的粒子。單次呼氣就可 提供足夠數(shù)量粒子，但通常需要從多次重復(fù)呼氣中采集粒子。比如，在對人類醫(yī)學(xué)狀態(tài)進(jìn)行 診斷時(shí)，可從持續(xù)一段時(shí)間的連續(xù)的吸氣/呼氣中采集粒子，這段時(shí)間包括至多數(shù)十分鐘， 例如，1秒到100分鐘，如1秒到50分鐘，5秒到20分鐘或10秒到5分鐘的單次呼氣。通過改變呼氣方式，也可能從呼吸道的不同部位采集代表性的粒子。與其中假設(shè) 通過從呼吸道的最遠(yuǎn)端打開的呼吸道中形成了更多粒子的正常呼吸相對照，在某些較為中 心的呼吸道中，當(dāng)呼吸道狹窄時(shí)受迫的呼氣增加了湍流，并因此增加了粒子的產(chǎn)出。在采集后，根據(jù)粒子的大小或質(zhì)量對粒子進(jìn)行分類?？梢允褂昧Ｗ佑?jì)數(shù)器用來對 個(gè)別粒子進(jìn)行計(jì)數(shù)，并因而提供了粒子的數(shù)量-大小分布?？梢酝ㄟ^假定球形粒子和密度 來計(jì)算質(zhì)量分布。隨之而來的是對采集到的非揮發(fā)性物質(zhì)的高等化學(xué)分析(如下詳細(xì)描 述)O依據(jù)粒子的質(zhì)量或大小對粒子進(jìn)行分類可以提供所述粒子的粒子分布譜。粒子分 布譜是在呼出的空氣中某一特定質(zhì)量或數(shù)量(或質(zhì)量或大小范圍)的粒子怎樣存在的量 度，其同樣可以用來確定主體的醫(yī)學(xué)狀態(tài)。本文中出現(xiàn)的粒子是指經(jīng)常懸浮在氣體中，通常 懸浮在但不必要懸浮在空氣中的固體、液體和液體包裹的固體物體。物體大小通常但不必 要大于0. 005微米并通常但不必要小于15微米。而大小應(yīng)當(dāng)是指空氣動(dòng)力學(xué)直徑或電遷 移直徑，合適地為空氣動(dòng)力學(xué)直徑。圖1顯示了用于采集呼出的粒子(在圖1中顯示為P)的慣性沖擊器10。沖擊器 10是具有入口 12和出口 14的容器，氣體和呼出的粒子通過該入口進(jìn)入該沖擊器10，并且 氣體和呼出的粒子通過該出口離開沖擊器10。舉例說明的圖1中的該沖擊器10為圓柱形， 具有在圓柱形的相對圓形表面上的入口 12和出口 14 ；盡管如此，入口和出口 12、14也有可 能為其他的幾何形狀或設(shè)計(jì)。沖擊器10包括多個(gè)平臺(tái)20、30、40、50。圖1舉例說明了 4個(gè)平臺(tái)20、30、40、50，
而已知具有從2到15個(gè)平臺(tái)的沖擊器。具有粒子(P)的主要?dú)饬?A)通過入口 12進(jìn)入沖擊器10并在通過出口 14離開沖擊器10之前依次穿過平臺(tái)20、30、40、50。該主要?dú)饬?A) 包括由主體呼出的空氣和粒子。流動(dòng)是由連接到?jīng)_擊器出口的泵產(chǎn)生的。依據(jù)本發(fā)明，通 常呼出氣體和粒子在離開主體和進(jìn)入沖擊器之間沒有被改變過。由隔離物21、31、41、51將每個(gè)平臺(tái)20、30、40、50與相鄰平臺(tái)分隔開。每個(gè)隔離物具有至少一個(gè)孔22、32、42、52(實(shí)踐中，在每個(gè)隔離物中存在多個(gè)孔)，該孔引導(dǎo)所述氣流(A)朝向采集盤33、43、53。安排每個(gè)采集盤33、43、53的主面使其基本上垂直于所述氣流 (A)的流動(dòng)方向。使用的采集盤33、43、53具有大約Imm的厚度并且是具有10_12mm邊長的正方形。 通過雙面帶將所述盤固定在位于通過管嘴的氣流出口處的基質(zhì)固定器上。該盤由天然硅制 成，因?yàn)檫@對于此后的分析是有利的。所述盤必須非常的干凈，因?yàn)槲⒘侩s質(zhì)會(huì)干擾后面的 粒子分析?？梢酝ㄟ^多種方式清潔硅盤，優(yōu)選地在有機(jī)溶劑中通過超聲清洗，然后通過紫外 線臭氧處理，或通過浸入1-10%的硝酸或過氧化氫中進(jìn)行。在清潔后，可針對采集和此后的化學(xué)分析進(jìn)一步優(yōu)化采集盤表面的準(zhǔn)備。通過變 化采集盤的親水性或其他表面化學(xué)性質(zhì)，以友好的方式控制了粒子和表面之間的相互作 用。優(yōu)選地，該采集盤的整個(gè)表面被修飾。疏水性的采集表面，相比較于親水性表面，將會(huì) 更強(qiáng)烈地結(jié)合疏水性部分例如脂質(zhì)分子的烴鏈。正常的親水性硅表面可通過表面覆蓋一薄 層疏水性物質(zhì)例如甲基硅烷或在硅基底上覆蓋一層金，然后在金上施加一單層甲基封端的 硫醇衍生物而實(shí)現(xiàn)疏水化。相似地，可使采集表面特異性地結(jié)合某種分子。通過在采集盤 表面覆蓋一層針對上述相關(guān)蛋白的抗體，可使特異性的蛋白與采集板表面結(jié)合。通過采用 適合的試劑，該被分析物質(zhì)的結(jié)合可引起顏色變化或發(fā)出熒光，而這些能夠在原位實(shí)時(shí)地 探測。通過電測量由被分析物結(jié)合到采集盤表面而引起的電流或電容的變化也能夠?qū)崿F(xiàn)原 位檢測。在該情況下，采集盤還要具有必要的能實(shí)現(xiàn)這種測量的電連接。所述沖擊器可包 括必要的電連接，該電連接與采集盤表面上適宜的連接器接觸。粒子具有慣性，因此當(dāng)在第一采集盤33處偏轉(zhuǎn)后不再跟隨空氣流，將會(huì)沖撞采集 盤33，而具有更小慣性的粒子將會(huì)繼續(xù)到下個(gè)平臺(tái)40。粒子的慣性依賴于它的質(zhì)量，而質(zhì) 量反過來取決于它的大小。通過這種方式，得以實(shí)現(xiàn)粒子質(zhì)量或大小的分離。這樣通過在每個(gè)階段選擇每個(gè)平臺(tái)中孔的數(shù)量、孔的直徑和從孔到采集盤的距 離，可能實(shí)現(xiàn)氣溶膠中粒子的大小或尺寸的分離。具有高慣性即大質(zhì)量/尺寸的粒子被分 離在前部平臺(tái)上，而具有小慣性即小質(zhì)量/尺寸的粒子將撞擊在后面的平臺(tái)上。通過選擇 孔的形狀，可能以適合于此后化學(xué)分析的形式濃縮采集的物質(zhì)。與呼出的空氣或呼吸氣濃 縮物相比，采集盤上物質(zhì)濃度的增加是可觀的。在本案中，使用修飾的3平臺(tái)Dekati PM10。修飾由下列組成以系數(shù)2減小第三 平臺(tái)管嘴的數(shù)量，以系數(shù)1. 5增大沖擊器的設(shè)計(jì)流速。原始沖擊器是每分鐘10公升的形式的，其是在15公升每分鐘的流動(dòng)速下運(yùn)行的。 最后一個(gè)平臺(tái)的20個(gè)孔被減少為10個(gè)，由此以系數(shù)2增大了每個(gè)管嘴中的氣流速度。對 于這3個(gè)平臺(tái)50%截止的尺寸[即，該尺寸的粒子數(shù)的一半被采集而另一半仍繼續(xù)。這不 會(huì)顯示出階梯形采集特征，而是“S-樣”特征]分別為7、1. 5和0. 5 μ m。如上文中描述的采集盤的表面功能塊，可被小型化，以實(shí)現(xiàn)在每個(gè)管嘴處不同的 功能化，從而方便地優(yōu)化平行采集不同的被分析物。相似地，通過其中給在管嘴出口處的采 集盤提供了恰當(dāng)?shù)谋砻婀δ軌K和/或電連接的采集盤芯片，實(shí)現(xiàn)了對特定物質(zhì)的平行的原 位光或電探測。沖擊器被設(shè)計(jì)以盡可能高效的方式采集呼出的粒子。這意味著實(shí)質(zhì)上所有在給定 質(zhì)量/大小區(qū)間內(nèi)的呼出的空氣中的粒子，都被采集用于分析。這些粒子以適于高等化學(xué)分析的濃縮的形式被回收。本發(fā)明同樣提供了一種對呼出的粒子進(jìn)行采集和分類的系統(tǒng)100，該系統(tǒng)包括a.具有第一開口 112和第二開口 113的容器114 ；b.連接到容器114的第一開口 112的雙向接口 110 ；c.具有進(jìn)口 12和出口 14的慣性沖擊器10，所述沖擊器10包括多個(gè)平臺(tái)20、30、 40,50...，這些平臺(tái)被布置為使得包括粒子(P)的氣流(A)通過入口 12進(jìn)入沖擊器10，并 在從該出口 14離開沖擊器10之前依次穿過每個(gè)平臺(tái)20、30、40、50...；其中通過具有孔22、32、42、52...的隔離物21、31、41、51...使每個(gè)平臺(tái)20、30、 40,50. · ·與相鄰平臺(tái)相分隔，該孔引導(dǎo)主要的氣流(A)朝向每個(gè)采集盤33、43、53...，安排 每個(gè)采集盤33、43、53...的主面使其基本上垂直于氣流(A)的流動(dòng)方向；該慣性沖擊器的 入口 12被連接到上述容器114的第一開口 112?？梢匀鐖D2中舉例說明的那樣設(shè)立采集系統(tǒng)。系統(tǒng)的較大部分位于恒溫室120中。 需要呼出粒子的個(gè)體通過雙向接口(110)吸入室內(nèi)空氣。吸氣后，吸入的空氣(A)穿過位 于所述接口之前的高效粒子過濾器(125)。將接口(110)保持在一定溫度，使得呼出的氣溶膠的大小分布不會(huì)因?yàn)樗羝?蒸發(fā)或冷凝而改變。呼出的空氣㈧通過接口(Iio)進(jìn)入位于恒溫室(120)中的系統(tǒng)，這同 樣也是為了保持氣溶膠的大小分布的目的。在室內(nèi)放置了用于呼出氣體的容器(114)。此 夕卜，將粒子計(jì)數(shù)器(116)連接到容器(114)的第一開口(112)以計(jì)算和測量粒子大小。用 于采集粒子(P)的慣性沖擊器(10)也被連到容器的第一開口(112)。穿過沖擊器(10)的流動(dòng)典型地是通過泵(115)保持的，所述泵位于恒溫室的外 面。圖2同樣顯示了氣體排放(130)并且加入了潮濕的不含粒子的氣體(135)。能夠測量數(shù)量-大小分布的粒子計(jì)數(shù)器(116)提供了額外的重要信息。這里 使用的粒子計(jì)數(shù)器是Gri_ 1.108光學(xué)粒子計(jì)數(shù)器(Gri_ AerosolTechnik, Ainring, Germany)，能夠計(jì)數(shù)以及對從0. 3到20微米之間的15個(gè)尺寸區(qū)間的粒子的大小進(jìn)行測量。 該儀器可提供所測量的氣溶膠的數(shù)量大小分布或從所測量的數(shù)量大小分布計(jì)算所得的質(zhì) 量分布。在該儀器中，充滿粒子的空氣以一種方式從小的、精確限定的、高強(qiáng)度照射的體積 中穿過，使得每次只有一個(gè)粒子被照射。被照射的粒子產(chǎn)生散射光脈沖，其強(qiáng)度被測量。由 于散射光的強(qiáng)度取決于粒子大小，因此可以在氣流中來對粒子計(jì)數(shù)并測量其大小。當(dāng)呼出氣流穿過相連的沖擊器(10)和粒子計(jì)數(shù)器(116)而流動(dòng)時(shí)，所述容器 (114)作為緩沖器，呼出的空氣體被存儲(chǔ)在其中。當(dāng)沒有呼氣發(fā)生時(shí)，該容器(114)給沖擊 器(10)和粒子計(jì)數(shù)器(116)提供空氣。潮濕的不具有粒子的空氣從容器(114)的第二開口 (113)加入，使得總是存在正排放流動(dòng)。該流動(dòng)通過位于容器(114)排放端的流量計(jì)(119) 來測量。通過以圖像方式呈現(xiàn)實(shí)時(shí)流動(dòng)，主體可以根據(jù)指示控制自己的呼吸頻率和強(qiáng)度。通過下述方式進(jìn)行采樣。假定沖擊器裝有干凈采集盤，而系統(tǒng)，尤其是沖擊器已經(jīng) 達(dá)到了所需要的溫度。首先流量計(jì)被歸零以允許正確測量流動(dòng)，然后潮濕的干凈空氣流量 被設(shè)定在一定值，使得在測量期間保持正的來自系統(tǒng)的流量。然后該沖擊器流量被設(shè)定在 低于該干凈空氣流量的值，在該過程期間，在盤上將不會(huì)收集到沉淀，因?yàn)榻o該系統(tǒng)供給了 干凈的不含粒子的空氣。然后，啟用光學(xué)粒子計(jì)數(shù)器并檢查沒有假的粒子存在，例如，指示 泄漏進(jìn)入系統(tǒng)中。然后開始呼氣到該系統(tǒng)中，粒子計(jì)數(shù)器連續(xù)不斷地每6秒就抽取樣本并產(chǎn)生大小分布，同時(shí)沖擊器采集樣本以用于之后的分析。當(dāng)已經(jīng)獲得了所需數(shù)量的樣本時(shí)，就終止采集，記錄采樣時(shí)間和呼出的體積。關(guān)閉通過沖擊器的流體，將沖擊器從測量系統(tǒng)上 移開，并回收裝載的盤。在系統(tǒng)的兩個(gè)組件是“相連的”的表述中，應(yīng)當(dāng)將其理解為空氣和呼出的粒子可在 兩個(gè)組件之間流動(dòng)。連接通常是采用管和合適的接頭、閥或密封件形成的，以引導(dǎo)氣體/粒 子流。該系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)的一種可能性是在不同的呼出速率下對不同級(jí)分中的粒子形成 進(jìn)行量化。這是一種非常簡單的用來探測湍流，例如哮喘中的湍流的方法，而且可被用作疾 病的標(biāo)記物。分析所述采集盤23、33、43、53以及它們相關(guān)的粒子P可以被從沖擊器10中取出，并且 可以分析上述粒子的化學(xué)成分。粒子P的化學(xué)成分提供對主體的醫(yī)學(xué)狀態(tài)的洞察(如下文 中醫(yī)學(xué)狀態(tài)部分描述的)。在一種分析策略中，對仍然位于采集盤上的粒子進(jìn)行分析。這種方法是通過如下 的化學(xué)分析技術(shù)完成的，這種技術(shù)提供了有關(guān)在粒子中出現(xiàn)的特定物質(zhì)的互補(bǔ)信息。飛行 時(shí)間二次離子質(zhì)譜儀(T0F-SIMS)對于分析質(zhì)量至多在IOOOu的物質(zhì)尤其有用，尤其是各種 不同類型的脂質(zhì)，其譜可隨各種醫(yī)學(xué)狀態(tài)而改變?；|(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜(MALDE-MS) 對于分析與炎癥反應(yīng)相關(guān)的肽和更大的大分子(各種蛋白)是合適的方法。通過應(yīng)用將 會(huì)把蛋白質(zhì)解離為能夠被測定的片段的蛋白水解酶、優(yōu)選胰蛋白酶，可進(jìn)一步方便對蛋白 進(jìn)行MALDI-MS鑒定，并且通過與公開的可用數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，其可用于結(jié)論性的蛋白質(zhì)鑒 定。對特定蛋白或其他生物分子(例如DNA)的分析可同樣通過將基于標(biāo)記抗體的不同生 物化學(xué)分析或?qū)嶒?yàn)方案直接應(yīng)用在采集盤上來完成。掃描電鏡(SEM)可以被用于對采集的 粒子聚集物的形態(tài)進(jìn)行分析。這樣的分析能夠揭示非生物來源的粒子，例如由于主體接觸 而產(chǎn)生的粒子。在另一分析策略中，將采集的物質(zhì)從采集盤上除去(沖洗)。可進(jìn)一步加工包括采 集粒子的沖洗溶液以用于不同的化學(xué)或生物化學(xué)分析技術(shù)。在最簡單的分析中，可以采用 TOC (總有機(jī)成分)分析器來分析采集的粒子中有機(jī)物質(zhì)的總量。使用不同元素分析器以獲 得采集物質(zhì)中碳、氮、氧和硫的含量，其本身又反映了不同類生物分子(脂質(zhì)、碳水化合物、 蛋白)的相對量。通過電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)可以測定痕量的無機(jī)元素，尤其 是金屬的量。這樣的分析將不僅提供關(guān)于非生物來源的物質(zhì)的信息，而且也可用來檢測在 特定疾病狀態(tài)下重要的含有金屬的生物分子(蛋白)例如鐵-反應(yīng)蛋白(IRP)。已經(jīng)顯示 在肺腫瘤組織中Cu和Zn增加了，并均在氣路中顯示出調(diào)控炎癥反應(yīng)的重要性。對于更多 生物分子的特異性分析，三種技術(shù)氣相色譜質(zhì)譜(GC-MS)、液相色譜質(zhì)譜(LC-MS)和直接的 MALDI-MS將會(huì)提供互補(bǔ)的信息。GC-MS將會(huì)提供關(guān)于在至多約500u的質(zhì)量范圍內(nèi)的半揮 發(fā)性物質(zhì)的信息。LC-MS將會(huì)提供有關(guān)不同生物分子，例如脂質(zhì)、肽和蛋白以及其修飾的定 量和定性信息。最后，直接的MALDI-MS可以被用于至多為幾個(gè)IOOOOu的生物分子的模式 檢測，允許你對脂質(zhì)和蛋白譜兩者進(jìn)行檢測和鑒定。也可對采集和沖洗的物質(zhì)進(jìn)行生物化 學(xué)分析，特別是對于特定感興趣蛋白的標(biāo)記抗體，或者進(jìn)行定量PCR分析，用于分析遺傳物 質(zhì)。
有幾種技術(shù)用來方便樣本處理并提高方法的靈敏性。在該方法中已經(jīng)呈現(xiàn)出的一個(gè)優(yōu)勢是使用表面解吸質(zhì)譜技術(shù)來直接分析取自沖擊器的采集盤的可能性。另一優(yōu)點(diǎn)是直 接在采集盤上凈化并修飾樣本，例如上述提到的酶，這被稱為盤上消解。也可在采集盤上創(chuàng) 造不同類型的表面，為了直接結(jié)合或修飾粒子樣本中的特定被分析物，所述采集盤已經(jīng)被 受體分子或酶共價(jià)修飾。這些方法是公知的并能夠被容易地使用在有機(jī)實(shí)驗(yàn)室中。這將可 觀地加速分析過程，并使得對大的病人組的研究變得切實(shí)可行。在通過質(zhì)譜方法鑒定新的生物標(biāo)記物后，可以引入新的分析儀器，例如表面等離 子體共振(SPR)和熒光光譜以便更容易地將所述分析放大到更大的群體組。這兩種方法更 容易被非專業(yè)人員使用，其使得在醫(yī)院或健康看護(hù)中心實(shí)施粒子采集方法變得更加可行， 并使得對大的病人組的研究更有時(shí)間效率。能夠使用直接來自沖擊器的采集盤是非常有利 的。上述提到的不同的質(zhì)譜(MS)技術(shù)具有不同的優(yōu)點(diǎn)，它們提供了有關(guān)采集的粒子 的組成的總括的信息。這意味著通過組合不同的MS技術(shù)，以非預(yù)定的方式可以檢測絕大部 分的生物分子。這與那些只能檢測預(yù)先選擇的或標(biāo)記的物質(zhì)的許多其它生化分析技術(shù)形成 對照。因此本發(fā)明的方法和MS技術(shù)的相容性是鑒別不同疾病的新的特異性生物標(biāo)記物的 一個(gè)重要優(yōu)點(diǎn)。將粒子的分析與對照化學(xué)分析進(jìn)行比較，可以鑒別與對照化學(xué)分析的偏差和/或 相似性。這可以被用于確定主體的一個(gè)或多個(gè)醫(yī)學(xué)狀態(tài)。對照化學(xué)分析可以來自具有某種 醫(yī)學(xué)狀態(tài)(在這種情況下尋找化學(xué)分析中的相似點(diǎn))或不具有某種醫(yī)學(xué)狀態(tài)(在這種情況 下尋找化學(xué)分析中的偏差)的主體，或者來自主體本身，不定期在不同的環(huán)境下取得(例 如，在另一時(shí)間點(diǎn)，或在某個(gè)治療或練習(xí)過程后)。通過在每個(gè)采集盤上對粒子分類來確定粒子分布譜。獲得的粒子分布譜可以被用 來確定主體中的一個(gè)或多個(gè)醫(yī)學(xué)狀態(tài)。如果將要作出診斷，則將由該主體呼出的粒子的粒 子分布譜與參考粒子分布譜進(jìn)行對比。記錄主體的粒子分布譜與參考粒子分布譜的相似性 和/或偏差，并將主體的粒子分布譜和參考粒子分布譜之間的相似性和/或偏差歸因于主 體的一個(gè)或多個(gè)醫(yī)學(xué)狀態(tài)。該參考粒子分布譜可以是來自不具有給定醫(yī)學(xué)狀態(tài)的主體的粒子分布譜。在該案 例中，可以記錄主體的粒子分布譜與參考粒子分布譜之間的偏差，提供了有關(guān)某種醫(yī)學(xué)狀 態(tài)的指征。該參考粒子分布譜備選地來自具有給定醫(yī)學(xué)狀態(tài)的主體?？梢杂涗浿黧w與病人的 粒子分布譜之間的相似性，導(dǎo)致對在主體中所述給定醫(yī)學(xué)狀態(tài)的診斷。該參考粒子分布譜同樣可來自主體本身，但在不同情形下獲取(例如，在另一時(shí) 間點(diǎn)，或在某個(gè)治療或練習(xí)過程后)。這將允許通過本發(fā)明的方法監(jiān)測醫(yī)學(xué)狀態(tài)。醫(yī)學(xué)狀態(tài)可 以通過本發(fā)明確定或監(jiān)測的醫(yī)學(xué)狀態(tài)包括-支氣管哮喘-囊性纖維化-慢性阻塞性肺疾病(COPD)-肺癌_間質(zhì)性肺疾病
_結(jié)節(jié)病_在系統(tǒng)性疾病例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)中的肺部負(fù)擔(dān)。-肺部感染ο 肺炎ο細(xì)菌定居ο病毒感染似乎其他系統(tǒng)性醫(yī)學(xué)狀態(tài)也可以被監(jiān)控例如-心力衰竭(例如內(nèi)皮素-1)
_高膽固醇血癥(在呼出粒子中發(fā)現(xiàn)膽固醇)_糖尿病(在粒子中發(fā)現(xiàn)胰島素)-新陳代謝綜合癥-對疾病或接觸增加的遺傳易感性所述粒子可以包括或由指示特定醫(yī)學(xué)狀態(tài)的生物標(biāo)記物組成。依據(jù)本發(fā)明的方法 允許檢測這樣的生物標(biāo)記物。人們認(rèn)為呼出的粒子源自于覆蓋整個(gè)呼吸道上皮細(xì)胞的呼吸道上皮粘液(RTLF) [Pediatr Allergy Immunol 15(1) :4_19]，其含有大量的抗氧化劑和表面活性劑。人們也 應(yīng)當(dāng)謹(jǐn)記從氣管的近端到末端RTLF的組分發(fā)生變化。豐富地存在于RTLF中的一種物質(zhì)是克拉拉細(xì)胞蛋白16(CC16)，也作為一種由克 拉拉細(xì)胞產(chǎn)生的抗炎癥蛋白而發(fā)揮作用。到現(xiàn)在為止，已經(jīng)只在BAL和血液中測量了 CC16。 迄今為止贏得關(guān)注的其他物質(zhì)是表面活性蛋白A-D，其同樣僅在支氣管肺泡灌洗BAL中被 檢測。受到特別關(guān)注的是探測和監(jiān)測粒子中的抗氧化劑的濃度。一種可能的生物標(biāo)記物 是在呼吸道中以高豐度存在的谷胱甘肽。其他在呼出液滴中作為可能的生物標(biāo)記物的抗氧 化劑是結(jié)合金屬的蛋白血漿銅藍(lán)蛋白和鐵傳遞蛋白，這些有可能采用基質(zhì)輔助激光解吸電 離質(zhì)譜(MALDI MS)測量。其他具有低分子量的潛在的抗氧化劑，例如抗壞血酸鹽、α-生 育酚、尿酸鹽以及L-半胱氨酸，同樣有可能采用質(zhì)譜方法來檢測，這些分子同樣是氧化應(yīng) 激的生物標(biāo)記物。作為抗氧化劑直接參與氧化應(yīng)激的潛在的生物標(biāo)記物是谷胱甘肽、血漿銅藍(lán)蛋 白、鐵傳遞蛋白、抗壞血酸鹽、α-生育酚、尿酸鹽以及L-半胱氨酸。谷胱甘肽尤其令人關(guān) 注，因?yàn)?，其在呼吸道中高度豐富地存在。用于探測這些抗氧化劑的分析方法是質(zhì)譜。a.脂質(zhì)RTLF中的磷脂譜可作為疾病的生物標(biāo)記物。已經(jīng)在大多數(shù)呼吸道疾病中看到了 磷脂成分(PC)的改變，例如在急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、肺炎、囊性纖維化以及哮喘中。 在哮喘中，在BAL中PC減少了，并且已經(jīng)顯示在過敏原刺激后PC/磷脂酰甘油(PG)之間的 關(guān)系發(fā)生改變。在呼吸道疾病中新的正在形成的研究領(lǐng)域還有脂質(zhì)的硝化和氧化，這可以改變它 們的功能。RTLF中的表面活性劑，包括磷脂和蛋白，被認(rèn)為在天然免疫系統(tǒng)中起重要作用。磷 脂是在天然免疫中活性的多種細(xì)胞因子例如前列腺素、凝血氧烷、嗜酸細(xì)胞活化趨化因子(extaxins)、脂氧素、溶解素(resolvins)等的前體。同樣也顯示表面活性蛋白在天然免疫、以及其他作為抗原呈遞細(xì)胞發(fā)揮作用的事情中和控制細(xì)胞死亡中扮演重要角色。關(guān)于 表面活性劑的新陳代謝的知識(shí)到現(xiàn)在為止都非常有限，但對于理解呼吸道疾病的發(fā)病機(jī)理
非常重要。使用TOF-SIMS對硅采集盤的表面分析已經(jīng)揭示了在呼出粒子中廣泛的磷脂。在 粒子中檢測到的磷脂與在BAL研究中在RTLF中發(fā)現(xiàn)的磷脂一致。磷脂的相對量同樣和BAL 一致。磷脂的相對量同樣和BAL—致。在患有哮喘和囊性纖維化的病人中CN-+CN0-(假定 主要來自蛋白和肽的片段)與P03-的比值升高了。該比值可以反映由于呼吸道疾病，血漿 蛋白滲漏到氣室中。b.蛋白質(zhì)和肽對支氣管灌洗樣本的蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了在樣本中存在多種蛋白質(zhì)。這項(xiàng)分析 是使用二維凝膠和質(zhì)譜進(jìn)行的。蛋白參與了其中的免疫應(yīng)激過程、細(xì)胞生長、氧化劑-抗氧 化劑以及蛋白酶-抗蛋白酶系統(tǒng)以及具有未知功能的蛋白質(zhì)。例如，已經(jīng)針對過敏性哮喘 病人進(jìn)行了 BAL的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。在該項(xiàng)研究中，在病人中鑒別出1592種蛋白，其中有 160種蛋白的表達(dá)與對照組有差異。最豐富的蛋白是血漿蛋白，其可能源于來自氣血屏障的 擴(kuò)散。血漿蛋白的增多可能由于滲出或損傷。很可能的是在BAL中檢測出的幾種肽和蛋白 也存在于呼出的粒子中。在呼吸道中作為疾病的生物標(biāo)記物的肽和蛋白包括內(nèi)皮素-1、白細(xì)胞介素_4、干 擾素-g、表面活性蛋白A-D和克拉拉細(xì)胞蛋白16等。能夠采用電噴霧質(zhì)譜ESI-MS和電離 質(zhì)譜方法MALDI-MS或通過免疫檢驗(yàn)檢測這些分子。在本發(fā)明中有很高的概率將會(huì)檢測出 更多類型的生物標(biāo)記物，因?yàn)槭占Ｗ颖仁褂煤舫龅暮粑鼩饫淠盒矢?，在后者中?集了較小數(shù)量的粒子。使用諸如胰島素這樣的蛋白水解酶對采集的樣本進(jìn)行處理，將產(chǎn)生 幾個(gè)肽片段，這些片段將形成一個(gè)模式，其對于某個(gè)特定的蛋白組是獨(dú)特的。對蛋白的翻譯后修飾例如磷酸化和糖基化的研究也可是生物標(biāo)記物的潛在目標(biāo)。 已知錯(cuò)誤的磷酸化模式是幾種疾病的一部分。在呼吸道中的另一類重要生物標(biāo)記物是粘蛋白糖蛋白，其有助于粘膜纖毛保護(hù)呼 吸道免受病原體和環(huán)境毒素侵害的防御。對于患有哮喘、慢性阻塞性肺病COPD和囊性纖維 化的患者，存在著粘蛋白糖蛋白的過表達(dá)。盡管由于糖蛋白的多樣化的糖基化模式，對糖蛋 白的分析有一些困難，但是追蹤這組化合物還是很有價(jià)值的，因?yàn)樗鼈兣c不同的呼吸道疾 病有關(guān)。在分析糖蛋白時(shí)的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它們很容易用親和色譜法進(jìn)行提純。而且可能在觀 測的蛋白糖基化模式中的變化將和疾病有關(guān)，因此應(yīng)考慮將其作為潛在的生物標(biāo)記物。c.細(xì)胞物質(zhì)和基因表達(dá)很可能呼出的粒子含有細(xì)胞或者細(xì)胞結(jié)構(gòu)，這些細(xì)胞或細(xì)胞結(jié)構(gòu)含有攜帶遺傳信 息的物質(zhì)，特別是DNA和RNA。這些細(xì)胞物質(zhì)可能來自細(xì)菌、病毒或呼吸道的細(xì)胞。對該物 質(zhì)的遺傳表達(dá)的分析可以提供有關(guān)診斷特定疾病的病理學(xué)的新信息，或者被用作為診斷某 些疾病的高度特異性的并且高敏感的工具。因此該方法能夠被用于鑒別在諸如肺炎和慢性 阻塞性肺病COPD的惡化等疾病中的病原體，還能被用于對例如在經(jīng)常是臨床問題的囊性 纖維化的定居的銅綠假單胞菌早期檢測中。d.金屬
在EBC中跟蹤對金屬例如鐵、鎘、鉛、鋁、銅的接觸也已經(jīng)是可能的。金屬最有可能被運(yùn)輸?shù)脚c呼出的粒子結(jié)合的EBC上。這暗示這種方法同樣具有監(jiān)測接觸空氣污染的各種 成分，例如鐵、鋅、鎘或鋁的可能性。與周圍納米粒子中的金屬接觸也已經(jīng)被與呼吸道疾病 的發(fā)展相關(guān)聯(lián)。
實(shí)施例將來自四個(gè)健康主體的呼出的粒子采集在硅晶片上。利用光學(xué)粒子計(jì)數(shù)器(Grimm 1. 108)記錄了粒子的濃度。為了獲得高粒子產(chǎn)量，進(jìn)行了受迫的呼氣(使用鼻夾)。訓(xùn)練 主體以進(jìn)行重復(fù)的不間斷呼氣，其對應(yīng)于在1秒內(nèi)主體個(gè)體最大受迫呼氣容量(FEVl)的 80%。可以接受距離目標(biāo)流量10%的偏差。在第1天早晨在15分鐘內(nèi)進(jìn)行采樣，并在第2 天以相似的方式重復(fù)采樣。通過飛行時(shí)間二次離子質(zhì)譜(TOF-SIMS IV IONTOF GmbH)分析在硅晶片上呼出的 粒子的化學(xué)組成。使25keV Bi3+ —次離子在圍繞粒子的斑為中心的面積為500 X 500 μ m2的 區(qū)域上進(jìn)行光柵化。采用針對最大分辨率優(yōu)化的儀器來記錄正負(fù)二次離子的質(zhì)譜。來自全 部的分析區(qū)域或來自選定感興趣區(qū)域的光譜以及所選離子的圖像都是采用儀器軟件從記 錄的原始數(shù)據(jù)文件中提取的。通過與來自純物質(zhì)和來自其他質(zhì)譜方法的公開數(shù)據(jù)的對照光 譜相比較來確定光譜中峰的歸屬，也可通過與理論同位素模式相比較來控制該歸屬。確定 的峰的相對強(qiáng)度是通過在各自的光譜上對總粒子強(qiáng)度進(jìn)行歸一化來計(jì)算出。圖3顯示來自一個(gè)對照主體的粒子斑的正(圖3A)和負(fù)(圖3B) TOF-SIMS光譜。圖4是來自一個(gè)對照主體的呼出粒子的一個(gè)斑的TOF-SIMS圖。圖5顯示呼出的粒子(0. 5-2. Oym)的濃度和時(shí)間的關(guān)系圖。圖6顯示在對健康主體和患有哮喘或囊性纖維化病人的先導(dǎo)研究中的比值 (CN+CNO)/PO3^表1.呼出的粒子的TOF-SIMS光譜峰的m/z比例值的歸屬。磷脂分子種類被稱為 x:a，其中χ代表碳原子數(shù)，a代表雙鍵的數(shù)目。正離子負(fù)離子歸屬m/z 歸屬 m/z磷酸膽堿離子 184 C16:l 253膽固醇-OH369 C16:0 255PC 片段476 C18:l 281PC 片段478 C18:0 283PC 片段494 PA32 1 645PC 片段522 PA32 0 647PC 片段524 PG 28:1 663PC 片段650 PG 28:0 665PC 28 0+H 678 PG34:2 671PC 片段680 PA34:1 673PC 30:0+H 706 PG32:0 721PC 32:1+H 732 PG34:1 747
PC 32:0+H 734 PG36:2 773PC 34:1+H 760 PG36:1 775PC 34:0+H 762 PI34:2 833PI34:1 835PI36:2 861PI36:1 863表2. 15分鐘采樣期內(nèi)的總呼出體積和平均呼出粒子(0. 5-2. Oym)濃度主體1主體2主體3主體4FEV14. 1 FEV12.8 FEV13. 2 FEV13. 2第1天第2天第1天第2天第1天第2天第1天第2天體積(公升)153128 176 181 142 144 201 166粒子/ 公升 210 123 149 55 956 343 239 180所有的粒子樣本均給出來自磷脂的強(qiáng)烈信號(hào)(圖2和4以及表1)。以正離子模式 的不同種的磷脂酰膽堿(PC) 了呈質(zhì)子化或堿金屬陽離子化的分子離子形式的不同種的磷 脂酰擔(dān)堿(PC)，而以陰離子模式檢測了呈去質(zhì)子化離子形式的磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌 醇(PI)和磷脂酸(PA)，表1。磷脂的組成與先前在支氣管肺泡灌洗(BAL)液中發(fā)現(xiàn)的相一 致，這指示呼出的粒子最有可能源自于下呼吸道。實(shí)施例2.培訓(xùn)主體使其進(jìn)行重復(fù)的連續(xù)呼吸，該呼吸對應(yīng)于在1秒內(nèi)主體個(gè)體最 大受迫呼出容量(FEVl)的80%。讓四名健康的志愿者、四名哮喘病人和四名患有囊性纖維 化的病人分別進(jìn)行10次受迫呼氣。將大小在0.5-2. Oym的呼出粒子采集在硅晶片上。光 學(xué)計(jì)數(shù)器實(shí)時(shí)地測量粒子的濃度。在取樣前施加3分鐘的不含粒子氣體的呼吸氣的沖洗階 段。使用飛行時(shí)間二次離子質(zhì)譜(T0F-SIMS)來分析硅晶片。在粒子中檢測到幾個(gè)類別的 磷脂磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酸(PA)。在組之間觀察 到一些差別。與對照組相比，在哮喘病人以及患有囊性纖維化的病人中PC信號(hào)總量和PG 信號(hào)總量的比例傾向于升高了。同樣，與對照組相比，與哮喘病人和患有囊性纖維化的病人 樣品中的磷脂相比，已知特征性的蛋白和肽(CN0_)的信號(hào)升高了(圖6)。實(shí)施例3.主體在20分鐘內(nèi)進(jìn)行受迫呼氣。將大小在0.5-2. Ομπι的呼出粒子收集在硅晶片上。使用熒光試劑DAPI (4，6- 二脒基2-苯基吲哚對硅晶片染色)，該試劑強(qiáng)烈 地結(jié)合到DNA和RNA上。在粒子斑中獲得了強(qiáng)烈的信號(hào)，指示呼出的粒子含有核酸。實(shí)施例4.兩個(gè)主體呼出150L空氣兩次；一次用于采集粒子，另一次用于呼吸氣冷 凝液采集。從硅晶片上解收呼出的粒子，并且將呼吸氣冷凝液濃縮，然后通過ELIZA分析表 面活性蛋白Α。在呼出的粒子中表面活性蛋白A(SpA)的總量比在呼出的呼吸氣冷凝液中測 得的要高6倍，并且比在100 μ L血清中的要高4倍。在檢測(對兩個(gè)主體在三種不同情況 下測試CV 5.4)時(shí)，對Sp A的分析顯示了高的個(gè)體內(nèi)的重復(fù)再現(xiàn)性。開發(fā)的采樣方法對于在呼出的氣體中檢測新的生物標(biāo)志物以及監(jiān)測呼吸道疾病 具有高的潛力。
權(quán)利要求
一種用于確定主體的醫(yī)學(xué)狀態(tài)的方法，所述方法包括下列步驟a.采集由所述主體呼出的粒子；b.依據(jù)所述粒子的質(zhì)量或大小對所述粒子進(jìn)行分類，g.分析所述粒子的化學(xué)成分，這樣允許確定該主體的醫(yī)學(xué)狀態(tài)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括下列步驟a.依據(jù)所述粒子的質(zhì)量或大小對所述粒子進(jìn)行分類來獲得所述粒子的粒子分布譜；b.比較由所述主體呼出的粒子的粒子分布譜和參考粒子分布譜；c.記錄所述主體的粒子分布譜和所述參考粒子分布譜之間的相似性和/或偏差；d.將主體的粒子分布譜和參考粒子分布譜之間的相似性和/或偏差歸因于所述主體 中的一個(gè)或多個(gè)醫(yī)學(xué)狀態(tài)；并任選地，e.分析所述粒子的化學(xué)成分。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的醫(yī)學(xué)狀態(tài)選自支氣管哮喘、囊性纖維化、慢性阻 塞性肺疾病(C0PD)、間質(zhì)性肺疾病、結(jié)節(jié)病、在系統(tǒng)性疾病例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)中的 肺部負(fù)擔(dān)、肺部感染例如肺炎、細(xì)菌定居或病毒感染、心力衰竭(例如內(nèi)皮素-1)、高膽固醇 血癥(在呼出粒子中發(fā)現(xiàn)膽固醇)、糖尿病(在粒子中發(fā)現(xiàn)胰島素)、新陳代謝綜合癥、對疾 病或接觸增加的遺傳易感性。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述的醫(yī)學(xué)狀態(tài)選自支氣管哮喘、囊性纖維化、慢性阻 塞性肺疾病(C0PD)、間質(zhì)性肺疾病、結(jié)節(jié)病、在系統(tǒng)性疾病例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)中的 肺部負(fù)擔(dān)、肺部感染例如肺炎、細(xì)菌定居或病毒感染。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或4中任一項(xiàng)的方法，其中所述參考粒子分布譜是從不具有給定的 醫(yī)學(xué)狀態(tài)的主體獲得的，并且步驟e.涉及記錄主體的粒子分布譜和參考粒子分布譜之間 的偏差。
6.根據(jù)權(quán)利要求2或4-5中任一項(xiàng)的方法，其中所述參考粒子分布譜來自具有給定醫(yī) 學(xué)狀態(tài)的病人，并且步驟e.涉及記錄所述主體和所述病人的粒子分布之間的相似性，導(dǎo)致 確定所述主體中的所述給定的醫(yī)學(xué)狀態(tài)。
7.一種用于提供呼出的呼吸氣粒子的粒子分布譜的方法，該方法包括下列步驟a.采集由主體呼出的粒子；并且b.依據(jù)所述粒子質(zhì)量或大小對所述粒子進(jìn)行分類以獲得所述粒子的粒子分布譜。
8.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中使用慣性沖擊器(10)根據(jù)粒子的質(zhì)量 對粒子進(jìn)行分類。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述沖擊器(10)具有入口(12)和出口(14)，該 沖擊器(10)包括多個(gè)平臺(tái)(20、30、40、50…)，安排所述平臺(tái)使得包括粒子(P)的氣流(A) 通過入口(12)進(jìn)入沖擊器(10)并在通過所述出口(14)離開沖擊器(10)之前依次穿過每 個(gè)平臺(tái)(20、30、40、50…)；其中通過隔離物(21、31、41、51…)使每個(gè)平臺(tái)(20、30、40、50…)與相鄰平臺(tái)相分隔， 該隔離物具有孔(22、32、42、52…)，所述孔引導(dǎo)所述氣流(A)朝向采集盤(33、43、53…)，安 排每個(gè)采集盤(33、43、53"0的主面使其基本上垂直于所述氣流(A)的流動(dòng)方向；從而，呼出的粒子以氣流(A)形式穿過所述慣性沖擊器(10)；使得引導(dǎo)主要的氣流(A)依次朝向每個(gè)平臺(tái)(20、30、40、50…)中的每個(gè)采集盤(23、33、43、53…)；使得至少位于第 一平臺(tái)(30)中的第一采集盤(33)采集第一質(zhì)量的粒子，而至少位于第二平臺(tái)(40)中的第 二采集盤(43)采集第二質(zhì)量的粒子。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的方法，其中使用粒子計(jì)數(shù)器(116)根據(jù)粒子大小 對粒子進(jìn)行分類。
11.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中，在依據(jù)粒子質(zhì)量或大小進(jìn)行分類后， 在從采集盤上首先沖洗或不從采集盤上首先沖洗的情況下，通過至少一種分析技術(shù)對粒子 進(jìn)行分析，所述分析技術(shù)選自飛行時(shí)間二次離子質(zhì)譜(TOF-SIMS)、基質(zhì)輔助的激光解吸 電離質(zhì)譜(MALDI-MS)、基于標(biāo)記抗體的生化檢測或方案、定量的PCR分析、掃描電子顯微鏡 (SEM)、氣相色譜質(zhì)譜(GC-MS)、液相色譜質(zhì)譜(LC-MS)、表面等離子體共振(SPR)、熒光光 譜、TOC(總有機(jī)物含量)分析、元素分析以及電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)。
12.一種用于對呼出的粒子進(jìn)行采集和分類的系統(tǒng)(100)，該系統(tǒng)包括a.具有第一開口(112)和第二開口 (113)的容器(114)；b.連接到所述容器(114)的第一開口(112)的雙向接口(110)；c.具有進(jìn)口(12)和出口 (14)的慣性沖擊器(10)，該沖擊器(10)包括多個(gè)平臺(tái)(20、 30、40、50…)，安排所述平臺(tái)使得包括粒子⑵的氣流㈧通過入口(12)進(jìn)入沖擊器(10)， 并在通過所述出口(14)離開沖擊器(10)之前依次穿過每個(gè)平臺(tái)(20、30、40、50…)；其中通過具有孔(22、32、42、52…)的隔離物(21、31、41、51…)使每個(gè)平臺(tái)(20、30、 40,50···)與相鄰平臺(tái)相分隔，該孔引導(dǎo)主要?dú)饬?A)朝向采集盤(33、43、53…)，安排每個(gè) 采集盤(33、43、53···)的主面使其基本上垂直于氣流(A)的流動(dòng)方向；該慣性沖擊器的入口 (12)被連接到所述容器(114)的第一開口(112)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的系統(tǒng)(100)，其中每個(gè)平臺(tái)(20、30、40、50…)包括適用于 探測被分析物的采集盤(33、43、53…)，其與其它平臺(tái)(20、30、40、50…)中的采集盤(33、 43、53…)不同。
14.一種適用于權(quán)利要求12或13的系統(tǒng)(100)中的采集盤(33、43、53…)。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的采集盤(33、43、53…)，其中通過涂覆一種物質(zhì)例如疏水性 物質(zhì)或抗體對其至少一個(gè)表面進(jìn)行修飾。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的采集盤(33、43、53…)，其包括電連接，該電連接使得 能夠探測到響應(yīng)于粒子結(jié)合到該采集盤而發(fā)生的采集盤(33、43、53···)的電流或電容的改 變。
全文摘要
動(dòng)物體在呼吸時(shí)呼出粒子。粒子的性質(zhì)和數(shù)量能夠指示某種醫(yī)學(xué)狀態(tài)。因此可以采集粒子，依據(jù)大小或質(zhì)量對其進(jìn)行分類并它們可被用于對一種或多種醫(yī)學(xué)狀態(tài)的診斷中。本發(fā)明提供了一種用于對呼出的粒子進(jìn)行采集和分類的方法和系統(tǒng)以及使用所述呼出粒子進(jìn)行診斷的方法。
文檔編號(hào)G01N33/497GK101827558SQ200880110004
公開日2010年9月8日 申請日期2008年10月1日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月2日
發(fā)明者埃弗特·揚(yáng)斯特羅姆, 安娜-卡林·奧林, 安娜-夏洛特·阿爾姆斯特蘭德, 朱卡·勞斯馬 申請人:安娜-卡林·奧林;安娜-夏洛特·阿爾姆斯特蘭德;朱卡·勞斯馬;埃弗特·揚(yáng)斯特羅姆