專利名稱：以蛋白中色氨酸殘基為Forster共振能量轉(zhuǎn)移供體的均相親和分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明利用在小分子熒光標(biāo)記配體(或半抗原)作為分析探針與蛋白結(jié)合形成的復(fù)合物 中，蛋白色氨酸殘基與探針之間發(fā)生Forster共振能量轉(zhuǎn)移(Forster-resonance-energy-transfer, FRET)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的色氨酸熒光被猝滅而下降并伴隨產(chǎn)生探針的特征性熒光發(fā)射而升高， 據(jù)此建立不需分離結(jié)合和游離探針的均相熒光親和分析方法；此均相熒光親和分析方法可用
于測(cè)定混合物中的蛋白含量、配體與蛋白的親和力、高親和力配體的含量等，在實(shí)驗(yàn)診斷、 配體類藥物篩選等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用。
發(fā)明的
背景技術(shù)：
在生物醫(yī)藥領(lǐng)域選擇性測(cè)定混合物中的特定蛋白、蛋白與配體的親和力、特定配體或半 抗原的含量是重要的基礎(chǔ)工作；這些測(cè)定通常依賴于蛋白同特殊配體、半抗原或抗原的高選 擇性結(jié)合生成復(fù)合物，稱為親和分析。目前，親和分析選擇性測(cè)定混合物中的特定蛋白主要 用單抗作為探針測(cè)定蛋白抗原含量，如酶聯(lián)免疫測(cè)定、放射免疫測(cè)定等；但這兩類技術(shù)都需 分離結(jié)合的抗體探針與游離的抗體探針，操作繁瑣而效率低，且使用同位素的危害大。親和 分析測(cè)定蛋白與配體的親和力可采用放射性同位素標(biāo)記配體結(jié)合法、熒光極化法、Forster共 振能量轉(zhuǎn)移(FRET)法等。其中，使用同位素標(biāo)記配體為探針的方法也需分離結(jié)合與游離的探 針、操作效率低且危害大，而熒光極化法和FRET法都不需分離結(jié)合與游離的標(biāo)記配體探針， 屬于均相親和分析；但熒光極化法靈敏度低，F(xiàn)RET需用特殊熒光基團(tuán)分別修飾相應(yīng)蛋白和參 考配體構(gòu)成對(duì)應(yīng)的FRET供體(donor)和接受體(acceptor)，顯然對(duì)蛋白進(jìn)行修飾容易改變蛋白 的功能且需要成本。因此，現(xiàn)有均相熒光親和分析方法仍然有不足之處。
FRET法用于均相親和分析靈敏度通常較高。因此，如果不需用特殊的熒光團(tuán)標(biāo)記蛋白質(zhì) 就能以FRET為基礎(chǔ)進(jìn)行均相親和分析測(cè)定對(duì)應(yīng)蛋白含量、配體親和力和配體當(dāng)量，則無(wú)疑 是一種更理想的均相熒光親和分析方法。發(fā)明內(nèi)容概述
本發(fā)明旨在利用天然蛋白質(zhì)中色氨酸殘基為其內(nèi)在FRET供體從而避免對(duì)蛋白的修飾需 求，同時(shí)設(shè)計(jì)對(duì)此蛋白有高特異性結(jié)合能力且?guī)в刑厥鉄晒鈭F(tuán)的配體作為相應(yīng)的FRET接受 體(此后稱為天然蛋白的FRET探針)，使得在此FRET探針同該蛋白的復(fù)合物中，由于色氨酸 殘基與探針中熒光團(tuán)的距離比在溶液中游離狀態(tài)時(shí)顯著縮短，從而可有效發(fā)生FRET，使被選 擇性激發(fā)的色氨酸殘基可將能量轉(zhuǎn)移到熒光配體上的熒光團(tuán)，造成色氨酸殘基的熒光被猝滅 而下降，同時(shí)探針熒光團(tuán)發(fā)射特有的熒光信號(hào)，建立起對(duì)應(yīng)的均相熒光親和分析體系。
發(fā)生FRET要求供體的熒光發(fā)射光譜與接受體的熒光激發(fā)光譜有效重疊，供體相對(duì)于接 受體有所需相對(duì)取向，供體熒光團(tuán)相對(duì)于接受體熒光團(tuán)的距離需要足夠近。蛋白分子足夠大 時(shí)通常含有一定數(shù)量色氨酸殘基，并在280 nm附近激發(fā)時(shí)產(chǎn)生發(fā)射峰位于340 nm附近的特 殊熒光，故蛋白質(zhì)中的色氨酸殘基可作為內(nèi)在的FRET供體。如果FRET探針與蛋白之間沒 有特異性相互作用，則探針與任何蛋白分子溶液中均勻分布；FRET探針與蛋白濃度處在微摩 爾每升水平時(shí)，探針與蛋白任何氨基酸殘基之間的穩(wěn)態(tài)距離都在100 nm左右。發(fā)生FRET 通常要求相應(yīng)供體與接受體之間的距離在7.0 nm以內(nèi)； 一般蛋白的形狀為球狀且直徑小于7.0 nm，通常蛋白中色氨酸殘基含量可達(dá)到2%左右，而且接近均勻分布在整個(gè)構(gòu)象空間。因此， 以色氨酸殘基為內(nèi)在FRET供體而分析探針為FRET接受體，如蛋白與FRET探針之間沒有 相互作用則FRET探針與蛋白色氨酸殘基之間不能發(fā)生有效的FRET;當(dāng)FRET探針與蛋白發(fā) 生特異相互作用生成復(fù)合物后，復(fù)合物內(nèi)探針熒光團(tuán)與蛋白色氨酸殘基之間的距離就可遠(yuǎn)小 于7.0nm，從而可發(fā)生有效的FRET。因此，只要獲得滿足要求的熒光標(biāo)記配體作為天然蛋白 的FRET探針，就可建立起以天然蛋白中色氨酸殘基為內(nèi)在FRET供體，以探針FRET熒光 升高或蛋白色氨酸殘基熒光猝滅為檢測(cè)信號(hào)且對(duì)含有色氨酸殘基蛋白通用的均相熒光親和分 析系統(tǒng)，其不需對(duì)蛋白進(jìn)行任何修飾，測(cè)定蛋白含量時(shí)不需要競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，具有明顯優(yōu)勢(shì)。
為增強(qiáng)蛋白與FRET探針形成復(fù)合物前后均相反應(yīng)體系的熒光信號(hào)變化，需選擇性激發(fā) 均相親和反應(yīng)體系中蛋白質(zhì)色氨酸殘基而避免直接激發(fā)FRET探針，且所用探針可有效通過(guò) FRET猝滅色氨酸殘基的熒光，故所用天然蛋白的FRET探針在色氨酸殘基的有效激發(fā)波長(zhǎng)下 應(yīng)為激發(fā)谷，而在蛋白質(zhì)色氨酸殘基發(fā)射峰附近為激發(fā)峰；如FRET探針與蛋白結(jié)合后其熒 光量子產(chǎn)率更高或發(fā)射光譜顯著不同，則此系統(tǒng)的靈敏度越高；天然蛋白中FRET探針結(jié)合 位點(diǎn)附近的色氨酸殘基越多，則其靈敏度也可更好。相應(yīng)地，滿足上述要求的熒光標(biāo)記基團(tuán) 主要是萘胺和香豆素衍生物，而考慮其穩(wěn)定性則萘胺衍生物更好，可用衍生物結(jié)構(gòu)如圖l。另一方面，天然蛋白的FRET探針用于均相熒光親和分析，其與目標(biāo)蛋白結(jié)合的特異性 越高越好；FRET探針同寡聚體蛋白的結(jié)合盡量不出現(xiàn)變構(gòu)效應(yīng)。同時(shí)，用于測(cè)定蛋白含量的 FRET探針與目標(biāo)蛋白親和力越高越好；用于測(cè)定配體親和力的FRET探針與靶蛋白的親和力 應(yīng)較高，但最好低于待測(cè)配體親和力；用于測(cè)定配體含量的FRET探針與蛋白的親和力應(yīng)較 高，但是必須顯著低于待測(cè)配體的親和力，且比待測(cè)配體越低越好。顯然，設(shè)計(jì)低親和力FRET 探針容易，而設(shè)計(jì)高親和力FRET探針的較難。
對(duì)于配體結(jié)合域與溶劑相通的蛋白，其FRET探針設(shè)計(jì)較為容易，可為識(shí)別基團(tuán)與滿足 要求熒光團(tuán)的加合物，例如鏈親和素和親和素等蛋白。對(duì)于配體結(jié)合域深入到蛋白構(gòu)象內(nèi)部 造成被結(jié)合的配體包埋在內(nèi)部的蛋白，需據(jù)配體結(jié)合域的構(gòu)象特點(diǎn)設(shè)計(jì)所需FRET探針。萘 胺熒光團(tuán)體積較小，對(duì)包埋在內(nèi)部的FRET探針也可用。更重要的是，通常配體結(jié)合域包埋 了配體時(shí)此結(jié)合域就越接近于蛋白三維構(gòu)象空間的中部，這樣結(jié)合的配體與色氨酸殘基之間 的距離就較近，有利于發(fā)生更強(qiáng)的FRET;同時(shí)，這種情況下疏水相互作用對(duì)配體的結(jié)合貢獻(xiàn) 大，對(duì)應(yīng)的結(jié)合域中容易出現(xiàn)色氨酸殘基，這也使得FRET效應(yīng)容易增強(qiáng)。因此，利用蛋白 的三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)所需要的FRET探針是有效策略。
用FRET探針通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定候選配體親和力時(shí)需避免候選配體散射信號(hào)干擾。用280 nm附近紫外光激發(fā)時(shí)有對(duì)稱結(jié)構(gòu)的配體在450 nm附件會(huì)產(chǎn)生散射信號(hào)，水在310nm附件也 會(huì)產(chǎn)生散射信號(hào)。但散射信號(hào)通常比相同濃度下的熒光信號(hào)低得多；當(dāng)所用候選配體濃度接 近于FRET探針濃度時(shí)其散射信號(hào)一般很弱。只要所用FRET探針親和力比較低，則通過(guò)競(jìng) 爭(zhēng)結(jié)合可測(cè)定高親和力配體的親和力。同時(shí)，所用FRET探針的熒光量子產(chǎn)率越高則熒光信 號(hào)比散射信號(hào)越強(qiáng)，則體系的抗干擾能力越強(qiáng)。另外，通常在280nm激發(fā)時(shí)，候選配體的散 射信號(hào)峰在400 nm以上，且對(duì)測(cè)定340nm熒光的干擾相對(duì)較小。所以，只要用適當(dāng)高的耙 蛋白濃度產(chǎn)生足夠的340nm熒光信號(hào)，且所設(shè)計(jì)的FRET探針能猝滅絕大部分的340nrn熒光， 則檢測(cè)候選配體與探針競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合過(guò)程中的蛋白熒光猝滅，仍可測(cè)定候選配體的親和力。
為便于合成所需FRET探針，將萘胺熒光團(tuán)活化成特定形式，以便與常見的蛋白結(jié)合基 團(tuán)連接成所需要的探針，包括將萘胺對(duì)應(yīng)羧酸衍生物生成N-羥基琥珀酰亞胺酯、生成萘胺的 伯氨或伯醇衍生物；在萘胺N的對(duì)位還可用所需要的取代基團(tuán)以調(diào)節(jié)與蛋白結(jié)合的親和力。 通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)，可以獲得所需要的FRET探針，從而以與天然蛋白的色氨酸殘基之間 發(fā)生FRET為基礎(chǔ)建立起均相熒光親和分析系統(tǒng)。應(yīng)用實(shí)施例
實(shí)施例l:用FRET探針測(cè)定鏈親和素含量
1. 設(shè)計(jì)和合成鏈親和素的FRET探針
(1) a-萘替乙二胺與生物素的N-羥基琥珀酰亞胺酯反應(yīng)，產(chǎn)物用乙醚沉淀和洗滌后，過(guò) 硅膠柱，用含7%甲醇的氯仿洗脫；產(chǎn)物用高分辨質(zhì)譜和NMR鑒定確認(rèn)，產(chǎn)物簡(jiǎn)稱 為BNEDA;結(jié)構(gòu)如圖2所示。
(2) 用丹磺酰氯和30倍乙二胺在二氯甲垸中反應(yīng)，產(chǎn)物用水洗滌，干燥后過(guò)硅膠柱，用 含7%甲醇的氯仿洗脫；產(chǎn)物用高分辨質(zhì)譜確認(rèn)，以下稱為DEDA;再用生物素的N-羥基琥珀酰亞胺酯與DEDA反應(yīng)，純化，高分辨質(zhì)譜和NMR確認(rèn)，結(jié)構(gòu)如圖2。
2. 建立基于檢測(cè)FRET探針BNEDA特有熒光為基礎(chǔ)的均相熒光親和分析系統(tǒng)
(1) 反應(yīng)體系為0.1Omol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.0,用0.5 jxm微孔濾膜過(guò)濾。
(2) 控制反應(yīng)體系蛋白總濃度為2.0 mg/L， BNEDA的總濃度為32 nmol/L。
(3) 掃描發(fā)現(xiàn)BNEDA在280nm為激發(fā)谷而在245 nm和325 nm為激發(fā)峰，其發(fā)射峰在 450nm附近，熒光量子產(chǎn)率接近0.3，且其在325 nm的激發(fā)峰遠(yuǎn)高于280 nm激發(fā)的 熒光信號(hào)。鏈親和素在280 nm為激發(fā)峰并在340 nm出現(xiàn)發(fā)射峰。BNEDA同鏈親和 素的復(fù)合物在280 nm出現(xiàn)比325 nm更高的激發(fā)峰且有典型的430 nm熒光發(fā)射，并 伴隨340 nm發(fā)射下降；當(dāng)用生物素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合置換BNEDA則伴隨340 nm熒光升高和 430 nm熒光顯著下降((圖3 a(激發(fā)光譜)和圖3 b(發(fā)射光譜))?？梢?，在鏈親和素和 BNEDA其復(fù)合物中發(fā)生了 FRET，藉此可建立均相熒光親和分析體系(圖4)。
(4) 用BNEDA檢測(cè)在280nm激發(fā)下在430nm的FRET熒光，用BNEDA滴定鏈親和素 的結(jié)合位點(diǎn)濃度(每個(gè)亞基一個(gè)結(jié)合位點(diǎn))，結(jié)果證實(shí)按照鏈親和素亞基分子量為 13500計(jì)算，則滴定時(shí)的結(jié)合比例為1:0.98 (附圖5);標(biāo)定后的鏈親和素用含20% 甘油的緩沖液加疊氮鈉抑制細(xì)菌保存作為標(biāo)準(zhǔn)品，可重復(fù)使用。
(5) 在有2.0 mg/L總蛋白(細(xì)菌裂解液或者牛血清白蛋白)時(shí)，檢測(cè)來(lái)自BNEDA的穩(wěn)態(tài) FRET熒光(430 nm)，其熒光同反應(yīng)體系的鏈親和素含量成正比；在普通熒光分光 光度計(jì)上用5 nm激發(fā)狹縫和10 nm發(fā)射狹縫，線性范圍可從0.50 nmol/L到30.0 nmol/L(附圖6);檢測(cè)限可達(dá)到0.15 nmol/L，即鏈親和素四聚體濃度為40 pmol/L。(6) 在相條件下，以單獨(dú)BNEDA的信號(hào)和加入BNEDA前的信號(hào)之和減去緩沖液的信號(hào) 為本底，則430nm熒光對(duì)鏈親和素含量的響應(yīng)曲線基本通過(guò)原點(diǎn)，這說(shuō)明430nm熒 光為BNEDA和BNEDA與鏈親和素復(fù)合物的加和，符合預(yù)期的化學(xué)計(jì)量學(xué)原則。
(7) 扣除本底后，在固定BNEDA濃度時(shí)，均相反應(yīng)體系的430 nm熒光信號(hào)對(duì)反應(yīng)體系 的表面活性劑、有機(jī)溶劑、金屬離子、常用絡(luò)合劑等都有抗性。
(8) 所合成的BDEDA在其與鏈親和素的復(fù)合物內(nèi)也能產(chǎn)生FRET現(xiàn)象，其FRET發(fā)射峰 在525 nm(圖7)。但其所含熒光團(tuán)在緩沖液中的熒光量子產(chǎn)率很低，所產(chǎn)生FRET熒 光信號(hào)很弱；相反，BDEDA猝滅鏈親和素在340 nm熒光的能力與BNEDA相當(dāng)。
實(shí)施例2:用FRET探針和競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定生物素衍生物的親和力
(1) 如果選用BDEDA為FRET探針時(shí)測(cè)定鏈親和素在280 nm激發(fā)下產(chǎn)生的340 nm熒光 信號(hào)靈敏度更高；如用BNEDA為FRET探針，其FRET熒光信號(hào)更高，可用于親和 力高且散射信號(hào)弱的候選配體；需考察在280 nm附近激發(fā)下，候選配體的散射信號(hào) 強(qiáng)弱決定選用那種FRET探針和檢測(cè)蛋白熒光猝滅還是探針的FRET熒光發(fā)射。
(2) 生物素對(duì)鏈親和素在340 nm熒光猝滅能力很弱且在430 nm附近的散射信號(hào)也很弱。 以BNEDA為FRET探針檢測(cè)430 nm熒光，測(cè)定競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合時(shí)BNEDA結(jié)合率隨生物 素濃度的變化，將濃度換算成對(duì)數(shù)后作圖，選取線性部分做回歸分析確定半有效濃度 (EC5()，圖8);對(duì)BDEDA檢測(cè)525 nm的FRET熒光發(fā)射確定生物素的EC50 (圖9)。 考慮到結(jié)合反應(yīng)體系蛋白結(jié)合位點(diǎn)濃度和FRET探針濃度相當(dāng)，故需特殊公式，利用 生物素與鏈親和素公認(rèn)的解離常數(shù)(為40finol/L)，將EC5Q換算成FRET探針的解 離常數(shù)(Linden, J. / QW. M/c/. 1982, S, 163-172)。
(3) 對(duì)400nm以上沒有明顯散射信號(hào)的非熒光候選配體，如生物素化乙醇胺、生物素化 丁胺等，以BNEDA為FRET探針檢測(cè)430 nm的熒光信號(hào)確定BNEDA結(jié)合率，對(duì) 數(shù)濃度作圖確定各自的EC5C，按照前述文獻(xiàn)公式計(jì)算各自的解離常數(shù)。
(4)對(duì)在400nm以上有明顯散射信號(hào)的非熒光候選配體，包括生物素化乙二胺、生物素 化環(huán)己胺等，用BDEDA為參考配體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合并檢測(cè)340nm熒光變化，以候選配 體絕對(duì)過(guò)量時(shí)的熒光減去沒有候選配體時(shí)的熒光為最大變化值，不同候選配體濃度下 的340nm熒光與候選配體絕對(duì)過(guò)量時(shí)的熒光之差的絕對(duì)值除以最大變化值為結(jié)合率， 對(duì)數(shù)濃度作圖確定各自的EC5o，按照前述文獻(xiàn)公式計(jì)算各自的解離常數(shù)。說(shuō)明書


圖l.可用的熒光標(biāo)記基團(tuán)
圖2. BNEDA和BDEDA結(jié)構(gòu)示意圖
圖3.BNEDA、鏈親和素相互作用體系的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜
圖4. BNEDA同鏈親和素亞基結(jié)合后發(fā)生共振能量轉(zhuǎn)移示意圖
鏈親和素亞基顯示綠色，其中紅色細(xì)線標(biāo)示為色氨酸殘基。粗樹枝狀 的結(jié)構(gòu)為BNEDA，萘胺環(huán)與色氨酸環(huán)之間發(fā)生共振能量轉(zhuǎn)移。
圖5.用BNEDA滴定44 nmol/L鏈親和素亞基的過(guò)程。
F430為BNEDA的FRET熒光，橫軸為BNEDA終濃度。
圖6.在430nm的熒光對(duì)BNEDA濃度、鏈親和素(STR)亞基濃度的響應(yīng)曲線。
圖7. BDEDA和鏈親和素體系在290nm激發(fā)的發(fā)射光譜
圖8.監(jiān)測(cè)430 nm的FRET熒光時(shí)，生物素(Biotin)與BNEDA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合過(guò)程中
結(jié)合率隨生物素濃度對(duì)數(shù)的變化。所用鏈親和素濃度為120 nmol/L，
BNEDA濃度為160nmol/L. 圖9.監(jiān)測(cè)525 nm的FRET熒光時(shí)，生物素(Biotin)與BDEDA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合過(guò)程中
結(jié)合率隨生物素濃度對(duì)數(shù)的變化。所用鏈親和素濃度為50 nmol/L， BDEDA
濃度為80nmol/L.
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權(quán)利要求
1、一種基于蛋白與熒光標(biāo)記的小分子配體(或半抗原)為探針?biāo)纬傻膹?fù)合物中色氨酸殘基與配體探針發(fā)生Forster共振能量轉(zhuǎn)移，引起結(jié)合反應(yīng)體系的蛋白質(zhì)自身熒光信號(hào)下降而熒光標(biāo)記配體探針的特有熒光信號(hào)升高的均相熒光親和分析方法，可用于測(cè)定混合物中蛋白含量、高親和力配體(半抗原)含量及配體與該蛋白的親和力。
2、 按照權(quán)利要求l所述，此均相熒光親和分析方法以帶有特殊熒光團(tuán)且與蛋白高特異 性結(jié)合的小分子配體為Forster共振能量轉(zhuǎn)移探針；在該蛋白與探針的復(fù)合物中蛋白 質(zhì)色氨酸殘基為Forster共振能量轉(zhuǎn)移的內(nèi)在供體，而對(duì)應(yīng)探針為Forster共振能量 轉(zhuǎn)移的接受體；在探針與該蛋白的復(fù)合物中，色氨酸殘基與探針之間發(fā)生Forster 共振能量轉(zhuǎn)移，使得色氨酸殘基熒光被猝滅而下降，同時(shí)該探針的特有熒光信號(hào)顯 著增強(qiáng)，且這些熒光信號(hào)的變化與所生成蛋白與探針復(fù)合物的量成正比，從而不需 分離結(jié)合與游離探針就可監(jiān)測(cè)探針與對(duì)應(yīng)蛋白之間的相互結(jié)合。
3、 按照權(quán)利要求1和2所述，此均相熒光親和分析方法所用Forster共振能量轉(zhuǎn)移探針 帶有熒光基團(tuán)且同該蛋白有高特異性結(jié)合能力，其顯著特征是此探針為該蛋白的特 異性配體；游離探針在260到300 nm之間存在熒光激發(fā)谷而在310到370 nm之間 存在熒光激發(fā)峰;探針與蛋白結(jié)合后因Forster共振能量轉(zhuǎn)移表現(xiàn)出在260到300 nm 之間的特殊激發(fā)峰和探針特有的熒光發(fā)射峰;此類探針的熒光量子產(chǎn)率應(yīng)盡可能高； 如所用Forster共振能量轉(zhuǎn)移探針還同時(shí)具有如下的一項(xiàng)或多項(xiàng)特征則更理想(1) .與對(duì)應(yīng)蛋白結(jié)合后探針的熒光量子產(chǎn)率遠(yuǎn)高于游離探針的熒光量子產(chǎn)率；(2) .與對(duì)應(yīng)蛋白結(jié)合后探針的熒光發(fā)射光譜顯著不同于游離探針的熒光發(fā)射光譜。
4、 按照權(quán)利要求1到3所述，此均相熒光親和分析方法可用于測(cè)定混合物中對(duì)應(yīng)蛋白 含量、配體親和力、特定配體含量；但這三種不同類型的應(yīng)用，對(duì)探針親和力有不 同要求，具體是(1) 測(cè)定混合物中對(duì)應(yīng)結(jié)合蛋白含量的探針與該蛋白親和力越高越好；(2) 測(cè)定特定配體含量探針，其親和力必須遠(yuǎn)低于所需定量測(cè)定配體的親和力；(3) 測(cè)定特定配體親和力探針，其親和力最好顯著低于待測(cè)配體親和力。
5、 按照權(quán)利要求1到3所述，可用于此類均相熒光親和分析方法的Forster共振能量轉(zhuǎn) 移探針可以是蛋白結(jié)合基團(tuán)與熒光標(biāo)記基團(tuán)的加合物，蛋白結(jié)合基團(tuán)應(yīng)根據(jù)結(jié)合部 位的構(gòu)象設(shè)計(jì)，而對(duì)應(yīng)熒光標(biāo)記基團(tuán)主要是萘胺和香豆素衍生物，通過(guò)相應(yīng)的取代 或縮合反應(yīng)等方式生成對(duì)應(yīng)的探針加合物，此類熒光標(biāo)記基團(tuán)具體包括(1) . a-萘胺衍生物，如在a-萘胺或?qū)ξ挥形娮尤〈鷆t-萘胺的芳香氮原子上連短鏈烷基并在烷基的另一端連上羥基或氨基或巰基的衍生物、在a-萘胺或?qū)ξ挥形?電子取代a-萘胺的芳香氮原子上連短鏈烷基且此垸基的另一端為磺酸酯等可離 去基團(tuán)的衍生物、在a-萘胺或?qū)ξ挥形娮尤〈鷄-萘胺的氮原子上連羧甲基后 將羧基活化的衍生物、在a-萘胺氮原子用兩個(gè)甲基或乙基取代后在氮原子對(duì)位 進(jìn)行a-卣代?；〈苌铩⒃赼-萘胺氮原子用兩個(gè)甲基或乙基取代后在氮原 子的4位或5位有可滿足熒光特征要求的其它活潑官能團(tuán)的衍生物；(2) . P-萘胺衍生物，如在l3-萘胺或?qū)ξ挥形娮尤〈鶳-萘胺的芳香氮原子上連短鏈垸基并在烷基的另一端連上羥基或氨基或巰基的衍生物、在(3-萘胺或?qū)ξ挥形?電子取代P-萘胺的芳香氮原子上連短鏈垸基且此垸基的另一端為磺酸酯等可離 去基團(tuán)的衍生物、在|3-萘胺或?qū)ξ挥形娮尤〈鷓-萘胺的氮原子上連羧甲基后 將羧基活化的衍生物、在|3-萘胺氮原子用兩個(gè)甲基或乙基取代后在氮原子對(duì)位 進(jìn)行a-鹵代?；〈苌铩⒃趐-萘胺氮原子用兩個(gè)甲基或乙基取代后在氮原 子的6位有可滿足熒光特征要求的其它活潑官能團(tuán)的衍生物；(3) .香豆素衍生物；有可活化羧基或氨基且激發(fā)峰在320到360 nm之間的香豆素衍生物。
6、 按照權(quán)利要求1到3所述，為了應(yīng)用此均相熒光親和分析方法進(jìn)行定量測(cè)定，所用 帶有熒光標(biāo)記的Forster共振能量轉(zhuǎn)移探針同對(duì)應(yīng)蛋白的結(jié)合特異性越高越好。
7、 按照權(quán)利要求1到3所述，用此均相熒光親和分析方法測(cè)定非熒光配體的親和力時(shí)， 因所用蛋白與其Forster共振能量轉(zhuǎn)移探針的濃度相當(dāng)，故用候選配體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的半 有效濃度計(jì)算其解離常數(shù)時(shí)需考慮競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合過(guò)程中探針濃度的下降。
8、 按照權(quán)利要求1到3所述，用此均相熒光親和分析方法測(cè)定配體親和力時(shí)可檢測(cè)蛋 白質(zhì)色氨酸熒光信號(hào)下降或探針Forster共振能量轉(zhuǎn)移熒光信號(hào)增強(qiáng)，應(yīng)據(jù)候選配體 的散射光譜選擇測(cè)定探針的Forster共振能量轉(zhuǎn)移熒光信號(hào)增強(qiáng)還是蛋白質(zhì)色氨酸 熒光下降，以最大可能避免候選配體產(chǎn)生的散射信號(hào)干擾；如候選配體自身有熒光， 則候選配體應(yīng)對(duì)探針的Forster共振能量轉(zhuǎn)移熒光或蛋白色氨酸熒光應(yīng)沒有干擾，否 則應(yīng)以此熒光候選配體與已知親和力非熒光配體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合來(lái)確定其親和力。
9、 按照權(quán)利要求1到3所述，此均相熒光親和分析方法可用抗體為對(duì)應(yīng)蛋白和滿足要 求的熒光標(biāo)記半抗原為探針，從而選擇性測(cè)定混合物中的半抗原含量。
全文摘要
本發(fā)明以蛋白質(zhì)中色氨酸殘基為內(nèi)在Forster共振能量轉(zhuǎn)移供體并設(shè)計(jì)特異性分析探針為Forster共振能量轉(zhuǎn)移接受體，從而建立均相熒光親和分析方法；所用分析探針帶萘胺類熒光團(tuán)，可檢測(cè)探針與蛋白復(fù)合物中色氨酸殘基在340nm附近熒光經(jīng)共振能量轉(zhuǎn)移被猝滅下降或探針經(jīng)共振能量轉(zhuǎn)移激發(fā)而使探針特有熒光升高；測(cè)定經(jīng)過(guò)共振能量轉(zhuǎn)移激發(fā)產(chǎn)生的探針特有熒光可高靈敏度非競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定蛋白含量；通過(guò)候選配體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，測(cè)定共振能量轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的探針特有熒光或蛋白自身340nm熒光的變化，可測(cè)定非熒光候選配體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的半有效濃度，考慮分析探針與靶蛋白濃度相當(dāng)?shù)那闆r可推算候選配體的解離常數(shù)；當(dāng)分析探針的親和力比待測(cè)配體的親和力低得多時(shí)，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合還可以測(cè)定高親和力配體的含量；此技術(shù)可用于實(shí)驗(yàn)診斷和配體類藥物篩選。
文檔編號(hào)G01N33/68GK101452002SQ200810237000
公開日2009年6月10日 申請(qǐng)日期2008年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月30日
發(fā)明者于明安, 冬 劉, 娟 廖, 飛 廖, 莎 朱, 楊曉蘭, 謝燕玲, 趙運(yùn)勝, 萍 鄧 申請(qǐng)人:重慶醫(yī)科大學(xué)