專利名稱：：一種用于檢測萊克多巴胺的試劑盒及其應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種萊克多巴胺的檢測領域，具體涉及一種用于檢測萊克多巴胺的試劑盒，本發(fā)明還涉及上述試劑盒在^r測萊克多巴胺中的應用。萊克多巴胺(Ractopamine,RAC),化學名稱為N-[2-(4-羥基苯基)-2-羥基乙基]-l-曱基-3-(4-羥基苯基)丙氨，化學結構如式(I)所示。市場銷售的萊克多巴胺為其鹽酸鹽，稱為鹽酸萊克多巴胺(RACHC1)，分子式為d8FU)3H.HC1,分子量為337.83,成白色粉末狀，常溫下暴露在空氣中性質穩(wěn)定，微溶于丙酮，易溶于曱醇、乙醇等有機溶劑，溶液成中性，pH為6.0~7.0。美國FDA規(guī)定人對于RAC的最大攝入量(ADI)為1.25jng/(kg體重.d)。超過這一劑量，就會出現(xiàn)不同程度的中毒反應，其癥狀與動物中毒癥狀相似，表現(xiàn)為肌肉震顫、四肢麻痹、心動過速、心律失常、腹痛、肌肉疼痛、惡心、眩暈等。目前，萊克多巴胺在我國屬于違禁藥物。生物素-親合素系統(tǒng)(biotin-avidinsystem,BAS),是70年代后期應用于免疫學，并得到迅速發(fā)展的一種新型生物反應放大系統(tǒng)。由于它具有生物素與親合素之間高度親和力及多級放大效應，并與熒光素、酶、同位
背景技術：
：式I萊克多巴胺的化學結構素等免疫標記技術有機地結合，使各種示蹤免疫分析的特異性和靈敏度進一步提高。BAS已經(jīng)廣泛應用于生物醫(yī)學實驗研究的各個領域，既可用于微量抗原、抗體及受體的定量、定性檢測及定位觀察研究，亦可制成親和介質用于上述各類反應體系中反應物的分離、純化。其性質概括如下(1)二者具有高度的特異的親和性生物素與(鏈霉)親和素之間的親和性，至少是抗原抗體間的一萬倍以上，且不易受外界干擾，復合物穩(wěn)定；(2)橋聯(lián)作用二者均可偶聯(lián)蛋白質、核酸、多糖和酶等生物活性物質，同時還能與固相材料結合，通過這些特性可將它們偶耳關起來；(3)多級放大作用一個蛋白質(或核酸等)分子上可結合多個生物素分子，而一個親和素又可結合四個生物素，因而生物素與親和素具有多級放大作用。BA技術的這些特性，使其在生物學、分子生物學、生物化學、臨床醫(yī)學等領域廣泛應用。CN1766630A公開了一種檢測動物源性食品中萊克多巴胺的酶聯(lián)免疫試劑盒，及使用該試劑盒對預處理的動物源性食品進行萊克多巴胺殘留檢測的方法。該試劑盒組成為包被了萊克多巴胺抗原或抗抗體的酶標板、萊克多巴胺鼠單克隆抗體或多克隆抗體工作液、酶標記的抗抗體或酶標記的萊克多巴胺抗原、萊克多巴胺標準品溶液、底物顯色液、終止液、濃縮洗滌液和濃縮復溶液。該試劑盒存在靈敏度低的缺陷。目前，常用于萊克多巴胺殘留檢測的方法主要有微生物法和儀器分析法，微生物法檢測雖然經(jīng)濟、操作筒便，但在樣本中有其他文生物抑制劑存在時，其靈敏度和特異性受到限制；高效液相色i普分析法、氣譜、氣質聯(lián)機法等單純的儀器分析法，雖然靈敏度高，但樣本前處理及測定操作煩瑣，費用高，不適宜大量樣本篩查。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是提供一種適于大批量樣本快速檢測、靈敏度較高且檢出限低于同類檢測產品的用于檢測萊克多巴胺的試劑盒。本發(fā)明的另一目的是提供上述試劑盒檢測萊克多巴胺的方法。為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的發(fā)明人在現(xiàn)有技術的基礎上進行了大量的研究和創(chuàng)造性的勞動，研制出了一種用于檢測萊克多巴胺的試劑盒，所述的試劑盒包括下述成分①包被了萊克多巴胺抗原的酶標板；②萊克多巴胺標準樣溶液；③萊克多巴胺抗體；④鏈霉親和素標記辣根過氧化物酶生物；生物素標記的第二抗體，所述的生物素標記的第二抗體為抗萊克多巴胺抗體的抗體；底物顯色液；⑦終止液。所述的顯色液包括底物溶液A和底物溶液B,所述的底物溶液A包括無水醋酸鈉8.2重量份、(3-糊精2.5重量份、過氧化氫脲O.150重量份、雙蒸水或純水1000重量份；所述的底物溶液B包括O.050重量份的四曱基聯(lián)苯胺TMB和5重量份的二甲基亞砜DMS0。所述底物溶液A制備方法如下無水醋酸鈉8.2重量份、P-糊精2.5重量份、過氧化氬脲O.150重量份溶解于1000重量份的雙蒸水中，并調pH至5.0,即得，其保存條件是4。C。所述的終止液為濃度為l.25mol/L的碌u酸。一種利用所述試劑盒檢測萊克多巴胺的方法，包括下述步驟①處理樣品；②向試劑盒中加入萊克多巴胺標準樣溶液將溶解于磷酸鹽緩沖液中的萊克多巴胺標準樣品加入到反應孔中，每孔加入IOOjLiL;③向試劑盒中加入萊克多巴胺抗體將萊克多巴胺抗體用磷酸鹽緩沖液稀釋1000倍，加入到反應孔中，每孔100jLiL,室溫孵育60分鐘，棄去孔中液體，洗液洗滌4次；④利用鏈霉親和素標記辣根過氧化物酶生物進行放大將生物素標記第二抗體用磷酸鹽緩沖液磷酸鹽緩沖液稀釋50，000倍，每孔加入IOOjliL,37。C反應30分鐘后吐溫20洗板4次，每孔加入IOOpL0.5%小牛血清/磷酸鹽緩沖液稀釋50，OOO倍的鏈霉親和素標記辣根過氧化物酶，37。C反應40分鐘，吐溫2G洗板5次。用底物顯色液進行顯色底物溶液A和底物溶液B混勻，顯色時每孔加入150jliL的底物顯色液；利用終止液終止反應顯色20分鐘后每孔加入50iaL濃度為1.25mol/L的硫酸終止液，終止反應；⑦讀數(shù)反應液在酶標儀450nm讀取吸光值。所述的步驟①為將剔除脂肪的動物肌肉組織樣品于離心管中，加入磷酸鹽緩沖液，漩渦振蕩器劇烈震蕩2-5min，室溫離心15min,取上清液15mL移至分液漏斗，加入正己烷，充分混合后靜置，取下層清夜備用。其中所述的試劑盒制備時，包被了萊克多巴胺抗原的酶標板按照如下的方法制備將包被抗原RAC-0VA溶于50mmo1、pH9-IO的碳酸緩沖液中，配制成10lig/mL的包被液，在酶標板每孔中加入100iaL包被液，37。C包被3小時后，棄去孔中液體，用磷酸鹽緩沖液O.05%(v/v),吐溫20洗液洗滌3次；再利用封閉液封閉酶標板的每孔加入O.5°/。脫脂奶粉/磷酸鹽緩沖液封閉液200iiL,在37。C條件下封閉1小時，棄去孔中液體，吐溫20洗^反3次。本發(fā)明中使用的萊克多巴胺抗原可以采用使用活性酯法將萊克多巴胺半抗原與載體蛋白進行偶聯(lián)得到，也可以從市場購買得到。下面詳細說明本發(fā)明的檢測過程1、檢測步驟試劑盒的包被了萊克多巴胺抗原的酶標板的制備包括下述的包被和封閉步驟包被將包被抗原(RAC-0VA)溶于50mmo1、pH9-IO的石友酸緩沖液中，配制成10jug/mL的包被液，于酶標板每孔中加入IOOnL包凈皮液，37。C包被3小時后，棄去孔中液體，用磷酸鹽緩沖液O.05%(v/v),吐溫20洗液洗滌3次；封閉每孔加入O.5%脫脂奶粉/磷酸鹽緩沖液封閉液200juL，37。C封閉l小時，棄去孔中液體，吐溫20洗板3次；加樣將溶解于磷酸鹽緩沖液中的萊克多巴胺標準樣品或待測樣品加入到反應孔中，每孑L力口入IOOjaL;竟爭將抗體用磷酸鹽緩沖液稀釋1000倍，加入到反應孔中，每孔IOOML,室溫賻育60分鐘，棄去孔中液體，洗液洗滌4次；放大將生物素標記第二抗體用磷酸鹽緩沖液稀釋50，GOO倍，每孔加入100iiL,37。C反應30分鐘后吐溫20洗板4次，每孔加入IOOjuL0.5%小牛血清/磷酸鹽緩沖液稀釋50，GOO倍的鏈霉親和素標記辣根過氧化物酶，37°C反應4G分鐘，吐溫2Q洗板5次。顯色將無水醋酸鈉8.2g、P-糊精2.5g、過氧化氫脲150mg溶解于1000mL雙蒸水中，調pH至5.0,配置成底物溶液A,4。C保存；將50mg四曱基聯(lián)苯胺(TMB)溶于5mL二曱基亞石風(DMSO),配成底物溶液B;顯色前混勻A與B。顯色時每孔加入150jiiL的底物溶液，顯色20分鐘后每孔加入50jiL1.25mol/L的硫酸終止;讀數(shù)反應液在酶標儀45Onm讀取吸光值。2、條件優(yōu)化及標線建立2.l包被抗原、抗體使用濃度的確定選定不同包被抗原及抗體濃度設置棋盤，按檢測步驟進行實驗，初步優(yōu)選包^皮原及抗體濃度。2.2封閉液的優(yōu)選初步選定以下幾種物質作為備選封閉液3%聚乙二醇，5%甘氨酸，0.5%脫脂奶粉，1%牛血清白蛋白(BSA)，1%卵清蛋白(0VA)，按照上述的實驗步驟進行實驗，每種封閉液對應不同標樣濃度設置三個平行，比較封閉液封閉效果。2.3其他條件的優(yōu)化生物素化第二抗體的稀釋倍數(shù)、反應時間、溫度條件，鏈霉親和素標記辣根過氧化物酶的稀釋倍數(shù)、反應時間、溫度條件的優(yōu)化方法參考封閉液的優(yōu)選方法。2.4繪制標準曲線以及空白值A空白，對照值A對照，根據(jù)公式計算抑制率值w際樣"空白'降％=用寸照-"空白x100(A為吸光值)以萊克多巴胺濃度對數(shù)值為橫坐標，抑制率為縱坐標，繪制標準曲線，標準曲線是典型的S型曲線，參見圖1。3、基質前處理方法(基質影響的消除)稱取4g剔除脂肪的動物肌肉組織樣品于50mL離心管中，加入20mL磷酸鹽緩沖液，漩渦振蕩器劇烈震蕩2min,室溫離心15min,轉速為4000rpm,取上清液15mL移至100mL分液漏斗，加入1GmL正己烷，充分混合后靜置，取下層清夜備用。從圖2中的曲線的重合程度看，兩條曲線基本重合，可以說，應用本發(fā)明的前處理方法，基本上消除了基質影響，達到了預期的目的。4、方法的評價4.1精密度精密度是指對于同一樣品多次測定結果的變化程度。以變異系數(shù)(CV%)表示，主要考查板內變異和板間變異。取6個不同濃度的萊克多巴胺標準溶液，進行間接生物素-親和素酶聯(lián)免疫吸附分析法(BA-ELISA)分析，每個濃度10個平行，對于建立的方法進行精密度的測試。根據(jù)吸光度值求得抑制率進行分析。取六個不同濃度的萊克多巴胺標準溶液，進行BA-ELISA分析，每個濃度每天作兩次分析，綜合5天測得的抑制率進行分析。4.2準確度準確度是指樣品測定值與真實值的符合程度，通常以回收率實驗來表示。在未檢出萊克多巴胺的陰性樣品中添加不同含量水平的RAC標準品，進行添加回收試驗。根據(jù)樣品前處理結果確定以lpg/kg、2lag/kg和10pg/kg三個濃度添加到所選樣品中，每個濃度做3個平行，進行間接BA-ELISA測定，計算回收率。本發(fā)明提供的用于檢測萊克多巴胺的試劑盒與現(xiàn)有技術相比，增加了信號放大系統(tǒng)鏈霉親和素標記辣根過氧化物酶生物，使得檢測的靈敏度大大提高，檢測限低，節(jié)省了大量抗體用量。萊克多巴胺的檢測實驗表明，樣品檢測限達到0.3±0.05ng/mL,而且抗體的稀釋度可達到1000倍，整板用量(按100孔計)約為30yg，與直接竟爭ELISA(約lOOjag)和間接竟爭ELISA(約lOOjag)相比，大大減少了抗體的使用量。利用本發(fā)明提供得到試劑盒進行萊克多巴胺檢測時，樣品前處理是將剔除脂肪的動物肌肉組織樣品于離心管中，加入磷酸鹽緩沖液，漩渦振蕩器劇烈震蕩2-5min,室溫離心15min,取上清液15mL移至分液漏斗，加入正己烷，充分混合后靜置，取下層清夜備用。上述前處理方法操作簡便、快速，無需有機溶劑反復萃取，蒸干有機溶劑及復溶等繁瑣操作。完成全部檢測操作過程需4-5小時，適合現(xiàn)場檢測的需要。從圖2中曲線的重合程度看，兩條曲線基本重合，可以說，應用本發(fā)明的前處理方法，基本上消除了基質影響，達到了預期的目的。萊克多巴胺的檢測實驗1.檢測條件的確立包被將包被抗原(MC-0VA)溶于50mmo1、pH9-10的碳酸緩沖液中，配制成10yg/mL的包被液，于酶標板每孔中加入IOOjLiL包被液，37。C包被3小時后，棄去孔中液體，用磷酸鹽緩沖液O.05%(v/v),吐溫20洗液封閉每孔加入O.5%脫脂奶粉/磷酸鹽緩沖液封閉液200ML，37。C封閉l小時，棄去孔中液體，吐溫20洗板3次；加樣將溶解于磷酸鹽緩沖液中的萊克多巴胺標準樣品或待測樣品加入到反應孔中，每孔加入IOOfiL;竟爭將抗體用磷酸鹽緩沖液稀釋1000倍，加入到反應孔中，每孔IOO室溫孵育60分鐘，棄去孔中液體，洗液洗滌4次；放大將生物素標記第二抗體用磷酸鹽緩沖液稀釋50,OOO倍，每孔加入100juL，37。C反應30分鐘后吐溫20洗板4次，每孔加入IOOjaLO.5%小牛血清/磷酸鹽緩沖液稀釋50，GOO倍的鏈霉親和素標記辣根過氧化物酶，37°C反應4Q分鐘，吐溫2Q洗板5次。顯色將無水醋酸鈉8.2g、P-糊精2.5g、過氧化氫脲150mg溶解于1000fflL雙蒸水中，調pH至5.0，配置成底物溶液A，4'C保存；將50mg四曱基聯(lián)苯胺(TMB)溶于5mL二曱基亞砜(DMSO)，配成底物溶液B;顯色前混勻A與B。顯色時每孔加入150iaL的底物溶液，顯色20分鐘后每孔加入50iaL1.25mol/L的碌u酸終止；讀數(shù)反應液在酶標^f義45Gnm讀取吸光值。2.標線建立以萊克多巴胺濃度對數(shù)值為橫坐標，抑制率為縱坐標，繪制標準曲線，標準曲線是典型的S型曲線，參見圖1:按照優(yōu)選的條件及^f全測步驟測定不同標樣濃度對應的吸光度值A標樣，以及空白值A空白，對照值A對照，根據(jù)公式計算抑制率值<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>3.基質影響的消除參見圖2(需要說明如何做的圖)從圖中曲線的重合程度看，兩條曲線基本重合，可以說，應用本發(fā)明的前處理方法，基本上消除了基質影響，達到了預期的目的。4.方法評i介4.1精密度4.1.1板內變異取6個不同濃度的萊克多巴胺標準溶液，進行間接BA-ELISA分析，每個濃度10個平行，對于建立的方法進行精密度的測試。根據(jù)吸光度值求得抑制率進行分析，結果見表l。表l萊克多巴胺間接BA-ELISA板內變異<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>從表中數(shù)據(jù)可以看出，除最低濃度點變異系數(shù)較大外，其余各點均小于10%。4.1.2板間變異取六個不同濃度的萊克多巴胺標準溶液，進行BA-ELISA分析，每個濃度每天做兩次分析，綜合5天測得的抑制率進行分析，結果見表2。表2萊克多巴胺間接BA-ELISA板間變異<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>圖1為萊克多巴胺的檢測實驗中萊克多巴胺濃度與抑制率關系。圖2為萊克多巴胺的檢測實驗中基質對抑制率的影響圖圖3為實施例1中抗體用磷酸鹽緩沖液加樣示意圖；圖4為實施例1中萊克多巴胺濃度與抑制率關系曲線。具體實施例方式下面結合附圖對本發(fā)明作進一步描述。1.1樣品的前處理選取豬肉陰性樣，預先添加萊克多巴胺標準樣品，添加最終濃度為2jug/kg。稱取4g上述豬肉，剔除脂肪，置于50mL離心管中，加入20mL磷酸鹽緩沖液，漩渦振蕩器劇烈震蕩2min，室溫離心15min，轉速為4000rpm,取上清液15mL移至lOOmL分液漏斗，加入10mL正己烷，充分混合后靜置，下層清液即為待測液，保存?zhèn)溆谩?.2;險測方法包被將包被抗原(RAC-OVA)溶于50mmo1、pH9-10的碳酸緩沖液中，配制成10ug/mL的包被液，于酶標板每孔中加入100juL包被液，37°C包被3小時后，棄去孔中液體，用磷酸鹽緩沖液O.05%(v/v),吐溫20洗液洗滌3次；封閉每孔加入0.5%脫脂奶粉/磷酸鹽緩沖液封閉液200jaL,37°C封閉1小時，棄去孔中液體，吐溫20洗板3次；配樣以磷酸鹽緩沖液配置濃度為20ng/mL的萊克多巴胺標準溶液，由該溶液5倍梯度稀釋，最終得到如下濃度標準溶液，20ng/mL、4ng/mL、0.8ng/mL、0.16ng/mL、0.032ng/mL、0.0064ng/mL。加樣加樣示意圖如圖4，將梯度稀釋的萊克多巴胺標準溶液濃度由低到高分別加入到對應反應孔I-VI中，每孔加入lOOjnL,每個濃度設置3個平行孔；反應孔B、C孔分別加入100jiL磷酸鹽緩沖液；反應孑LM孔(6個平行)，加入1.1方法處理過的代測液100jliL。竟爭將抗體用磷酸鹽緩沖液稀釋1000倍，加入到反應孔中(除B孔外)，每孔100juL,B孔中加入100iaL磷酸鹽緩沖液，室溫孵育60分鐘，棄去孔中液體，洗液洗滌4次，加樣示意圖參見圖3;放大將生物素標記第二抗體用磷酸鹽緩沖液稀釋50，000倍，所有反應孔均加入100jaL,37。C反應30分鐘后吐溫20洗板4次，所有反應孔均加入lOOiaL濃度為O.5%小牛血清/磷酸鹽緩沖液稀釋50,OOO倍的鏈霉親和素標記辣根過氧化物酶，37。C反應40分鐘，吐溫20洗板5次。顯色將無水醋酸鈉8.2g、p-糊精2.5g、過氧化氫脲150mg溶解于1000mL雙蒸水中，調pH至5.0，配置成底物溶液A，4。C保存；將50mg四曱基聯(lián)苯胺(TMB)溶于5mL二曱基亞砜(DMSO),配成底物溶液B;顯色前混勻A與B。顯色時所有反應孔均加入150jaL的底物溶液，顯色20分鐘后每孔加入50iaL1.25mol/L的硫酸終止;讀數(shù)反應液在酶標儀45Gnm讀取吸光值。繪制標準曲線根據(jù)公式計算抑制率值，以萊克多巴胺濃度對數(shù)值為橫坐標，抑制率為縱坐標，繪制標準曲線，如圖4所示。樣品檢測結果由吸光值計算出抑制率為48.18%，讀取圖4得到檢測結果約為0.31ng/mL,根據(jù)前處理方法(5倍提取)換算出樣品中萊克多巴胺的含量為1.55jug/kg,回收率為77.5%。權利要求1、一種用于檢測萊克多巴胺的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒包括下述成分①包被了萊克多巴胺抗原的酶標板；②萊克多巴胺標準樣溶液；③萊克多巴胺抗體；④鏈霉親和素標記辣根過氧化物酶生物；⑤生物素標記的第二抗體；⑥底物顯色液；⑦終止液。2、根據(jù)權利要求l所述的試劑盒，其特征在于所述的顯色液包括底物溶液A和底物溶液B，所述的底物溶液A包括無水醋酸鈉8.2重量份、p-糊精2.5重量份、過氧化氫脲O.150重量份、雙蒸水或純水1000重量份；所述的底物溶液B包括O.050重量份的四甲基聯(lián)苯胺TMB和5重量份的二曱基亞砜DMSO。3、根據(jù)權利要求l所述的試劑盒，其特征在于所述的終止液為濃度為1.25mol/L的石充酸。4、一種利用權利要求l所述試劑盒檢測萊克多巴胺的方法，其特征在于所述的方法包括下述步驟①處理樣品；②向試劑盒中加入萊克多巴胺標準樣溶液將溶解于磷酸鹽緩沖液中的萊克多巴胺標準樣品加入到反應孔中，每孔加入iooml;③向試劑盒中加入萊克多巴胺抗體將萊克多巴胺抗體用磷酸鹽緩沖液稀釋1000倍，加入到反應孔中，每孔100juL，室溫孵育60分鐘，棄去孔中液體，洗液洗滌4次；④利用鏈霉親和素標記辣根過氧化物酶生物進行放大將生物素標記第二抗體用磷酸鹽緩沖液磷酸鹽緩沖液稀釋50，000倍，每孔加入10QjuL,37。C反應30分鐘后吐溫20洗板4次，每孔加入IOOjaL0.5%小牛血清/磷酸鹽緩沖液稀釋50,OOO倍的鏈霉親和素標記辣根過氧化物酶，37。C反應40分鐘，吐溫2Q洗纟反5次。⑤用底物顯色液進行顯色底物溶液A和底物溶液B混勻，顯色時每孔加入150juL的底物顯色液；⑥利用終止液終止反應顯色20分鐘后每孔加入50juL濃度為1.25mol/L的石克酸終止液，終止反應；⑦讀數(shù)反應液在酶標儀450nm讀取吸光值。5、根據(jù)權利要求4所述的檢測萊克多巴胺的方法，其特征在于所述的步驟①為將剔除脂肪的動物肌肉組織樣品于離心管中，加入磷酸鹽緩沖液，漩渦振蕩器劇烈震蕩2-5min,室溫離心15min，取上清液15mL移至分液漏斗，加入正己烷，充分混合后靜置，取下層清夜備用。全文摘要本發(fā)明公開了一種用于檢測萊克多巴胺的試劑盒及其應用，所述的試劑盒包括下述成分①包被了萊克多巴胺抗原的酶標板；②萊克多巴胺標準樣溶液；③萊克多巴胺抗體；④鏈霉親和素標記辣根過氧化物酶生物；⑤生物素標記的第二抗體；⑥底物顯色液；⑦終止液。本發(fā)明提供的試劑盒不僅適于大批量樣本快速檢測，而且靈敏度較高且檢出限低于同類檢測產品，屬于萊克多巴胺的檢測領域。文檔編號G01N21/77GK101315379SQ20081011665公開日2008年12月3日申請日期2008年7月15日優(yōu)先權日2008年7月15日發(fā)明者雷溫申請人:天津九鼎生物工程有限公司;溫雷