專利名稱：：檢測系統(tǒng)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于檢測分子締合的系統(tǒng)。本發(fā)明具有檢測不同分子的締合并且由此檢測異源-二聚體和/或異源-寡聚體的形成的具體應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：將在蛋白質(zhì)締合的情形中討論本發(fā)明的背景。然而，本發(fā)明的范圍不應(yīng)該理解為受限于此。在細(xì)胞中蛋白不以分離形式起作用，而是以穩(wěn)定的或瞬時的復(fù)合物形式起作用，蛋白-蛋白相互作用是蛋白功能的重要決定因素(Auerbach等,(2002),蛋白質(zhì)組學(xué)(尸rafeo/m'")，2,611-623)。此外，蛋白和蛋白復(fù)合物與其它細(xì)胞成分如DNA、RNA和小分子相互作用。理解參與這些相互作用的個體蛋白以及它們的相互作用二者對于更好地理解生物學(xué)過程是重要的。存在一些工具，用來在體外、在細(xì)胞表面通過交聯(lián)的潛力共免疫沉淀、或在體內(nèi)證明蛋白-蛋白相互作用，其包括，例如，熒光RET的共振能量轉(zhuǎn)移(RET)技術(shù)(FRET)和生物發(fā)光RET的共振能量轉(zhuǎn)移(RET)技術(shù)(BRET)。G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)的相互作用代表蛋白締合的生理學(xué)和潛在藥學(xué)相關(guān)性、且特別是異源-二聚體和/或異源-寡聚體的相關(guān)性的極佳實例。如Milligan(Milligan,(2006),今日藥物開發(fā)(2>wgZXscove^7b&力，11,541-549)所觀察的，同源-二聚化和同源-寡聚化對于藥物開發(fā)工業(yè)具有有限的啟示，而"GCPR異源-二聚體和異源-寡聚體的差別性藥理學(xué)、功能和調(diào)控提示選擇性靶向不同組織中的GPCRs的方式，并且暗示一些藥物試劑的功能機制在體內(nèi)可能不同于由依賴于單一GPCR的異源表達(dá)的簡單配體篩選程序所預(yù)測的功能機制"。共免疫沉淀已經(jīng)用來鑒定GPCR異源二聚體(JordanBA和DeviLA(1999)G-蛋白-偶聯(lián)受體異源二聚化調(diào)控受體功能(G-protein-coupledreceptorheterodimerizationmodulatesreceptorfunction)自然(TVafwre)399,697-700)。然而，共免疫沉淀不能區(qū)分組成型和隨機型締合。特別地，存在對在細(xì)胞裂解和溶解后發(fā)生的假象(artefactual)聚集的關(guān)注(KroegerKM等(2003)神經(jīng)內(nèi)分泌途徑中的G-蛋白偶聯(lián)受體寡聚化(G-proteincoupledreceptoroligomerizationinneuroendocrinepathways).神經(jīng)內(nèi)分泌學(xué)前沿(尸ra"f.A^wraemfocn'"o/.)24,254-278)。此外，共免疫沉淀不適用于自動化或高通量篩選。熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)能夠檢測體內(nèi)蛋白-蛋白相互作用(Forster，(1948),物理學(xué)年刊(*".尸/^.)2，57-75)。在克隆了綠色熒光蛋白(GFP)及其具有不同光譜特征的突變變體時，該技術(shù)變得特別具有吸引性并且適用于在活細(xì)胞中進(jìn)行的測定法。這允許通過融合編碼DNA序列而將GFP及其變體遺傳附著到任何靶蛋白上(Heim等，(1994),/W^IS.91,12501-12504)。FRET能夠監(jiān)測在細(xì)胞內(nèi)任何位置發(fā)生的相互作用。FRET可以在任何細(xì)胞類型(哺乳動物、酵母、細(xì)菌等)或無細(xì)胞系統(tǒng)中進(jìn)行確定。其可以通過熒光光譜法、熒光顯微鏡、和熒光激活的細(xì)胞分選法(FACS)進(jìn)行檢測。生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(BRET)是己經(jīng)開發(fā)來研究體內(nèi)蛋白-蛋白相互作用的另一種技術(shù)(Xu等,(1999),授W.,,96,151-156;Eidne等,(2002),內(nèi)分泌學(xué)和新陳代謝趨勢(7Ve"A五M必cn'".Meto6o/.)13,415-421)。與FRET相同，BRET允許在活細(xì)胞或無細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)檢測，并且其不局限于特定的細(xì)胞區(qū)室。在使用FRET或BRET評估標(biāo)記的蛋白之間的直接相互作用時，很難區(qū)分背景信號與由組成型相互作用導(dǎo)致的信號。此外，由于RET依賴于能量供體和受體之間的相對方向和距離，相互作用親和性不直接與信號強度相關(guān)。已經(jīng)提議將'飽和，BRET[MercierJF，SalahpourA,AngersS,BreitA和BouvierM(2002)通過生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移定量評估pi-和(32-腎上腺素能受體同源-和異源二聚化(Quantitativeassessmentofbeta1-andbeta2-adrenergicreceptorhomo-andheterodimerizationbybioluminescenceresonanceenergytransfer).生物化學(xué)雜志(JBiolChem)277,44925~44931.]作為區(qū)分背景和組成型信號的方法，然而，為了產(chǎn)生飽和曲線，這需要相對于供體-標(biāo)記的蛋白表達(dá)增加濃度的受體-標(biāo)記的蛋白，并且絕不能是高通量的。前述討論僅意欲促使理解本發(fā)明。其不應(yīng)該解釋為以任何方式限制本發(fā)明下述描述的范圍或應(yīng)用，其也不應(yīng)該解釋為承認(rèn)所討論的任何信息屬于在優(yōu)先權(quán)日時相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員的公知常識。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明人己經(jīng)開發(fā)了能夠克服或至少減少在蛋白質(zhì)締合分析中鑒定的一些問題的檢測系統(tǒng)。最重要地，使用依賴于外部調(diào)控的信號，本發(fā)明的系統(tǒng)能夠鑒定在不同分子之間產(chǎn)生的潛在的組成型締合(即，異源二聚體)以及多個拷貝的相同分子產(chǎn)生的那些(即，寡聚體)，由此賦予區(qū)分組成型締合和隨機性締合的能力。在本發(fā)明的第一方面中，提供一種用于檢測分子締合的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括i).第一試劑，其包括與第一報道成分偶聯(lián)的第一相互作用組；ii).第二試劑，其包括與第二報道成分偶聯(lián)的第二相互作用組；iii).第三試劑，其包括第三相互作用組；iv).調(diào)控劑；和v).檢測器；其中所述第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生能夠由所述檢測器檢測的信號；并且其中所述調(diào)控劑調(diào)控所述第二相互作用組與所述第三相互作用組的締合；以使由所述檢測器監(jiān)測由所述第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生的信號組成監(jiān)測所述第一和第三試劑的締合。所述系統(tǒng)還可以包括報道成分引發(fā)物，其中僅在存在所述報道成分弓i發(fā)物的條件下，所述第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生能夠由所述檢測器檢測的信號。在本發(fā)明的第二方面中，提供一種檢測分子締合的方法，所述方法包括下列步驟i).提供第一試劑，所述第一試劑包括與第一報道成分偶聯(lián)的第一相互作用組；ii).提供第二試劑，所述第二試劑包括與第二報道成分偶聯(lián)的第二相互作用組；iii).提供第三試劑，所述第三試劑包括第三相互作用組；iv).提供調(diào)控劑；其中；所述第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生信號；并且其中所述調(diào)控劑調(diào)控所述第二相互作用組與所述第三相互作用組的締合；然后v).檢測和/或監(jiān)測由所述第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生的任何信號；從而通過所述檢測器監(jiān)測由所述第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生的信號組成監(jiān)測所述第一和第三試劑的締合。在檢測和/或監(jiān)測由所述第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生的任何信號的步驟之前，所述方法還可以包括提供報道成分引發(fā)物的步驟，其中僅在存在所述報道成分引發(fā)物的條件下，所述第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生能夠由檢測器檢測的信號。在本發(fā)明的一種形式中，提供報道成分引發(fā)物和提供調(diào)控劑的步驟，在提供第一、第二和第三試劑的步驟之后發(fā)生。在本發(fā)明的特別有利的形式中，所述第一、第二和第三試劑通過在向其中引入調(diào)控劑的細(xì)胞中共表達(dá)的方式提供。在第三方面中，本發(fā)明提供一種用于確定當(dāng)?shù)诙鞍着c第一蛋白締合時，測試化合物是否與第二蛋白相互作用和/或其程度的方法，所述方法包括下列步驟a).使所述測試化合物與系統(tǒng)接觸，所述系統(tǒng)包括i).第一試劑，所述第一試劑包括與第一報道成分偶聯(lián)的第一蛋白；ii).第二試劑，所述第二試劑包括與第二報道成分偶聯(lián)的相互作用組；iii).第三試劑，所述第三試劑包括第二蛋白；其中所述第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生信號；并且其中調(diào)控劑調(diào)控所述相互作用組與所述第二蛋白的締合；b).確定信號，作為當(dāng)所述第二蛋白與第一蛋白締合時，所述測試化合物是否與第二蛋白相互作用和/或其程度的確定。在一個實施方案中，第二蛋白是受體，并且本發(fā)明的第三方面包括用于確定當(dāng)?shù)诙鞍着c第一蛋白締合時，測試化合物是否是第二蛋白的激動劑的方法，并且確定信號作為當(dāng)所述第二蛋白與第一蛋白締合時，所述測試化合物是否與第二蛋白相互作用和/或相互作用的程度的確定的步驟更具體地包括這樣的步驟，即，檢測信號的增加，作為當(dāng)所述第二蛋白與第一蛋白締合時，所述測試化合物是否是第二蛋白的激動劑和/或其程度的確定。所述第一蛋白也可以是受體。在一個實施方案中，第二蛋白是受體，并且本發(fā)明的第三方面包括用于確定當(dāng)?shù)诙鞍着c第一蛋白締合時，測試化合物是否是第二蛋白的拮抗劑或部分激動劑和/或其程度的方法，所述方法包括下列步驟a).使所述測試化合物與系統(tǒng)接觸，所述系統(tǒng)包括i).第一試劑，所述第一試劑包括與第一報道成分偶聯(lián)的第一蛋白；ii).第二試劑，.所述第二試劑包括與第二報堪成分偶聯(lián)的相互作用組；'iii).第三試劑，所述第三試劑包括第二蛋白；iv).所述第二蛋白的激動劑；其中所述第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生信號；并且其中調(diào)控劑調(diào)控所述相互作用組與所述第二蛋白的締合；b).檢測信號的減少，作為當(dāng)?shù)诙鞍着c第一蛋白締合時，測試化合物是否是所述第二蛋白的拮抗劑或部分激動劑和/或其程度的確定。所述第一蛋白也可以是受體。在一個實施方案中，第二蛋白是組成型活性受體，并且本發(fā)明的第三方面包括一種用于確定當(dāng)所述第二蛋白與第一蛋白締合時，測試化合物是否是所述第二蛋白的逆激動劑和/或其程度的方法，并且確定信號作為當(dāng)所述第二蛋白與第一蛋白締合時所述測試化合物是否與第二蛋白相互作用和/或其程度的確定的步驟更具體地包括這樣的步驟，即，檢測信號的減少，作為當(dāng)所述第二蛋白與第一蛋白締合時，所述測試化合物是否是所述第二蛋白的逆激動劑的確定。在一個實施方案中，其中所述第一和第二蛋白均為受體，本發(fā)明包括用于針對第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體選擇性活性篩選測試化合物的方法，所述方法包括下列步驟a)確定當(dāng)?shù)诙鞍着c第一蛋白締合時，測試化合物是否與所述第二蛋白相互作用、和/或其程度；和b)如果在所述第二蛋白與第一蛋白締合的同時，所述測試化合物與所述第二蛋白相互作用，則確定在不存在所述第一蛋白的條件下，所述測試化合物是否與所述第二蛋白相互作用、或其程度；從而在所述第二蛋白與所述第一蛋白締合的同時與所述第二蛋白相互作用時表現(xiàn)出更大親和性和/或潛力和/或功效的測試化合物針對所述第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體是選擇性的。在一個實施方案中，其中所述第一和第二蛋白均為受體，本發(fā)明包括用于針對第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體選擇性拮抗性或部分激動性篩選測試化合物的方法，所述方法包括下列步驟a).通過使所述測試化合物與系統(tǒng)接觸，而確定所述測試化合物是否是所述第一蛋白/第二蛋白異源二聚體/-寡聚體的拮抗^或部分激動劑、和/或其程度，所述系統(tǒng)包括i).第一試劑，所述第一試劑包括與第一報道成分偶聯(lián)的第一蛋白；ii).第二試劑，所述第二試劑包括與第二報道成分偶聯(lián)的相互作用組；iii).第三試劑，所述第三試劑包括第二蛋白；iv).下列各項的激動劑所述第一蛋白、所述第二蛋白和/或所述第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體；其中所述第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生信號；并且其中調(diào)控劑調(diào)控所述相互作用組與所述第二蛋白的締合；b).檢測信號的減少，作為所述測試化合物是否是所述第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體的拮抗劑或部分激動劑和/或其程度的確定；c).如果所述測試化合物是所述第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體的拮抗劑或部分激動劑，則確定在不存在第一蛋白條件下所述測試化合物是否與第二蛋白相互作用、或其程度，以及在不存在第二蛋白的條件下所述測試化合物是否與第一蛋白相互作用、或其程度；從而在與所述第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體相互作用時表現(xiàn)出更大的激動性或部分激動性特性的測試化合物針對所述第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/_寡聚體是選擇性的。在一個實施方案中，其中所述第一和第二蛋白均為受體，提供用于針對第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體的選擇性拮抗性或部分激動性篩選測試化合物的方法，所述方法包括下列步驟a)通過使所述測試化合物與系統(tǒng)接觸，而確定所述測試化合物是否是第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體的拮抗劑或部分激動劑、和/或其程度，所述系統(tǒng)包括i).第一試劑，所述第一試劑包括與第一報道成分偶聯(lián)的第二蛋白；ii).第二試劑，所述第二試劑包括與第二報道成分偶聯(lián)的相互作用組；.iii).第三試劑，所述第三試劑包括第一蛋白；iv).下列各項的激動劑第二蛋白，第一蛋白和/或第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體；其中所述第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生信號；并且其中調(diào)控劑調(diào)控所述相互作用組與所述第一蛋白的締合；b)檢測信號的減少，作為所述測試化合物是否是第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體的拮抗劑或部分激動劑和/或其程度的確定；c)如果所述測試化合物是所述第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體的拮抗劑或部分激動劑，則確定在不存在第二蛋白的條件下所述測試化合物是否是所述第一蛋白的拮抗劑或部分激動劑、或其程度，以及在不存在第一蛋白的條件下所述測試化合物是否是所述第二蛋白的拮抗劑或部分激動劑、或其程度；從而在與所述第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體相互作用時表現(xiàn)出更大拮抗性或部分激動性特性的測試化合物針對所述第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體A寡聚體是選擇性的。在一個實施方案中，其中所述第一蛋白和第二蛋白均為受體，提供用于針對第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體選擇性逆激動性篩選測試化合物的方法，所述方法包括下列步驟a)通過使所述測試化合物與系統(tǒng)接觸，而確定所述測試化合物是否是第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體A寡聚體的逆激動劑、和/或其程度，所述系統(tǒng)包括i).第一試劑，所述第一試劑包括與第一報道成分偶聯(lián)的第一蛋白；ii).第二試劑，所述第二試劑包括與第二報道成分偶聯(lián)的相互作用組；iii).第三試劑，所述第三試劑包括組成型活性的第二蛋白；其中所述第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生信號；并且其中調(diào)控劑調(diào)控所述相互作用組與所述第二蛋白的締合；b)檢測信號的減少，作為所述測試化合物是否是第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體的逆激動劑和/或其程度的確定；—c)如果所述測試化合物是所述第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體的逆激動劑，則確定在不存在第二蛋白的條件下所述測試化合物是否是所述第一蛋白的逆激動劑、或其程度，以及在不存在第一蛋白的條件下所述測試化合物是否是所述第二蛋白的逆激動劑、或其程度；從而在與所述第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體相互作用時表現(xiàn)出更大逆激動性特性的測試化合物針對所述第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體是選擇性的。在一個實施方案中，其中所述第一蛋白和第二蛋白均為受體，提供用于針對第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體A寡聚體選擇性逆激動性篩選測試化合物的方法，所述方法包括下列步驟a)通過使所述測試化合物與系統(tǒng)接觸，而確定所述測試化合物是否是第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體的逆激動劑、和/或其程度，所述系統(tǒng)包括i).第一試劑，所述第一試劑包括與第一報道成分偶聯(lián)的第二蛋白；ii).第二試劑，所述第二試劑包括與第二報道成分偶聯(lián)的相互作用組；iii).第三試劑，所述第三試劑包括組成型的第一蛋白；其中所述第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生信號；并且其中調(diào)控劑調(diào)控所述相互作用組與所述第一蛋白的締合；b)檢測信號的減少，作為所述測試化合物是否是第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體的逆激動劑和/或其程度的確定；c)如果所述測試化合物是所述第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體的逆激動劑，則確定在不存在第一蛋白的條件下所述測試化合物是否是所述第二蛋白的逆激動劑、或其程度，以及在不存在第二蛋白的條件下所述測試化合物是否是所述第一蛋白的逆激動劑、或其程度；從而在與所述第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體相互作用時表現(xiàn)出更大逆激動性特性的測試化合物針對所述第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體是選擇性的。在本發(fā)明的第四方面中，提供用于檢測分子締合的試劑盒，所述試劑盒包括i).第一試劑，其包括與第一報道成分偶聯(lián)的第一相互作用組；ii).第二試劑，其包括與第二報道成分偶聯(lián)的第二相互作用組；iii).第三試劑，其包括第三相互作用組；iv).調(diào)控劑；和其中所述第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生能夠進(jìn)行檢測的信號；并且其中所述調(diào)控劑調(diào)控所述第二相互作用組與所述第三相互作用組的締合。在本發(fā)明的一種形式中，所述試劑盒還包括報道成分引發(fā)物，并且僅在存在所述報道成分引發(fā)物的條件下，所述第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生能夠進(jìn)行檢測的信號。21在本發(fā)明的一種形式中，所述調(diào)控劑增加第二相互作用組與第三相互作用組締合的傾向，從而通過檢測器檢測由第一和第二報道成分接近產(chǎn)生的信號組成對所述第一試劑與第三試劑的締合的檢測。應(yīng)該理解，所述調(diào)控劑可以與第一、第二或第三相互作用組的任一種相互作用，或同時與第一和第三相互作用組二者相互作用，或同時與第二和第三相互作用組相互作用，以調(diào)控第二相互作用組與第三相互作用組的締合。在本發(fā)明的一種備選形式中，所述調(diào)控劑降低第二相互作用組與第三相互作用組締合的傾向，從而通過檢測器檢測由所述第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生的信號的減少組成對第一和第三試劑解離的檢測。在本發(fā)明的高度有利的形式中，所述第一相互作用組與所述第三相互作用組不同。因此，在該形式中，對由第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生的信號的檢測組成對第一和第三相互作用組的異源-二聚化和/或-寡聚化的檢測。在本發(fā)明的優(yōu)選形式中，第三試劑不包括這樣的成分，所述成分能夠產(chǎn)生顯著干擾和/或有助于由第一和第二報道成分的接近所產(chǎn)生的信號的信號。因此，在該形式中，對由第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生的信號的檢測是容易的。在一些系統(tǒng)中，諸如其中所述第一和第三相互作用組以低水平表達(dá)，和/或其中所選擇的第一和第二報道成分的組合產(chǎn)生弱信號，按照上述本發(fā)明的優(yōu)選形式促進(jìn)信號的檢測可以使得測定法可行，或甚至更有利地，適合高通量篩選。在本發(fā)明的優(yōu)選形式中，所述第三試劑選自下組受體、離子通道、酶、載體、轉(zhuǎn)運蛋白、膜內(nèi)在蛋白質(zhì)、細(xì)胞骨架蛋白、黏附分子、信號傳導(dǎo)蛋白、支架蛋白、輔助蛋白、運輸?shù)鞍?、轉(zhuǎn)錄因子、核輔因子和核酸分子，如下文所定義。在本發(fā)明的優(yōu)選形式中，所述調(diào)控劑是配體或酶。在本發(fā)明的優(yōu)選形式中，所述第三試劑通過在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)而產(chǎn)生。在第三試劑通過在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)產(chǎn)生的情形中，本發(fā)明的方法可以在全細(xì)胞、細(xì)胞級分中或在不含細(xì)胞的系統(tǒng)中進(jìn)行。在本發(fā)明的特別有利的實施方案中，第一和第三相互作用組以受體形式提供，并且調(diào)控劑以調(diào)控所述第三相互作用組的受體的配體的形式提供，從而所述調(diào)控劑對由第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生的信號的調(diào)控是所述第一和第三相互作用組的受體的締合的指示。在本發(fā)明的第五方面中，提供用于關(guān)于針對第一蛋白和第二蛋白的異源二聚體的選擇活性篩選測試化合物的方法，所述方法包括下列步驟a).使處于增加濃度的所述測試化合物與系統(tǒng)接觸，所述系統(tǒng)包括i).第一試劑，所述第一試劑包括與第一報道成分偶聯(lián)的第一蛋白；ii).第二試劑，所述第二試劑包括與第二報道成分偶聯(lián)的相互作用組；iii).第三試劑，所述第三試劑包括第二蛋白；其中所述第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生信號；并且其中調(diào)控劑調(diào)控所述相互作用組與所述第二蛋白的締合；b).確定信號，作為處于每種濃度的所述測試化合物是否調(diào)控所述相互作用組與第二蛋白的所述締合的確定，以產(chǎn)生劑量-響應(yīng)曲線；c).確定所述劑量-響應(yīng)曲線的Hill斜率(Hillslope)，其中超過l的Hill斜率表示所述測試化合物與異源-二聚體相互作用。在本發(fā)明的第六方面中，提供通過本發(fā)明的系統(tǒng)、方法或試劑盒中的任一種鑒定的第一蛋白-第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體。.在本發(fā)明的第七方面中，提供通過本發(fā)明的系統(tǒng)、方法或試劑盒中的任一種鑒定的異源-二聚體或異源-寡聚體受體，其包括與至少一個第二受體亞基締合的至少一個第一受體亞基。在本發(fā)明的第八方面中，提供通過施用治療有效量的第二受體激動劑、逆激動劑或拮抗劑而治療患有第一受體-相關(guān)疾病的患者的方法，其中所述第一和第二受體形成通過本發(fā)明的系統(tǒng)、方法或試劑盒中的任一種鑒定的異源-二聚體/-寡聚體。在一個實施方案中，第二受體激動劑、逆激動劑或拮抗劑與第一受體激動劑、逆激動劑或拮抗劑共同施用。在本發(fā)明的第九方面中，提供通過施用治療有效量的第一受體激動23劑、逆激動劑或拮抗劑而治療患有第二受體-相關(guān)的疾病的患者的方法，其中所述第一和第二受體形成通過本發(fā)明的系統(tǒng)、方法或試劑盒中的任一種鑒定的異源-二聚體/-寡聚體。在一個實施方案中，第一受體激動劑、逆激動劑或拮抗劑與第二受體激動劑、逆激動劑或拮抗劑共同施用。在本發(fā)明的第十方面中，提供制備用于治療患有第一受體相關(guān)的疾病的患者的藥物的方法，所述方法包括使用治療有效量的第二受體激動劑、逆激動劑或拮抗劑，其中第一和第二受體形成通過本發(fā)明的系統(tǒng)、方法或試劑盒中的任一種鑒定的異源-二聚體/-寡聚體。所述藥物還可以包含第一受體激動劑、逆激動劑或拮抗劑。在本發(fā)明的第十一方面中，提供制備用于治療患有第二受體相關(guān)的疾病的患者的藥物的方法，所述方法包括使用治療有效量的第一受體激動劑、逆激動劑或拮抗劑，其中第一和第二受體形成通過本發(fā)明的系統(tǒng)、方法或試劑盒中的任一種鑒定的異源-二聚體/-寡聚體。所述藥物還可以包含第二受體激動劑、逆激動劑或拮抗劑。在本發(fā)明的第十二方面中，提供通過施用治療有效量的選擇性第二受體激動劑、拮抗劑或逆激動劑結(jié)合劑、或其片段而治療患有第一受體相關(guān)疾病的患者的方法，其中第一受體和第二受體形成通過前述權(quán)利要求的系統(tǒng)、方法或試劑盒中的任一種鑒定的異源-二聚體/-寡聚體。所述選擇性第二受體激動劑、拮抗劑或逆激動劑結(jié)合劑可以是抗體，包括人源化抗體、多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、CDR-移植的抗體(CDR-graftedantibody)和/或抗-獨特型抗體。在本發(fā)明的第十三方面中，提供通過施用治療有效量的選擇性第一受體激動劑、拮抗劑或逆激動劑結(jié)合劑、或其片段而治療患有第二受體相關(guān)疾病的患者的方法，其中第一受體和第二受體形成通過前述權(quán)利要求的系統(tǒng)、方法或試劑盒中的任一種鑒定的異源-二聚體/-寡聚體。所述選擇性第一受體激動劑、拮抗劑或逆激動劑結(jié)合劑可以是抗體，包括人源化抗體、多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、CDR-移植的抗體和/或抗-獨特型抗體。在本發(fā)明的第十四方面中，提供通過施用治療有效量的選擇性第一受體激動劑、拮抗劑或逆激動劑結(jié)合劑、或其片段而治療患有第二受體相關(guān)疾病的患者的方法，其中第一受體和第二受體形成通過前述權(quán)利要求的系統(tǒng)、方法或試劑盒中的任一種鑒定的異源-二聚體/-寡聚體。所述選擇性第一受體激動劑、拮抗劑或逆激動劑結(jié)合劑可以是抗體，包括人源化抗體、多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、CDR-移植的抗體和/或抗-獨特型抗體。在本發(fā)明的第十五方面中，提供在第二蛋白與第一蛋白締合時，通過本發(fā)明的方法鑒定的第二蛋白的激動劑。在本發(fā)明的第十六方面中，提供在第二蛋白與第一蛋白締合時，通過本發(fā)明的方法鑒定的第二蛋白的拮抗劑或部分激動劑。在本發(fā)明的第十七方面中，提供在第二蛋白與第一蛋白締合時，通過本發(fā)明的方法鑒定的第二蛋白的逆激動劑。在本發(fā)明的第十八方面中，提供通過本發(fā)明的方法鑒定的第一蛋白-第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體的選擇性激動劑和/或拮抗劑和/或逆激動劑。附圖簡述圖1顯示形成用于檢測分子締合的系統(tǒng)的基礎(chǔ)的試劑的組成第一試劑包括與第一報道成分偶聯(lián)的第一相互作用組；第二試劑包括與第二報道成分偶聯(lián)的第二相互作用組；并且第三試劑包括第三相互作用組。圖2顯示調(diào)控劑的施用怎樣調(diào)控第二相互作用組與第三相互作用組的締合，優(yōu)選地通過與所述第三相互作用組相互作用，單獨地、或同時與所述第一相互作用組相互作用。圖3顯示如果第一和第三相互作用組締合，對第二和第三相互作用組的締合的調(diào)控因此調(diào)控第一和第二報道成分的接近，由此調(diào)控能夠由檢測器檢測的信號。因此，通過檢測器監(jiān)測由第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生的信號組成對第一和第三試劑的締合的監(jiān)測。如果第一和第三相互作用組不締合，第一和第二報道成分將在空間上保持分離，并且不可能產(chǎn)生可檢測的信號。圖4顯示促甲狀腺素釋放激素受體(TRHR)作為IG1,Rluc作為RC1,卩-抑制蛋白2(barr2)作為IG2,Venus作為RC2和一系列不同GPCRs作為IG3。在用它們各自的配體的每一種處理后，在瞬時共表達(dá)TRHR/Rluc和barr2/Venus與pcDNA3，食欲肽受體2(OxR2),CXC趨化因子受體2(CXCR2)，血凝素表位-標(biāo)記的黑皮質(zhì)素受體3或4(HA-MC3R或HA-MC4R)，或多巴胺D2受體長形式(D2LR)或短形式(D2SR)的HEK293細(xì)胞上，在37C進(jìn)行eBRET測量。對于每種受體的不同配體處理(10"M)為促甲狀腺素釋放激素(TRH)用于TRHR/Rluc(與pcDNA3);食欲肽A(OxA)用于OXR2;白介素-8(IL-8)用于CXCR2;a-促黑激素(a-MSH)用于HA-MC3R，HA-MC4R;以及溴麥角環(huán)肽(BROM)用于D2LR和D2SR。圖5顯示促甲狀腺素釋放激素受體(TRHR)作為IG1，Rluc作為RC1,卩-抑制蛋白1(barrl)或(3-抑制蛋白2(barr2)作為IG2,EGFP作為RC2并且OxR2作為IG3。在瞬時共表達(dá)TRHR/Rluc禾BEGFP/barrl或EGFP/barr2與pcDNA3或OXR2的HEK293細(xì)胞上在37C進(jìn)行eBRET測量。配體處理為僅用OxA或TRH或者OxA和TRH二者組合。磷酸緩沖鹽溶液(PBS)用作賦形劑對照。圖6顯示促甲狀腺素釋放激素受體(TRHR)作為IG1,Rluc作為RC1,卩-抑制蛋白2(barr2)作為IG2,Venus作為RC2并且OxRl或OxR2作為IG3。在HEK293細(xì)胞上在37C進(jìn)行eBRET測量，所述HEK293細(xì)胞在用1(T6MOxRl-選擇性拮抗劑SB-334867-A預(yù)處理約40分鐘，并且然后加入10'6MOxA(IG3配體；調(diào)控劑)或1(T6MTRH(IG1配體)，或二者后，瞬時共表達(dá)TRHR/Rluc和barr2/Venus與pcDNA3，OxRl或OxR2。在未用拮抗劑預(yù)溫育的情形中，將細(xì)胞用PBS替代處理相同量的時間。圖7顯示促甲狀腺素釋放激素受體(TRHR)作為IG1，Rluc作為RC1,P-抑制蛋白1(barrl)或(3-抑制蛋白2(barr2)作為IG2，EGFP作為RC2以及血凝素表位-標(biāo)記的OxR2(HA-OxR2)作為IG3。在瞬時共表達(dá)TRHR/Rluc和EGFP/barrl或EGFP/barr2與pcDNA3或HA-OxR2的HEK293細(xì)胞上在37C進(jìn)行eBRET測量。配體處理為僅為OxA或TRH。磷酸緩沖鹽溶液(PBS)用作賦形劑對照。圖8顯示促甲狀腺素釋放激素受體(TRHR)作為IG1，Rluc作為RC1,26卩-抑制蛋白1(barrl)或(3-抑制蛋白1不依賴磷酸化作用的突變體R169E(barrlRW9E)作為IG2,EGFP作為RC2且OxR2作為IG3。在瞬時共表達(dá)TRHR/Rluc和EGFP/barrl或EGFP/barrlR169E與pcDNA3或OxR2的HEK293細(xì)胞上，在37C進(jìn)行eBRET測量。配體處理為僅用OxA或TRH。磷酸緩沖鹽溶液(PBS)用作賦形劑對照。圖9顯示在氨基酸335截短的促甲狀腺素釋放激素受體(TRHR335)作為IG1,Rluc作為RC1，(3-抑制蛋白1(barrl)作為IG2,EGFP作為RC2且OxR2或TRHR作為IG3。在瞬時共表達(dá)TRHR335/Rluc和EGFP/barrl與OxR2或TRHR的HEK293細(xì)胞上，在37C進(jìn)行eBRET測量。配體處理為僅用OxA或TRH。圖10顯示關(guān)于促甲狀腺素釋放激素受體(TRHR)作為IG1,Rluc作為RC1,(3-抑制蛋白2(barr2)作為IG2,Venus作為RC2且不存在IG3的劑量-響應(yīng)曲線。使用增加的TRH劑量，在瞬時共表達(dá)TRHR/Rluc，barr2/Venus和pcDNA3的HEK293細(xì)胞上，在37C進(jìn)行BRET測量。使用Prism(GraphPad)繪制S型劑量響應(yīng)曲線，假定Hill斜率為1或允許可變的斜率。在該圖的表格中包括關(guān)于可變斜率曲線的EC5Q和Hill斜率值。圖11顯示關(guān)于OxR2作為IG1，Rluc作為RC1，barr2作為IG2，Venus作為RC2且不存在IG3的劑量-響應(yīng)曲線。使用增加的OxA劑量，在瞬時共表達(dá)OxR2/Rluc,barr2/Venus和pcDNA3的HEK293細(xì)胞上在37C進(jìn)行BRET測量。使用Prism(GraphPad)繪制S型劑量響應(yīng)曲線，假定Hill斜率為1或允許可變的斜率。在該圖的表格中包括關(guān)于可變斜率曲線的EC5()和Hill斜率值。圖12顯示關(guān)于促甲狀腺素釋放激素受體(TRHR)作為IG1，Rluc作為RC1,卩-抑制蛋白2(barr2)作為IG2,Venus作為RC2和OxR2作為IG3的劑量-響應(yīng)曲線。使用增加的OxA劑量，在瞬時共表達(dá)TRHR/Rluc,barr2/Venus和OxR2的HEK293細(xì)胞上，在37C進(jìn)行BRET測量。使用Prism(GraphPad)繪制S型劑量響應(yīng)曲線，假定Hill斜率為1或允許可變的斜率。在該圖的表格中包括關(guān)于可變斜率曲線的EC5Q和Hill斜率值。顯示使用腔腸素h(coelenterazineh)和EnduRen作為兩種形式的Rluc底物(報道成分引發(fā)物)產(chǎn)生的曲線。圖13顯示在存在或不存在作為IG3的OxR2的條件下，關(guān)于TRHR作為IG1,Rluc作為RC1,barrl作為IG2，EGFP作為RC2的劑量-響應(yīng)曲線。使用增加的TRH劑量，在不存在OxR2的條件下，在瞬時共表達(dá)TRHR/Rluc和EGFP/bard的HEK293細(xì)胞上，以及使用增加的OxA劑量，用或不用1(T6MTRH的條件下，在瞬時共表達(dá)TRHR/Rluc和EGFP/barrl與OxR2的HEK293細(xì)胞上，在37C進(jìn)行BRET測量。還繪制通過將使用1(T6MTRH產(chǎn)生的配體-誘導(dǎo)的信號(來自TRH:TRHR/Rluc+EGFP/barrl曲線)與關(guān)于OxA:TRHR/Rluc+EGFP/barrl+OxR2曲線產(chǎn)生的每一個點相加而數(shù)學(xué)產(chǎn)生的曲線(TRHR/Rluc+EGFP/barrl+OxR2:TRH(10—6M)+OxA:計算的數(shù)據(jù))。圖14顯示在存在或不存在作為IG3的OxR2的條件下，關(guān)于TRHR作為IG1，Rluc作為RCl，barrl作為IG2，EGFP作為RC2的劑量-響應(yīng)曲線。使用增加的TRH劑量，在不存在OxR2的條件下，在瞬時共表達(dá)TRHR/Rluc和EGFP/barrl的HEK293細(xì)胞上，以及使用增加的OxA劑量，或增加的TRH劑量加1(T6MOxA，在瞬時共表達(dá)TRHR/Rluc和EGFP/barrl與OxR2的HEK293細(xì)胞上，在37C進(jìn)行BRET測量。還繪制通過將使用10—6MOxA產(chǎn)生的配體-誘導(dǎo)的信號(來自O(shè)xA:TRHR/Rluc+EGFP/barrl+OxR2曲線)與關(guān)于TRH:TRHR/Rluc+EGFP/barrl曲線產(chǎn)生的每一點相加而數(shù)學(xué)產(chǎn)生的曲線(TRHR/Rluc+EGFP/barrl+OxR2:TRH+OxA(1(T6M):計算的數(shù)據(jù))。圖15顯示關(guān)于TRHR335作為IG1,Rluc作為RC1，barr2作為IG2,Venus作為RC2且OxR2作為IG3的劑量響應(yīng)曲線。使用單獨的或組合的增加劑量的TRH和OxA，在瞬時共表達(dá)TRHR335/Rluc,barr2/Venus和OxR2的HEK293細(xì)胞上在37C進(jìn)行BRET測量。圖16顯示關(guān)于每種受體組合(IG1和IG3;在83分鐘內(nèi)捕獲的數(shù)據(jù))隨時間的累積eBRET讀數(shù)。TRHR為IG1,Rluc為RCl,barrl為IG2，EGFP為RC2且OxR2為IG3。對于每次實驗，轉(zhuǎn)染相同量的EGFP/barrl(IG2-RC2)。以恒定量(0.1ngDNA/L)轉(zhuǎn)染TRHR/Rluc(IGl-RCl)，而以變化量的DNA(O,0.01,0.05,0.1,0.5，0.7pgDNA/孔)轉(zhuǎn)染OxR2(IG3)。在向每個孔中加入10'6MOxA(調(diào)控齊IJ)后，在HEK293細(xì)胞上在37C進(jìn)行28eBRET領(lǐng)!)量。僅當(dāng)表達(dá)OxR2(IG3)時檢測到信號(在0嗎OxR2沒有記錄到任何信號)。圖17顯示關(guān)于TRHR作為IG1，Rluc作為RC1,barr2作為IG2,Venus作為RC2且OxR2作為IG3的劑量響應(yīng)曲線。在96-孔或384-孔微量培養(yǎng)板上，使用增加的OxA劑量，在瞬時共表達(dá)TRHR/Rluc,barr2/Venus和OxR2的HEK293細(xì)胞上在37C進(jìn)行BRET測量。圖18顯示OxR2作為IG1,Rluc8作為RC1,(3-抑制蛋白2(barr2)作為IG2,Venus作為RC2和血凝素表位-標(biāo)記的TRHR(HA-TRHR)作為IG3。在瞬時共表達(dá)OxR2/RJuc8和barr2/Venus與pcDNA3或HA-TRHR的HEK293細(xì)胞上，在37C進(jìn)行eBRET測量。配體處理為僅用OxA或TRH。磷酸緩沖鹽溶液(PBS)用作賦形劑對照。數(shù)據(jù)表示為配體-誘導(dǎo)的BRET比率。圖19顯示促甲狀腺素釋放激素受體(TRHR)作為IG1，Rluc8作為RC1,(3-抑制蛋白2(barr2)作為IG2，Venus作為RC2和血凝素表位-標(biāo)記的OxR2(HA-OxR2)作為IG3。在等分在96孔平板的所有孔中的瞬時共表達(dá)TRHR/Rluc8和barr2/Venus與HA-OxR2的HEK293細(xì)胞上，在37C進(jìn)行eBRET測量。在96孔板的前兩行和最后兩行(共48個孔)加入磷酸緩沖鹽溶液(PBS)作為賦形劑對照。數(shù)據(jù)表示為熒光/發(fā)光。圖20顯示促甲狀腺素釋放激素受體(TRHR)作為IG1,Rluc8作為RC1,卩-抑制蛋白2(barr2)作為IG2，Venus作為RC2和血凝素表位-標(biāo)記的OxR2(HA-OxR2)作為IG3。在等分在96孔板的所有孔中的瞬時共表達(dá)TRHR/Rluc8和barr2/Venus與HA-OxR2的HEK293細(xì)胞上，在37C進(jìn)行eBRET測量。將OxA加入到96孔板的中間4行(共48個孔)中。數(shù)據(jù)表示為熒光/發(fā)光。圖21顯示關(guān)于促甲狀腺素釋放激素受體(TRHR)作為IG1，Rluc8作為RC1,卩-抑制蛋白2(barr2)作為IG2，Venus作為RC2和血凝素表位-標(biāo)記的OxR2(HA-OxR2)作為IG3的z-因子數(shù)據(jù)。如在圖19和20中所示，在等分在96孔板的所有孔中的瞬時共表達(dá)TRHR/Rluc8和barr2/Venus與HA-OxR2的HEK293細(xì)胞上，在37C進(jìn)行eBRET測量。在96孔板的前兩行和最后兩行(共48個孔)加入磷酸緩沖鹽溶液(PBS)作為賦形劑對照。將OxA加入96孔板的中間四行(共48個孔)中。數(shù)據(jù)表示為熒光/發(fā)光。圖22顯示CC趨化因子受體5(CCR5)作為IG1,Topaz(TYFP)作為RC1,(3-抑制蛋白2(barr2)作為IG2,Rluc作為RC2和CC趨化因子受體2(CCR2)作為IG3。在瞬時共表達(dá)CCR5(5)TYFP(在CCR5和TYFP之間包含5個氨基酸的接頭)和barr2/Rluc與CCR2或pcDNA3的HEK293細(xì)胞上，在37C進(jìn)行eBRET測量。配體處理為單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP1;CCR2選擇性配體)，巨噬細(xì)胞炎性蛋白lb(MIPlb;CCR5選擇性配體)，或組合的MCP1和MIPlb二者。磷酸緩沖鹽溶液(PBS)用作賦形劑對照。圖23顯示關(guān)于CC趨化因子受體5(CCR5)作為IG1，Topaz(TYFP)作為RC1,(3-抑制蛋白2(barr2)作為IG2,Rluc作為RC2和CC趨化因子受體2(CCR2)作為IG3的劑量-響應(yīng)曲線。在用增加劑量的單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP1;CCR2選擇性配體)處理的瞬時共表達(dá)CCR5(5)TYFP(在CCR5和TYFP之間包含5個氨基酸的接頭)，barr2/Rluc和CCR2的HEK293細(xì)胞上，在37C進(jìn)行BRET測量。使用允許可變斜率的Prism(GraphPad)繪制S型劑量響應(yīng)曲線。圖24顯示緩激肽B2受體(B2R)作為IG1，Rluc8作為RC1,(3-抑制蛋白2(barr2)作為IG2,Venus作為RC2和血凝素表位-標(biāo)記的1型血管緊張素II受體(HA-AT1R)作為IG3。在用血管緊張素II(AnglI)處理的瞬時共表達(dá)B2R/Rluc8,barr2/Venus和HA-AT1R的HEK293細(xì)胞上，在37C進(jìn)行eBRET測量。磷酸緩沖鹽溶液(PBS訴作賦形劑對照。數(shù)據(jù)表示為配體-誘導(dǎo)的BRET比率。圖25顯示關(guān)于緩激肽B2受體(B2R)作為IG1,Rluc8作為RC1,(3-抑制蛋白2(barr2)作為IG2，Venus作為RC2和血凝素表位-標(biāo)記的1型血管緊張素II受體(HA-AT1R)作為IG3的劑量-響應(yīng)曲線。在用增加劑量的血管緊張素II(AnglI)處理的瞬時共表達(dá)B2R/Rluc8、barr2/Venus和HA-AT1R的HEK293細(xì)胞上，在37C進(jìn)行BRET測量。使用允許可變斜率的Prism(GraphPad)繪制S型劑量響應(yīng)曲線?？s略語ACEa-MSHAngIIAT1RB2RbarrBKBRETBROMCBCCRCCR5(5)TYFPCSFCXCRD2LRD2SRDOPeBRETECFPEGFPEYFPFRETGPCRsHAhES細(xì)胞血管緊張素-轉(zhuǎn)化酶.a-促黑激素.血管緊張素II.1型血管緊張素II受體.緩激肽B2受體.卩-抑制蛋白.緩激肽.生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移.溴麥角環(huán)肽.大麻素受體.CC趨化因子受體.通過5個氨基酸的接頭區(qū)域與TYFP連接的CCR5.腦脊液.CXC趨化因子受體.多巴胺D2受體(長形式).多巴胺D2受體(短形式).S阿片樣物質(zhì).延長的BRET:在延長的時間階段內(nèi)監(jiān)測的BRET.增強的藍(lán)綠熒光蛋白(Enhanced￡yanfluorescentgrotein)，其是維多禾(J亞7jC母(Je^omav/cton'a)綠色熒光蛋白基因(GFP)的變體.增強的綠色熒光蛋白(EnhancedQreenfluorescent￡rotein)是野生型GFP的紅移變體.增強的黃色熒光蛋白(EnhancedYellowfluorescent￡rotein).熒光共振能量轉(zhuǎn)移.G-蛋白偶聯(lián)的受體.血凝素表位-標(biāo)記.人胚胎干細(xì)胞.His(6)由6個連續(xù)的組氨酸殘基組成的組氨酸標(biāo)記.IG相互作用組.IL隱8白介素-S.KOPK阿片樣物質(zhì).MCP1單核細(xì)胞趨化蛋白1(CCR2選擇性配體).MCR黑皮質(zhì)素受體，MIPlb巨噬細(xì)胞炎性蛋白lb(CCR5選擇性配體).mRFPl單體紅色熒光蛋白.OR阿片樣物質(zhì)受體.OxA食欲肽A.OxB食欲肽B.OxR食欲肽受體.PBS磷酸緩沖鹽溶液.pcDNA3真核表達(dá)載體.RC報道成分.REM快眼動相.RET共振能量轉(zhuǎn)移.Rluc海腎(Renilla)螢光素酶.Rluc8改良的海腎螢光素酶.SWS慢波睡眠.TRH促甲狀腺素釋放激素.TRHR促甲狀腺素釋放激素受體.TYFP黃玉色熒光蛋白.(TopazyellowFluorescentprotein)Venus改良的黃色熒光蛋白.wt野生型.實施發(fā)明的最佳方式微在詳細(xì)描述本發(fā)明之前，應(yīng)該理解，本發(fā)明不限于具體舉例的生物發(fā)光或熒光蛋白、分析物、或本發(fā)明公開的方法。還應(yīng)該理解，本文所用的術(shù)語僅是為了描述本發(fā)明具體實施方案的目的，并不意欲限制。本文引用的所有的出版物，包括專利和專利申請，不管是在上文還是在下文中引用的，通過引用完全結(jié)合于此。然而，引用本文提到的出版物是為了描述和公開在所述出版物中報道的方法、試劑和載體的目的，并且所述方法、試劑和載體可以與本發(fā)明聯(lián)系使用。本文中沒有任何內(nèi)容應(yīng)該解釋為承認(rèn)本發(fā)明沒有資格由優(yōu)先權(quán)發(fā)明賦予日期在所述公開內(nèi)容之前。此外，除非另外指明，本發(fā)明的實施利用本領(lǐng)域技術(shù)范圍之內(nèi)的常規(guī)分子生物學(xué)、化學(xué)和熒光技術(shù)。所述技術(shù)是熟練的工人公知的，并且完全在參考文獻(xiàn)中解釋。關(guān)于熒光技術(shù)，參見，例如，Coligan,Dunn，Ploegh，Speicher和Wingfield"現(xiàn)代蛋白質(zhì)科學(xué)方法(CurrentprotocolsinProteinScience)"(1999)巻I和II(JohnWiley&Sons公司)；和Bailey,J.E.和Ollis,D.F.，生物化學(xué)工程基本原理(BiochemicalEngineeringFundamentals),McGraw-HillBookCompany,紐約，1986;Lakowicz,J.R.熒光光譜法原理(PrinciplesofFluorescenceSpectroscopy)，紐約PlenumPress(1983)。當(dāng)用在本文中且用在后附的權(quán)利要求中時，單數(shù)形式"一個(a)個(an),"和"所述(the)"包括復(fù)數(shù)，除非上下文另外清楚地指明。因此，例如，提及"一種蛋白(aprotein)"包括多種這樣的蛋白，并且提及"一種分析物(ananalyte)"是提及一種或多種分析物，等等。除非另外定義，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
普通技術(shù)人員常規(guī)理解相同的意思。盡管可以使用與本文所述的那些相似或等價的任何材料和方法來實施或檢驗本發(fā)明，但是現(xiàn)在描述優(yōu)選的材料和方法。本文所述的本發(fā)明可以包括一個或多個數(shù)值(例如，尺寸、濃度等)范圍。應(yīng)該理解數(shù)值范圍包括在該范圍內(nèi)的所有數(shù)值，包括限定該范圍的數(shù)值，以及接近這樣范圍的數(shù)值，所述數(shù)值導(dǎo)致與緊接近限定該范圍界限的數(shù)值的數(shù)值相同或基本相同的結(jié)果。在本說明書中，除非上下文另外需要，措辭"包括(comprise)"或變化，如"包括(comprises)"或"包括(comprising)"應(yīng)該理解為暗示包括所陳述的整數(shù)，或整數(shù)組，但是并不排除任何其它的整數(shù)或整數(shù)組。房縦正如從本發(fā)明的前述概述清楚看到的，本發(fā)明涉及檢測兩種試劑締合的系統(tǒng)、方法和試劑盒。術(shù)語"締合"，當(dāng)用于本文時，是指通過任何己知的直接或間接穩(wěn)定的原子或分子水平相互作用或它們的任意組合而締合的相互作用組的組合，其中所述相互作用包括，但不限于，鍵合相互作用，如共價結(jié)合、離子鍵合、氫鍵合、配位鍵合、或任何其它分子結(jié)合相互作用，靜電相互作用，極性或疏水性相互作用，或任何其它經(jīng)典或量子機械穩(wěn)定原子或分子相互作用。術(shù)語"締合"還包括涉及相互作用組的任何相互作用或構(gòu)象變化，其使得報道成分充分接近足以產(chǎn)生信號。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，RCs之間的距離優(yōu)選在1-10nm范圍內(nèi)。不需要在試劑的IG與RC之間的直接物理接觸，并且其可以由一個或多個連接分子介導(dǎo)。還從本發(fā)明的前述概述中清楚的是，主要目的締合是通過第二和第三試劑締合的方式所檢測的第一和第三試劑的締合。更具體地，目的締合是通過第二和第三試劑的相互作用組的締合的方式所檢測的第一和第三試劑的相互作用組的締合，所述第二和第三試劑的相互作用組的締合本身通過由第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生的信號進(jìn)行檢測。在第二和第三試劑的締合中重要的是其受調(diào)控劑調(diào)控的程度，并且由此指示所述第一和第三試劑締合的潛在的組成性性質(zhì)。第一、第二鄉(xiāng)三淑y第一和第二試劑二者均包括相互作用組(IG),其中所述IG直接或間接地與報道成分(RC)偶聯(lián)。第三試劑包括IG?？梢杂欣丶庸せ蛐揎椩噭园瘜W(xué)基團、肽序列、蛋白或核酸分子，其可以(i)促進(jìn)它們的純化和/或(ii)使它們靶向真核宿主細(xì)胞的亞細(xì)胞區(qū)室和/或(iii)當(dāng)加入到圍繞細(xì)胞的介質(zhì)中時，能使它們穿過真核細(xì)胞的細(xì)胞膜和/或(iv)能使它們的表達(dá)水平通過利用抗體或其它方法進(jìn)行評估。當(dāng)用于本文時，術(shù)語"相互作用組"或"IG"是指與另一種IG直接或間接相互作用的分子或分子復(fù)合物。因此，第一、第二和第三試劑的相互作用組或IG可以是化合物、蛋白、蛋白結(jié)構(gòu)域、蛋白環(huán)、蛋白-末端、肽、激素、蛋白-脂質(zhì)復(fù)合物、脂質(zhì)、碳水化合物、包含碳水化合物的化合物、核酸、寡核苷酸、藥劑、藥物耙、抗體、抗原性物質(zhì)、病毒、細(xì)菌、和細(xì)胞或任何它們的復(fù)合物。此外或備選地，每個相互作用組可以是任何類型的受體、離子通道、酶、載體、轉(zhuǎn)運蛋白、膜內(nèi)在蛋白質(zhì)、細(xì)胞骨架蛋白、黏附分子、信號傳導(dǎo)蛋白、支架蛋白、輔助蛋白、運輸?shù)鞍?、轉(zhuǎn)錄因子、核輔因子或核酸分子，如下文所定義。當(dāng)?shù)谝?、第二和第三相互作用組中的任一個或每一個是核酸分子時，那么可以使用任何形式的核酸分子。例如，所述核酸分子可以包括基因組脫氧核酸(DNA),重組DNA,互補(complimentary)DNA(cDNA)，肽核酸CPNA)，核糖核酸(RNA),包含異形核RNA(hnRNA)的RNA,轉(zhuǎn)移RNA(tRNA),小干擾RNA(siRNA),信使RNA(mRNA),或核糖體RNA(rRNA)以及它們的雜交分子。本質(zhì)上，所述相互作用組是能夠與一個或多個其它實體形成復(fù)合物的實體。例如，在本發(fā)明的情形中，抗體是第一IG，原因在于它能夠與抗原形成復(fù)合物，其中所述抗原可以是第二IG(見下文)。本發(fā)明的IG的另一個實樹是配體，其能夠與受體形成復(fù)合物。另一個實例是酶與其底物的相互作用。另外，所述IGs可以是同一分子的部分。因此，例如，G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的第三胞內(nèi)環(huán)可以是第一IG，且同一受體的C-末端可以是第二IG，它們將在受體被激活或滅活時締合。源飾調(diào)控劑直接(諸如配體)或間接地(諸如通過改變pH或溫度)調(diào)控第二相互作用組與第三相互作用組的締合。所述調(diào)控劑可以通過與所述第一、第二或第三相互作用組中的一種或多種相互作用而調(diào)控第二相互作用組與第三相互作用組的締合。然而，在本發(fā)明的優(yōu)選形式中，所述調(diào)控劑可以通過單獨與第三相互作用組相互作用、或同時與第一相互作用組相互作用而調(diào)控第二相互作用組與第三相互作用組的締合。在本發(fā)明的另一個有利形式中，組合加入多于一種調(diào)控劑。這可以包括與通過與第一相互作用組相互作用而調(diào)控第二相互作用組與第三相互作用組的締合的調(diào)控劑組合，加入通過與第三相互作用組相互作用而調(diào)控第二相互作用組與第三相互作用組的締合的調(diào)控劑。從本發(fā)明的概述中清楚的，第一和第二試劑包括與相互作用組偶聯(lián)的報道成分。當(dāng)用于本文時，術(shù)語"偶聯(lián)的"、"直接偶聯(lián)的"和"間接偶聯(lián)的"意指所述報道成分與IG附著或締合，以形成能夠進(jìn)行分析或檢測的試劑。優(yōu)選的偶聯(lián)方法是由所述IGs和RCs的性質(zhì)確定的。第一和第二報道成分可以是能夠發(fā)射可檢測信號的任何已知的化合物、有機的或無機的、蛋白質(zhì)的或非蛋白質(zhì)的或它們的復(fù)合物。在一些實施方案中，所述報道成分選自由下列各項組成的組酶、發(fā)光分子或它們的部分、熒光分子或它們的部分以及轉(zhuǎn)錄因子或其它與所述相互作用組偶聯(lián)的分子。第一和第二報道成分與第一和第二相互作用組的直接或間接的偶聯(lián)分別可以通過任何已知的共價或非共價方式偶聯(lián)兩種分子，包括化學(xué)交聯(lián)、蛋白的化學(xué)修飾、氨基酸的化學(xué)修飾、核酸的化學(xué)修飾、碳水化合物的化學(xué)修飾、脂質(zhì)的化學(xué)修飾、任何其它有機或無機分子的化學(xué)修飾、生物素-抗生物素蛋白相互作用、抗原-抗體相互作用和核酸雜交。在本發(fā)明的一種形式中，第一和/或第二報道成分分別通過接頭與第一和/或第二相互作用組間接偶聯(lián)。在一些實施方案中，所述接頭包括酶裂解位點。直接偶聯(lián)蛋白質(zhì)IG和蛋白質(zhì)RC的方法的實例是遺傳融合，其中融合編碼IG和生物發(fā)光或熒光蛋白的基因以產(chǎn)生單一多肽鏈。直接偶聯(lián)方法的另一個實例是綴合，其中IG與熒光團的偶聯(lián)使用酶如連接酶、水解酶、特別是磷酸酶、酯酶和糖苷酶、或氧化還原酶、特別是過氧化物酶實現(xiàn)。在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實施方案中，第一和/或第二相互作用組與第一和/或第二報道成分，分別地，每一個各自形成單一多肽鏈的一部分。其它官能團可以形成同一多肽鏈的一部分。例如，第一和/或第二相互作用組與第一和/或第二報道成分分別形成單一多肽鏈的一部分，其另外包括-(i)編碼用于親和純化融合構(gòu)建體的肽序列的序列；和/或Cii)編碼將融合構(gòu)建體導(dǎo)向真核細(xì)胞的亞細(xì)胞區(qū)室的肽序列的序列；和/或(iii)編碼促進(jìn)穿透真核細(xì)胞膜的肽序列的序列；和域(iv)能夠使得通過使用抗體或其它方法評估表達(dá)水平的序列；以產(chǎn)生所述相互作用組、所述報道成分和所述其它肽的融合蛋白。適，叛遭成辦第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生能夠通過檢測器檢測的信號。第一和第二RCs組成互補對，在這種意義上，在不影響本發(fā)明的功能的條件下，第一RC可以與第二RC互換(即，第一RC與第二IG偶聯(lián)，和第二RC與第一IG偶聯(lián))。因此，報道成分可以包括酶、發(fā)光或生物發(fā)光分子、熒光分子、和轉(zhuǎn)錄因子或通過結(jié)合酶裂解位點的接頭與所述相互作用組偶聯(lián)的其它分子。簡言之，能夠由于它們的空伺接近而發(fā)射可檢測信號的任何已知分子，有機的或無機的，蛋白質(zhì)的或非蛋白質(zhì)的或它們的復(fù)合物。在本發(fā)明的優(yōu)選形式中，第三試劑不包括能夠產(chǎn)生顯著干擾和/或有助于由第一和第二報道成分的接近所產(chǎn)生的信號的信號的報道成分。因此，在該形式中，對由第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生的信號的檢測是便利的。優(yōu)選地，在存在報道成分引發(fā)物的條件下，由第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生的信號選自由下列各項組成的組發(fā)光、熒光和比色變化。在一些實施方案中，發(fā)光由選自由下列各項組成的組的生物發(fā)光蛋白產(chǎn)生螢光素酶、半乳糖苷酶、內(nèi)酰胺酶、過氧化物酶、或能夠在存在適第一和第二報道成分的優(yōu)選組合包括發(fā)光報道成分與熒光報道成分，發(fā)光報道成分與非熒光猝滅劑，熒光報道成分與非熒光猝滅劑，能夠共振能量轉(zhuǎn)移的第一和第二熒光報道成分。然而，第一和第二報道成分的有用組合決不限于所述這些。本發(fā)明可以使用的第一和第二報道成分的備選組合包括在US6893827(Applera公司)；US6800445(Applera公司)；US7049076(Sentigen生物科學(xué)公司，和紐約城哥倫比亞大學(xué)的托管人(SentigenYork));US6110693(杜克大學(xué)(DukeUniversity));US5891646(杜克大學(xué)(DukeUniversity));和WO/2005/031309(ODYSSEYTHERA公司)中示例的那些。在本發(fā)明的一些方面中，所述檢測系統(tǒng)包括RCs對的組合，其能夠作為供體和/或受體分子。因此，按照本發(fā)明可以使用的RCs可以基于其物理性質(zhì)選擇，如在共振能量轉(zhuǎn)移(RET)領(lǐng)域中已知的，這樣選擇二者，以使它們一起包括RET對的供體和受體分子。如果在RET對中的RCs之一是生物發(fā)光蛋白，則該RET稱為生物發(fā)光RET(BRET)。如果形成RET對的兩個RCs均為熒光團，則所得到的RET稱為熒光RET(FRET)。已知的適宜供體和受體對的實例包括海腎螢光素酶和黃色熒光蛋白;海腎螢光素酶和綠色熒光蛋白；藍(lán)綠熒光蛋白和黃色熒光蛋白；熒光素和四甲基羅丹明；5-(2'-氨基乙基)氨基萘-l-磺酸(EDANS)和熒光素；通常參見R.Haugland,熒光探針和研究化學(xué)品手冊(HandbookofFluorescentProbesandResearchChemicals)(第六版1995)。一種或兩種熒光團可以是熒光蛋白，諸如綠色熒光蛋白，并且在IG是通過制備IG和熒光蛋白的融合蛋.白獲得的蛋白或肽時，使用熒光蛋白作為熒光團是特別有利的?；パa的第一和第二報道成分可以以單一蛋白諸如酶、或熒光團的互補部分的形式提供，在使得所述互補部分接近時，恢復(fù)其功能。例如，分裂-Rluc互補(Split-Rluccomplementation)(Paulmurugan，R.禾PGambhir,S.S.使用裂化合成的海腎螢光素酶蛋白-片段-輔助的互補性監(jiān)測蛋白-蛋白相互作用(Monitoringprotein-proteininteractionsusingsplitsynthetic7em.〃a/wci/^oeprotein-fragment-assistedcomplementation).^七學(xué)年干l)(^"a/,C7z泄)75,1584-1589(2003))和分裂GFP(splitGFP)互補(Hu,C.D.禾口Kerrpola,T.K.使用多色熒光互補分析同時顯現(xiàn)活細(xì)胞中的多種蛋白相互作用(Simultaneousvisualisationofmultipleproteininteractionsinlivingcellsusingmulticolourfluorescencecomplementationanalysis)自然生物技術(shù)(TVaf.B/o&c/zwo/.)21,539-545(2003))。在一個實施方案中，第一和/或第二報道成分之一是非熒光猝滅劑。所述非熒光猝滅劑可以是具有吸收光且猝滅熒光和/或發(fā)光的能力的任何已知的非熒光發(fā)光團。因此，所述非熒光猝滅劑可以是任何己知的分子，不管是蛋白質(zhì)的或非蛋白質(zhì)的。優(yōu)選地，所述非熒光猝滅劑選自由下列各項組成的組dabcy;非熒光pocilloporins,QSY-7，QSY-9,QSY-21,QSY-35,BHq畫l,BHQ-2和BHQ-3。當(dāng)用于本文時，術(shù)語"發(fā)光分子"是指能夠產(chǎn)生發(fā)光的任何分子。生物發(fā)光蛋白包括螢光素酶，其已經(jīng)在細(xì)菌、真菌、昆蟲和海洋動物中發(fā)現(xiàn)。它們在發(fā)光條件下催化特定底物(通常已知為螢光素)的氧化(Hastings(1996)基因(Gene)173,5-11)。最廣泛已知的底物是腔腸素(coelenterazine)，其存在于刺胞動物、橈足動物、Chaetgnaths、蹄水母動物、十足蝦類(decapodshrimps)、糠蝦(mysidshrimps)、放射蟲禾口一些魚類中(Greer和Szalay,(2002),發(fā)光(I薩."證腳)，17,43-74)。兩種最廣泛使用的螢光素酶是(i)Renilla螢光素酶(來自凡re"z/onw'力，一種35kDa的蛋白質(zhì)，其利用腔腸素作為底物并且在480nm處發(fā)光(Lorenz等，(1991),園，88,4438-4442);和(ii)螢火蟲螢光素酶(來自北美螢火蟲(P/zo">2Wp_yra/&))，一種61kDa的蛋白質(zhì)，其利用螢光素作為底物并且在560nm處發(fā)光(deWet等，(1987),分子細(xì)胞生物學(xué)(Mo/.CW/.脂.),2987,39725-737)。己經(jīng)開發(fā)了Renilla螢光素酶的突變形式，從而提高在涉及生物發(fā)光的測定法中的表現(xiàn)。已經(jīng)利用人源化的密碼子應(yīng)用來使得螢光素酶DNA對于哺乳動物轉(zhuǎn)錄機制"較不是外源性的"，并且確保最大的基因表達(dá)。點突變的密碼子-人源化的Renma螢光素酶的實例是Rluc2(C124A7M185V)未突變的螢光素酶相比表現(xiàn)出顯著改善的性質(zhì)，包括在與腔腸素類似物:起使用時增加的光輸出和在血清中在37°C更好的穩(wěn)定性(Loening等(2006)蛋白質(zhì)加工設(shè)計選擇(尸ra^"Z)m19，391-400;Loening等(2007)自然方法學(xué)(AtoMe溈oA)4，641-643;De等(2007)癌癥研究(Ca"cerD67,7175-7183)。Gaussia螢光素酶(來自pn'"cep力也己經(jīng)用在生化測定法中(Verhaegen等，(2002),化學(xué)年刊""a/.C/zew.),74:4378-4385)。Gaussia螢光素酶是一種20kDa的蛋白質(zhì)，其在快速反應(yīng)中氧化腔腸素，導(dǎo)致在470nm處的亮光發(fā)射。理想地，只要底物存在，與本發(fā)明一起使用的生物發(fā)光蛋白就表現(xiàn)出強烈且恒定的光發(fā)射。由于生物發(fā)光蛋白與IGs偶聯(lián)，優(yōu)選地使用具有小分子量的生物發(fā)光蛋白，以減小由于空間位阻抑制IGs之間的相互作用的可能性。另外，所述生物發(fā)光蛋白優(yōu)選地由單一多肽鏈組成，以促進(jìn)第一和第二試劑的便利生產(chǎn)。另外，所述生物發(fā)光蛋白優(yōu)選地不形成寡聚體或聚集體，所述寡聚體或聚集體另外能夠抑制與其偶聯(lián)的IG的功能。所述生物發(fā)光蛋白Renilla螢光素酶、Gaussia螢光素酶和螢火蟲螢光素酶滿足所有或大部分這些標(biāo)準(zhǔn)。_^船當(dāng)用于本文時，術(shù)語"熒光分子"是指能夠發(fā)熒光或磷光的任何分子，包括蛋白。存在許多可以用在本發(fā)明中的熒光蛋白。例如，分子和細(xì)胞生物學(xué)中最廣泛應(yīng)用的熒光蛋白是來自水母維多利亞水母的綠色熒光蛋白(GFP)(Tsien,(1998),生物化學(xué)每年綜述"畫.Wev.腸c/亂),67，509-544)以及由其序列衍生的變體。通過點突變開發(fā)"增強的"熒光蛋白(例如，EGFP)，其增加溶解性和熒光并且促進(jìn)蛋白折疊(Zemicka-Goetz等，(1997),發(fā)育(Z)，/o/細(xì)f),124,1133-1137)。位置64的Phe點突變?yōu)長eu己經(jīng)增加蛋白在37口C的穩(wěn)定性，并且位置65的Ser點突變?yōu)門hr導(dǎo)致增加的熒光(Okabe等，(1997)，F(xiàn)EBS通訊(F五AS丄幼era)，407,313-319;ClontechPaloAlto，Calif.)。從Clontech商購的EGFP結(jié)合人源化的密碼子應(yīng)用，使其對于哺乳動物轉(zhuǎn)錄機制"較不外源性"且確保最大的基因表達(dá)。另外，綠色熒光蛋白的光譜特性可以通過特定氨基酸的基因定點誘變而改變，例如，已經(jīng)生產(chǎn)了EGFP的藍(lán)色(EBFP)、藍(lán)綠(ECFP)和黃色(EYFP)突變體(Zhang等，(2002),自然分子細(xì)胞生物學(xué)綜述(Ato.Mo/.Ce〃，3,906-918)。另一類重要的熒光蛋白是來自珊瑚物種圓盤海葵(iX5cowma)(DsRed)(Matz等，(1999),自然生物技術(shù)(iVaf.歷otec/z"o/.)17，969-973)和紫點?？?//eferacfecWspa)(HcRed)(Gurskaya等，(2001),FEBS通訊(F五^SI^".)507,16-20)的紅色熒光蛋白(RFP)。在一些實施方案中，具有高熒光量子產(chǎn)量的熒光蛋白與本發(fā)明一起使用。在一些實施方案中，與本發(fā)明一起使用的熒光蛋白的分子量應(yīng)該足夠小以避免IGs之間的空間位阻。優(yōu)選地，使用單體蛋白來避免聚集和對偶聯(lián)的IG功能的千擾。GFP形成弱二聚體，但是其二聚化的傾向可以通過將在二聚化界面的疏水性氨基酸突變而最小化(Zacharias等，(2002)，科學(xué)(5W,e),296,913-916)。紅色熒光蛋白DsRed是一種專性四聚體蛋白。最近，已經(jīng)描述了DsRed序列的17個點突變，其使得DsRed成為二聚體蛋白(二聚體2)。該二聚體的亞基可以通過肽接頭連接以形成物理學(xué)以單體作用的束縛的二聚體(tethereddimer)(t-二聚體2(12))。其余16個點突變將該二聚體2轉(zhuǎn)換為單體變體(mRFPl)(Campbell等，(2002),/W^S.t/SA99,7877-7882)。紅色熒光蛋白HcRed是一種二聚體蛋白，并且作為單體是不發(fā)熒光的。然而，兩個亞基可以通過短肽接頭連接第一亞基的C端與第二亞基的N端而融合。該融合的蛋白(t-HcRed)有效地以單體單元作用，與t-二聚體2(12)類似(Fradkov等，(2002)，生化雜志(歷oc/7em.丄),368,17-21)。優(yōu)選地，與本發(fā)明一起使用的熒光蛋白表現(xiàn)出形成它們的熒光團的短成熟時間。在這些分子中的熒光團通過多肽鏈的特定重排而形成。該過程可以花費小于1小時到大于24小時(Zhang等,(2002)，自然分子細(xì)胞生物學(xué)綜述(A/flf.Mo/.Ce〃歷o/.),3,906-918)。由于慢成熟過程限制功能性RC的可用性和濃度，故優(yōu)選使用快速成熟的蛋白?？焖俪墒斓臒晒獾鞍兹缇G色熒光蛋白EGFP及其顏色變體以及紅色熒光蛋白t-二聚體2和mRFP1。慢成熟蛋白例如DsRed和HcRed。在一些實施方案中，熒光由選自由下列各項組成的組的熒光蛋白產(chǎn)生:綠色熒光蛋白(GFP)或其變體，GFP的藍(lán)色熒光變體(BFP),GFP的藍(lán)綠熒光變體(CFP),GFP的黃色熒光變體(YFP),增強的GFP(EGFP),增強的CFP(ECFP),增強的YFP(EYFP),GFPS65T，深黃綠色(Emerald),黃玉色(TYFP),Venus,檸檬色(Citrine),mCitrine,GFPuv,不穩(wěn)定的EGFP(dEGFP),不穩(wěn)定的ECFP(dECFP),不穩(wěn)定的EYFP(dEYFP),mCFPm，天藍(lán)色(Cerulean)，T-藍(lán)寶石色，CyPet,YPet,mKO,HcRed，t-HcRed,DsRed，DsRed2，DsRed-單體，J-Red,二聚體2,t-二聚體2(12),mRFPl,pocill叩orin,RenillaGFP,MonsterGFP,paGFP,Kaede蛋白和激發(fā)蛋白(kindlingprotein),藻膽蛋白和藻膽蛋白綴合物，包括B-藻紅蛋白、R-藻紅蛋白和別藻藍(lán)蛋白。熒光蛋白的其它實例包括mHoneydew,mBanana,mOrange，dTomato，tdTomato,mTangerine,mStrawberry,mCherry，mGrapel,mRaspberry，mGrape2,mPium(Shaner等(2005)自然方法學(xué)(A^.M"/zoA)，2,905-909)和在由TsienR等產(chǎn)生的成果之后命名的任何其它蛋白，以及在珊瑚中表達(dá)的任何熒光分子或其衍生物。有效用作螢光素酶的互補報道成分的特別有利的熒光蛋白是Venus(Nagai,T等，用于細(xì)胞-生物學(xué)應(yīng)用的具有有效成熟的萆色熒光蛋白的變體(Avariantofyellowfluorescentproteinwithefficientmaturationforcell-biologicalapplications),自然生物技術(shù)(iVaf.Biotechnol.)(2002)20,87-90;和Hamdan，F(xiàn).等(2005)使用基于生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移1的卩-抑制蛋白2募集測定法高通量篩選G蛋白-偶聯(lián)的受體拮抗齊U(High-ThroughputScreeningofGProtein—CoupledReceptorAntagonistsUsingaBioluminescenceResonanceEnergyTransfer1—BasedBeta-Arrestin2RecruitmentAssay),生物分子篩選雜;志(Jbwrwa/o/J5/omo/ecw/arScreemV^)10,463-475》當(dāng)用于本文時，術(shù)語"熒光部分(fluorescentmoiety)"或"熒光部分"互換使用，并且是指能夠產(chǎn)生熒光的非蛋白質(zhì)分子。非蛋白質(zhì)熒光分子通常是可以與其它分子連接的小分子。每個非蛋白質(zhì)熒光分子具有特定的光譜特征。存在可以用在本發(fā)明中的許多不同的熒光部分。非限制性實例包括羅丹明、羅丹明衍生物、丹酰、7-羥基香豆素、熒光素、熒光素衍生物、俄勒崗綠、德克薩斯紅、AlexaFluor染料和Cy染料。關(guān)于本發(fā)明，非常具有吸引性的熒光部分種類是熒光納米晶體(Bruchez等，(1998),科學(xué)(5Wwce),281,2013-2016)。熒光納米晶體表現(xiàn)出強熒光，并且它們的熒光發(fā)射可以通過晶體尺寸在超過lOOOnm的波長范圍內(nèi)調(diào)整。所有的納米晶體的激發(fā)在相同波長下發(fā)射，不依賴于它們的熒光發(fā)射。因此，可以由相同光源或通過來自相同生物發(fā)光蛋白或熒光分子的RET激發(fā)不同的納米晶體。優(yōu)選地，使用具有高熒光量子產(chǎn)量的熒光部分。在一些實施方案中，熒光由選自由下列各項組成的組的熒光部分產(chǎn)生:AlexaFluor染料及衍生物，Bodipy染料及衍生物，Cy染料及衍生物，熒光素及衍生物，丹酰，7-羥基香豆素，熒光和發(fā)光微球體，熒光納米晶體,Marina藍(lán),Cascade藍(lán)，Cascade黃,Pacific藍(lán)，俄勒崗綠及衍生物，四甲基羅丹明及衍生物，.羅丹明及衍生物，德克薩斯紅及衍生物,稀土元素螯合劑或它們的任意組合或衍生物或具有熒光性質(zhì)的任何其它分子。最近報道了新型熒光部分，并且包括蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)成分二者(Griffin等，(1998),科學(xué)(Sc/證),281，269-272;Adams等,(2002),美國化學(xué)協(xié)會雜志a爿m.Ozem.Soc.),124,6063-6076)。聯(lián)砷-四半胱氨酸系統(tǒng)(biarsenical-tetracysteinesystem)融合包含短四半胱氨酸的肽與靶蛋白。該肽與細(xì)胞穿透性、非熒光生成聯(lián)砷染料形成穩(wěn)定的、熒光復(fù)合物。取決于染料的分子結(jié)構(gòu)，獲得不同的熒光團。叛微分微欽43在一些實施方案中，將使用至少一種報道成分引發(fā)物來由所述報道成分產(chǎn)生信號。當(dāng)用于本文時，術(shù)語"報道成分引發(fā)物"是指能夠使得第一和第二報道成分的組合在緊密接近的條件下產(chǎn)生可檢測的信號的分子、條件和/或能源。在一些實施方案中，所述報道成分引發(fā)物直接作用，而在其它實施方案中，該作用是間接的。優(yōu)選地，所述報道成分引發(fā)物是試劑，包括任何己知的化合物，有機的或無機的、蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)的、底物、配體、抗體、酶、核酸、碳水化合物、脂質(zhì)、藥物化合物、激動劑、拮抗劑、逆激動劑或化合物或它們的復(fù)合物；或是條件改變，包括溫度、離子強度或pH的改變；或是能源，包括光。所述報道成分引發(fā)物可以是報道基因。在一些實施方案中，所述報道成分引發(fā)物是可以與酶、轉(zhuǎn)錄因子、熒光或生物發(fā)光分子聯(lián)合使用產(chǎn)生信號的任何分子。報道成分引發(fā)物的實例包括用于生物發(fā)光反應(yīng)的底物，用于熒光團的激發(fā)光，響應(yīng)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的報道成分的報道基因，緩沖劑，適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)，釋放束縛(caged)的分子所需要的條件如UV輻射或利用內(nèi)源酶活性的活細(xì)胞，適宜的溫度、離子強度和pH以使包括酶和熒光團的蛋白適當(dāng)行使功能，和保持制備物存活性的適宜條件，包括使用緩沖劑和/或C02灌注。在生物發(fā)光的情形中，所述報道成分引發(fā)物將是底物。關(guān)于生物發(fā)光，底物的選擇可影響由生物發(fā)光蛋白產(chǎn)生的光的波長、強度和持續(xù)時間。例如，對于Renilla螢光素酶，腔腸素類似物是可用的，其在418-512nm之間引起光發(fā)射(Inouye等，(1997)，生化雜志(B/oc/zem,J.)，233，349-353)。己經(jīng)描述了一種腔腸素類似物(400A，'DeepBlueC')與Renilla螢光素酶在400nm處發(fā)光(PCT申請WO01/46691)。理想地，底物的半衰期是這樣的，以使光發(fā)射持續(xù)充足的時間階段從而在該時間階段內(nèi)檢測之。特別理想的是提供充足的半衰期以使在加入調(diào)控劑之前建立穩(wěn)定態(tài)的底物。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)EnduRen(參見Pfleger等，用于監(jiān)測活細(xì)胞中延長的蛋白-蛋白相互作用的延長的生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(eBRET)(Extendedbioluminescenceresonanceenergytransfer(eBRET)formonitoringprolongedprotein-proteininteractionsinlivecells)(2006)細(xì)胞信號傳導(dǎo)(Ce//w/arSig朋///^),18,1664-1670)是高度優(yōu)選的備選物，特別是從高通量篩選的觀點來看。最近產(chǎn)生的雙脫氧腔腸素(bisdeoxycoelenterazine)(DeepBlueC)的保護衍生物可能在下述情形中對DeepBlueC是優(yōu)選的，所述情形即，該底物的光譜特性是有利的但是衰減動力學(xué)限制有效應(yīng)用(Levi等(2007)美國化學(xué)協(xié)會雜志CMwC7zem&c)129,11900-11901)。與本發(fā)明一起使用的底物優(yōu)選是細(xì)胞-透過性的，并且能夠通過細(xì)胞膜變?yōu)榧?xì)胞內(nèi)分子可用的。腔腸素及其大部分衍生物是高度細(xì)胞透過性的(Shimomura等，(1997),生化雜志(歷oc/^w./),326:297-298),而螢光素不有效穿過哺乳動物細(xì)胞的膜。然而，已經(jīng)開發(fā)了束縛的螢光素化合物，其通過細(xì)胞膜，并且一旦在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)部即可通過細(xì)胞酶或UV光釋放(Yang等，(1993)'生物技術(shù)(歷o/w/7"/《^s),15，848-850)。當(dāng)用于本文時，術(shù)語"能源"是指能夠激活特定的熒光團的任何能源。在一些實施方案中，所述能源是光。光源的非限制性實例包括激光、汞燈或氙燈。光源還具有將發(fā)射的光限制為特定波長或特定波長范圍的工具。這可以是，例如，安裝在濾波器輪或濾波器載玻片上的適當(dāng)?shù)臑V波器、單色光鏡、分色鏡或僅產(chǎn)生單波長光的激光。如上述討論，在第一和第二試劑中相互作用組可以與報道成分直接或間接偶聯(lián)。在所述報道成分是生物發(fā)光或熒光蛋白的情形中，所述生物發(fā)光或熒光蛋白可以直接或間接地(例如，通過接頭基團)偶聯(lián)(例如，共價鍵合)到適當(dāng)?shù)腎G上。偶聯(lián)生物發(fā)光或熒光蛋白與試劑的方式在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的。偶聯(lián)蛋白質(zhì)IG和蛋白質(zhì)RC的直接方法的實例是遺傳融合，其中融合編碼IG和生物發(fā)光或熒光蛋白的基因，以產(chǎn)生單一多肽鏈。直接偶聯(lián)方法的另一個實例是綴合，其中IG與熒光團的偶聯(lián)使用酶，如連接酶、水解酶、特別是磷酸酶、酯酶和糖苷酶、或氧化還原酶、特別是過氧化物酶進(jìn)行。與可以遺傳融合到蛋白質(zhì)IGs上的蛋白質(zhì)熒光部分相反，熒光部分和非蛋白質(zhì)、非熒光猝滅劑具有這樣的缺點，即，它們附著到蛋白質(zhì)IGs上更困難，并且通常不能在活細(xì)胞內(nèi)發(fā)生。直接偶聯(lián)非蛋白質(zhì)熒光部分和非熒光猝滅劑與IGs的實例包括與反應(yīng)基共價連接的部分，其能夠與IG的45特定化學(xué)基團形成共價鍵。實例是與半胱氨酸殘基的SH-基團反應(yīng)的碘乙酰胺和馬來酰亞胺，和與賴氨酸殘基的NH、基團反應(yīng)的琥珀酰亞胺酯、羧酸和磺酰氯(Ishii等,(1986),生物物理學(xué)雜志丄)50,75-89;Staros等，(1986),生物化學(xué)年刊(^"a/.歷oc/zem.)156,220-222;Lefevre等,(1996)，生物綴合物化學(xué)(歷oco"y唯.7,482-489)。將熒光部分附著到IG上的另一種已知的方法典型地包括將熒光部分移接到IG上或通過在其合成過程中將熒光部分結(jié)合到IG中。重要的是，所標(biāo)記的IG保留未標(biāo)記的IG的重要性質(zhì)，如與受體或核酸的選擇性結(jié)合、特定酶的激活或抑制、或結(jié)合到生物膜內(nèi)的能力。存在廣泛種類的熒光部分可用，包括，例如，聯(lián)吡咯亞甲基硼二氟化物染料(dipyrrometheneborondifluoridedyes)、羅丹明、羅丹明衍生物、德克薩斯紅、丹酰、7-羥基香豆素、等等。對于可以使用的各種標(biāo)記或信號產(chǎn)生系統(tǒng)的綜述，參見美國專利號4,391,904。間接偶聯(lián)熒光部分與IG如蛋白或核酸的方法的一個實例包括熒光部分與蛋白如能夠結(jié)合生物素的抗生物素蛋白的共價鍵合，其中生物素共價結(jié)合IG，以使所述IG和熒光部分通過生物素和抗生物素蛋白之間的相互作用而間接偶聯(lián)在一起。間接偶聯(lián)IG和生物發(fā)光或熒光蛋白的方法的另一個實例是通過接頭基團偶聯(lián)。接頭基團可以作為間隔臂起作用以將所述生物發(fā)光或熒光蛋白與試劑分隔，從而避免對結(jié)合能力的干擾。接頭基團還可以作用增加試劑上的取代基的化學(xué)反應(yīng)性，并且因此增加偶聯(lián)效率?；瘜W(xué)反應(yīng)性的增加還可以促進(jìn)試劑、或試劑上官能團的應(yīng)用，否則所述應(yīng)用將是不可能的。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的，各種雙官能或多官能試劑，同-和異-官能(諸如在Pierce化學(xué)品公司(PierceChemicalCo.)羅克福德，III的目錄中記述的那些)二者，可以用作接頭基團。偶聯(lián)可以，例如，通過氨基基團、羧基基團、巰基基團或氧化的碳水化合物殘基實施。存在大量描述所述方法的參考文獻(xiàn)，例如，美國專利號4,671,958。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)RC或蛋白質(zhì)IG通過利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)將編碼RC或IG的DNA序列插入到表達(dá)載體中而重組產(chǎn)生。將DNA序列可操作性地連接到適宜的轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)控元件上。負(fù)責(zé)DNA表達(dá)的調(diào)控元件僅位于編碼第一多肽的DNA序列的5'。類似地，終止翻譯和轉(zhuǎn)錄終止信號所需要的終止密碼子僅存在于編碼第二多肽的DNA序列的3'。融合的RC和IG多肽在適當(dāng)?shù)乃拗髦斜磉_(dá)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的多種表達(dá)載體中的任一種可以用來表達(dá)本發(fā)明的重組多肽。表達(dá)可以在任何適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中實現(xiàn)，所述宿主細(xì)胞已經(jīng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染了包含編碼重組多肽的DNA分子的表達(dá)載體。適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞包括原核細(xì)胞、酵母和高級真核細(xì)胞。優(yōu)選地，所用的宿主細(xì)胞是大腸桿菌、酵母或哺乳動物細(xì)胞系，諸如CHO,HEK293或COS-7細(xì)胞。在另一個實施方案中，蛋白質(zhì)IG-RC試劑作為融合構(gòu)建體重組產(chǎn)生。使用已知的重組DNA技術(shù)來將編碼蛋白質(zhì)RC多肽和IG多肽的分離的DNA序列組裝到適宜的表達(dá)載體中，而構(gòu)建編碼本發(fā)明的融合蛋白的DNA序列。用或不用肽接頭，將第一DNA序列的3'端連接到第二DNA序列的5'端，以使兩個序列的閱讀框符合讀框，從而允許所述兩個DNA序列的mRNA翻譯成保留RC和IG二者生物學(xué)活性的單一融合蛋白。RC和IG在融合構(gòu)建體內(nèi)的方向可以交換，以增加其功能性或表達(dá)。肽接頭序列可以用來將生物發(fā)光蛋白和IG多肽分隔充分的距離，以足以確保每種多肽折疊成其二級和三級結(jié)構(gòu)。使用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將這樣的肽接頭序列結(jié)合到融合蛋白中。適當(dāng)?shù)碾慕宇^序列可以基于下述因素進(jìn)行選擇(1)它們采用靈活延伸的構(gòu)象的能力；(2)它們不能采用可以與生物發(fā)光蛋白或IG上的功能性表位相互作用的二級結(jié)構(gòu)；和(3)缺少可能與多肽功能性表位相互作用或減小融合多肽的溶解性的疏水性或帶電荷殘基。優(yōu)選的肽接頭序列包含Gly,Asn和Ser殘基。其它接近中性的氨基酸，諸如Thr和Ala也可以用在接頭序列中?？梢杂行в米鹘宇^的氨基酸序列包括在下列各項中公開的那些Maratea等，(1985),基因(Ge"e)，40,39-46;Murphy等，(1986),iW^S.83,8258-8262;美國專利號4,935,233和4,751，180。接頭序列長度可以為1-約50個氨基酸。當(dāng)所述生物發(fā)光蛋白或IG具有可以用來分隔功能性結(jié)構(gòu)域和防止空間干擾的非必需N端氨基酸區(qū)域時，不需要肽序列。連接的DNA序列可操作性地連接到適宜的轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)控元件上。負(fù)責(zé)DNA表達(dá)的調(diào)控元件僅位于編碼第一多肽的DNA序列的5'。類似地，47終止翻譯和轉(zhuǎn)錄終止信號所需要的終止密碼子僅存在于編碼第二多肽的DNA序列的3'。在一些實施方案中，編碼重組多肽的序列進(jìn)一步遺傳融合到編碼促進(jìn)通過親和層析純化融合構(gòu)建體的肽的序列上。實例包括組氨酸標(biāo)記、麥芽糖-結(jié)合蛋白標(biāo)記、纖維素-結(jié)合蛋白標(biāo)記、內(nèi)含肽標(biāo)記、S-標(biāo)記和GST標(biāo)記。在另一個實施方案中，編碼重組多肽的序列遺傳融合到編碼促進(jìn)融合構(gòu)建體靶向真核宿主細(xì)胞的特定亞細(xì)胞區(qū)室或分泌到周圍介質(zhì)中的肽的序列上。實例包括核定位信號、線粒體輸入序列、靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和輸出信號的KDEL序列。在另一個實施方案中，編碼重組多肽的序列遺傳融合到編碼促進(jìn)穿過真核細(xì)胞膜且因此將融合構(gòu)建體攝入到細(xì)胞內(nèi)的肽的序列上(Schwartz等，(2000)，現(xiàn)代分子治療學(xué)觀點(Cwr.M/.7Tzer.),2,162-167)。實例包括來源于HIVTat蛋白、單純皰疹病毒VP22和卡波西FGF-4的肽序列。作為重組方法的備選方案，多肽和寡肽可以化學(xué)合成。所述方法典型地包括固態(tài)方法，但是還可以利用基于溶液的化學(xué)和固態(tài)和溶液方法的一一種或多種組合。Merrifield,(1964),美國化學(xué)協(xié)會雜志a^肌Oze肌Soc.),85,2149;和Houghton,(1985),尸A/^S,L/M.,82,5132記述了合成蛋白的固態(tài)方法的實例。一旦按上述己經(jīng)形成相互作用組和報道成分，它們就可以用在本發(fā)明的方法中。在一些實施方案中，第一、第二和第三試劑中的每一個均是蛋白質(zhì)的，其中第一和第二試劑通過遺傳融合偶聯(lián)以在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中與IG第三試劑一起表達(dá)IG-RC融合構(gòu)建體。RCs的激活和檢測以及IGs的締合發(fā)生在活宿主細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞器內(nèi)、其細(xì)胞膜內(nèi)或其表面上。在另一個實施方案中，IG-RC試劑亞組是蛋白質(zhì)的并且通過遺傳融合偶聯(lián)以在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達(dá)IG-RC融合構(gòu)建體。將另一IG-RC試劑亞組，蛋白質(zhì)樣、非蛋白質(zhì)的或其組合，加入到宿主細(xì)胞中，其任選地具有穿透宿主細(xì)胞膜的能力。RCs的激活和檢測以及IGs的締合發(fā)生在活宿主細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞器內(nèi)、其細(xì)胞膜內(nèi)或其表面上。48在另一個實施方案中，所述IG-RC試劑，不管它們的性質(zhì)和制備方法，在還可以包含適當(dāng)緩沖物質(zhì)的溶液中提供。IG-RC試劑可以是下列各項的一部分細(xì)胞提取物、細(xì)胞級分或合成混合物，或可以是至少約90%純度，更優(yōu)選至少約95%純度，且最優(yōu)選至少約99%純度。純化按照本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法發(fā)生，包括硫酸銨沉淀、親和柱、離子交換和/或尺寸排阻和/或疏水相互作用層析、HPLC、FPLC、凝膠電泳、毛細(xì)管電泳等(一般參見，Scopes,(1982),蛋白質(zhì)純化(/Vofe/"Pwr訴ca"ow)，Springer-Overflag，紐約，Deutsche,酶學(xué)方法(MethodsinEnzymology)巻182:蛋白純化指南(GuidetoProteinPurification).,學(xué)院出版公司(AcademicPress,Inc.)紐約(1990))。信號當(dāng)用于本文時，術(shù)語"信號"包括發(fā)光、熒光和檢測為吸光度改變的比色改變。這可以由報道成分的酶活性和/或通過作用為報道成分的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的報道基因的上調(diào)或下調(diào)而導(dǎo)致。信號也可以取決于報道成分之間的能量轉(zhuǎn)移。在一些實施方案中，信號應(yīng)該是"發(fā)射的光"，其中檢測信號的步驟是通過光檢測器檢測特定波長的光的光子。光檢測器的實例包括光電倍增管或CCD照相機。檢測器還包括將所檢測的光限制為特定波長或特定波長范圍內(nèi)的工具。這可以是例如，固定在濾波器輪或濾波器載玻片上的適當(dāng)?shù)臑V光器或單色光鏡或分色鏡。在一些實施方案中，第一RC由對該RC特異性的激發(fā)光激活，并且由該RC發(fā)射的光被第二RC吸收。然后，檢測由第二RC產(chǎn)生的熒光，或者如果第二RC是猝滅劑，那么則檢測由第一RC產(chǎn)生的熒光的減少。在一些實施方案中，第一RC通過加入對該RC特異性的底物而激活，并且由該RC發(fā)射的光被第二RC吸收。然后檢測由所述第二RC產(chǎn)生的熒光，或者如果第二RC是猝滅劑，那么則檢測由第一RC產(chǎn)生的發(fā)光的減少。應(yīng)該清楚，本發(fā)明的應(yīng)用不限于由配體調(diào)控的受體的相互作用。在本發(fā)明的一個實施方案中，第二相互作用組通過酶裂解位點偶聯(lián)到第三相互作用組上，并且調(diào)控劑是適合作用在所述酶裂解位點上的酶，以使通過檢測器檢測由第一和第二報道成分接近產(chǎn)生的信號的減少組成對第二和第三試劑的解離的檢測，并且因此組成對第一和第三試劑的締合的監(jiān)測。易于通過本發(fā)明分析的系統(tǒng)的實例本發(fā)明的應(yīng)用的實例是分析細(xì)胞因子受體信號傳導(dǎo)。在通過結(jié)合它們的配體而激活時，細(xì)胞因子受體形成膜-結(jié)合的亞基的異源-二聚體。一個亞基通常對所述配體是特異性的，而另一個亞基負(fù)責(zé)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并且由其它配體-特異性亞基共享。激活的受體與細(xì)胞內(nèi)蛋白如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄(STAT)蛋白的激活劑相互作用(Ishihara等(2002)，生物化學(xué)和生物物理學(xué)學(xué)報(說oc/2z'肌所o;/2，Jcto)，1592,281-296)。因此，細(xì)胞因子受體信號傳導(dǎo)包括具有許多重疊和多余功能的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子和受體分子網(wǎng)絡(luò)。通常很難將特定的作用歸因于特定分子或受體的作用。第一試劑可以來源于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體亞基(RC1-IG1)，第二試劑來源于形成適當(dāng)?shù)腞ET對(RC1-IG1:IG2-RC2)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白(RC2-IG2)，且第三試劑來源于配體-特異性受體亞基。當(dāng)配體與采用配體-特異性受體亞基形式的第三試劑相互作用時，以信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白形式的第二相互作用組與第三試劑締合。如果信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體亞基與配體-特異性受體亞基締合，則第一和第二報道成分將接近并產(chǎn)生可檢測的信號。另一個實例是分析形成同源或異源-二聚體的G-蛋白偶聯(lián)的受體(GPCRs)。最近的研究已經(jīng)表明，GPCRs不但可以以單體作用，還可以以引起改變的配體結(jié)合、信號傳導(dǎo)和胞吞作用的同源-和異源-二聚體作用(Rios等(2000)藥物治療(Pharmacol.Ther.)92,71-87)。因此，作用為特定受體的激動劑或拮抗劑的藥物的作用可取決于該受體的結(jié)合配偶體。將藥物的作用限制在由特定受體二聚體介導(dǎo)的細(xì)胞反應(yīng)可能是理想的。本發(fā)明提供的系統(tǒng)能夠監(jiān)測特定GPCR異源-二聚體的活性。GPCRs本身作用為IGs。一個GPCR附著在RC上(IGl-RCl,IG3)。第二個IG(IG2-RC2)來源于在配體結(jié)合時與GPCRs相互作用的分子(例如，(3-抑制蛋白，或其突變體)。所述檢測系統(tǒng)不但檢測受體異源二聚體的形成，而且可以區(qū)分配體或藥物是否作用為所述受體異源-二聚體的激動劑、部分激動劑、拮抗劑、逆激動劑或部分逆激動劑。另一個實例是基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。轉(zhuǎn)錄因子以多蛋白-DNA復(fù)合物形式作用，并且這些復(fù)合物的組成決定它們的特異性和活性(Wolberger等(1999)生物物理學(xué)和生物分子結(jié)構(gòu)綜述年刊(Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.)28,29-56)。例如，轉(zhuǎn)錄因子Fos僅作為與JUN轉(zhuǎn)錄因子家族成員的異源-二聚體才有活性(Chinenov等(2001)癌基因(Oncogene)20,2438-2452)。FoWw"二聚體可以激活或抑制多種基因的轉(zhuǎn)錄。該復(fù)合物的特異性和活性通過與該二聚體相互作用的其它蛋白調(diào)控，如ETS轉(zhuǎn)錄因子，NF-AT或Smad蛋白(Wang等(1994)分析細(xì)胞生物學(xué)(Mo.CellBiol.)14,1153-1159;Stranick等(1994)生物化學(xué)雜志G.Biol.Chem.)272,16453-16465;Zhang等(1998)自然(Nature)394,909-913)。IGs可以來源于Fw和/柳蛋白，其中一個附著在報道成分上。另一個IG來源于與Fos/Jim復(fù)合物相互作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)控劑。該IG附著在第二RC上，其發(fā)射或猝滅由附著在或An蛋白上的RC轉(zhuǎn)移的光。該信號對于包括蛋白特定組合的三聚體復(fù)合物的活性是特異性的。通過與其它調(diào)控劑相互作用激活或使用相同調(diào)控劑激活不同的Fay//""復(fù)合物將導(dǎo)致不同的信號，這取決于它們是否是由于第一和第二IG締合而發(fā)生，或是否是由于由第二和第三IG締合引起的第一和第二RC接近而發(fā)生，或是否是由于二者的組合而發(fā)生。另一個實例是開發(fā)新型抗病毒藥物。HIV和其它病毒治療的主要問題是病毒通過病毒蛋白的點突變而逐漸變得耐受目前開發(fā)的所有藥物的適應(yīng)性。因此，靶向病毒生命周期中的多個事件的治療是更成功的，并且不同藥物的混合物，即所謂的組合治療，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了寬泛的臨床應(yīng)用。有希望的、新型抗-反轉(zhuǎn)錄病毒藥物是病毒進(jìn)入抑制劑(Starr-Spires等(2002),臨床實驗室醫(yī)學(xué)(C//".丄W.MW.)22,681-701)。HIV病毒體的進(jìn)入通過兩種細(xì)胞受體介導(dǎo)CD4和CXCR4或CCR5,這取決于病毒株。當(dāng)病毒表面改變時，僅阻斷病毒-CD4相互作用的抗體或藥物迅速放松它們的功效。本發(fā)明所提供的系統(tǒng)允許同時檢測病毒與兩種受體的結(jié)合。所述兩種受體之一可以用RC標(biāo)記，所述RC如是病毒表面蛋白，在形成三聚體復(fù)合物時產(chǎn)生特異性信號。因此，可以鑒定有效阻斷兩種相互作用或抑制病毒蛋白結(jié)合兩種受體所需要的構(gòu)象改變的化合物。由于同時耙向兩種病毒相互作用，故較不可能出現(xiàn)抗性病毒。在另一個實例中，本發(fā)明用來分析大的、穩(wěn)定的分子復(fù)合物的組成、構(gòu)象、組裝或解離。RET信號的存在或不存在指示所述復(fù)合物的組裝和功能性或在所述復(fù)合物、或復(fù)合物成分內(nèi)的構(gòu)象改變/運動。復(fù)合物的實例包括轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、核糖體、蛋白質(zhì)組、蛋白伴侶、寡聚體受體、離子通道等?？赡艿厥?，在不同組織中的異源-二聚體的全體成員是獨特的，且它們代表"新"的藥物靶標(biāo)。例如，6'guanidinoaltrindole，公知的KOP受體配體的類似物，己經(jīng)鑒定為DOP-KOP異源-二聚體選擇性激動劑，具有作為脊柱選擇性止痛劑的功效，導(dǎo)致這樣的結(jié)論，即DOP-KOP異源二聚體在脊髓中表達(dá)而不在腦內(nèi)表達(dá)(Waldhoer,M.等(2005)異源-二聚體選擇性激動劑在體內(nèi)表現(xiàn)出與G-蛋白偶聯(lián)的受體二聚體的相關(guān)性(Ahetero-dimerselectiveagnositshowsWvorelevanceofG-proteincoupledreceptordimers).美國國家科學(xué)院學(xué)報(iVoc.Waf/.爿cd102，9050-9055)。因此，本發(fā)明能夠鑒定新的藥物靶標(biāo)。在許多情形中，在參考文獻(xiàn)中未解釋的觀察資料可以由本發(fā)明所示的異源-二聚體對來揭示。例如，下述阿片樣物質(zhì)受體的變體是已知的2milOR，2SOR和3kOR。然而，對于每種僅存在一種基因。已經(jīng)表明在該家族內(nèi)和之外的異源-二聚體形成可以解釋這些結(jié)果。其中藥理學(xué)提示除基因外的更多靶點的其它實例包括P-AR4受體、降鈣素-基因相關(guān)肽1和2、C5A受體亞型、ETB受體亞型、甘丙肽受體亞型、神經(jīng)肽Y3亞型和血小板激活因子受體亞型。在許多情形中，其余一種或多種受體可以通過異源-二聚體對的存在進(jìn)行解釋，本發(fā)明能夠進(jìn)行其鑒定。特別轉(zhuǎn)向GPCRs,銷售最好的GPCR-靶向藥物包括克敏能(Claritin)(組胺受體/變態(tài)反應(yīng)適應(yīng)癥)；Cozarr,依普羅沙坦(Teveten)(血管緊張素受體/高血壓適應(yīng)癥)和氯氮平(Clozapine)(多巴胺/精神分裂癥)-以及在下表中突出表示的其它藥物(GPCR藥物)。52<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>體是懷孕婦女中的先兆子癇的原因。證據(jù)表明所述異源-二聚體對血管緊張素II更敏感(AngII;AbdAlla等(2001)自然醫(yī)學(xué)(Ato.MW.)7,1003-1009)。血管緊張素II和緩激肽(BK)起相反-調(diào)控作用，AngII在心血管系統(tǒng)中作用為主要的血管收縮劑，BK通過激發(fā)血管舒張而拮抗這些作用。使用瞬時轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞，表明發(fā)生B2R和AT1R的異源二聚化，并且取決于存在的受體的相對量(AbdAlla等(2000)自然(A^wre)407,94-98)。另外，在受體偶聯(lián)的情形中，Gi-和Gq-介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)的程度提高，并且受體內(nèi)在化模式改變。增強的信號傳導(dǎo)功效歸因于增加的AT1R活化，因為它主要與Gi和Gq蛋白偶聯(lián)。當(dāng)與B2R締合時AT1R的致敏使得作者進(jìn)行連續(xù)的研究，以研究其可能在體內(nèi)的具有的潛在作用。由于先前的數(shù)據(jù)已經(jīng)表明增加的AT1R表達(dá)與先兆子癇不相關(guān)(Masse等(1998)臨床生物化學(xué)(C7/"祝oc/^w)31,251-255;Pouliot等(1998)婦女產(chǎn)科學(xué)(OZ^dG盧eco/)91,591-595)，并且與對照受試者相比，血管緊張素II的循環(huán)水平?jīng)]有顯著不同(deJong等(1991)臨床圍產(chǎn)期學(xué)(C""Pen'"ato/)8,683-711),Abdalla等(2001，自然醫(yī)學(xué)7,1003-1009)，假設(shè)在先兆子癇婦女中觀察到的對AngII的超敏性(Abdul-Karim&Assalin(1961)美國婦女產(chǎn)科學(xué)雜志"wJGy"eco/)13,421-424;Oney和Kaulhausen(1982)美國婦女產(chǎn)科學(xué)雜志UwJO&WG戸eco/)142，17-20)可能以某種方式與AT1R和B2R之間的異源二聚化相關(guān)。事實上，該研究能夠舉例說明超敏先兆子癇癥狀與在血小板上增加的b2r表達(dá)水平強相關(guān)，其又導(dǎo)致與AT1R的增加的異源二聚化和對AngII循環(huán)水平的提高的敏感性(AbdAlla等(2001)自然醫(yī)學(xué))7,1003-1009)。此外，它們能夠表明異源二聚化使得AT1R耐受加重AngII敏感性的自由基滅活，建立與異常GPCR異源二聚化相關(guān)的第一疾病模型(對于最近的綜述，參見Quitterer等(2004)腎臟學(xué)研討會(&m!力iV印/2ra/)24，115-119;Shah(2005)美國生理學(xué)和腎生理學(xué)雜志"mJ戶/7j^/0/ie加/尸/yw'o/)288,F614-625)。支持AT1R和B2R在相同組織類型中共表達(dá)的數(shù)據(jù)不限于Abdalla與同事的工作。用特異性生長因子處理人胚胎干細(xì)胞(hES)以使這些細(xì)胞成為上皮譜系，然后隨后通過RT-PCR評估GPCRs的表達(dá)(Huang等(2007)55細(xì)胞生理學(xué)雜志(/Ce〃尸/2^/oZ)211,816-825)。令人感興趣地，分化的hES和未分化的hES(通過慢病毒轉(zhuǎn)染AT1R和B2R)二者都表達(dá)這些GPCRs,然而僅有分化的細(xì)胞在面對激動劑刺激時能夠激活G-蛋白-介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑。研究試圖確定有助于血管緊張素-轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑在部分肝切除后在大鼠中增強肝再生的能力的機制(Yayama等(2007)生物藥學(xué)報告(&o/P/w，Sw〃)30,591-594)。ACE催化AngII形成，因此對該酶的抑制有效地阻斷AT1R激動劑的合成。與對照相比，在用ACE抑制劑處理的動物中肝再生顯著更高，并且與AT1R拮抗劑組合還提高肝再生的程度。這種作用受到B2R-特異拮抗劑的部分抑制，表明ACE抑制劑對B2R的激活和對AT1R的抑制可能是所述化合物再生特性的基礎(chǔ)。阿片樣物質(zhì)系統(tǒng)的一個特性在于受體不能再循環(huán)，并且這導(dǎo)致阿片樣物質(zhì)作用的脫敏。這是由于在配體刺激時受體不能內(nèi)在化。本發(fā)明可以使得能夠鑒定與阿片樣受體異源-二聚化的受體，在所述情形中，關(guān)于這一配偶體受體的配體的共同施用可以引發(fā)所述受體異源-二聚體的內(nèi)在化，并且由此避免阿片樣物質(zhì)受體脫敏成為可能。孤獨受體具有未知的功能，并且關(guān)于它們各自的配體沒有可用的信息。許多GPCRs是孤獨受體。本發(fā)明可以用來檢測任何孤獨受體能否與一組潛在的求偶受體(suitorreceptor)、包括GPCRs形成異源-二聚體對。然后使用已知的激動劑和拮抗劑引發(fā)孤獨受^K的能力可以通過共表達(dá)研究檢測。其最近的實例是使甩MrgE孤獨受體，發(fā)現(xiàn)其與MrgD受體異源-二聚化，并且提高M(jìn)rgD激動劑B-丙氨酸的功效。這些受體有效地參與疼痛控制。通常，對于高通量篩選和藥物發(fā)現(xiàn)，這種類型的測定法可以用來在特定的多成分分子締合物內(nèi)在其環(huán)境中發(fā)現(xiàn)抑制或激活分子功能的化合物。同一分子在另一種締合物內(nèi)的功能可以不受影響。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該清楚，上述分子相互作用的方面在許多細(xì)胞功能中起重要作用，并且不限于在所述實例中描述的那些。炬伊汰嚴(yán),釋及激素受沐會欲嚴(yán)f謬#嚴(yán)二覆沐-寡褒沐正如從下述實施例中清楚的，本發(fā)明人在本文中已經(jīng)使用本發(fā)明的系統(tǒng)來鑒定和表征促甲狀腺素釋放激素受體與食欲肽受體的分子締合。短語"促甲狀腺素釋放激素受體"或"TRHR"應(yīng)該理解成至少包括G蛋白偶聯(lián)的受體，其與在前垂體腺的促甲狀腺素細(xì)胞中、以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的多種結(jié)構(gòu)由促甲狀腺素釋放激素(TRH)激活的相似(Riehl等(2000)神經(jīng)精神病理學(xué)(iVewrap^c/zopk^maco/ogv)23,34-45),除了其它作用，其具有刺激促甲狀腺素(甲狀腺剌激激素；TSH)合成和分泌的主要調(diào)控作用，并且與促甲狀腺素釋放激素受體1(TRHRl)同義(Gershengom(2003)促甲狀腺素禾畢放激素受體信號傳導(dǎo)(Thyrotropin-releasinghormonereceptorsignaling),在激素百禾斗全書(五wcyc/opec//(30//2wmo"as)中.EdsHenryHL和NormanAW.學(xué)院出版社.巻3;502-510)。短語"促甲狀腺素釋放激素受體"或"TRHR"也應(yīng)該理解為意指促甲狀腺素釋放激素受體2或TRHR2,已知至少在大鼠和小鼠中表達(dá)的促甲狀腺素釋放激素受體的第二亞型，并且其功能尚未被清楚闡明(Gershengom(2003)促甲狀腺素釋放激素受體信號傳導(dǎo)(Thyrotropin-releasinghormonereceptorsignaling),在激素百禾斗全書(五"c3;c/0/7ed/ao//zormo"ay)中.EdsHenryHL禾口NormanAW.學(xué)院出版社.巻3;502-510)。短語"促甲狀腺素釋放激素受體"或"TRHR，，還應(yīng)該理解為包括最新發(fā)現(xiàn)的TRHR家族成員。在實例中，促甲狀腺素釋放激素受體和縮寫詞TRHR是指TRHR1。短語"食欲肽受體"或"OxR"應(yīng)該理解為意指食欲肽受體l(OxRl;OXR1;OX!R;下丘泌素-l-受體；hcrtrl)或食欲肽受體2(OxR2;OXR2;OX2R;下丘泌素-2-受體；hctr2)，作為與Sakurai等描述的要被食欲肽A(OxA;下丘泌素-l;Hcrt-l)和食欲肽B(OxB;下丘泌素-2;Hcrt-2)(Sakurai等(1998)細(xì)胞(Ce//)92,573-585)激活的那些相似的G蛋白-偶聯(lián)受體。"食欲肽受體"或"OxR"還應(yīng)該理解為包括最新發(fā)現(xiàn)的食欲肽受體家族成員。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該清楚，促甲狀腺素釋放激素受體與食欲肽受體的締合使得能夠使用一種受體的配體(它們應(yīng)該是激動劑、逆激動劑或拮抗劑)治療與另一種受體相關(guān)的疾病。因此，本發(fā)明包括通過施用治療有效量的促甲狀腺素釋放激素受體激動劑、逆激動劑或拮抗劑來治療患有食欲肽-相關(guān)疾病的患者的方法。所述促甲狀腺素釋放激素受體激動劑、逆激動劑或拮抗劑可以與食欲肽受體激動劑、逆激動劑或拮抗劑共同施用。本發(fā)明還包括通過施用治療有效量的食欲肽受體激動劑、逆激動劑或拮抗劑來治療患有促甲狀腺素釋放激素-相關(guān)疾病的患者的方法。本發(fā)明還包括制備用于通過施用治療有效量的促甲狀腺素釋放激素受體激動劑、逆激動劑或拮抗劑來治療患有食欲肽-相關(guān)疾病的患者的藥物的方法。所述藥物還可以包含食欲肽受體激動劑、逆激動劑或拮抗劑。本發(fā)明還包括制備用于通過施用治療有效量的食欲肽受體激動劑、逆激動劑或拮抗劑來治療患有促甲狀腺素釋放激素-相關(guān)疾病的患者的藥物的方法。所述藥物還可以包含促甲狀腺素釋放激素受體激動劑、逆激動劑或拮抗劑。因此，本發(fā)明包括通過施用治療有效量的促甲狀腺素-選擇性結(jié)合劑、或其片段來治療患有食欲肽-相關(guān)的疾病的患者的方法。所述促甲狀腺素-選擇性結(jié)合劑可以是抗體，包括人源化的抗體、多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、CDR-移植抗體和/或抗-獨特型抗體。本發(fā)明還包括通過施用治療有效量的食欲肽-選擇性結(jié)合劑、或其片段來治療患有促甲狀腺素釋放激素-相關(guān)的疾病的患者的方法。所述食欲肽-選擇性結(jié)合劑可以是抗體，包括人源化的抗體、多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、CDR-移植抗體和/或抗-獨特型抗體。Gary報道了促甲狀腺素釋放激素(TRH)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中的功能(Gary,KeithA.,等，體內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)控的促甲狀腺素釋放激素(TRH)假說對于基于TRH的治療的暗示(TheThyrotropin-ReleasingHormone(TRH)HypothesisofHomeostaticRegulation:ImplicationsforTRH-BasedTherapeutics),JPET305:410~416,2003)作為4種解剖學(xué)上不同的成分，它們一起包括通用的TRH體內(nèi)穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)，它們?yōu)?)下丘腦-促垂體神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)(hypothalamic-hypophysiotropicneuroendocrinesystem),2)腦干/中腦/脊髓系統(tǒng)，3)邊緣/皮質(zhì)系統(tǒng)，和4)生物鐘學(xué)系統(tǒng)。58Gary還記錄"對TRH調(diào)控和標(biāo)準(zhǔn)化CNS活性的整體功能的了解，以及對TRH本身作為治療劑的固有限制性的了解，導(dǎo)致對在顯著寬泛的臨床情形中來自代謝穩(wěn)定性TRH-模擬藥物，作為單一治療和作為其它治療劑的佐劑二者的治療益處的理性的預(yù)測"。促甲狀腺素釋放激素-相關(guān)的疾病包括這樣的疾病，即，其與增加的或減少的促甲狀腺素釋放激素生產(chǎn)、和/或增加的或減少的細(xì)胞針對促甲狀腺素釋放激素的響應(yīng)性相關(guān)。下述列表(Gary，KeithA.,等，體內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)控的促甲狀腺素釋放激素(TRH)假說對于基于TRH的治療的暗示(TheThyrotropin-ReleasingHormone(TRH)HypothesisofHomeostaticRegulation:ImplicationsforTRH-BasedTherapeutics)，JPET305:410~416,2003)提供了一些TRH-相關(guān)的疾病的實例抑郁癥，特別伴隨嗜睡；慢性疲勞綜合征；日間過度嗜睡(excessivedaytimesleepiness)(包括嗜眠癥)，神經(jīng)衰弱，和昏睡；對藥物、化療、或放射治療繼發(fā)的鎮(zhèn)靜；鎮(zhèn)靜劑中毒/呼吸窘迫(ER設(shè)定(setting));全身麻醉恢復(fù)；注意力缺陷/多動癥(hyperactivedisorder);生理節(jié)律紊亂(例如，時差綜合征(jetlag));由情緒穩(wěn)定劑申導(dǎo)致的兩極情感疾病(bipolaraffectivediscorder);焦慮癥*;阿爾茨海默病和其它具有認(rèn)知缺陷的癡呆癥*;癲癇病(Seizuredisorders)*;禾口運動神經(jīng)元疾病*。*可能作為輔佐治療是特別有效的然而，應(yīng)該理解，短語促甲狀腺素釋放激素-相關(guān)疾病不限于此。食欲肽-相關(guān)疾病包括這樣的疾病，即，其與增加或減少的食欲肽生產(chǎn)、和/或增加或減少的細(xì)胞針對食欲肽的響應(yīng)性相關(guān)。食欲肽-相關(guān)疾病的主要實例是伴有猝倒癥的嗜眠癥。在約90%的患者中，這與低的或不可檢測的腦脊液(CSF)食欲肽A水平相關(guān)(Baumann和Bassetti(2005)睡眠藥物綜述(57e^Me力'c/"eiev^酉)9,253-268)。食欲肽受體2基因突變導(dǎo)致家族性犬科動物嗜眠癥，并且在偶發(fā)性犬科動物嗜眠癥中觀察到食欲肽神經(jīng)元的丟失和低CSF食欲肽A。在一些情形中，由急性外傷性腦損傷引起的神經(jīng)病癥，急性感染性多神經(jīng)炎和晚期帕金森綜合征還可能與低的或不可檢測的CSF食欲肽A水平相聯(lián)系。Sakurai己經(jīng)假設(shè)了食欲肽系統(tǒng)在飲食和能量體內(nèi)穩(wěn)態(tài)中的作用，原因在于食欲肽神經(jīng)元的活性受葡萄糖和瘦蛋白抑制，并且受生長素釋放肽刺激，所述生長素釋放肽是一種促進(jìn)飲食的胃源性肽。這可能具有關(guān)于肥胖癥的治療的暗示(Sakumi(2005)睡眠藥物綜述(67eepAf^Z/c/"e/^v/ewj)9,231-241)。然而，應(yīng)該理解，短語食欲肽-相關(guān)的疾病不限于此。已知的食欲肽受體調(diào)控劑包括食欲肽A(OxA;下丘泌素-l;Hcrt-l),食欲肽B(OxB;下丘泌素-2;Hcrt-2)以及它們的片段(Lang等(2004)藥物化學(xué)雜志aMWC77柳)47,1153-1160)。己知的的關(guān)于OxRl和OxR2的拮抗劑包括6,7-二甲氧基-l,2，3,4-四氫異喹啉類似物(HiroseM等(2003)生物有機藥物化學(xué)通訊(歷owg.MedC/zem.)13,4497-4499)，Almorexant((2R)-2-((lS)-6,7-二甲氧基-l-[2-(4畫三氟甲基苯基)-乙基]-3,4-二氫-11-異喹啉-2-基}-^甲基-2-苯基-乙酰胺;ACT-078573;Actelion藥物有限公司(ActelionPharmaceuticalsLtd.)，Allschwil,瑞士；Brisbare-Roch等(2007)自然醫(yī)學(xué)(A^"wMe&">2e)13,150-155)。已知的OxRl拮抗劑包括SB-334867-A(1-(2-甲基苯并噁唑-6-基)-3-[l,5]二氮雜萘-4-基鹽酸脲)，SB-674042(l-(5-(2-氟-苯基)-2-甲基-噻唑基_4-基)-1-((5)-2-(5-苯基-(1,3，4)噁二唑-2基甲基)-吡咯烷-l-基)-甲垸酮(methanone)),SB-408124(1-(6,8-二氟-2-甲基-喹啉-4-基)-3-(4-二甲基氨基-苯基)-脲)和SB-410220(1-(5,8-二氟-喹啉-4-基)-3-(4-二甲基氨基-苯基)-脲)(Haynes等(2000)調(diào)控肽(i^gw/atofy96,45-51;Langmead等(2004)英國藥理學(xué)雜志(^7'他/zJow"a/o/尸/wrmaco/og)141,340-346)。已知的OxR2拮抗劑包括iV-芳基甲基叔-亮氨酰6，7-二甲氧基-1,2，3,44四氫異-喹啉類似物和W-?；?，7-二甲氧基-l,2,3,4-四氫異喹啉類似物(HiroseM等(2003)生物有機醫(yī)學(xué)化學(xué)通訊(歷oorg.MedC7^m.丄饑)13,4497-4499),和取代的4-苯基-[l,3]二噁烷,特別是1-(2,4-二溴-苯基)-3-((4&55)-2,2-二甲基-4-苯基-[I,3]二噁烷-5-基)-脲(McAteeLC等(2004)生物有機醫(yī)學(xué)化學(xué)通訊(歷owg.C7ze肌丄欲.)14,4225-4229)。已知的促甲狀腺素釋放激素受體的調(diào)控劑包括促甲狀腺素釋放激素(TRH;促甲狀腺素釋放素；TRF;pGlu-His-Pro-NH2),[Glu2]TRH,氨基端焦谷氨酰殘基被吡啶鑰部分替代的[Glu2]TRH(Prokai-Tatrai等(2005)醫(yī)學(xué)化學(xué)(MW.C7zew.)1,141-152),甲基-TRH,(3-甲基-His2)TRH,孟替瑞林((3R,6R)-6-甲基-5-氧代-3-硫代嗎啉基羰基-L-組氨酰-L-脯氨酰胺四水合物;CG-3703;GrunenthalGmbH，Aachen，德國)，CNK-602A(N-[(6-甲基-5-氧代-3-硫代嗎啉基)羰基]-L-組氨酰-L-脯氨酰胺；Renming等(1992)歐洲藥理學(xué)雜志(￡w/尸to，aco/.)223,185-192)，他替瑞林((-)-N-[(S)-六氫-l-甲基-2,6-二氧代-4-嘧啶基羰基]-L-組氨酰-L-脯氨酰胺四水合物；Ceredist;TA-0910;TanabeSeiyaku有限公司，大阪，日本)，JTP-2942(N°-[(l&2i)-2-甲基-4-氧代環(huán)戊基羰基]-L-組氨酰-L-脯氨酰胺一水合物；日本煙草公司(JapanTobacco,Inc.)，東京，日本)，氮替瑞林(YM-14673;Yamanouchi制藥有限公司(YamanouchiPharmaceuticalCo.,Ltd)，東京，日本)，DN-1417(Y-丁內(nèi)酯卞羰基-組氨酰-脯氨酰胺檸檬酸鹽；MiyamotoM等(1981)生命科學(xué)(h/e&O28,861-869),RX隱77368(pGlu-His-(3，3，-二甲基)-Pro-NH2;Ferring制藥，F(xiàn)eltham，Middlesex,UK),CG-3509(GrunenthalGmBH,Stolberg,德國)，MK-771(l-焦-2-氨基已二酰基-L-組氨酰-L-噻唑烷-4-羧酰胺(carboxamide);默克(Merck),Rahway,新澤西)，泊替瑞林(RGH2202;L-6-酮哌啶-2-羰基-L-亮氨酰-L-脯氨酸酰胺；GedeonRichterPharmaceuticals,布達(dá)佩斯，匈牙利)，Ro24-9975(1&37,5(25)，55>5-[(5-氧代-1-苯基甲基)-2-吡咯烷基]-甲基]-5-[(1//-咪唑-5-基)甲基]-環(huán)己垸乙酰胺;霍夫曼拉維奇羅氏(Hoffman-LaRoche),巴塞爾，瑞士)，普羅瑞林(5-氧代-L-脯氨酰-L-組氨酰-L-脯氨酸酰胺；ThyrelTRH;Ferring制藥，Tarrytown,紐約)，咪達(dá)唑侖，地西泮和氯氮萆(逆激動劑；Jinsi-ParimooA和GershengomMC(1997)內(nèi)分泌學(xué)(五"GtocW"o/ogy)138,1471-1475)。已經(jīng)建立了食欲肽系統(tǒng)和伴有猝倒癥的嗜眠癥之間的強相關(guān)性(Sakurai(2005)睡眠醫(yī)學(xué)綜述(57ee/MW/c/"eiev/e薦)9，231-241)。此外，Nishino等提議TRH類似物可以有效用于治療嗜眠癥中的日間過度嗜睡(Nishino等(1997)神經(jīng)科學(xué)雜志(77^/oz#tm/o/7VeMraM/ewce)17,6401-6408)。TRH類似物CG-3703和TA-0910以劑量-和時間-依賴性方式顯著減少慢波睡眠(SWS)和快速眼動(REM)睡眠。此外，在研究的大部分動物中，TRH類似物完全抑制猝倒癥。血清T3和T4沒有顯著變化，"表明TRH以及TRH類似物的抗猝倒和警示作用受神經(jīng)調(diào)控性CNS特性介導(dǎo)而不受對甲狀頸干(thyroidaxis)間接作用的介導(dǎo)。"(Nishino等(1997)神經(jīng)科學(xué)雜志(77ze)ow/77g/q/V2ewro^^"ce)17,6401-6408)。在2000年，這些觀察受到進(jìn)一步研究的支持(Riehl等(2000)神經(jīng)精神病藥理學(xué)(7Vewrap^c/zop/zarmaco/ogy)23,34-45)。TRH和食欲肽(及其類似物)在嗜眠癥病理生理學(xué)中的作用模式尚未闡明，然而，在本發(fā)明中鑒定的異源-二聚體/-寡聚體相互作用有助于這些受體系統(tǒng)的綜合。1116111等評論，"解釋下丘泌素系統(tǒng)參與嗜眠癥病理生理學(xué)中的機制尚不清楚。然而，有趣的是，注意到包含下丘泌素[食欲肽]-的神經(jīng)元專一地位于外側(cè)下丘腦處(Sakurai等1998[細(xì)胞(Ce//),92,573-585];Peyron等1998[神經(jīng)科學(xué)雜志aA^wmsc.)18,9996-10015]),其為富含TRH神經(jīng)元的區(qū)域(Kreider等1985[肽(尸e//^fes)6，997-1000])。另外，下丘泌素[食欲肽]和TRH受體二者均為針對神經(jīng)肽的G-蛋白偶聯(lián)的受體，并且TRH受體表現(xiàn)出與下丘泌素[食欲肽]受體的第二高(25%)的同源性(與Y2神經(jīng)肽Y受體具有最高同源性)(Sakurai等1998[細(xì)胞(Ce〃)，92，573-585]),表明TRH可能通過與下丘泌素[食欲肽]系統(tǒng)的未知的特異性相互作用而在嗜眠癥的病理生理學(xué)中起重要作用。"(Riehl等(2000)神經(jīng)精神病藥理學(xué)(A^"rap^c/zop/zamwco/ogy)23,34-45)。作者已經(jīng)鑒定TRH和食欲肽系統(tǒng)整合的可能性，而沒有鑒定所述整合可作為在本發(fā)明中鑒定的受體異源-二聚化/-寡聚化的結(jié)果而發(fā)生。除了嗜眠癥之外，TRH和食欲肽受體系統(tǒng)可能關(guān)于飲食和代謝體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的控制而整合。在饑餓過程中，甲狀腺激素分泌被抑制，而在外側(cè)下丘腦中，前下丘泌素原(食欲肽的前體)mRNA被上調(diào)。這樣的觀察導(dǎo)致Kok等研究TRH和食欲肽系統(tǒng)的整合，因為"盡管"，"下丘泌素-[食欲肽-]和促甲狀腺素細(xì)胞神經(jīng)回路的局部解剖圖(topography)表明TRH神經(jīng)活動受到下丘泌素[食欲肽]輸入的控制，但是信號的本質(zhì)(即，興奮或抑制)保持為未知"(Kok等(2005)AJP-內(nèi)分泌學(xué)和代謝學(xué)(^/P-五"^cn'"o/ogya"dMeto6o/Z湖)288,892-899)。該研究證明與對照相比較，在食欲肽-缺陷型患發(fā)作性睡眠癥的人中顯著更低的平均血漿TSH濃度。重要的是注意到，在所述系統(tǒng)中，與前饋信號傳導(dǎo)一樣，包括通過在激素-神經(jīng)遞質(zhì)-分泌神經(jīng)元上或在其位置處表達(dá)的受體的自分泌和旁分泌反饋的復(fù)雜反饋途徑可能是普遍的，并且可能在其中這些受體形成異源-二聚體/-寡聚體的系統(tǒng)整合中起生理學(xué)或病理生理學(xué)作用。本發(fā)明包括針對促甲狀腺素釋放激素受體/食欲肽受體異源-二聚體/-寡聚體選擇性活性篩選測試化合物的方法，所述方法包括下述步驟a)確定在食欲肽受體與促甲狀腺素釋放激素受體締合時，所述測試化合物是否與所述食欲肽受體相互作用、和/或其程度；和b)如果在食欲肽受體與促甲狀腺素釋放激素受體締合時所述測試化合物與所述食欲肽受體相互作用，則在不存在促甲狀腺素釋放激素受體的條件下，確定所述測試化合物是否與所述食欲肽受體相互作用、或其程度；以使在所述食欲肽受體與促甲狀腺素釋放激素受體締合時與所述食欲肽受體相互作用時表現(xiàn)出更大親和性和/或潛力和/或功效的測試化合物是針對促甲狀腺素釋放激素受體/食欲肽受體異源-二聚體/-寡聚體選擇性的。本發(fā)明包括針對促甲狀腺素釋放激素受體/食欲肽受體異源-二聚體/-寡聚體選擇性活性篩選測試化合物的方法，所述方法包括下列步驟a)確定在促甲狀腺素釋放激素受體與食欲肽受體締合時，所述測試化合物是否與所述促甲狀腺素釋放激素受體相互作用、和/或其程度；和b)如果在促甲狀腺素釋放激素受體與食欲肽受體締合時所述測試化合物與所述促甲狀腺素釋放激素受體相互作用，則在不存在食欲肽受體的條件下，確定所述測試化合物是否與所述促甲狀腺素釋放激素受體相互作用、或其程度；63以使在所述促甲狀腺素釋放激素受體與食欲肽受體締合時與所述促甲狀腺素釋放激素受體相互作用時表現(xiàn)出更大親和性和/或潛力和/或功效的測試化合物是針對促甲狀腺素釋放激素受體/食欲肽受體異源-二聚體/-寡聚體選擇性的。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，通過本發(fā)明的方法進(jìn)行下述步驟確定在促甲狀腺素釋放激素受體與食欲肽受體締合時測試化合物是否與所述促甲狀腺素釋放激素受體相互作用、和/或其程度的步驟；和/或確定在食欲肽受體與促甲狀腺素釋放激素受體締合時測試化合物是否與所述食欲肽受體相互作用、和/或其程度的步驟。本發(fā)明還包括通過施用治療有效量的促甲狀腺素釋放激素受體/食欲肽受體異源-二聚體A寡聚體選擇性激動劑、逆激動劑或拮抗劑而治療患有促甲狀腺素釋放激素-相關(guān)疾病或食欲肽-相關(guān)疾病的患者的方法。本發(fā)明還包括治療有效量的促甲狀腺素釋放激素受體/食欲肽受體異源-二聚體/-寡聚體選擇性激動劑、逆激動劑或拮抗劑用于制備治療患有促甲狀腺素釋放激素-相關(guān)疾病或食欲肽-相關(guān)疾病的患者的藥物的應(yīng)用。本發(fā)明包括促甲狀腺素釋放激素受體/食欲肽受體異源-二聚體/-寡聚體的選擇性激動劑和/或拮抗劑和/或逆激動劑。當(dāng)用于本文時，術(shù)語"患者"是指可能患有食欲肽-或促甲狀腺素釋放激素-相關(guān)疾病中的一種或多種的任何動物。最優(yōu)選地，所述動物為哺乳動物。該術(shù)語應(yīng)該理解為包括例如人、畜牧動物(即，牛、馬、山羊、綿羊和豬)、家養(yǎng)寵物(即，貓和狗)等。當(dāng)用于本文時，短語"治療有效量"是指足以調(diào)控與食欲肽受體激動劑、逆激動劑或拮抗劑與食欲肽受體相互作用，或促甲狀腺素釋放激素受體激動劑、逆激動劑或拮抗劑與促甲狀腺素釋放激素受體相互作用，或食欲肽受體/促甲狀腺素釋放激素受體異源-二聚體/寡聚體-特異性激動劑、逆激動劑或拮抗劑與食欲肽受體/促甲狀腺素釋放激素受體異源-二聚體/寡聚體的相互作用相關(guān)的生物學(xué)活性的量。在本發(fā)明該方面的情形中，其中促甲狀腺素釋放激素受體激動劑、逆激動劑或拮抗劑與食欲肽受體激動劑、逆激動劑或拮抗劑組合施用，組合中的促甲狀腺素釋放激素受體激動劑、逆激動劑或拮抗劑的治療有效量或食欲肽受體激動劑、逆激動劑或拮抗劑的治療有效量可以低于單獨施用時促甲狀腺素釋放激素受體激動劑、逆激動劑或拮抗劑或食欲肽受體激動劑、逆激動劑或拮抗劑的治療有效量。艮P，促甲狀腺素釋放激素受體激動劑、逆激動劑或拮抗劑和食欲肽受體激動劑、逆激動劑或拮抗劑的組合施用可能以另外可能是其任一的亞治療劑量產(chǎn)生治療效果。本發(fā)明的藥物可以通過注射施用，或制備用于口服、肺部、鼻或用于任何其它施用形式。優(yōu)選地，例如，藥物通過例如靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、眼框內(nèi)、眼部、心室內(nèi)、顱內(nèi)、囊內(nèi)、脊柱內(nèi)、池內(nèi)、腹膜內(nèi)、頰含、直腸、陰道、鼻內(nèi)或通過氣霧劑施用而施用。然而，施用方式必須至少適合所述藥物已經(jīng)制備成的形式。對于最有效響應(yīng)的施用方式可能需要憑經(jīng)驗確定，并且提供下述施用方式作為實例，并且不限制以任何方式遞送本發(fā)明的組合物的方法。所有上述制劑通常在制藥工業(yè)中使用并且對于適當(dāng)有資格的從業(yè)者通常是己知的。除了激動劑和/或逆激動劑和/或拮抗劑之外，本發(fā)明的藥物可以包括藥用無毒賦形劑和載體，并且通過任何腸胃外技術(shù)如皮下、靜脈內(nèi)和腹膜內(nèi)注射進(jìn)行施用。另外，制劑可以任選地包含一種或多種佐劑。適合注射應(yīng)用的藥物形式包括無菌水溶液(在水溶性情形中)或分散體，和用于即時制備無菌注射溶液或分散體的無菌粉劑。備選地，本發(fā)明的化合物可以包封在脂質(zhì)體中，并且在可注射溶液中遞送，以輔助它們穿過細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運。備選地，或另外地，所述制劑可以包含自我-組裝的孔結(jié)構(gòu)的成分，以促進(jìn)穿過細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運。所述載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，例如，其包含水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇，等)、它們的適當(dāng)?shù)幕旌衔?、和植物油。例如，通過利用涂層如磷脂酰膽堿，在分散體的情形中通過保持需要的粒度，和利用表面活性劑，可以保持適當(dāng)?shù)牧鲃有?。可注射組合物的延長的吸收可以通過在該組合物中使用延遲吸收的試劑如單硬脂酸鋁和明膠而導(dǎo)致。無菌注射溶液可以通過將需要量的活性化合物，當(dāng)需要時，與各種上述列舉的各種其它成分，結(jié)合在適當(dāng)?shù)娜軇┲校缓筮^濾滅菌而制備。通常，分散體通過將各種無菌活性成分和來自上述列舉的那些的需要的其它,成分結(jié)合在包含基本分散介質(zhì)的無菌賦形劑(vehicle)中而制備。在用于65制備無菌注射溶液的無菌粉劑的情形中，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍-干燥技術(shù)，其產(chǎn)生活性成分加來自其預(yù)先無菌過濾的溶液的任何其它需要的成分的粉末。在本文中考慮使用的是口服固體劑型，其一般在^r"w",雷明頓藥物科學(xué)(iewz,"gto"k戶/z(arm(3ceMac(3/iSWewcasO,第18版.(1990Mack出版公司，EastonPA18042)在第89章中描述，其通過引用結(jié)合在本文中。固體劑型包括片劑、膠囊、丸劑、藥片或錠劑、扁囊劑或小丸劑。此外，可以使用脂質(zhì)體或類蛋白包封來配制該組合物(如，例如，在美國專利號4，925，673中報道的類蛋白微球體)?？梢允褂弥|(zhì)體包封，并且脂質(zhì)體可以用各種聚合物衍生(例如，美國專利號5,013,556)。Marshall在現(xiàn)代制藥學(xué)(Mo&m,第10章,Banker和Rhodes編，(1979)中提供了用于治療的可能的固體劑型的描述，其通過引用結(jié)合在本文中。一般地，所述制劑包括作為本發(fā)明的部分描述的化合物(或其化學(xué)修飾的形式)、和允許針對胃環(huán)境提供保護、并且在腸中釋放生物學(xué)活性物質(zhì)的惰性成分。對于本發(fā)明的激動劑、拮抗劑和逆激動劑，釋放位置可以是胃、小腸(十二指腸、空腸(jejunem)、或回腸)、或大腸。本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得在胃中不溶解而將在十二指腸或在腸內(nèi)其它地方釋放物質(zhì)的制劑。優(yōu)選地，釋放將通過對所述組合物進(jìn)行保護或通過在胃環(huán)境之外如在腸內(nèi)釋放該化合物而避免胃環(huán)境的有害作用。為了確保完全的胃抗性，對至少pH5.0是不能滲透的涂層是必需的。用作腸衣的較常見的惰性成分的實例是乙酸-l,2,4-苯甲酸纖維素(CAT),羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯(HPMCP),HPMCP50,HPMCP55，聚醋酸乙烯鄰苯二甲酸酯(PVAP)，丙烯酸樹脂L30D,Aquateric，醋酞纖維素(CAP),丙烯酸樹脂L，丙烯酸樹脂S，和蟲膠。這些涂層可以作為混合的薄膜使用。涂層或涂層混合物還可以用在片劑上，其不是意欲針對胃進(jìn)行保護。這可以包括糖涂層、或使得所述片劑更容易吞咽的涂層。膠囊可以由用于遞送干治療劑即粉劑的硬殼(諸如明膠)組成；對于液體形式，可以使用軟明膠殼。扁囊劑的殼物質(zhì)可以是稠淀粉或其它可食用的紙。對于丸劑、錠劑、模制的片劑或片劑研碎物，可以使用濕聚(moistmassing)技術(shù)。治療劑可以以約lmm粒度的粒劑或小丸劑的形式作為細(xì)碎的微粒包含在制劑中。用于膠囊施用的物質(zhì)的制劑還可以是作為粉劑，稍微壓縮的填料(plugs)或者甚至作為片劑形式。所述治療劑可以通過壓縮制備。著色劑和調(diào)味劑均可以包括在其中。例如，可以配制化合物(諸如通過脂質(zhì)體或微球體包封)，然后進(jìn)一步包含在可食用的產(chǎn)品中，諸如包含著色劑和調(diào)味劑的冷凍飲料中?？梢允褂枚栊晕镔|(zhì)稀釋或增加治療劑的體積。這些稀釋劑可以包括碳水化合物、特別是甘露醇、ot-乳糖、無水乳糖、纖維素、蔗糖、改性葡聚糖和淀粉。某些無機鹽也可以用作填充劑，包括三磷酸鈣、碳酸鎂和氯化鈉。一些商購的稀釋劑為Fast-Flo，Emdex,STA-Rx1500，Emcompress和Avicell。在治療劑的配制過程中可以將崩解劑包含在固體劑型中。用作崩解劑的物質(zhì)包括但不限于淀粉，包括基于淀粉的商購崩解劑淀粉乙醇酸鈉(Explotab)。淀粉羥乙酸鈉、離子交換樹脂(Amberiite)、羧甲基纖維素鈉、ultmmylopectin、藻酸鈉、明膠、橙皮、酸性羧甲基纖維素、天然海綿和膨潤土均可以使用。另一種形式的崩解劑是不溶的陽離子交換樹脂。粉末狀膠可以用作崩解劑和粘合劑，并且這些可以包括粉末膠諸如瓊脂、刺梧桐或黃蓍膠。藻酸及其鈉鹽也可以有效用作崩解劑。粘合劑可以用來保持治療化合物在一起以形成硬片劑，并且包括來自天然產(chǎn)物的物質(zhì)，如阿拉伯樹膠、黃蓍膠、淀粉和明膠。其它包括甲基纖維素(MC)、乙基纖維素(EC)和羧甲基纖維素(CMC)。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羥丙基甲基纖維素(HPMC)均可以用在醇溶液中來粒化治療劑。在治療劑的配制過程中可以包括潤滑齊U(artifrictionalagent)，以防止在配置過程中的黏附。潤滑劑可以用作在治療劑和模壁之間的層，并且這些可以包括但不限于硬脂酸包括其鎂鹽和鈣鹽、聚四氟乙烯(PTFE)、液體石蠟、植物油和蠟。還可以使用可溶的潤滑劑，諸如十二垸基硫酸鈉、十二垸基硫酸鎂、各種分子量的聚乙二醇、和聚乙二醇(Carbowax)4000和6000?？梢约尤胫鲃?，所述助流劑可以在配制過程中提高化合物的流動性并且在壓縮過程中輔助重排。所述助流劑可以包括淀粉、滑石、熱解硅膠和水合硅鋁酸鹽。為了輔助治療劑溶解到水性環(huán)境中，可以加入表面活性劑作為濕潤劑。)表面活性劑可以包括陰離子去污劑如十二烷基硫酸鈉、多庫酯鈉和二辛基磺67酸鈉?？梢允褂藐栯x子去污劑，并且其可以包括苯扎氯銨或苯索氯銨。可以作為表面活性劑包含在制劑中的潛在的非離子去污劑的列表為聚桂醇400、聚乙二醇酯、聚氧乙烯氫化蓖麻油10、50和60、單硬脂酸甘油酯、聚山梨酯40、60、65和80、蔗糖脂肪酸酯、甲基纖維素和羧甲基纖維素。這些表面活性劑可以單獨或作為不同比例的混合物存在于化合物的制劑中。有力提高化合物攝取的佐劑例如為脂肪酸油酸、亞油酸和亞麻酸?？蒯屩苿┛梢允抢硐氲?。可以將化合物結(jié)合在允許通過擴散或瀝濾機制釋放的惰性基質(zhì)如樹膠中。也可以將緩慢崩解基質(zhì)結(jié)合在制劑中。該治療劑的另一種控釋形式是通過基于Oros治療系統(tǒng)(Alza公司)的方法，即，將藥物包封在半滲透性膜中，其允許水進(jìn)入并且推動藥物通過由于滲透作用形成的單個小開孔流出。一些腸衣還具有延遲釋放的作用。可以使用物質(zhì)的混合物來提供最佳的薄膜涂層。薄膜涂敷可以在盤狀涂布機或在流化床中或通過壓縮涂敷進(jìn)行。本發(fā)明還考慮化合物的肺遞送。在吸入時化合物可以被遞送至哺乳動物的肺部，并且穿過肺上皮內(nèi)層進(jìn)入血流中。在本發(fā)明的實踐中考慮的應(yīng)用是設(shè)計用于肺遞送治療產(chǎn)品的寬范圍的機械裝置，包括但不限于，噴霧器、定量吸入器、和粉末吸入器，所有這些都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。適用于實施本發(fā)明的商購裝置一些具體實例為由Mallinckrodt,公司，圣路易斯，密蘇里州制造的Ultravent噴霧器；由Marquest醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(MarquestMedicalProducts),Englewood,科羅拉多制造的AcornII噴霧器；由Glaxo公司，ResearchTrianglePark,北卡羅萊納州制造的Ventolin定量吸入器；和由Fisons公司，Bedford,馬薩諸塞州制造的Spinhaler粉末吸入器。所有這樣的裝置需要使用適用于分散所述化合物的制劑。典型地，每種制劑對所用的裝置類型是特異的，并且除了有效用于治療的常用的稀釋劑、佐劑和/或載體之外，可以包括使用適當(dāng)?shù)耐七M(jìn)劑物質(zhì)。此外，還考慮使用脂質(zhì)體、微膠囊或微球體、內(nèi)含物復(fù)合物、或其它類型的載體。適用于噴氣式或超聲式的噴霧器的制劑典型地包括懸浮在水中的化合物。所述制劑還可以包括緩沖劑和簡單的糖(例如，用于蛋白穩(wěn)定和滲透壓調(diào)節(jié))。噴霧器制劑還可以包含表面活性劑，以減少或防止在形成氣霧劑過程中由于溶液的霧化引起的表面誘導(dǎo)的化合物聚集。用于定量吸入器裝置的制劑通常包括細(xì)分的粉末，所述粉末包含在表面活性劑的輔助下懸浮在推動劑中的化合物。所述推動劑可以是任何常規(guī)用于該目的的物質(zhì)，諸如含氯氟烴、氫氯氟烴、或氫氟烴、或烴，包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲垸、二氯四氟乙醇、和1,1,1,2-四氟乙垸或它們的組合。適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣┌ㄈ退嵘嚼嫣购痛蠖孤蚜字Ｓ退嵋部梢杂行в米鞅砻婊钚詣?。用于從粉末吸入裝置分散的制劑包括包含所述化合物的細(xì)分的干粉，并且還可以包括以促進(jìn)粉末從所述裝置分散的量如占所述制劑的重量的50-90%的填充劑，諸如乳糖、山梨醇、蔗糖、或甘露醇。所述化合物(或衍生物)應(yīng)該最有利地配制在具有小于10微米平均粒度、最優(yōu)選0.5-5微米平均粒度的微粒形式中，以用于最有效的遞送至肺部末梢。還考慮化合物的鼻遞送。鼻遞送允許蛋白在將治療產(chǎn)品施用到鼻后直接通過血流，不需要該產(chǎn)品在肺部沉積。用于鼻遞送的制劑包括具有葡聚糖或環(huán)糊精的那些。應(yīng)該理解，本發(fā)明的藥物可以以單劑量時間表給藥，或優(yōu)選地，以多劑量時間表給藥。多劑量時間表是其中遞送的主要過程可以是使用1-10份單獨的劑量，然后以保持或加強治療所需要的隨后的時間間隔給藥其它劑量的一種時間表。該劑量方案還應(yīng)該至少部分由個體的需要和從業(yè)者的判斷所確定?，F(xiàn)在將通過僅參考下述非限制性實施例的方式進(jìn)一步描述本發(fā)明。然而，應(yīng)該理解，下述實施例僅是舉例說明性的，并且不應(yīng)該以任何方式視為是對上述本發(fā)明的一般性的限制。特別地，盡管關(guān)于特異性相互作用組的使用詳細(xì)描述了本發(fā)明，但是應(yīng)該清楚地明白本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)不限于這些相互作用組。一鼓茲將細(xì)胞以約630,000個細(xì)胞/孔(HEK293FT)或約150,000個細(xì)胞/孔(COS-7)的密度接種在6-孔板中，并且在37。C,5。/。C02保持在補充了10%胎牛血清(FCS;Gibco)的完全培養(yǎng)基(包含0.3mg/ml谷氨酰胺，100IU/ml青霉素和100(ig/ml鏈霉素(Gibco)的DMEM)中。在接種后24小時，使用GeneJuice(Novagen)或Metafectene(Biontex)按照供應(yīng)商的用法說明迸行瞬時轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24小時，用PBS洗滌細(xì)胞，使用0.05%胰蛋白酶/0.53mMEDTA脫附，重懸在HEPES-緩沖的不含酚紅的含5%FCS的完全培養(yǎng)基中，并且加入到聚-L-賴氨酸-包被的白色微量培養(yǎng)板(Nimc)中。轉(zhuǎn)染后48小時，在用EnduRen普洛麥格((Promega))以30-40|iM的終濃度在37。C,5。/。C02預(yù)溫育細(xì)胞2小時后，進(jìn)行eBRET測定法2小時。對于原始的BRET研究，所述HEPES-緩沖的不含酚紅的完全培養(yǎng)基用PBS替代，并且在開始該測定法之前立即加入腔腸素h(分子探針(MolecularProbes))至終濃度5^M。BRET測量在37°C使用Victor光平板讀數(shù)儀利用Wallac1420軟件(Perkin-Elmer)進(jìn)行。在每個'供體波長范圍，(400-475nm)和'受體波長范圍，(對于EGFP〉500nm或?qū)τ贓YFP、Topaz(TYFP)或Venus520-540nm)連續(xù)測量過濾的光發(fā)射3-5秒。通過減去背景BRET比例而標(biāo)準(zhǔn)化在相互作用的蛋白之間觀察到的BRET信號。這可以以下列兩種方式中的一種進(jìn)行(參見Pfleger等(2006)細(xì)胞信號(Ce/Z^g^/J18,1664-1670;Pfleger等(2006)自然方法(淑Pratoc)1,336-344):l)從關(guān)于包含相互作用的受體和供體融合蛋白的樣品的同一比例減去關(guān)于僅包含供體構(gòu)建體的細(xì)胞樣品通過在400-475nm發(fā)射的'受體波長范圍，的光發(fā)射比例;2)從關(guān)于用配體處理的同一細(xì)胞樣品的第二等分試樣的同一比例減去關(guān)于用賦形劑處理的細(xì)胞樣品通過在400-475nm發(fā)射的'受體波長范圍，的光發(fā)射比例。在下述實施例中，將使用第一種計算法，除非將信號描述為'配體誘導(dǎo)的BRET比例'。備選地，并且特別地，當(dāng)舉例說明z-因子數(shù)據(jù)時(Zhang等(1999)生物分子篩選雜志aAowo/Scree"^4,67-73)，在相互作用的蛋白之間觀察的BRET信號可以與背景BRET比例結(jié)合(與減去之相反)顯示，以獨立地評估與在相互作用的蛋白之間觀察到的BRET信號相關(guān)的誤差和與背景BERT比例相關(guān)的誤差。在該情形中，數(shù)據(jù)顯示為"熒光/發(fā)光"，作為關(guān)于特定細(xì)胞樣品的通過在400-475nm發(fā)射的'受體波長范圍，的光發(fā)射比例。除非另外闡述，在96孔微量培養(yǎng)板中測量BRET信號。實施例l指示促甲狀腺素釋放激素受體與食欲肽受體的分子締合的可檢測信號的測量現(xiàn)在參考圖4，在用它們各自的配體處理后，從瞬時共表達(dá)TRHR/Rluc和barr2/Venus與pcDNA3，OxR2，CXCR2,HA-MC3R,HA-MC4R，D2LR或D2SR的細(xì)胞測量eBRET信號。在配體(在0分鐘處加入)處理之前，對于每種受體組合記錄基線eBRET信號。在第一分鐘內(nèi)，對共表達(dá)TRHR/Rluc和barr2/Venus與pcDNA3的細(xì)胞的TRH處理導(dǎo)致eBRET信號快速達(dá)到大于0.17的峰值，并且該信號在整個記錄時間期間內(nèi)(接近2小時)保持較高。在用OxA處理共表達(dá)TRHR/Rluc、barr2/Venus和OxR2的細(xì)胞后也觀察到信號。然而，該信號持續(xù)30分鐘達(dá)到約0.07-0.08。對于其余受體組合中的任一種沒有觀察到配體-誘導(dǎo)的eBRET信號。本實施例表明，對于其中促甲狀腺素釋放激素受體(TRHR)是IG1，Rluc是RC1,(3-抑制蛋白2(barr2)是IG2,Venus是RC2和OxR2是IG3的組合，并且當(dāng)在該情形中調(diào)控劑OxA作為與IG3特異性相互作用的結(jié)果調(diào)控IG2和IG3的締合時，特異性檢測到由RC1和RC2的接近導(dǎo)致的信號。當(dāng)IG3為CXCR2,HA-MC3R,HA-MC4R，D2LR或D2SR并且對這些IG3s特異性的激動劑調(diào)控IG2和IG3的締合時，沒有檢測到信號，這表明該信號是針對OxR2作為IG3的組合4爭異性的。更一般地，本實施例表明本發(fā)明的方法鑒定和/或監(jiān)測特異性相互作用組之間的特異性分子締合的能力，并且本發(fā)明人使用在本發(fā)明中所述的方法已經(jīng)鑒定了促甲狀腺素釋放激素受體與食欲肽受體的分子締合。本實施例還表明，關(guān)于由于IG2和IG3締合調(diào)控導(dǎo)致的由RC1和RC2接近產(chǎn)生的信號所觀察到的動力學(xué)模式不同于在該IG1-IG2締合由配體，在該情形中是TRH，與IG1的特異性相互作用調(diào)控時關(guān)于由IG1和IG2締合導(dǎo)致的由RC1和RC2接近產(chǎn)生的eBRET信號所觀察到的動力學(xué)模式。與后種模式相比，前種模式基本上是延遲的。71實施例2指示促甲狀腺素釋放激素受體與食欲肽受體的分子締合的加性(additive)可檢測信號的測量現(xiàn)在參考圖5，從瞬時共表達(dá)TRHR/Rluc和EGFP/barrl或EGFP/barr2與pcDNA3或0XR2的細(xì)胞測量eBRET信號。配體處理是僅用OxA或TRH或組合的OxA和TRH二者。在配體(在0分鐘處加入)處理之前，對于每種受體組合記錄基線eBRET信號。在整個記錄時間時期(70分鐘)，用PBS處理的表達(dá)每種組合的細(xì)胞僅表現(xiàn)出基線eBRET信號。在用OxA處理之后，表達(dá)OxR2和EGFP/barrl(十字形)或EGFP/barr2(灰色倒三角形)的細(xì)胞表現(xiàn)出在超過10分鐘后達(dá)到平臺的eBRET信號。在僅表達(dá)TRHR/Rluc(無OxR2)與任一種barr的細(xì)胞中，TRH處理導(dǎo)致對eBRET信號的快速刺激。具有barr2的信號(黑色圓)比關(guān)于barrl(灰色三角形)的信號大，然而，如果存在OxA，則關(guān)于任一種抑制蛋白不存在差異(barr2,黑色三角形；barrl,灰色圓)。在表達(dá)TRHR/Rluc和OxR2(barrl,灰色正方形；barr2,黑色正方形)二者的細(xì)胞中，加入兩種配體表現(xiàn)出增加的eBRET信號，其高于在單獨加入OxA或TRH之后觀察到的信號。本實施例表明，對于其中促甲狀腺素釋放激素受體(TRHR)是IG1，Rluc是RC1,(3-抑制蛋白1(barrl)或卩-抑制蛋白2(barr2)是IG2，EGFP是RC2和OxR2是IG3的組合，在調(diào)控劑OxA作為與IG3特異性相互作用的結(jié)果調(diào)控IG2和IG3的締合時,檢測到由RC1和RC2的接近導(dǎo)致的信號。'因此，本實施例表明使用與實施例l所示的備選組合，包括使用不同的IG2和RC2的信號檢測。如在實施例1中，本實施例表明關(guān)于在該情形中由于通過OxA調(diào)控IG2和IG3的締合導(dǎo)致的由RC1和RC2接近產(chǎn)生的信號所觀察到的延遲的動力學(xué)模式不同于在該IG1-IG2締合由配體，在該情形中是TRH，與IG1的特異性相互作用調(diào)控時關(guān)于由IG1和IG2締合導(dǎo)致的由RC1和RC2接近產(chǎn)生的eBRET信號所觀察到的更快速的動力學(xué)模式。然而，除了在實施例中所表明的之外，本實施例表明使用IG1配體(TRH)和IG3配體(OxA;調(diào)控劑)組合治療的加性效應(yīng)。72因此，本實施例提供本發(fā)明所述的方法鑒定和/或監(jiān)測特異性相互作用組之間的特異性分子締合的能力的深入且清楚的證明，以及使用本發(fā)明所述的方法關(guān)于促甲狀腺素釋放激素受體與食欲肽受體的分子締合的深入且清楚的證據(jù)，原因在于該附加作用是除了IG2-IG3-IG1締合之外由于IG1-IG2締合的結(jié)果產(chǎn)生的RC1和RC2接近的指示。這提供針對在不存在IGl-特異性配體的條件下由非特異性IG1-IG2締合產(chǎn)生的信號的證據(jù)。不希望受到理論限制，這種附加作用也可能部分是由于IG1配體作用為調(diào)控劑通過對IG3的變構(gòu)作用而調(diào)控IG2和IG3的締合所導(dǎo)致。此外，這種附加作用也可能部分是由于活性IG構(gòu)象(與激動劑結(jié)合的一種構(gòu)象)導(dǎo)致，所述構(gòu)象更有利于信號產(chǎn)生，可能能夠增加RC1和RC2的接近，或更有利于RC1和RC2的相對取向。實施例3競爭調(diào)控劑結(jié)合的拮抗劑對信號產(chǎn)生的作用的測量現(xiàn)在參考圖6，在加入1(T6MOxA(IG3配體；調(diào)控劑)或1(T6MTRH(IG1配體)、或二者之前用1(^MOxRl-選擇性拮抗劑SB-334867-A預(yù)處理約40分鐘后，從瞬時共表達(dá)TRHR/Rluc和barr2/Venus與pcDNA3、OxRl或OxR2的細(xì)胞測量eBRET信號。將未用拮抗劑預(yù)處理的細(xì)胞用PBS代替進(jìn)行預(yù)處理相同量的時間。在激動劑(在0分鐘處加入)處理之前，對于每種受體組合記錄基線eBRET信號。對于OxA-處理的TRHR/Rluc和barr2/Ve皿s與OxRl觀察到小eBRET信號沐色菱形)。在存在拮抗劑的條件下，該信號減小(開放的正方形)。向表達(dá)OxRl的細(xì)胞中加入TRH和OxA二者導(dǎo)致高得多的信號(白色三角形)，并且在存在拮抗劑的條件下，該信號的大小減小(灰色圓形)。在用OxA處理共表達(dá)TRHR/Rluc、barr2/Venus與OxR2的細(xì)胞后觀察到eBRET信號(黑色菱形)。該信號不受拮抗劑預(yù)處理的影響(白色正方形)。向表達(dá)OxR2的細(xì)胞中加入TRH和OxA二者產(chǎn)生這樣的信號，其在存在(黑色圓形)或不存在(灰色三角形)拮抗劑的條件下沒有不同。本實施例顯示，對于其中促甲狀腺素釋放激素受體(TRHR)是IG1,Rluc是RC1,(3-抑制蛋白2(barr2)是IG2，Venus是RC2和OxRl或OxR2是IG3的組合，在調(diào)控劑OxA作為與IG3特異性相互作用的結(jié)果調(diào)控IG2和IG3的締合時，檢測到的由RC1和RC接近產(chǎn)生的信號。本實施例表明，調(diào)控劑結(jié)合的特異性拮抗性，在該情形中，OxA通過OxRl-選擇性拮抗劑SB-334867-A作用在OxRl上的特異性拮抗性，可以作為其對由于受到調(diào)控劑調(diào)控的RC1和RC2接近產(chǎn)生的信號的結(jié)果而檢測，在該情形中所述調(diào)控劑是OxA。實施例4在IG3上應(yīng)用不組成報道成分的標(biāo)記現(xiàn)在參考圖7，從瞬時共表達(dá)TRHR/Rluc和EGFP/barrl或EGFP/barr2與pcDNA3或HA-OxR2的細(xì)胞測量eBRET信號。配體處理是僅用OxA或TRH。在配體(在0分鐘處加入)處理之前，對于每種受體組合記錄基線eBRET信號。在整個記錄時間時期(80分鐘)，用PBS處理的表達(dá)每種組合的細(xì)胞僅表現(xiàn)出基線eBRET信號(數(shù)據(jù)未顯示)。在用OxA處理之后，表達(dá)HA-OxR2和任一種EGFP/barrs的細(xì)胞表現(xiàn)出在超過10分鐘后達(dá)到平臺的eBRET信號(EGFP/barrl，黑色菱形，和EGFP/barr2,黑色圓形)。在僅表達(dá)TRHR/Rluc的細(xì)胞(無HA-OxR2)中，TRH刺激eBRET信號的快速增加，在最初的幾分鐘內(nèi)達(dá)到峰值，然后在剩余的記錄時間期間內(nèi)信號略微下移(灰色正方形)。在向缺乏HA-OxR2的細(xì)胞中加入OxA后沒有觀察到eBRET信號高于基線的增加(灰色三角形)。本實施例顯示，對于其中促甲狀腺素釋放激素受體(TRHR)是IG1,Rluc是RC1,(3-抑制蛋白1(barrl)或卩-抑制蛋白2(barr2)'是IG2,EGFP是RC2和血凝素(HA)表位-標(biāo)記的OxR2(HA-OxR2)是IG3的組合，在調(diào)控劑OxA作為與IG3特異性相互作用的結(jié)果調(diào)控IG2和IG3的締合時，檢測到的由RC1和RC2的接近產(chǎn)生的信號。本實施例表明，IG3可以被標(biāo)記，諸如通過加入血凝素(HA)表位-標(biāo)記，然而，該標(biāo)記不組成報道成分并且不干擾和/或有助于由RC1和RC2的接近產(chǎn)生的信號。這樣的標(biāo)記能夠確定附加信息，諸如IG3的相對表達(dá)水平。實施例S突變體B-抑制蛋白作為相互作用組的應(yīng)用現(xiàn)在參考圖8，從瞬時共表達(dá)TRHR/Rluc和EGFP/barrl或EGFP/barrl不依賴磷酸化作用的突變體R169E(EGFP/barrlR169E)與pcDNA3或OxR2的細(xì)胞測量eBRET信號。配體處理為僅用OxA或TRH。在配體(在0分鐘處加入)處理之前，對于每種受體組合記錄基線eBRET信號。在整個記錄時間時期(100分鐘)，用PBS處理的表達(dá)每種組合的細(xì)胞僅表現(xiàn)出基線eBRET信號(白色正方形，白色菱形和黑色菱形)。在用OxA處理之后，表達(dá)OxR2禾nEGFP/barrl(黑色圓形)或EGFP/barrlR169E(黑色三角形)的細(xì)胞表現(xiàn)出eBRET信號，其中EGFP/barrl在超過10分鐘后達(dá)到平臺，而EGFP/barrlR169E顯示較低的信號，其直到20分鐘才達(dá)到平臺。在僅表達(dá)TRHR/Rluc(無OxR2)與任一種barrs的細(xì)胞中，TRH刺激eBRET信號的快速增加，在最初的幾分鐘內(nèi)達(dá)到峰值，然后在剩余記錄時間期間內(nèi)該信號略微下移。關(guān)于EGFP/barrlR169E的信號(白色三角形)低于關(guān)于EGFP/barrl的信號(白色圓形)，其可能反映該蛋白的較低的表達(dá)水平。本實施例顯示，對于其中促甲狀腺素釋放激素受體(TRHR)是IG1,Rluc是RC1,barrl或barrlR169E是IG2,EGFP是RC2和OxR2是IG3的組合檢測到的由RC1和RC2的接近產(chǎn)生的信號。本實施例表明，在使用突變體p-抑制蛋白，如(3-抑制蛋白l不依賴磷酸化作用的突變體R169E，作為相互作用組之一時，可以產(chǎn)生可檢測的信號。實施例6測量指示C-端截短的促甲狀腺素釋放激素受體與食欲肽受體的分子締合的可檢測的信號現(xiàn)在參考圖9，從瞬時共表達(dá)TRHR335/Rluc和EGFP/barrl與OxR2或TRHR的細(xì)胞測量eBRET信號。配體處理是僅用OxA或TRH。在配體(在0分鐘處加入)處理之前，對于每種受體組合記錄基線eBRET信號。在用OxA處理之后，表達(dá)OxR2的細(xì)胞(黑色圓形)表現(xiàn)出在約20分鐘之后達(dá)到平臺的eBRET信號。相反，在用OxA處理時從表達(dá)TRHR的細(xì)胞(白色三角形)，或在用TRH處理時從表達(dá)OxR2的細(xì)75胞(黑色正方形)，沒有觀察到高于基線的eBRET信號。本實施例顯示，對于其中在氨基酸335處截短的促甲狀腺素釋放激素受體(TRHR335)是IG1,Rluc是RC1,卩-抑制蛋白1(barrl)是IG2,EGFP是RC2和OxR2或TRHR是IG3的組合，檢測到由RC1禾BRC2的接近產(chǎn)生的信號。本實施例表明，在IG1不與IG2相互作用時，在該情形中，截短的TRHR不與barrl相互作用，可以產(chǎn)生可檢測的信號(Heding等(2000)內(nèi)分泌學(xué)(五wfocn'"o/ogy)141,299-306)。當(dāng)用TRH處理TRHR335/Rluc+EGFP/barrl+OxR2時在圖9中觀察到的信號缺乏證實當(dāng)用OxA處理該試劑組合時觀察到的信號不是由于IG1-IG2締合產(chǎn)生。因此，本實施例提供促甲狀腺素釋放激素受體與食欲肽受體分子締合的深入且清楚的證據(jù)，原因在于IG1不與IG2相互作用是作為IG2-IG3-IG1締合而不是IG1-IG2締合的結(jié)果的RC1和RC2接近的指示。這進(jìn)一步提供針對在不存在IGl-特異性配體的條件下由非特異性IG1-IG2締合產(chǎn)生的信號的證據(jù)。此夕卜，本實施例表明，該信號由IG2-IG3-IG1締合導(dǎo)致，而與引起IG1反式激活的IG3激活相反，其然后與IG2締合，由此在IG2和IG3不締合的條件下引起RC1和RC2緊密接近。實施例7測量以特征性劑量-依賴性方式指示TRHR與OXR2分子締合的可檢測的信號現(xiàn)在參考圖10、11和12，從瞬時共表達(dá)下列各項的細(xì)胞測量BRET信號TRHR/Rluc和barr2/Venus與pcDNA3(用增加的TRH劑量處理；圖10);OxR2/Rluc和barr2/Venus與pcDNA3(用增加的OxA劑量處理；圖11);以及TRHR/Rluc和barr2/Venus與OxR2(用增加的OxA劑量處理；圖12)。本實施例顯示關(guān)于TRHR作為IG1，Rluc作為RC1,barr2作為IG2,Venus作為RC2且在不存在IG3的條件下的TRH劑量-響應(yīng)油線(圖10);關(guān)于OxR2作為IG1，Rluc作為RC1,barr2作為IG2，Venus作為RC2且在不存在IG3的條件下的OxA劑量-響應(yīng)曲線(圖ll);以及關(guān)于TRHR作為IG1，Rluc作為RC1，barr2作為IG2,Venus作為RC2和OxR2作為IG3的OxA劑量-口向應(yīng)曲線(圖12)。本實施例表明，信號可以以劑量-依賴性方式檢測。此外，關(guān)于由作用在IG3(OxR2)上的調(diào)控劑(OxA)以及因此由IG1-RC1(TRHR/Rluc)和IG2-RC2(barr2/Venus;圖12)接近產(chǎn)生的信號的EC5o值與來自導(dǎo)致IG1-RC1(OxR2/Rluc)和IG2-RC2(barr2/Venus;圖1l)接近的OxA對IG1(OxR2)的激活的那些相當(dāng)，并且不同于來自導(dǎo)致IG1-RC1(TRHR/Rluc)和IG2-RC2(barr2/Venus;圖IO)接近的TRH對IG1(TRHR)的激活的那些。因此，本實施例進(jìn)一步表明，信號由IG2-IG3-IG1締合產(chǎn)生而不是由IG1-IG2締合產(chǎn)生。關(guān)于導(dǎo)致IG1-RC1(OxR2/Rluc)和IG2-RC2(barr2/Venus;圖U)接近的OxA對IGl(OxR2)的激活；禾B導(dǎo)致IG1-RC1(TRHR/Rluc)和IG2-RC2(barr2/Venus;圖IO)接近的TRH對IG1(TRHR)的激活的劑量-響應(yīng)Hill斜率均約為1。相反，關(guān)于導(dǎo)致IG1-RC1(TRHR/Rluc)和IG2-RC2(barr2/Venus;圖12)接近的作用在IG3(OxR2)上的調(diào)控劑(OxA)的劑量-口向應(yīng)Hill斜率顯著大于l。因此，本實施例表明使用Hill斜率作為指征鑒定和監(jiān)測特異性分子締合的潛力。本實施例進(jìn)一步表明，不同形式的Rluc底物(報道成分引發(fā)物)，在該情形中為腔腸素h和EnduRen，可以用來產(chǎn)生具有相似EC5Q值的數(shù)據(jù)(圖12)。實施例8測量以劑量-依賴性方式指示TRHR與OXR2的分子締合的加性可檢測信號現(xiàn)在參考圖13和14，在不存在OxR2的條件下，使用增加劑量的TRH，從瞬時共表達(dá)TRHR/Rluc和EGFP/barrl的細(xì)胞，以及使用增加的OxA劑量有和無10.6MTRH、或增加的TRH劑量與10—6MOxA，從瞬時共表達(dá)TRHR/Rluc和EGFP/barrl與OxR2的細(xì)胞，測量BRET信號。本實施例顯示通過將使用1CT6MTRH產(chǎn)生的配體誘導(dǎo)的信號(來自TRH:TRHR/Rluc+EGFP/barrl曲線)與關(guān)于OxA:TRHR/Rluc+EGFP/barrl+OxR2曲線所產(chǎn)生的每個點相加而數(shù)學(xué)產(chǎn)生的曲線(TRHR/Rluc+EGFP/barrl+OxR2:TRH(10'6M)+OxA:計算的數(shù)據(jù))，其在由關(guān)于TRHR/Rluc+EGFP/barrl+OxR2:TRH(1(T6M)+OxA組合觀察到的數(shù)據(jù)產(chǎn)生的曲線之上(圖13)。此外，本實施例顯示通過將使用10—6MOxA產(chǎn)生的配體-誘導(dǎo)的信號(來自O(shè)xA:TRHR/Rluc+EGFP/barrl+OxR2曲線)與關(guān)于TRH:TRHR/Rluc+EGFP/barrl曲線產(chǎn)生的每個點相加而數(shù)學(xué)產(chǎn)生的曲線(TRHR/Rluc+EGFP/barrl+OxR2:TRH+OxA(1(T6M):計算的數(shù)據(jù))，其在關(guān)于TRHR/Rluc+EGFP/barrl+OxR2:TRH+OxA(10'6M)組合觀察到的數(shù)據(jù)產(chǎn)生的曲線之上(圖14)。因此，本實施例清楚地表明了使用IG1配體(TRH)和IG3配體(OxA;調(diào)控劑)組合處理的劑量依賴性方式的加性效應(yīng)。因此，本實施例進(jìn)一步提供關(guān)于促甲狀腺素釋放激素受體與食欲肽受體的分子締合的證據(jù)，原因在于該加性效應(yīng)指示作為除了IG2-IG3-IG1締合之外的IG1-IG2締合結(jié)果的RC1和RC2接近。這進(jìn)一步提供針對在不存在IGl-特異性配體條件下來源于非特異性IG1-IG2締合的信號的證據(jù)。不希望受到理論限制，該加性效應(yīng)還可能部分是由于IG1配體作用為調(diào)控劑通過對IG3的變構(gòu)作用而調(diào)控IG2和IG3的締合而產(chǎn)生。此外，該加性效應(yīng)還可能部分是由于活性IG構(gòu)象(與激動劑結(jié)合的構(gòu)象)，其更有利于信號產(chǎn)生，可能能夠增加RC1和RC2的接近，或RC1和RC2的更有利的相對取向。實施例9測量以劑量-依賴性方式指示TRHR335與OXR2的分子締合的加性可檢測信號現(xiàn)在參考圖15，使用增加劑量的單獨的TRH與OxA或二者的組合，從瞬時共表達(dá)TRHR335/Rluc、barr2/Venus和OxR2的細(xì)胞，測量BRET信號。使用劑量響應(yīng)曲線，本實施例表明，在IG1(TRHR335)不能與IG2(barr2)相互作用時，加入TRH沒有導(dǎo)致作為與IG1(TRHR335)相互作用的結(jié)果的由RC1(Rluc)與RC2(Venus)接近產(chǎn)生的BRET信號。然而，觀察到由于與IG3(OxR2)相互作用的結(jié)果由RC1(Rluc)和RC2(Venus)接近產(chǎn)78生的BRET信號，這表明IGl(TRHR335)和IG3(OxR2)的締合。這證實實施例6中的數(shù)據(jù)。本實施例進(jìn)一步表明，盡管缺少由于加入TRH引起的BRET信號，但是當(dāng)加入TRH和OxA二者時，觀察到高于僅加入OxA觀察到的增加的信號。這表明，盡管不能有助于IG1-IG2(TRHR335-barr2)締合，IG1(TRHR335)的激活不影響信號產(chǎn)生。不希望受到理論限制，這可能暗示IG1通過變構(gòu)機制影響IG3。這也可能暗示活性IG構(gòu)象(與激動劑結(jié)合的構(gòu)象)更有利于信號產(chǎn)生，可能能夠增加RC1和RC2的接近，或者RC1和RC2的更有利的相對取向。因此，本實施例進(jìn)一步表明，與單獨的IG3處理相比較，IG1和IG3共同處理可以導(dǎo)致額外的信號產(chǎn)生和/或信息，并且本發(fā)明包括這樣的共同處理。實施例10測量指示TRHR與不同表達(dá)水平的OXR2的分子締合的可檢測的信號現(xiàn)在參考圖16，在加入10—6MOxA后，從瞬時共表達(dá)TRHR/Rluc、EGFP/barrl和OxR2的細(xì)胞測量eBRET信號。本實施例顯示關(guān)于每種受體組合隨時間的累積eBRET讀數(shù)(IG1和IG3;在83分鐘內(nèi)捕獲的數(shù)據(jù))。對于每次實驗，轉(zhuǎn)染相同量的EGFP/barrl(IG2-RC2)。以恒定量(0.1iigDNA/孑L)轉(zhuǎn)染TRHR/Rluc(IGl-RCl)，而以變化量的DNA(O,0.01,0.05,0.1，0.5,0.7嗎DNA/孔)轉(zhuǎn)染OxR2(IG3)。僅當(dāng)OxR2(IG3)表達(dá)時，檢測到信號(在0ngOxR2沒有記錄到信號)。本實施例表明當(dāng)OxR2的DNA濃度信號低至O.Ol嗎DNA/孔時，可以檢測到信號。此外，本實施例表明，在每次轉(zhuǎn)染中增加的OxR2DNA的量導(dǎo)致可檢測信號的增加。在1:1比例的DNA濃度(0.1:0.1pgDNA/孔)觀察到最大可檢測信號。以高于TRHR/RlucDNA的量的水平進(jìn)一步增加OxR2DNA濃度(0.5或0.7pgDNA/孔)導(dǎo)致檢測到較低的信號。本實施例暗示增加IG3分子(OxR2)數(shù)目導(dǎo)致到達(dá)這樣的點，所述點超過IG1分子(丁皿)數(shù)目成為形成異源-二聚體/-寡聚體的限制的點。因此，當(dāng)與不產(chǎn)生信號的調(diào)控劑(OxA)相互作用時，對于不與IGl分子(TRHR)締合的IG3分子(OxR2)存在與IG2-RC2(EGFP/barrl)締合的增加的傾向。因此，由于關(guān)于IG2-RC2(EGFP/barrl)締合的競爭作用，信號產(chǎn)生將受到抑制。因此，本實施例使用本發(fā)明所述的方法提供關(guān)于促甲狀腺素釋放激素受體與食欲肽受體的分子締合的深入且清楚的證據(jù)，原因在于，如果信號不是依賴于IG1和IG3的特異性分子締合，則預(yù)計使用超過IG1濃度增加的增加的IG3濃度不會發(fā)生這樣的信號減少。實施例11在384-孔板中測量指示TRHR與OXR2的分子締合的可檢測信號現(xiàn)在參考圖17，在96-孔和384-孔微量培養(yǎng)板中使用增加的OxA劑量，從瞬時共表達(dá)TRHR/Rluc、barr2/Venus和OxR2的細(xì)胞測量BRET信號。使用相同濃度的表達(dá)相同濃度的試劑的細(xì)胞，相同濃度的Rluc底物(報道成分引發(fā)物)和相同濃度的配體(調(diào)控劑)，進(jìn)行BRET測量。加入到384-孔板的每個孔的總體積約為加入到96-孔板的每個孔的體積的一半。本實施例表明除了96-孔板之外，在384-孔板中，以劑量-依賴性方式指示TRHR與OxR2的分子締合的可檢測信號的測量。因此，本實施例證明本發(fā)明所述的方法能夠按比例縮小，由此使其易于進(jìn)行高通量篩選應(yīng)用。實施例12測暈指示作為IG3的促甲狀腺素釋放激素受體與作為IG1的食欲肽受體的分子締合的可檢測信號現(xiàn)在參考圖18，從瞬時共表達(dá)OxR2/Rluc8和barr2/Venus與HA-TRHR或pcDNA3的細(xì)胞，測量eBRET信號。配體處理為用OxA或TRH。在配體或賦形劑(在0分鐘處加入)處理之前，對于每種受體組合記錄基線eBRET信號。在最初5分鐘內(nèi)，用OxA處理共表達(dá)OxR2/Rluc8和barr2/Venus與HA-TRHR的細(xì)胞，導(dǎo)致eBRET信號快速達(dá)到0.1的峰值，并且在整個記錄時間期間(經(jīng)過1小時)內(nèi)該信號保持為較高。在用TRH處理共表達(dá)OxR2/Rluc8、barr2/Venus和HA-TRHR的細(xì)胞后，也觀察到信號。然而，該信號隨時間逐漸增加至達(dá)到0.05。在用TRH處理共表達(dá)OxR2/Rluc8和barr2/Venus與pcDNA3的細(xì)胞之后沒有觀察到配體-誘導(dǎo)的eBRET信號。本實施例表明，對于其中OxR2是IG1，Rluc8是RC1,(3-抑制蛋白2(barr2)是IG2,Venus是RC2和HA-TRHR是IG3的組合，并且當(dāng)調(diào)控劑，在該情形中為TRH，作為與IG3特異性相互作用的結(jié)果調(diào)控IG2和IG3的締合時，特異性檢測到由RC1和RC2接近產(chǎn)生的信號。本實施例表明使用作為IG3的促甲狀腺素釋放激素受體和作為IG1的食欲肽受體檢測到促甲狀腺素釋放激素受體與食欲肽受體的分子締合。這表明與前述實施例比較使用備選的IG's排列這些受體的分子締合的檢測。本實施例還表明第二類型的螢光素酶,Rluc8的應(yīng)用，在該情形中其用作RC1，Venus作為RC2。本實施例進(jìn)一步表明記述在Pfleger等，2006(細(xì)胞信號(CW/S/g"aO18,1664畫1670)和Pfleger等，2006(自然方法(脂Protoc)1,336-344)中的計算eBRET信號的備選方法可以用來測量指示促甲狀腺素釋放激素受體和食欲肽受體的分子締合的可檢測信號。如在實施例4中，本實施例表明可以標(biāo)記IG3，諸如通過加入血凝素(HA)表位-標(biāo)記，然而，該標(biāo)記不組成報道成分并且不干擾和/或有助于由RC1和RC2的接近產(chǎn)生的信號。這樣的標(biāo)記能夠使用本發(fā)明所述的方法確定額外的信息，諸如IG3的相對表達(dá)水平。實施例13測量指示促甲狀腺素釋放激素受體與具有超過0.6的Z-因子的食欲肽受體的分子締合的可檢測信號現(xiàn)在參考圖19、20和21，從等分在96-孔板的所有孔中的瞬時共表達(dá)TRHR/Rluc8和barr2/Venus與HA-OxR2的細(xì)胞測量eBRET信號。在96孔板的前兩行和最后兩行(共48個孔)加入磷酸緩沖鹽溶液(PBS)作為賦形劑對照。將OxA加入到96孔板的中間4行(共48個孔)中。數(shù)據(jù)表示為熒光/發(fā)光。81在配體或賦形劑(在0分鐘處加入)處理之前，記錄基線讀數(shù)。用OxA處理共表達(dá)TRHR/Rluc8和barr2/Venus與HA-0xR2的細(xì)胞導(dǎo)致熒光/發(fā)光比例的增加(圖20)，在用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)賦形劑對照處理后沒有觀察到該增加(圖19)。使用Zhang等，1999(生物分子篩選雜志(J歷owo/Scree")4,67-73)所述的計算法，比較用OxA處理的48-孔(定義為關(guān)于z-因子計算的'信號')和用PBS處理的48-L(定義為關(guān)于z-因子計算的'背景')的熒光/發(fā)光比例的分析導(dǎo)致0.67的z-因子。平均值顯示為實線和來自顯示為虛線的平均值的3個標(biāo)準(zhǔn)偏差。本實施例表明，對于其中TRHR是IG1,Rluc8是RC1，p-抑制蛋白2(barr2)是IG2,Venus是RC2和HA-OxR2是IG3的組合，并且在調(diào)控劑，在該情形中為OxA，作為與IG3特異性相互作用的結(jié)果調(diào)控IG2和IG3的締合時，特異性檢測到由于RC1和RC2的接近產(chǎn)生的信號。本實施例表明，以導(dǎo)致超過0.6的z-因子的方式檢測促甲狀腺素釋放激素受體和食欲肽受體的分子締合，并且因此易于進(jìn)行高通量篩選。本實施例進(jìn)一步證明表示BRET數(shù)據(jù)的第三種方法，其可以用來表示指示促甲狀腺素釋放激素受體和食欲肽受體的分子締合的可檢測信號。如在實施例4和12中，本實施例表明可以標(biāo)記IG3，諸如通過添加血凝素(HA)表位-標(biāo)記，然而，該標(biāo)記不組成報道成分并且不干擾和/或有助于由RC1和RC2的接近產(chǎn)生的信號。這樣的標(biāo)記能夠使用本發(fā)明所述的方法確定額外的信息，諸如IG3的相對表達(dá)水平。實施例14測量指示已知的CCR2和CCR5的分子締合的可檢測信號—現(xiàn)在參考圖22和23:從瞬時共表達(dá)CCR5(5)TYFP和barr2/Rluc與CCR2或pcDNA3的細(xì)胞測量eBRET信號(配體處理為用MCP1，MIPlb,或組合的MCP1和MIPlb二者；圖22);從用增加劑量的單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP1;CCR2選擇性配體)處理的瞬時共表達(dá)CCR5(5)TYFP、barr2/Rluc和CCR2的細(xì)胞測量配體-誘導(dǎo)的BRET信號，并且表示為BRET比例(％最大值；圖23)。在配體(在0分鐘處加入)處理之前，對于每種受體組合記錄基線eBRET信號(圖22)。在表達(dá)CCR5(5)TYFP與barr2/Rluc和pcDNA3的細(xì)胞中，CCR2選擇性配體MCP1沒有引發(fā)eBRET信號(開放圓形)，而CCR5選擇性配體MIPlb產(chǎn)生強信號(黑色正方形)。加入MCP1對該信號沒有產(chǎn)生差別(開放的正方形)。在存在CCR2的條件下，MCP1能夠產(chǎn)生barr2/Rluc和CCR5(5)TYFP之間的信號(黑色圓形)。用MIPlb處理這些細(xì)胞也產(chǎn)生信號(灰色圓形)。這低于在不存在CCR2條件下產(chǎn)生的信號，其可能是由于當(dāng)共表達(dá)3種蛋白時更低的受體表達(dá)水平和/或可能是在異源二聚化時受體構(gòu)象改變的結(jié)果。在表達(dá)兩種受體的細(xì)胞中用兩種配體處理產(chǎn)生最高的eBRET信號(黑色倒三角形)。用PBS處理的表達(dá)所述組合的每一種的細(xì)胞(開放的三角形和灰色正方形)在整個記錄時間期間內(nèi)(95分鐘)僅表現(xiàn)出基線eBRET信號。本實施例進(jìn)一步顯示關(guān)于CC趨化因子受體5(CCR5)作為IG1,Topaz(TYFP)作為RC1，barr2作為IG2,Rluc作為RC2和CC趨化因子受體2(CCR2)作為IG3的MCP1劑量-響應(yīng)曲線(圖23)。本實施例表明，對于其中CCR5是IG1，Topaz(TYFP)是RCl,|3-抑制蛋白2(barr2)是IG2,Rluc是RC2和CCR2是IG3的組合，在調(diào)控劑MCP1(CCR2選擇配體)作為與IG3特異性相互作用的結(jié)果調(diào)控IG2和IG3的締合時，檢測到由RC1和RC2的接近產(chǎn)生的信號。因此，本實施例證明了在參考文獻(xiàn)中公布的使用IG1和IG3作為GPCRs作為形成功能性異源-二聚體/-寡聚體的信號檢測(^^11^0等(2001)胚胎學(xué)雜志(五M50JoMma/)20,2497-2507)，其與實施例1中證明的新型異源-二聚體7-寡聚體截然不同，由此提供對本發(fā)明的方法的獨立確認(rèn)。對于barr2/Rluc+CCR(5)TYFP+CCR2組合，使用MCP1和MIPlb共同處理導(dǎo)致高于單獨使用MCP1和MIPlb產(chǎn)生的信號的相加的信號(圖22)。因此，本實施例表明，使用關(guān)于IG1和IG3二者的配體共同處理的增強的信號不可能完全通過IG1-IG2締合和IG2-IG3-IG1締合的加性效應(yīng)解釋。因此，不希望受到理論限制，本實施例表明，IG1配體還可以作用為調(diào)控劑通過對IG3的變構(gòu)作用來調(diào)控IG2和IG3的締合。此外，活性IG構(gòu)象(與激動劑結(jié)合的構(gòu)象)可更有利于信號產(chǎn)生，可能能夠增加RC1和RC2的接近，或RC1和RC2的更有利的相對取向。因此，本實施例表明，與單獨的IG3處理相比，IG1和IG3的共同處理可以導(dǎo)致額外的信號產(chǎn)生和/或信息，并且本發(fā)明包括所述共同處理。本實施例還證明第三種類型的熒光團Topaz(TYFP)的應(yīng)用，在該情形中其用作RC1，Rluc作為RC2。實施例15測量指示已知的B2R和AT1R的分子締合的可檢測信號現(xiàn)在參考圖24和25:從用血管緊張素II(AngII)處理的瞬時共表達(dá)B2R/Rluc8、barr2/Venus和HA-AT1R的細(xì)胞測量eBRET信號(圖24)和劑量-響應(yīng)曲線(圖25)。在配體(在0分鐘處加入)處理之前，記錄基線eBRET信號(圖24)。AngII處理產(chǎn)生eBRET信號的強增加。本實施例進(jìn)一步顯示關(guān)于緩激肽B2受體(B2R)作為IG1，Rluc8作為RC1，barr2作為IG2,Venus作為RC2和血凝素表位-標(biāo)記的1型血管緊張素II受體(HA-AT1R)作為IG3的AngII劑量-響應(yīng)曲線(圖23)。本實施例表明，對于其中B2R是IG1，Rluc8是RCl，barr2是IG2，Venus是RC2和HA-AT1R是IG3的組合，在調(diào)控劑AngII作為與IG3特異性相互作用的結(jié)果調(diào)控IG2和IG3的締合時，檢測到由于RC1和RC2的接近產(chǎn)生的信號。因此，本實施例證明了在參考文獻(xiàn)中公布的使用IG1和IG3作為第二GPCRs組合作為形成功能性異源-二聚體/-寡聚體的信號檢測(八6(^1^等(2000)自然(A^we)407，94-98;AbdAlla等(2001)自然醫(yī)學(xué)(A^.Afe/.)7,1003-1009),其與實施例1中證明的新型異源-二聚體/-寡聚體截然不同，由此提供對本發(fā)明的方法的進(jìn)一步的獨立確認(rèn)。權(quán)利要求1.一種用于檢測分子締合的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括i).第一試劑，其包括與第一報道成分偶聯(lián)的第一相互作用組；ii).第二試劑，其包括與第二報道成分偶聯(lián)的第二相互作用組；iii).第三試劑，其包括第三相互作用組；iv).調(diào)控劑；和v).檢測器；其中所述第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生能夠由所述檢測器檢測的信號；并且其中所述調(diào)控劑調(diào)控所述第二相互作用組與所述第三相互作用組的締合；以使由所述檢測器監(jiān)測由所述第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生的信號組成監(jiān)測所述第一和第三試劑的締合。2.按照權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其特征在于所述系統(tǒng)還包括報道成分引發(fā)物，其中僅在存在所述報道成分引發(fā)物的條件下，所述第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生能夠由所述檢測器檢測的信號。3.—種檢測分子締合的方法，所述方法包括下列步驟i).提供第一試劑，所述第一試劑包括與第一報道成分偶聯(lián)的第一相互作用組；ii).提供第二試劑，所述第二試劑包括與第二報道成分偶聯(lián)的第二相互作甩組；iii).提供第三試劑，所述第三試劑包括第三相互作用組；iv).提供調(diào)控劑；其中；所述第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生信號；并且其中所述調(diào)控劑調(diào)控所述第二相互作用組與所述第三相互作用組的締合；然后v).檢測和/或監(jiān)測由所述第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生的任何信號；從而通過所述檢測器監(jiān)測由所述第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生的信號組成監(jiān)測所述第一和第三試劑的締合。4.按照權(quán)利要求3的方法，其特征在于，在檢測和/或監(jiān)測由所述第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生的任何信號的步驟之前，所述方法還包括提供報道成分引發(fā)物的步驟，其中僅在存在所述報道成分引發(fā)物的條件下，所述第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生能夠由所述檢測器檢測的信號。5.按照權(quán)利要求4的方法，其特征在于，提供報道成分引發(fā)物和提供調(diào)控劑的步驟發(fā)生于提供所述第一、第二和第三試劑的步驟之后。6.按照前述權(quán)利要求任一項的系統(tǒng)或方法，其特征在于，所述第一、第二和第三試劑通過在向其中引入調(diào)控劑的細(xì)胞中共表達(dá)的方式提供。7.—種用于確定當(dāng)?shù)诙鞍着c第一蛋白締合時，測試化合物是否與第二蛋白相互作用和/或其程度的方法，所述方法包括下列步驟a).使所述測試化合物與系統(tǒng)接觸，所述系統(tǒng)包括i).第一試劑，所述第一試劑包括與第一報道成分偶聯(lián)的第一蛋白；ii).第二試劑，所述第二試劑包括與第二報道成分偶聯(lián)的相互作用組；iii).第三試劑，所述第三試劑包括所述第二蛋白；其中所述第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生信號；并且其中調(diào)控劑調(diào)控所述相互作用組與所述第二蛋白的締合；b).確定信號，作為當(dāng)所述第二蛋白與第一蛋白締合時，所述測試化合物是否與第二蛋白相互作用和/或其程度的確定。8.按照權(quán)利要求7的方法，其特征在于，所述第二蛋白是受體，從而確定在所述第二蛋白與第一蛋白締合時測試化合物是否與第二蛋白相互作用和/或其程度的方法包括用于確定當(dāng)所述第二蛋白與第一蛋白締合時，測試化合物是否是第二蛋白的激動劑和/或其程度的方法，并且更具體地，確定信號作為當(dāng)所述第二蛋白與第一蛋白締合時，所述測試化合物是否與第二蛋白相互作用和/或其程度的確定的步驟包括這樣的步驟，即，檢測信號的增加，作為當(dāng)所述第二蛋白與第一蛋白締合時，所述測試化合物是否是所述第二蛋白的激動劑的確定。9.按照權(quán)利要求8的方法，其特征在于所述第一蛋白也是受體。10.按照權(quán)利要求7的方法，其特征在于所述第二蛋白是受體，從而用于確定在所述第二蛋白與第一蛋白締合時，測試化合物是否與第二蛋白相互作用和/或其程度的方法包括用于確定在所述第二蛋白與第一蛋白締合時，測試化合物是否是所述第二蛋白的拮抗劑或部分激動劑和/或其程度的方法，所述方法包括下列步驟a).使所述測試化合物與系統(tǒng)接觸，所述系統(tǒng)包括i).第一試劑，所述第一試劑包括與第一報道成分偶聯(lián)的所述第一蛋白；ii).第二試劑，所述第二試劑包括與第二報道成分偶聯(lián)的相互作用組；iii).第三試劑，所述第三試劑包括所述第二蛋白；iv).所述第二蛋白的激動劑；其中所述第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生信號；并且其中調(diào)控劑調(diào)控所述相互作用組與所述第二蛋白的締合；b).檢測信號的減少，作為當(dāng)所述第二蛋白與第一蛋白締合時，所述測試化合物是否是所述第二蛋白的拮抗劑或部分激動劑和/或其程度的確定。11.按照權(quán)利要求10的方法，其特征在于所述第一蛋白也是受體。12.按照權(quán)利要求7的方法，其特征在于，所述第二蛋白是組成型活性受體，從而用于確定當(dāng)所述第二蛋白與第一蛋白締合時，測試化合物是否與第二蛋白相互作用和/或其程度的方法包括用于確定當(dāng)所述第二蛋白與第一蛋白締合時，測試化合物是否是所述第二蛋白的逆激動劑和/或其程度的方法，并且更具體地，確定信號作為當(dāng)所述第二蛋白與第一蛋白締合時所述測試化合物是否與第二蛋白相互作用和/或其程度的確定的步驟包括這樣的步驟，即，檢測信號的減少，作為當(dāng)所述第二蛋白與第一蛋白締合時，所述測試化合物是否是所述第二蛋白的逆激動劑和/或其程度的確定。13.按照權(quán)利要求12的方法，其特征在于所述第一蛋白也是受體。14.按照權(quán)利要求7的方法，其特征在于，所述第一和第二蛋白均為受體，從而用于確定當(dāng)所述第二蛋白與第一蛋白締合時，測試化合物是否與第二蛋白相互作用和/或其程度的方法包括用于針對第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體選擇性活性篩選測試化合物的方法，所述方法包括下列步驟a)確定當(dāng)所述第二蛋白與第一蛋白締合時，所述測試化合物是否與所述第二蛋白相互作用和/或其程度；和b)如果在所述第二蛋白與第一蛋白締合的同時，所述測試化合物與所述第二蛋白相互作用，則確定在不存在所述第一蛋白的條件下，所述測試化合物是否與所述第二蛋白相互作用或其程度；從而在所述第二蛋白與所述第一蛋白締合的同時與所述第二蛋白相互作用時表現(xiàn)出更大親和性和/或潛力和/或功效的測試化合物針對所述第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚#:是選擇性的。15.按照權(quán)利要求7的方法，其特征在于，所述第一和第二蛋白均為受體，并且所述方法包括用于針對第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體選擇性拮抗性或部分激動性來篩選測試化合物的方法，所述方法包括下列步驟.-a).通過使所述測試化合物與系統(tǒng)接觸，而確定所述測試化合物是否是所述第一蛋白/第二蛋白異源二聚體/-寡聚體的拮抗劑或部分激動劑和/或其程度，所述系統(tǒng)包括i).第一試劑，所述第一試劑包括與第一報道成分偶聯(lián)的第一蛋白；ii).第二試劑，所述第二試劑包括與第二報道成分偶聯(lián)的相互作用組；.iii)>第三試劑，所述第三試劑包括所述第二蛋白；iv).下列各項的激動劑所述第一蛋白、所述第二蛋白和/或所述第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體A寡聚體；其中所述第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生信號；并且其中調(diào)控劑調(diào)控所述相互作用組與所述第二蛋白的締合；b).檢測信號的減少，作為所述測試化合物是否是所述第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體的拮抗劑或部分激動劑和/或其程度的確定；c).如果所述測試化合物是所述第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體的拮抗劑或部分激動劑，則確定在不存在第一蛋白條件下所述測試化合物是否與所述第二蛋白相互作用或其程度，以及在不存在所述第二蛋白的條件下所述測試化合物是否與所述第一蛋白相互作用或其程度;從而在與所述第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體相互作用時表現(xiàn)出更大的激動性或部分激動性特性的測試化合物針對所述第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體是選擇性的。16.按照權(quán)利要求7的方法，其特征在于，所述第一蛋白和第二蛋白均為受體，并且所述方法包括針對第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體的選擇性拮抗性或部分激動性來篩選測試化合物的方法，所述方法包括下列步驟a).通過使所述測試化合物與系統(tǒng)接觸，而確定所述測試化合物是否是所述第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體的拮抗劑或部分激動劑和/或其程度，所述系統(tǒng)包括i).第一試劑，所述第一試劑包括與第一報道成分偶聯(lián)的第二蛋白；ii).第二試劑，所述第二試劑包括與第二報道成分偶聯(lián)的相互作用組；iii).第三試劑，所述第三試劑包括所述第一蛋白；iv).下列各項的激動劑所述第二蛋白，所述第一蛋白和/或所述第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體；其中所述第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生信號；并且其中調(diào)控劑調(diào)控所述相互作用組與所述第一蛋白的締合；b).檢測信號的減少，作為所述測試化合物是否是所述第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體的拮抗劑或部分激動劑和/或其程度的確定；c).如果所述測試化合物是所述第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體的拮抗劑或部分激動劑，則確定在不存在所述第二蛋白的條件下所述測試化合物是否是所述第一蛋白的拮抗劑或部分激動劑或其程度，以及在不存在所述第一蛋白的條件下所述測試化合物是否是所述第二蛋白的拮抗劑或部分激動劑或其程度；從而在與所述第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體相互作用時表現(xiàn)出更大拮抗性或部分激動性特性的測試化合物針對所述第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體是選擇性的。17.按照權(quán)利要求7的方法，其特征在于，所述第一蛋白和第二蛋白均為受體，并且所述方法包括用于針對第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體選擇性逆激動性來篩選測試化合物的方法，所述方法包括下列步驟a).通過使所述測試化合物與系統(tǒng)接觸，而確定所述測試化合物是否是所述第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體的逆激動劑和/或其程度，所述系統(tǒng)包括i).第一試劑，所述第一試劑包括與第一報道成分偶聯(lián)的第一蛋白；ii).第二試劑，所述第二試劑包括與第二報道成分偶聯(lián)的相互作用組；iii).第三試劑，所述第三試劑包括組成型活性的第二蛋白；其中所述第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生信號；并且其中所述調(diào)控劑調(diào)控所述相互作用組與所述第二蛋白的締合；b)檢測信號的減少，作為所述測試化合物是否是所述第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體的逆激動劑和/或其程度的確定；c)如果所述測試化合物是所述第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體的逆激動劑，則確定在不存在所述第二蛋白的條件下所述測試化合物是否是所述第一蛋白的逆激動劑或其程度，以及在不存在所述第一蛋白的條件下所述測試化合物是否是所述第二蛋白的逆激動劑或其程度；從而在與所述第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體相互作用時表現(xiàn)出更大逆激動性特性的測試化合物針對所述第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體是選擇性的。18.按照權(quán)利要求7的方法，其特征在于，所述第一蛋白和第二蛋白均為受體，提供用于針對第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體選擇性逆激動性來篩選測試化合物的方法，所述方法包括下列步驟a)通過使所述測試化合物與系統(tǒng)接觸，而確定所述測試化合物是否是所述第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體的逆激動劑和/或其程度，所述系統(tǒng)包括i).第一試劑，所述第一試劑包括與第一報道成分偶聯(lián)的第二蛋白；ii).第二試劑，所述第二試劑包括與第二報道成分偶聯(lián)的相互作用組；iii).第三試劑，所述第三試劑包括組成型的第一蛋白；其中所述第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生信號；并且其中調(diào)控劑調(diào)控所述相互作用組與所述第一蛋白的締合；b)檢測信號的減少，作為所述測試化合物是否是所述第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體的逆激動劑和/或其程度的確定；c)如果所述測試化合物是所述第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體的逆激動劑，則確定在不存在所述第一蛋白的條件下所述測試化合物是否是所述第二蛋白的逆激動劑或其程度，以及在不存在所述第二蛋白的條件下所述測試化合物是否是所述第一蛋白的逆激動劑或其程度；從而在與所述第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體相互作用時表現(xiàn)出更大逆激動性特性的測試化合物針對所述第一蛋白/第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體是選擇性的。19.用于檢測分子締合的試劑盒，所述試劑盒包括i).第一試劑，其包括與第一報道成分偶聯(lián)的第一相互作用組；ii).第二試劑，其包括與第二報道成分偶聯(lián)的第二相互作用組；iii).第三試劑,其包括第三相互作用組；iv).調(diào)控劑；和其中所述第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生能夠進(jìn)行檢測的信號；并且其中所述調(diào)控劑調(diào)控所述第二相互作用組與所述第三相互作用組的締合。20.按照權(quán)利要求19的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括報道成分引發(fā)物，并且僅在存在所述報道成分引發(fā)物的條件下，所述第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生能夠進(jìn)行檢測的信號。21.用于篩選對第一蛋白和第二蛋白的異源二聚體具有選擇活性的測試化合物的方法，所述方法包括下列步驟a).使處于增加濃度的所述測試化合物與系統(tǒng)接觸，所述系統(tǒng)包括i).第一試劑，所述第一試劑包括與第一報道成分偶聯(lián)的第一蛋白；ii).第二試劑，所述第二試劑包括與第二報道成分偶聯(lián)的相互作用組；iii).第三試劑，所述第三試劑包括所述第二蛋白；其中所述第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生信號；并且其中所述調(diào)控劑調(diào)控所述相互作用組與所述第二蛋白的締合；b).確定信號，作為處于每種濃度的所述測試化合物是否調(diào)控所述相互作用組與第二蛋白的所述締合的確定，以產(chǎn)生劑量-響應(yīng)曲線；c).確定所述劑量-響應(yīng)曲線的Hill斜率，其中超過l的Hill斜率表示所述測試化合物與異源-二聚體相互作用。22.前述權(quán)利要求中任一項的系統(tǒng)、方法或試劑盒，其特征在于，所述調(diào)控劑增加所述第二相互作用組與第三相互作用組締合的傾向，從而通過檢測器檢測由所述第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生的信號組成對所述第一試劑和第三試劑的締合的檢測。23.前述權(quán)利要求中任一項的系統(tǒng)、方法或試劑盒，其特征在于，所述調(diào)控劑減少所述第二相互作用組與第三相互作用組締合的傾向，從而通過檢測器檢測由所述第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生的信號的減少組成對所述第一和第三試劑的解離的檢測。24.前述權(quán)利要求中任一項的系統(tǒng)、方法或試劑盒，其特征在于，所述第一相互作用組與所述第三相互作用組不同，從而對由所述第一和第二報道成分的接近所產(chǎn)生的信號的檢測組成對所述第一和第三相互作用組的異源-二聚化和/或-寡聚化的檢測。25.前述權(quán)利要求中任一項的系統(tǒng)、方法或試劑盒，其特征在于，所述第三試劑不包括這樣的成分，所述成分能夠產(chǎn)生顯著干擾和/或有助于由第一和第二報道成分的接近所產(chǎn)生的信號的信號，從而，對由所述第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生的信號的檢測是容易的。26.前述權(quán)利要求中任一項的系統(tǒng)、方法或試劑盒，其特征在于，所述第三試劑選自下組受體、離子通道、酶、載體、轉(zhuǎn)運蛋白、膜內(nèi)在蛋白質(zhì)、細(xì)胞骨架蛋白、黏附分子、信號傳導(dǎo)蛋白、支架蛋白、輔助蛋白、運輸?shù)鞍?、轉(zhuǎn)錄因子、核輔因子和核酸分子。27.前述權(quán)利要求中任一項的系統(tǒng)、方法或試劑盒，其特征在于，所述調(diào)控劑是配體或酶。28.前述權(quán)利要求中任一項的系統(tǒng)、方法或試劑盒，其特征在于，所述第三試劑通過在細(xì)胞內(nèi)，包括全細(xì)胞、細(xì)胞級分或不含細(xì)胞的系統(tǒng)中表達(dá)而產(chǎn)生。29.前述權(quán)利要求中任一項的系統(tǒng)、方法或試劑盒，其特征在于，所述第一和第三相互作用組以受體形式提供，并且所述調(diào)控劑以調(diào)控所述第三相互作用組的受體的配體的形式提供，從而所述調(diào)控劑對由所述第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生的信號的調(diào)控是所述第一和第三相互作用組的受體的組成型締合的指示。30.通過前述權(quán)利要求的系統(tǒng)、方法或試劑盒中的任一種鑒定的第一蛋白-第二蛋白異源-二聚體A寡聚體。31.通過前述權(quán)利要求的系統(tǒng)、方法或試劑盒中的任一種鑒定的異源-二聚體或異源寡聚體受體，其包括與至少一個第二受體亞基締合的至少一個第一受體亞基。32.通過施用治療有效量的第二受體激動劑、逆激動劑或拮抗劑而治療患有第一受體-相關(guān)疾病的患者的方法，其中所述第一和第二受體形成通過前述權(quán)利要求的系統(tǒng)、方法或試劑盒中的任一種鑒定的異源-二聚體/-寡聚體。33.按照權(quán)利要求32的方法，其特征在于，所述第二受體激動劑、逆激動劑或拮抗劑與第一受體激動劑、逆激動劑或拮抗劑共同施用。34.通過施用治療有效量的第一受體激動劑、逆激動劑或拮抗劑而治療患有第二受體-相關(guān)的疾病的患者的方法，其中所述第一和第二受體形成通過前述權(quán)利要求的系統(tǒng)、方法或試劑盒中的任一種鑒定的異源-二聚體/-寡聚體。35.按照權(quán)利要求34的方法，其特征在于，所述第一受體激動劑、逆激動劑或拮抗劑與第二受體激動劑、逆激動劑或拮抗劑共同施用。36.制備用于治療患有第一受體-相關(guān)的疾病的患者的藥物的方法，所述方法包括使用治療有效量的第二受體激動劑、逆激動劑或拮抗劑，其中所述第一和第二受體形成通過前述權(quán)利要求的系統(tǒng)、方法或試劑盒中的任一種鑒定的異源-二聚體A寡聚體。37.按照權(quán)利要求36的方法，其特征在于，所述藥物包含第一受體激動劑、逆激動劑或拮抗劑。38.制備用于治療患有第二受體-相關(guān)的疾病的患者的藥物的方法，所述方法包括使用治療有效量的第一受體激動劑、逆激動劑或拮抗劑，其中所述第一和第二受體形成通過前述權(quán)利要求的系統(tǒng)、方法或試劑盒中的任一種鑒定的異源-二聚體/-寡聚體。39.按照權(quán)利要求38的方法，其特征在于，所述藥物包含第二受體激動劑、逆激動劑或拮抗劑。40.通過施用治療有效量的選擇性第二受體激動劑、拮抗劑或逆激動劑結(jié)合劑、或其片段而治療患有第一受體-相關(guān)疾病的患者的方法，其中所述第一受體和第二受體形成通過前述權(quán)利要求的系統(tǒng)、方法或試劑盒中的任一種鑒定的異源-二聚體/-寡聚體。41.按照權(quán)利要求40的方法，其特征在于，所述選擇性第二受體激動劑、拮抗劑或逆激動劑結(jié)合劑是抗體，包括人源化抗體、多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、CDR-移植的抗體和/或抗-獨特型抗體。42.通過施用治療有效量的選擇性第一受體激動劑、拮抗劑或逆激動劑結(jié)合劑、或其片段而治療患有第二受體-相關(guān)疾病的患者的方法，其中所述第一受體和第二受體形成通過前述權(quán)利要求的系統(tǒng)、方法或試劑盒中的任一種鑒定的異源-二聚體/-寡聚體。43.按照權(quán)利要求42的方法，其特征在于，所述選擇性第一受體激動劑、拮抗劑或逆激動劑結(jié)合劑可以是抗體，包括人源化抗體、多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、CDR-移植的抗體和/或抗-獨特型抗體。44.在第二蛋白與第一蛋白締合時，通過權(quán)利要求8或9的方法鑒定的所述第二蛋白的激動劑。45.在第二蛋白與第一蛋白締合時，通過權(quán)利要求IO或11的方法鑒定的所述第二蛋白的拮抗劑或部分激動劑。46.在第二蛋白與第一蛋白締合時，通過權(quán)利要求12或13的方法鑒定的所述第二蛋白的逆激動劑。47.第一蛋白-第二蛋白異源-二聚體/-寡聚體的選擇性激動劑和/或拮抗劑和/或逆激動劑，其通過權(quán)利要求14-18中任一項所述的方法鑒定。全文摘要一種用于檢測分子締合的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括i)第一試劑，其包括與第一報道成分偶聯(lián)的第一相互作用組；ii)第二試劑，其包括與第二報道成分偶聯(lián)的第二相互作用組；iii)第三試劑，其包括第三相互作用組；iv)調(diào)控劑和v)檢測器；其中所述第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生能夠由所述檢測器檢測的信號；并且其中所述調(diào)控劑調(diào)控所述第二相互作用組與所述第三相互作用組的締合；以使由所述檢測器監(jiān)測由所述第一和第二報道成分的接近產(chǎn)生的信號組成監(jiān)測所述第一和第三試劑的締合。文檔編號G01N21/64GK101657715SQ200780049677公開日2010年2月24日申請日期2007年11月9日優(yōu)先權(quán)日2006年11月10日發(fā)明者亨·布恩·西伊,凱文·唐納德·喬治·普夫勒格,卡琳·安·艾德尼,路斯·馬里·澤貝爾申請人:戴麥里克斯生物科學(xué)有限公司