專利名稱：用于肌鈣蛋白分析的高靈敏系統(tǒng)和方法
交叉參考
該申請基于35USC§119要求以下申請的優(yōu)先權2006年04月04日提出的美國臨時申請60/789304號、2006年04月19日提出的美國臨時申請60/793664號、2006年05月26日提出的美國臨時申請60/808662號、2006年11月28日提出的美國臨時申請60/861498號和2006年12月04日提出的美國臨時申請60/872986號，本文完整引入所有以上專利申請作為參考。
背景技術：
在美國每年有差不多600萬人因患有胸痛出現在急診部門。盡管這些病人中僅有15％-20％最終診斷為患有急性冠狀動脈綜合征(ACS)，但大約一半的病人被收入院以進行評估。相反，2％的患有ACS的病人被錯誤地排除了。由于患有ACS的病人短期內具有相對高的發(fā)生嚴重的心血管不良事件的風險，顯然需要對他們進行識別的精確客觀的工具。
目前使用的心肌損傷的標志物的缺點在于其臨床應用受到了限制。心肌酶分析已經形成為確定是否有心肌損傷的基礎。遺憾的是，標準的肌酸激酶-MB(CK-MB)分析在直至胸痛開始后10-12小時后才能可靠地排除梗塞形成。更早期的診斷對于纖維蛋白溶解治療和治療類選方面將具有非常獨特的優(yōu)勢。
發(fā)明概述 本發(fā)明的一方面提供了方法。
在某些實施方式中，本發(fā)明提供了測定樣品中是否存在肌鈣蛋白的單一分子或其片段或復合物的方法，包括i)用標記物標記可能存在的所述分子、片段或復合物；和ii)檢測是否存在所述標記物，其中，檢測到標記物的存在表明樣品中存在肌鈣蛋白的單一分子、片段或復合物。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，肌鈣蛋白是肌鈣蛋白的心肌異型體。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，肌鈣蛋白可以是心肌肌鈣蛋白I(cTnI)或心肌肌鈣蛋白C(cTnC)。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，肌鈣蛋白是cTnI。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，肌鈣蛋白的單一分子可以以低于約100pg/ml的檢測限被檢測到。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，肌鈣蛋白的單一分子可以以低于約20pg/ml的檢測限被檢測到。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，標記物包括熒光部分。在某些實施方式中，熒光部分在被以其激發(fā)波長發(fā)射光的激光器激發(fā)時，能夠發(fā)射至少約200個光子，其中激光聚焦于包含熒光部分的直徑不小于約5微米的點上，而且其中激光指向該點的總能量不超過約3微焦耳。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，熒光部分包括含有至少一個取代的吲哚環(huán)系統(tǒng)的分子，其中，在吲哚環(huán)3位碳上的取代基含有化學反應性的基團或偶聯物質基團。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，熒光部分包括染料。染料的例子包括但不限于AlexaFluor 488、AlexaFluor 532、AlexaFluor647、AlexaFluor 680及AlexaFluor 700。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，熒光部分包括AlexaFluor 647。在某些實施方式中，熒光部分包括含有至少一個取代的吲哚環(huán)系統(tǒng)的分子，其中，在吲哚環(huán)3位碳上的取代基含有化學反應性的基團或偶聯物質基團。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，標記物進一步包括肌鈣蛋白分子、片段或復合物的結合伴體(partner)。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，結合伴體包括對肌鈣蛋白分子、片段或復合物特異性的抗體。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，抗體對于肌鈣蛋白分子的特定區(qū)域是特異性的。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，抗體對于包含心肌肌鈣蛋白I的氨基酸27-41的區(qū)域是特異性的。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，抗體可以是多克隆抗體。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，抗體是單克隆抗體。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，所述方法進一步包括在固體載體上捕獲肌鈣蛋白或肌鈣蛋白復合物。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，固體載體可以是微量滴定板或順磁性珠。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，固體載體包括連接在固體載體上的對于肌鈣蛋白或肌鈣蛋白復合物特異性的捕獲伴體。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，捕獲伴體與固體載體的連接是非共價的。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，捕獲伴體與固體載體的連接是共價的。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，捕獲伴體的共價連接使得捕獲伴體以特定取向連接到固體載體上。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，特定取向使得肌鈣蛋白或肌鈣蛋白復合物和捕獲伴體的特異性結合最大化。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，捕獲伴體包括抗體。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，抗體是單克隆抗體。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，抗體對于心肌肌鈣蛋白I的氨基酸87-91是特異性的。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，抗體對于心肌肌鈣蛋白I的氨基酸41-49是特異性的。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，樣品是血液、血清或血漿樣品。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，樣品是血清樣品。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，標記物包括熒光部分，且步驟ii)包括使標記物穿過單分子檢測器。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，單分子檢測器包括a)激發(fā)熒光部分的電磁輻射源；b)供熒光部分穿過的毛細流動池；c)用于在毛細流動池中移動熒光部分的動力源；d)限定在毛細流動池內部的用于接收由電磁源發(fā)射的電磁輻射的探詢空間；e)可操作地連接于探詢空間的、用于測量激發(fā)的熒光部分的電磁特征的電磁輻射檢測器；和f)位于探詢空間和檢測器之間的顯微鏡物鏡，其中，該物鏡是高數值孔徑透鏡。
在某些實施方式中，本發(fā)明提供了確定個體的診斷、預后或治療方法的方法，包括i)測定該個體的樣品中的心肌肌鈣蛋白濃度，或測定該個體的系列樣品中的心肌肌鈣蛋白濃度，其中，通過對樣品中心肌肌鈣蛋白的檢測限低于約50pg/ml的心肌肌鈣蛋白分析方法測定濃度；和ii)根據樣品的濃度或系列樣品的濃度確定個體的診斷、預后或治療方法。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，步驟ii)包括分析步驟，例如，將所述濃度或系列濃度與濃度的正常值比較，將所述濃度或系列濃度與預定的閾水平比較，將所述濃度或系列濃度與基線值比較，和確定系列濃度的濃度變化率。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，步驟ii)包括比較樣品中肌鈣蛋白的濃度與預定的閾濃度，并且，如果樣品濃度高于閾水平，則確定診斷、預后或治療方法。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，通過測定正常個體組中肌鈣蛋白的第99百分位數(percentile)濃度，并設定閾濃度為該第99百分位數濃度而確定閾濃度。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，在心臟應力試驗過程中或之后，采集至少一個樣品。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，心肌肌鈣蛋白選自心肌肌鈣蛋白I和心肌肌鈣蛋白T。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，心肌肌鈣蛋白是心肌肌鈣蛋白I。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，心肌肌鈣蛋白的濃度是總心肌肌鈣蛋白濃度。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，心肌肌鈣蛋白的濃度是心肌肌鈣蛋白復合物、心肌肌鈣蛋白片段、磷酸化的心肌肌鈣蛋白、氧化的心肌肌鈣蛋白或其組合的濃度。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，心肌肌鈣蛋白的濃度相比于總心肌肌鈣蛋白。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，診斷、預后或治療方法是心肌梗塞的診斷、預后或治療方法。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，診斷、預后或治療方法包括心肌梗塞風險水平的危險分級。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，在個體向醫(yī)療專業(yè)人員呈現一種或多種表明心肌缺血或心肌梗塞或其可能性的癥狀時或在接近該時間的時刻測定所述濃度或系列濃度。在某些實施方式中，一種或多種癥狀可以是胸痛、胸悶、臂痛、不正常的EKG、不正常的酶水平或呼吸短促。在某些實施方式中，通過包括檢測肌鈣蛋白的單一分子或其復合物或片段的方法測定濃度。在某些實施方式中，本發(fā)明的方法包括用包含熒光部分的標記物標記肌鈣蛋白或肌鈣蛋白復合物。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，熒光部分在被以其激發(fā)波長發(fā)射光的激光器激發(fā)時，能夠發(fā)射至少約200個光子，其中激光聚焦于包含熒光部分的直徑5微米的點上，而且其中激光指向該點的總能量不超過約3微焦耳。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，熒光部分包括含有至少一個取代的吲哚環(huán)系統(tǒng)的分子，其中，在吲哚環(huán)3位碳上的取代基含有化學反應性的基團或偶聯物質基團。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，熒光部分包括選自AlexaFluor 488、AlexaFluor 532、AlexaFluor 647、AlexaFluor 680或AlexaFluor 700的染料。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，熒光部分包括AlexaFluor 647。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，標記物進一步包括肌鈣蛋白的結合伴體。在某些實施方式中，結合伴體包括對肌鈣蛋白特異性的抗體。在某些實施方式中，該抗體是多克隆抗體。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，該方法進一步包括在固體載體上捕獲肌鈣蛋白或肌鈣蛋白復合物。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，固體載體可以是微量滴定板或順磁性珠。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，固體載體包括連接在固體載體上的對于肌鈣蛋白或肌鈣蛋白復合物特異性的捕獲伴體。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，捕獲伴體與固體載體的連接是非共價的。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，捕獲伴體與固體載體的連接是共價的。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，捕獲伴體的共價連接使得捕獲伴體以特定取向連接到固體載體。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，特定取向使得肌鈣蛋白或肌鈣蛋白復合物和捕獲伴體的特異性結合最大化。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，步驟i)進一步包括評估個體的另一個指標，且步驟ii)包括基于樣品中肌鈣蛋白的濃度和其它非肌鈣蛋白標志物的指標的評估或基于系列樣品的濃度確定個體的診斷、預后或治療方法。在某些實施方式中，其它指標是心肌缺血或心肌梗塞的臨床指標。在某些實施方式中，其它指標是樣品或系列樣品中的一種或多種非肌鈣蛋白標志物的濃度。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，一種或多種標志物是心肌缺血的標志物、或炎癥和斑塊不穩(wěn)定性的標志物。在某些實施方式中，一種或多種心肌缺血的標志物可以是肌酸激酶(CK)及其心肌部分CK心肌帶(MB)、天冬氨酸氨基轉移酶、乳酸脫氫酶(LDH)、α-羥丁酸脫氫酶、肌紅蛋白、谷草轉氨酶、糖原磷酸化酶BB、未結合的游離脂肪酸、心型脂肪酸結合蛋白(H-FABP)、缺血修飾白蛋白、肌球蛋白輕鏈1或肌球蛋白輕鏈2。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，一種或多種標志物包括一種或多種心肌損傷的特異性的標志物。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，診斷、預后或治療方法是非心肌梗塞狀態(tài)的診斷、預后或治療方法。在某些實施方式中，所述狀態(tài)是心臟毒性。在某些實施方式中，心臟毒性與向個體施用藥物有關。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，所述狀態(tài)選自急性風濕熱、淀粉樣變性、心臟創(chuàng)傷(包括挫傷、切除、起搏、放電、心臟復律、導管插入和心臟手術)、再灌注損傷、充血性心力衰竭、末期腎衰竭、II型糖原貯積病(龐普病)、心臟移植、具有輸血性含鐵血黃素沉著的血紅蛋白病(haeomoglobinopathy)、高血壓(包括妊娠期高血壓)、低血壓(常伴有心律不齊)、甲狀腺功能減退、心肌炎、心包炎、術后非心臟手術、肺栓塞及敗血癥。
本發(fā)明的另一方面包括組合物。
在某些實施方式中，本發(fā)明包括用于檢測肌鈣蛋白異型體的組合物，該組合物包括連接有熒光部分的肌鈣蛋白異型體的結合伴體，其中，熒光部分在被以其激發(fā)波長發(fā)射光的激光器激發(fā)時，能夠發(fā)射至少約200個光子，其中激光聚焦于包含熒光部分的直徑不小于約5微米的點，而且其中激光指向該點的總能量不超過約3微焦耳。在本發(fā)明組合物的某些實施方式中，結合伴體包括肌鈣蛋白異型體的抗體。在某些實施方式中，抗體是多克隆抗體。在某些實施方式中，抗體是單克隆抗體。在某些實施方式中，肌鈣蛋白異型體是心肌異型體。在某些實施方式中，心肌異型體選自cTnI和cTnT。在某些實施方式中，心肌異型體是cTnI。在某些實施方式中，抗體對于肌鈣蛋白分子的特定區(qū)域是特異性的。在某些實施方式中，抗體對于包含心肌肌鈣蛋白I的氨基酸27-41的區(qū)域是特異性的。在本發(fā)明組合物的某些實施方式中，熒光部分包括含有至少一個取代的吲哚環(huán)系統(tǒng)的分子，其中在吲哚環(huán)3位碳上的取代基包含化學反應性的基團或偶聯物質基團。在某些實施方式中，熒光部分包括可以是AlexaFluor 488、AlexaFluor 532、AlexaFluor 647、AlexaFluor 680或AlexaFluor 700的染料。在某些實施方式中，熒光部分包括AlexaFluor647。
在某些實施方式中，本發(fā)明涉及含有一組用于測定心肌肌鈣蛋白濃度的標準物的組合物，其中，所述標準物中的至少一種的心肌肌鈣蛋白濃度低于約10pg/ml。
在某些實施方式中，本發(fā)明涉及試劑盒，該試劑盒包括含有連接在熒光染料部分上的心肌肌鈣蛋白抗體的組合物，其中，熒光染料部分在被以其激發(fā)波長發(fā)射光的激光器激發(fā)時，能夠發(fā)射至少約200個光子，其中激光聚焦于包含熒光部分的直徑不小于約5微米的點，并且其中激光指向該點的總能量不超過約3微焦耳，其中，組合物包裝于合適的包裝中。在本發(fā)明的試劑盒的某些實施方式中，心肌肌鈣蛋白是心肌肌鈣蛋白I或心肌肌鈣蛋白T。在某些實施方式中，心肌肌鈣蛋白是心肌肌鈣蛋白I。在本發(fā)明的試劑盒的某些實施方式中，試劑盒進一步包括說明書。在本發(fā)明的試劑盒的某些實施方式中，試劑盒進一步包括含有連接在固體載體上的心肌肌鈣蛋白I的捕獲抗體的組合物。在某些實施方式中，固體載體包括微量滴定板或順磁性微粒。在本發(fā)明的試劑盒的某些實施方式中，試劑盒進一步包括選自洗滌緩沖液、分析緩沖液、洗脫緩沖液和校準物稀釋液的成分。在本發(fā)明的試劑盒的某些實施方式中，進一步包括心肌肌鈣蛋白標準物。
參考引用
本說明書中提到的所有出版物和專利申請都引入本文作為參考，如同每一單獨出版物或專利申請具體且單獨地引入作為參考。
附圖簡要說明

圖1A和1B單一微粒分析器的組件的排列的示意圖。圖1A顯示包括一個電磁源和一個電磁檢測器的分析器，圖1B顯示包括兩個電磁源和一個電磁檢測器的分析器。
圖2A和2B單一微粒分析器的毛細流動池的示意圖。圖2A顯示包括一個電磁源的分析器的流動池，圖2B顯示包括兩個電磁源的分析器的流動池。
圖3A和3B顯示單一微粒分析器的激光器和檢測器光學器件的常規(guī)(A)和共焦(B)定位的示意圖。圖3A顯示具有一個電磁源和一個電磁檢測器的分析器的排列，圖3B顯示具有兩個電磁源和兩個電磁檢測器的分析器的排列。
圖4cTnI濃度范圍的線性標準曲線。
圖5cTnI的生物學閾(臨界濃度)是7pg/ml的cTnI濃度，其以相應的10％的CV確定第99百分位數濃度。
圖6使用本發(fā)明的分析器系統(tǒng)確定的cTnI分析結果與由國家標準和技術研究所(National Institute of Standards and Technology)提供的標準測量的相關性(R2＝0.9999)。
圖7來自在急診室出現胸痛的病人的系列血清樣品中cTnI的檢測。使用本發(fā)明的分析器系統(tǒng)得到的測量值與使用商用的分析方法得到的測量值進行比較。
圖8 cTnI的正常(沒有局部缺血)生物學濃度和來自出現胸痛的病人的血清樣品中的cTnI濃度的分布。
在附加的權利要求中詳細提出了本發(fā)明的新型特征。通過參考以下給出利用了本發(fā)明的原理的示例性實施方式的詳細說明和其附圖可獲得對于本發(fā)明的特征和優(yōu)點的更好的理解。

具體實施例方式 概要 I.引言 II.心肌肌鈣蛋白 III.心肌肌鈣蛋白的標記物A.肌鈣蛋白的結合伴體 1.抗體 2.交叉反應性抗體B.和結合伴體一起使用的熒光部分 1.染料 2.量子點C.結合伴體-熒光部分組合物 IV.心肌肌鈣蛋白的高靈敏分析A.樣品B.樣品制備C.肌鈣蛋白的檢測和濃度的測定 V.適于肌鈣蛋白的高靈敏分析的儀器和系統(tǒng)A.裝置/系統(tǒng)B.單一微粒分析器 1.電磁輻射源 2.毛細流動池 3.動力 4.檢測器C.采樣系統(tǒng)D.樣品制備系統(tǒng)E.樣品回收 VI.使用心肌肌鈣蛋白的高靈敏分析的方法A.樣品B.診斷、預后或治療方法的確定 1.急性心肌梗塞 2.AMI以外的狀態(tài) a.心臟毒性C.商業(yè)方法 VII.組合物 VIII.試劑盒 I.引言 本發(fā)明提供了用于高靈敏檢測肌鈣蛋白如心肌肌鈣蛋白的組合物和方法。心肌獨有的肌鈣蛋白的心肌異型體(心肌肌鈣蛋白I和/或T)釋放進入血液表明心肌損傷，并提供了其用作診斷或預后標志物、或者用于幫助確定治療的基礎。
肌肉中的肌鈣蛋白復合物由肌鈣蛋白I、C和T組成。肌鈣蛋白C以兩種異型體存在，一種來自心肌和慢縮肌，一種來自快縮??；因為肌鈣蛋白C實際上在所有的橫紋肌中發(fā)現，其作為特異性標志物的用途是有限的。相反，肌鈣蛋白I和T在慢縮肌、快縮肌和心肌中以不同的異型體表達。肌鈣蛋白I和T的獨特心肌異型體使得它們在免疫學上與骨骼肌的其它肌鈣蛋白相區(qū)別。因此，心肌肌鈣蛋白I和T釋放進入血液表明心肌損傷，并提供了其用作診斷或預后標志物，或者用于幫助確定治療的基礎。
目前使用的心肌損傷的標志物具有限制臨床應用的缺點。心肌酶分析已經形成為確定是否出現損傷心肌的基礎。遺憾的是，標準的肌酸激酶-MB(CK-MB)分析在直至胸痛開始后10-12小時才能可靠地排除梗塞形成。更早期的診斷對于纖維蛋白溶解治療和治療類選方面將具有非常獨特的優(yōu)勢。
因為在健康個體的循環(huán)中發(fā)現的肌鈣蛋白的水平非常低，且心肌特異性肌鈣蛋白不會來自于心臟外的來源，所以肌鈣蛋白是非常靈敏且特異性的心臟損傷的標志物。除了心肌梗塞，許多其它狀態(tài)也能引起心肌損傷，而且這樣的損傷的早期檢測證明對臨床醫(yī)生是有用的。但是，現有的心肌肌鈣蛋白的檢測和定量方法沒有足夠的靈敏度，直至釋放進入血液的心肌肌鈣蛋白水平達到異常高的濃度時，如0.1ng/ml或更高時，才能檢測到。
因此，本發(fā)明的方法和組合物包括高靈敏檢測和定量心肌肌鈣蛋白的方法和組合物，和基于這種高靈敏檢測和定量的診斷、預后和/或確定治療的組合物和方法。
II.心肌肌鈣蛋白 當心肌肌鈣蛋白的兩種獨特形式，心肌肌鈣蛋白I(cTnI)和心肌肌鈣蛋白(cTnT)從心肌釋放進入血液時，在血液中存在各形式的幾個類型。其中包括由這兩種形式彼此形成的和/或與心肌肌鈣蛋白C(cTnC)形成的各種復合物。而且，這兩種形式實際上會發(fā)生即時的蛋白水解降解，從而產生多種片段。另外，各種磷酸化和氧化形式的肌鈣蛋白也可能存在于血液中。參見，例如，美國專利6 991 907號，其在本文完整引入作為參考。除非另有說明，本文使用的“心肌肌鈣蛋白”包括所有形式的心肌肌鈣蛋白，包括 在某些實施方式中，發(fā)明提供了檢測和/或測定總心肌肌鈣蛋白(即，例如血液、血清或血漿樣品的樣品中的所有或主要部分的心肌肌鈣蛋白的總和，不管它是游離的、復合的、蛋白水解(proteotlytic)片段、磷酸化的、氧化的還是經其它修飾的)的濃度的方法和組合物。在某些實施方式中，心肌肌鈣蛋白是cTnI，在其它實施方式中，心肌肌鈣蛋白是cTnT，且在另外的其它實施方式中，心肌肌鈣蛋白是cTnI和cTnT。可以理解，不需要獲得絕對的總測量值，只要確定與總量一致的比例就可以，其可以和標準值比較。也可以理解，如果一種形式的肌鈣蛋白是總量中較少的組分，那么該形式檢測為不存在或低水平，將不會明顯影響肌鈣蛋白總量的測量。因此，本文所用的“總心肌肌鈣蛋白”，是指計劃測量樣品中的所有或基本上所有形式的特定的心肌肌鈣蛋白，例如，所有的cTnI或所有的cTnT，其中，樣品間的一致性使得可以通過樣品和標準的比較，或一個樣品和另一個樣品的比較來得出臨床相關的結論。
在某些實施方式中，本發(fā)明提供了檢測和/或測定樣品中肌鈣蛋白各種形式中的一種或多種作為獨立個體的濃度的方法和組合物，例如，復合的cTnI、游離的cTnI、混雜的cTnI(例如，氧化的或磷酸化的)，或復合的cTnT、游離的cTnT、混雜的cTnT(例如，氧化的或磷酸化的)，且通常能夠提供樣品中該形式的濃度。在后面的實施方式中，可以確定不同個體的比例或絕對值。因此，在某些實施方式中，本發(fā)明提供了檢測和通常測定一種或多種形式的復合肌鈣蛋白、或一種或多種肌鈣蛋白片段、或一種或多種氧化或磷酸化形式的肌鈣蛋白的濃度的方法。在某些實施方式中，檢測多于一種的形式，且可以測定各種形式的濃度，例如，通過對單一的樣品進行不同個體的多元分析，或對相同樣品或類似樣品的等分試樣進行單獨的分析?？梢垣@得各種形式的濃度的比例。例如，可以確定特定形式的心肌肌鈣蛋白(例如片段、復合物、或修飾形式)的濃度與總心肌肌鈣蛋白濃度的比例。這些比例和/或絕對值能夠提供有意義的臨床信息。例如，心肌肌鈣蛋白的片段的相對比例能夠表明自釋放進入血液以來的時間長度，從而，間接地表明例如自心肌梗塞以來的時間長度。參見，例如，美國專利6 991 907號，其在本文完整引入作為參考。
III.心肌肌鈣蛋白標記物 在某些實施方式中，本發(fā)明提供了包括用于高靈敏檢測和定量心肌肌鈣蛋白的標記物的方法和組合物。
本領域的技術人員可以認識到，許多策略可用于標記靶分子，使其在微?；旌衔镏心軌虮粰z測或區(qū)分出來?？梢允褂萌魏我阎姆椒ㄟB接標記物，包括利用標記物和靶標之間的非特異性或特異性相互作用。標記物可以提供可檢測的信號或影響微粒在電場中的遷移率。而且，可以直接地或通過結合伴體完成標記。
在某些實施方式中，標記物包括連接在熒光部分上的肌鈣蛋白的結合伴體。
A.肌鈣蛋白的結合伴體 可以使用任何合適的對于要檢測的心肌肌鈣蛋白形式具有所需的特異性的結合伴體。例如，可以使用對于所有或基本上所有cTnI形式特異性的結合伴體，或可以使用對于所有或基本上所有cTnT形式特異性的結合伴體；一般地，這樣的結合伴體結合到很可能在樣品中發(fā)現的心肌肌鈣蛋白的所有或大部分不同形式所共有的心肌肌鈣蛋白的區(qū)域。在某些實施方式中，可以使用對一種或多種心肌肌鈣蛋白的特定形式特異性的結合伴體，例如，復合的cTnI、游離的cTnI、混雜的cTnI(例如，氧化的或磷酸化的)的結合伴體，或復合的cTnT、游離的cTnT、混雜的cTnT(例如，氧化的或磷酸化的)的結合伴體。結合伴體為本領域已知，且包括，例如，適體(aptamer)、凝集素和受體。有用的和通用類型的結合伴體是抗體。
1.抗體 在某些實施方式中，結合伴體是心肌肌鈣蛋白的特異性抗體。本文使用的術語“抗體”是一個廣義的術語且在其一般意義上使用，包括但不限于，指天然產生的抗體及非天然產生的抗體，包括，例如，單鏈抗體、嵌合抗體、雙功能抗體和人源化抗體及其抗原結合片段。在某些實施方式中，抗體是cTnI特異性的。在某些實施方式中，抗體是cTnT特異性的。在某些實施方式中，標記物包括cTnI和cTnT兩者的抗體?？贵w可以是對于所有或基本上所有形式的心肌肌鈣蛋白特異性的，例如，對于所有或基本上所有形式的cTnI或對于所有或基本上所有形式的cTnT特異性的。在某些實施方式中，可以使用對于一種或多種特定形式的心肌肌鈣蛋白特異性的抗體，例如，復合的cTnI、游離的cTnI、混雜的cTnI(例如，氧化的或磷酸化的)的結合伴體，或復合的cTnT、游離的cTnT、混雜的cTnT(例如，氧化的或磷酸化的)的結合伴體。本發(fā)明也包括了抗體的混合物，例如，cTnI和cTnT抗體的混合物，或各種形式肌鈣蛋白(游離的、復合的，等等)的抗體的混合物，或混合物的混合物。
可以理解，對于激起(raise)抗體的肌鈣蛋白的表位或區(qū)域的選擇將決定其特異性，例如，對于全肌鈣蛋白、特定片段、復合的肌鈣蛋白、修飾的肌鈣蛋白等等的特異性。在某些實施方式中，抗體對于心肌肌鈣蛋白的特定的氨基酸區(qū)域是特異性的。在某些實施方式中，抗體對于人心肌肌鈣蛋白I的氨基酸27-41是特異性的。單克隆抗體和多克隆抗體都可以作為結合伴體使用。在某些實施方式中，抗體是多克隆抗體。在某些實施方式中，抗體是單克隆抗體。在某些實施方式中，抗體是對于人心肌肌鈣蛋白I的氨基酸27-41特異性的多克隆抗體。在某些實施方式中，這種抗體不受肝素、磷酸化作用、氧化作用和肌鈣蛋白復合物形成的影響，且不會與骨骼肌的肌鈣蛋白I交叉反應。
生產抗體的方法早已建立。在FEBS Lett.270，57-61(1990)和Genomics 21，311-316(1994)中描述了肌鈣蛋白I和肌鈣蛋白T的心肌特異性序列。本領域的技術人員可以認識到，可使用許多方法生產抗體，例如，在Antibodies，A Laboratory Manual，Ed Harlow和David Lane，ColdSpring Harbor Laboratory(1988)，Cold Spring Harbor，N.Y.中描述的方法。本領域的技術人員也可以理解，也可以使用各種方法(AntibodyEngineeringA Practical Approach(Borrebaeck，C.等人)，1995，OxfordUniversity Press，Oxford；J.Immunol.149，3914-3920(1992))根據基因信息制備模擬抗體的結合片段或Fab片段。在美國專利5579687、6 991 907號及在美國專利申請20050164317號中公開了產生針對肌鈣蛋白的各種復合物、片段、磷酸化形式和氧化形式的抗體的方法，本文將它們完整引入作為參考。在國際專利申請PCT/US94/05468號中描述了模擬肌鈣蛋白I的心肌特異性序列的包含14個氨基酸的合成肽，和用于制備該肽的抗體的方法。也可以商購游離和復合的心肌肌鈣蛋白的單克隆抗體和多克隆抗體(HyTest，HyTest Ltd.，Turku Finland；Abcam Inc.，Cambridge，MA，USA，Life Diagnostics，Inc.，West Chester，PA，USA；Fitzgerald IndustriesInternational，Inc.，Concord，MA 01742-3049 USA；BiosPacific，Emeryville，CA)。
在某些實施方式中，抗體是哺乳動物的抗體，例如，山羊多克隆抗cTnI抗體?？贵w可以是對于cTnI的特定區(qū)域特異性的，例如，對于人心肌肌鈣蛋白I的氨基酸27-41特異性的。捕獲結合伴體和檢測結合伴體對，例如，捕獲和檢測抗體對，可用于本發(fā)明的某些實施方式中。因此，在某些實施方式中，使用異相分析方案，其中通常使用兩種結合伴體，例如，兩種抗體。一種結合伴體是捕獲伴體，通常固定于固體載體上，另一種結合伴體是檢測結合伴體，一般具有可檢測的附加標記物。在某些實施方式中，一對中的捕獲結合伴體成員是對于所有或基本上所有形式的心肌肌鈣蛋白特異性的抗體。舉例來說，抗體，例如，對于游離的心肌肌鈣蛋白I(cTnI)的氨基酸41-49和與其它肌鈣蛋白成分形成復合物的cTnI特異性的單克隆抗體。優(yōu)選地，這種抗體不受肝素、磷酸化作用、氧化作用和肌鈣蛋白復合物形成影響，且不會與骨骼肌的肌鈣蛋白I交叉反應。因此，據認為抗體結合總cTnI。另一例子是對于心肌肌鈣蛋白I(cTnI)的氨基酸87-91特異性的且不會與骨骼肌的肌鈣蛋白I交叉反應的單克隆抗體。這樣的抗體可從BiosPacific，Emeryville，CA獲得，其它的抗體對是已知的或能夠設計的。
交叉反應性抗體 在某些實施方式中，使用與各種物種交叉反應的抗體作為捕獲抗體、檢測抗體或作為兩者是有利的。這樣的實施方式包括通過測定釋放進入血液的例如作為心肌損傷標志物的心肌肌鈣蛋白測量藥物毒性。交叉反應性抗體允許在例如非人類的一個物種上進行毒性研究，并在分析試劑中使用同樣的抗體或抗體對將結果直接轉到如人類的另一物種的研究或臨床觀察上，從而減少分析之間的變易性。因此，在某些實施方式中，一種或多種作為標志物(例如，如心肌肌鈣蛋白I的心肌肌鈣蛋白)的結合伴體使用的抗體可以是交叉反應性抗體。在某些實施方式中，抗體與來自選自人、猴、狗和小鼠的至少兩個物種的標志物(例如，心肌肌鈣蛋白)發(fā)生交叉反應。在某些實施方式中，抗體與來自人、猴、狗和小鼠的所有種類的標志物(例如，心肌肌鈣蛋白)發(fā)生交叉反應。
B.和結合伴體一起使用的熒光部分 在某些實施方式中，例如抗體的結合伴體連接在熒光部分上。該部分的熒光足夠允許在單分子檢測器(如本文所述的單分子檢測器)中檢測。本文使用的術語“熒光部分”包括一種或多種熒光體，其總的熒光使得該部分可以在本文所述的單分子檢測器中檢測到。因此，熒光部分可以包括單一的個體(例如，量子點或熒光分子)或多個個體(例如，多個熒光分子)?？梢岳斫?，本文使用的術語“部分”指一組熒光體，例如，多個熒光染料分子，各單個個體可以單獨地連接在結合伴體上，或多個個體可以連接在一起，只要作為一組的個體提供足夠的檢測熒光即可。
一般地，所述部分的熒光包括對量子效率和缺乏光漂白性能進行組合以使得該部分足以在單分子檢測器中在背景水平之上檢測到，并具有達到希望的分析檢測水平、準確度及精密度所必需的相容性。例如，在某些實施方式中，熒光部分的熒光使得其允許在本文所述的裝置中以低于約10、5、4、3、2或1pg/ml的檢測水平和低于約20、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％或更低的變異系數(例如，約10％或更低)檢測和/或定量肌鈣蛋白。在某些實施方式中，熒光部分的熒光使得其允許在本文所述的裝置中以低于約5pg/ml的檢測限和低于約10％的變異系數檢測和/或定量肌鈣蛋白。本文所用的術語“檢測限”包括可以確認樣品中含有目標物質分子的最低濃度，例如，第一非零值。它可以通過零點的變異性和標準曲線的斜率確定。例如，分析的檢測限可以通過建立標準曲線、確定標準曲線零位值并向該值加上2個標準差來確定。產生等于該值的信號的目標物質濃度是“檢測下限”的濃度。
更進一步，該部分具有與其在選擇的分析中的用途一致的性質。在某些實施方式中，分析是免疫分析，其中，熒光部分連接在抗體上；該部分必須具有使得其不與其它抗體或蛋白質聚集，或產生不超過與所需的分析準確度及精密度相容的聚集的性質。在某些實施方式中，優(yōu)選的熒光部分是具有以下特性的組合的熒光部分，例如染料分子1)高的吸收系數；2)高的量子產額；3)高的光穩(wěn)定性(低的光漂白)；和4)與標記目標生物分子(例如，蛋白質)的相容性，從而其可以使用本發(fā)明的分析器或系統(tǒng)進行分析(例如，不會導致目標蛋白質沉淀，或熒光部分連接的蛋白質沉淀)。
在本發(fā)明的某些實施方式中可用的熒光部分(例如，單個熒光染料分子或多個熒光染料分子)可以從其被EM輻射激發(fā)時光子發(fā)射特征方面進行限定。例如，在某些實施方式中，本發(fā)明利用了當受到在熒光染料部分的激發(fā)波長處發(fā)射光的激光器激發(fā)時能夠發(fā)射平均至少約10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、350、400、500、600、700、800、900或1000個光子的熒光染料部分(例如，單個熒光染料分子或多個熒光染料分子)，其中激光聚焦于包含該熒光染料部分的直徑不低于約5微米的點上，而且其中激光指向該點的總能量不超過約3微焦耳?？梢岳斫?，總能量可以通過激光器的功率輸出和染料部分的暴露時間長度的許多不同組合獲得。例如，可以使用功率輸出為1mW的激光器3毫秒，可以使用功率輸出為3mW的激光1毫秒，可以使用功率輸出為6mW的激光0.5毫秒，可以使用功率輸出為12mW的激光0.25毫秒，等等。
在某些實施方式中，本發(fā)明利用了當被在熒光染料部分的激發(fā)波長處發(fā)射光的激光器激發(fā)時能夠發(fā)射平均至少約50個光子的熒光染料部分(例如，單個熒光染料分子或多個熒光染料分子)，其中激光聚焦于包含該熒光染料部分的直徑不低于約5微米的點上，而且其中激光指向該點的總能量不超過約3微焦耳。在某些實施方式中，本發(fā)明利用了當被在熒光染料部分的激發(fā)波長處發(fā)射光的激光器激發(fā)時能夠發(fā)射平均至少約100個光子的熒光染料部分(例如，單個熒光染料分子或多個熒光染料分子)，其中激光聚焦于包含該熒光染料部分的直徑不低于約5微米的點上，而且其中激光指向該點的總能量不超過約3微焦耳。在某些實施方式中，本發(fā)明利用了當被在熒光染料部分的激發(fā)波長處發(fā)射光的激光器激發(fā)時能夠發(fā)射平均至少約150個光子的熒光染料部分(例如，單個熒光染料分子或多個熒光染料分子)，其中激光聚焦于包含該熒光染料部分的直徑不低于約5微米的點上，而且其中激光指向該點的總能量不超過約3微焦耳。在某些實施方式中，本發(fā)明利用了當被在熒光染料部分的激發(fā)波長處發(fā)射光的激光器激發(fā)時能夠發(fā)射平均至少約200個光子的熒光染料部分(例如，單個熒光染料分子或多個熒光染料分子)，其中激光聚焦于包含該熒光染料部分的直徑不低于約5微米的點上，而且其中激光指向該點的總能量不超過約3微焦耳。在某些實施方式中，本發(fā)明利用了當被在熒光染料部分的激發(fā)波長處發(fā)射光的激光器激發(fā)時能夠發(fā)射平均至少約300個光子的熒光染料部分(例如，單個熒光染料分子或多個熒光染料分子)，其中激光聚焦于包含該熒光染料部分的直徑不低于約5微米的點上，而且其中激光指向該點的總能量不超過約3微焦耳。在某些實施方式中，本發(fā)明利用了當被在熒光染料部分的激發(fā)波長處發(fā)射光的激光器激發(fā)時能夠發(fā)射平均至少約500個光子的熒光染料部分(例如，單個熒光染料分子或多個熒光染料分子)，其中激光聚焦于包含該熒光染料部分的直徑不低于約5微米的點上，而且其中激光指向該點的總能量不超過約3微焦耳。
在某些實施方式中，熒光部分包括平均至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個熒光體(例如熒光分子)。在某些實施方式中，熒光部分包括平均不超過約2、3、4、5、6、7、8、9、10或11個熒光體，例如熒光分子。在某些實施方式中，熒光部分包括平均約1-11、或約2-10、或約2-8、或約2-6、或約2-5、或約2-4、或約3-10、或約3-8、或約3-6、或約3-5、或約4-10、或約4-8、或約4-6、或約2、3、4、5、6或大于約6個熒光體。在某些實施方式中，熒光部分包括平均約2-8個連接的熒光部分。在某些實施方式中，平均為約2-6個熒光體。在某些實施方式中，熒光部分包括平均約2-4個熒光體。在某些實施方式中，熒光部分包括平均約3-10個熒光體。在某些實施方式中，熒光部分包括平均約3-8個熒光體。在某些實施方式中，熒光部分包括平均約3-6個熒光體?！捌骄币馕吨谧鳛楸景l(fā)明的標記物組的代表性樣品的給定樣品中(其中，樣品包含多個結合伴體-熒光部分單元)，如通過標準分析方法確定的，組成熒光部分的特定熒光體與結合伴體的摩爾比對應于所給定的數值或數值范圍。例如，在其中標記物包括作為抗體的結合伴體和包括多個具有特定吸收的熒光染料分子的熒光部分的實施方式中，可以使用分光光度分析法，其中，將標記物溶液稀釋至合適的水平，并在280nm測定吸光度以測定蛋白質(抗體)的摩爾濃度，和在例如650nm(對于AlexaFluor 647)測定吸光度以測定熒光染料分子的摩爾濃度。后者和前者摩爾濃度的比值代表連接在各個抗體上的熒光部分中熒光體(染料分子)的平均數。
1.染料 在某些實施方式中，本發(fā)明利用了包括熒光染料分子的熒光部分。在某些實施方式中，本發(fā)明利用了被在分子的激發(fā)波長處發(fā)射光的激光器激發(fā)時能夠發(fā)射至少約50個光子的熒光染料分子，其中激光聚焦于包含該分子的直徑不低于約5微米的點上，而且其中激光指向該點的總能量不超過約3微焦耳。在某些實施方式中，本發(fā)明利用了被在分子的激發(fā)波長處發(fā)射光的激光器激發(fā)時能夠發(fā)射至少約75個光子的熒光染料分子，其中激光聚焦于包含該分子的直徑不低于約5微米的點上，而且其中激光指向該點的總能量不超過約3微焦耳。在某些實施方式中，本發(fā)明利用了被在分子的激發(fā)波長處發(fā)射光的激光器激發(fā)時能夠發(fā)射至少約100個光子的熒光染料分子，其中激光聚焦于包含該分子的直徑不低于約5微米的點上，而且其中激光指向該點的總能量不超過約3微焦耳。在某些實施方式中，本發(fā)明利用了被在分子的激發(fā)波長處發(fā)射光的激光器激發(fā)時能夠發(fā)射至少約150個光子的熒光染料分子，其中激光聚焦于包含該分子的直徑不低于約5微米的點上，而且其中激光指向該點的總能量不超過約3微焦耳。在某些實施方式中，本發(fā)明利用了被在分子的激發(fā)波長處發(fā)射光的激光器激發(fā)時能夠發(fā)射至少約200個光子的熒光染料分子，其中激光聚焦于包含該分子的直徑不低于約5微米的點上，而且其中激光指向該點的總能量不超過約3微焦耳。
下面的表1給出了可用于本發(fā)明的熒光部分的熒光體的非窮盡的列表。在某些實施方式中，熒光體選自Alexa Flour 488、532、647、700、750、熒光素、B-藻紅蛋白、別藻藍蛋白、PBXL-3及Qdot 605。
表1 熒光體





用于本發(fā)明的合適的染料包括修飾的羰花青染料。羰花青染料的修飾包括羰花青染料的吲哚環(huán)的修飾，以使得3號位置具有反應性基團或偶聯物質。吲哚環(huán)的修飾提供的染料偶聯物比用通過1位的氮原子結合的具有相似結構的羰花青染料標記的偶聯物在蛋白質、核酸和其它生物聚合體上產生均勻的和實質上更高的熒光。除了在實質上相同的波長處比結構類似的染料具有更強烈的熒光發(fā)射和在與生物高聚物偶聯后在吸收光譜上減少假象外，修飾的羰花青染料在吸收峰比結構類似的染料具有更好的光穩(wěn)定性和更高的吸收(消光系數)。因此，在使用修飾的染料及其偶聯物的分析中修飾的羰花青染料產生了更高的靈敏性。優(yōu)選的修飾的染料包括含有至少一個取代的吲哚環(huán)系統(tǒng)的化合物，其中，在吲哚環(huán)3位碳上的取代基包含化學反應性的基團或偶聯物質。其它染料化合物包括含氮雜吲哚(azabenzazolium)環(huán)部分和至少一個磺酸部分的化合物。美國專利6 977 305描述了能夠在本發(fā)明的各種實施方式中用來檢測單獨的微粒的修飾的羰花青染料，其在本文完整引入作為參考。因此，在某些實施方式中，本發(fā)明的標記物利用包括取代的吲哚環(huán)系統(tǒng)的熒光染料，其中，在吲哚環(huán)3位碳上的取代基包含化學反應性的基團或偶聯物質基團。
在某些實施方式中，標記物包括熒光部分，熒光部分包含一種或多種Alexa染料(Molecular Probe，Eugene，OR)。美國專利6977 305、6 974874、6 130 101和6 974 305公開了Alexa染料，在本文完整引入作為參考。本發(fā)明的某些實施方式利用選自AlexaFluor 647、AlexaFluor 488、AlexaFluor 532、AlexaFluor 555、AlexaFluor 610、AlexaFluor 680、AlexaFluor 700和AlexaFluor 750的染料。本發(fā)明的某些實施方式利用選自AlexaFluor 488、AlexaFluor 532、AlexaFluor 647、AlexaFluor 700和AlexaFluor 750的染料。本發(fā)明的某些實施方式利用AlexaFluor647分子，其在約650-660nm之間具有最大吸收和在約660-670nm之間具有最大發(fā)射。AlexaFluor 647染料單獨使用或與其它AlexaFluor染料組合使用。
另外，目前可得到的有機熒光染料可以通過加入諸如聚乙烯的親水基團使其具有較少的疏水性?？商娲?，目前的諸如AlexaFluor 647染料的磺酸化有機熒光染料可以通過變?yōu)閮尚噪x子而使其具有較少的酸性。用修飾的熒光染料標記的微粒(如抗體)在免疫分析中可能會較少地與表面及蛋白質非特異性地結合，從而能夠進行具有較高靈敏度和較低背景的分析。為了提高檢測單一微粒的系統(tǒng)的靈敏度而修飾和改進熒光染料的方法在本領域內是已知的。優(yōu)選地，修飾在維持高的量子產額的同時，提高斯托克斯頻移。
2 量子點 在某些實施方式中，用于使用本發(fā)明的分析器系統(tǒng)檢測樣品中的分子的熒光標記部分是量子點。量子點(QDs)，也叫半導體納米晶體或人造原子，是在其中任何地方含有100-1000個電子和2-10nm的范圍的半導體晶體。一些量子點的直徑為10-20nm。量子點具有高的量子產額，這使得其在光學應用中尤其有用。量子點是通過形成激子而發(fā)熒光的熒光團，激子被認為是傳統(tǒng)熒光團的激發(fā)態(tài)，但具有高達200納秒的長得多的壽命。這種性質為量子點提供了低的光漂白。量子點的能量水平可以通過改變量子點的大小、形狀及量子點電位深度來控制。小的激子量子點的一個光學特征是顯色，其通過點的大小來確定。點越大，就越紅，或越朝向熒光光譜的紅端。點越小，就越藍，或越朝向熒光光譜的藍端。決定熒光的能量從而決定熒光的顏色的帶隙能量和量子點大小的平方成反比例。較大的量子點具有更密集地區(qū)隔的較多的能量水平，從而允許量子點吸收含有較低能量的光子，即，那些比較接近光譜紅端的光子。因為點的發(fā)射頻率取決于帶隙，所以可能極為精密地控制點的輸出波長。在某些實施方式中，用單一微粒分析器系統(tǒng)檢測的蛋白質用量子點標記。在某些實施方式中，單一微粒分析器用來檢測用一個量子點標記的蛋白質，并使用濾光器以在不同的波長檢測不同的蛋白質。
量子點具有寬激發(fā)和窄發(fā)射的性質，這使得當使用顏色過濾時，對于單一樣品中的多重目標的多元分析只需要單一的電磁源以解析個別的信號。因此，在某些實施方式中，分析器系統(tǒng)包括一個連續(xù)波激光器和各使用一個量子點標記的微粒。膠態(tài)制備的量子點是自由移動的，且可以通過金屬配位官能團連接在各種分子上。這些官能團包括但不限于，硫醇、胺、腈、膦、氧化膦、膦酸、羧酸或其它配體。通過將合適的分子與表面鍵合，量子點能夠分散于或溶于幾乎任何溶劑中或合并到各種無機和有機膜上。量子點(QDs)可以直接通過馬來酰亞胺酯偶聯反應結合鏈霉親和素或通過馬來酰亞胺-硫醇偶聯反應結合抗體。這產生了含有共價連接在表面上的生物分子的材料，其產生具有高特異活性的偶聯物。在某些實施方式中，用單一微粒分析器檢測的蛋白質用一個量子點標記。在某些實施方式中，量子點的直徑為10-20nm。在其它實施方式中，量子點的直徑為2-10nm。有用的量子點包括QD 605、QD 610、QD 655和QD 705。尤其優(yōu)選的量子點是QD 605。
C.結合伴體-熒光部分組合物(標記物) 本發(fā)明的標記物一般包含結合熒光部分以提供在本文所述的儀器中檢測和定量所需的熒光的結合伴體，如抗體。任何適用于在本文所述的單分子檢測器中檢測的結合伴體和熒光部分的組合可以作為本發(fā)明的標記物使用。在某些實施方式中，本發(fā)明提供了用于心肌肌鈣蛋白分子或其片段、復合物、磷酸化、或氧化形式的標記物，其中，標記物包括心肌肌鈣蛋白的抗體和熒光部分?？贵w可以是上述的任何抗體，如cTnT或cTnI的抗體。在某些實施方式中，抗體是cTnI的抗體。在某些實施方式中，抗體對于心肌肌鈣蛋白的特定區(qū)域是特異性的，例如，對于人cTnI的氨基酸27-41是特異性的。在某些實施方式中，本發(fā)明提供了包括連接在抗cTnI抗體(例如，多克隆抗體，如那些來自BiosPacific，Emeryville的名稱為G129C的山羊多克隆抗體)上的熒光部分的組合物?？梢赃B接熒光部分以使得標記物被在該熒光部分的激發(fā)波長處發(fā)射光的激光器激發(fā)時，能夠發(fā)射平均至少約50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、350、400、500、600、700、800、900或1000個光子，其中激光聚焦于包含該熒光部分的直徑不低于約5微米的點，而且其中激光指向該點的總能量不超過約3微焦耳。在某些實施方式中，熒光部分可以是被在熒光部分的激發(fā)波長處發(fā)射光的激光器激發(fā)時，能夠發(fā)射平均至少約50、100、150或200個光子的熒光部分，其中激光聚焦于包含熒光部分的直徑不低于約5微米的點，而且其中激光指向該點的總能量不超過約3微焦耳。熒光部分可以是包括一個或多個染料分子的熒光部分，染料分子的結構包括一個取代的吲哚環(huán)系統(tǒng)，其中，在吲哚環(huán)3位碳上的取代基包含化學反應性的基團或偶聯物質基團。標記組合物可以包括包含一個或多個選自AlexaFluor 488、532、647、700或750的染料分子的熒光部分。標記組合物可以包括包含一個或多個選自AlexaFluor 488、532、700或750的染料分子的熒光部分。標記組合物可以包括包含一個或多個AlexaFluor 488染料分子的熒光部分。標記組合物可以包括包含一個或多個AlexaFluor 555染料分子的熒光部分。標記組合物可以包括包含一個或多個AlexaFluor 610染料分子的熒光部分。標記組合物可以包括包含一個或多個AlexaFluor 647染料分子的熒光部分。標記組合物可以包括包含一個或多個AlexaFluor 680染料分子的熒光部分。標記組合物可以包括包含一個或多個AlexaFluor 700染料分子的熒光部分。標記組合物可以包括包含一個或多個AlexaFluor 750染料分子的熒光部分。
在某些實施方式中，本發(fā)明提供了用于檢測心肌肌鈣蛋白I的組合物，其包括連接在對于人cTnI的氨基酸27-41特異性的抗體(例如，山羊多克隆抗cTnI抗體)上的AlexFluor分子(例如，選自上述組的AlexFluor分子，如AlexFluor 647分子)。在某些實施方式中，本發(fā)明提供了用于檢測心肌肌鈣蛋白I的組合物，其包括平均1-11、或約2-10、或約2-8、或約2-6、或約2-5、或約2-4、或約3-10、或約3-8、或約3-6、或約3-5、或約4-10、或約4-8、或約4-6、或約2、3、4、5、6、或大于約6個連接在對于人cTnI的氨基酸27-41特異性的抗體(例如，山羊多克隆抗cTnI抗體)上的AlexaFluor 647分子。在某些實施方式中，本發(fā)明提供了用于檢測心肌肌鈣蛋白I的組合物，其包括平均1-11、或約2-10、或約2-8、或約2-6、或約2-5、或約2-4、或約3-10、或約3-8、或約3-6、或約3-5、或約4-10、或約4-8、或約4-6、或約2、3、4、5、6、或大于約6個連接在對于人cTnI的氨基酸27-41特異性的抗體(例如，山羊多克隆抗cTnI抗體)上的AlexaFluor 647分子。在某些實施方式中，本發(fā)明提供了用于檢測心肌肌鈣蛋白I的組合物，其包括平均約2-10個連接在對于人cTnI的氨基酸27-41特異性的抗體(例如，山羊多克隆抗cTnI抗體)上的AlexaFluor 647分子。在某些實施方式中，本發(fā)明提供了用于檢測心肌肌鈣蛋白I的組合物，其包括平均約2-8個連接在對于人cTnI的氨基酸27-41特異性的抗體(例如，山羊多克隆抗cTnI抗體)上的AlexaFluor 647分子。在某些實施方式中，本發(fā)明提供了用于檢測心肌肌鈣蛋白I的組合物，其包括平均約2-6個連接在對于人cTnI的氨基酸27-41特異性的抗體(例如，山羊多克隆抗cTnI抗體)上的AlexaFluor 647分子。在某些實施方式中，本發(fā)明提供了用于檢測心肌肌鈣蛋白I的組合物，其包括平均約2-4個連接在對于人cTnI的氨基酸27-41特異性的抗體(例如，山羊多克隆抗cTnI抗體)上的AlexaFluor647分子。在某些實施方式中，本發(fā)明提供了用于檢測心肌肌鈣蛋白I的組合物，其包括平均約3-8個連接在對于人cTnI的氨基酸27-41特異性的抗體(例如，山羊多克隆抗cTnI抗體)上的AlexaFluor 647分子。在某些實施方式中，本發(fā)明提供了用于檢測心肌肌鈣蛋白I的組合物，其包括平均約3-6個連接在對于人cTnI的氨基酸27-41特異性的抗體(例如，山羊多克隆抗cTnI抗體)上的AlexaFluor 647分子。在某些實施方式中，本發(fā)明提供了用于檢測心肌肌鈣蛋白I的組合物，其包括平均約4-8個連接在對于人cTnI的氨基酸27-41特異性的抗體(例如，山羊多克隆抗cTnI抗體)上的AlexaFluor 647分子。
熒光部分或組成熒光部分的熒光體與如抗體的結合伴體的連接，可以通過任何合適的方法實現；這類方法是本領域內熟知的，且在實施例中給出了示例方法。在某些實施方式中，在熒光部分和結合伴體連接以形成在本發(fā)明的方法中使用的標記物之后，及在用標記物標記目標蛋白質之前，進行過濾步驟是有用的。例如，抗體-染料標記物在使用前可以例如，通過0.2微米的過濾器或任何合適的過濾器過濾，以除去聚合體。也可以例如，通過0.2微米的過濾器，或任何合適的過濾器過濾其它用于本發(fā)明的分析的試劑。不受理論的限制，據認為這樣的過濾除去了一部分如抗體-染料標記物的聚合體。由于這樣的聚合體作為一個單位與目標蛋白質結合，但在洗脫緩沖液中進行釋放時很可能解聚，因此可能產生假陽性；即，從僅結合單一目標蛋白質分子的聚合體檢測到幾個標記物。與理論無關，已經發(fā)現過濾減少了后續(xù)分析中的假陽性，并提高了準確度和精密度。
IV.心肌肌鈣蛋白的高靈敏分析 一方面，本發(fā)明提供了測定樣品中是否存在心肌肌鈣蛋白的單一分子或其片段或復合物的方法，通過i)用標記物標記可能存在的分子、片段或其復合物；和ii)檢測標記物存在與否，其中，發(fā)現標記物的存在表明樣品中存在心肌肌鈣蛋白的單一分子、片段或復合物。本文使用的“心肌肌鈣蛋白分子”包括包含特定種類的心肌肌鈣蛋白的基本上天然產生的整個氨基酸序列的分子，包括翻譯后修飾的形式，例如，磷酸化形式及氧化形式或其它化學改變形式。本文使用的分子的“片段”，包括含有少于天然存在的整個氨基酸序列的心肌肌鈣蛋白分子，包括對于完整分子的修飾。本文使用的心肌肌鈣蛋白分子的“復合物”，包括與一個或多個其它分子或物質聯合的心肌肌鈣蛋白分子或片段，例如，與一個或多個其它心肌肌鈣蛋白分子聯合。在某些實施方式中，本方法能夠以低于約100、80、60、50、40、30、20、15、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1pg/ml的檢測限檢測肌鈣蛋白。在某些實施方式中，本方法能夠以低于約100pg/ml的檢測限檢測肌鈣蛋白。在某些實施方式中，本方法能夠以低于約50pg/ml的檢測限檢測肌鈣蛋白。在某些實施方式中，本方法能夠以低于約20pg/ml的檢測限檢測肌鈣蛋白。在某些實施方式中，本方法能夠以低于約10pg/ml的檢測限檢測肌鈣蛋白。在某些實施方式中，本方法能夠以低于約5pg/ml的檢測限檢測肌鈣蛋白。在某些實施方式中，本方法能夠以低于約3pg/ml的檢測限檢測肌鈣蛋白。在某些實施方式中，本方法能夠以低于約1pg/ml的檢測限檢測肌鈣蛋白。檢測限可以通過使用合適的國家標準和技術研究所參考標準物質，如標準cTnI來確定。
本方法也提供了通過檢測樣品中肌鈣蛋白單一分子來測定樣品中的心肌肌鈣蛋白濃度的方法。肌鈣蛋白單一分子的“檢測”包括直接或間接地檢測該分子。在間接檢測的情況下，可以檢測對應于心肌肌鈣蛋白單一分子的標記物，例如，已經連接在心肌肌鈣蛋白單一分子上的標記物。
檢測的心肌肌鈣蛋白的類型如本文所述，例如，cTnT、cTnI、總心肌肌鈣蛋白(例如，總cTnI或總cTnT)或游離的心肌肌鈣蛋白、復合的心肌肌鈣蛋白、或心肌肌鈣蛋白片段。在某些實施方式中，檢測和/或定量總心肌肌鈣蛋白。在某些實施方式中，檢測總cTnT。在某些實施方式中，檢測和/或定量總cTnI。
A.樣品 樣品可以是任何合適的樣品。一般地，樣品是生物樣品，例如，生物流體。這樣的流體包括，但不限于呼出氣冷凝液(EBC)、支氣管肺泡灌洗液(BAL)、血液、血清、血漿、尿液、腦脊髓液、胸膜液、滑液、腹膜液、羊水、胃液、淋巴液、間隙液、組織勻漿、細胞提取物、唾液、痰液、糞便、生理分泌液、淚液、粘液、汗液、乳汁、精液、精液液體、陰道分泌物、來自潰瘍和其他表面疹、皰和膿腫的液體、和包括正常、惡性及可疑組織活組織檢查的組織提取物，或其中可能含有感興趣的目標微粒的身體的任何其它組分。其它的諸如細胞或組織培養(yǎng)物或肉湯培養(yǎng)物的類似的樣本也受到關注。
在某些實施方式中，樣品是血液樣品。在某些實施方式中，樣品是血漿樣品。在某些實施方式中，樣品是血清樣品。
B.樣品制備 一般地，可以使用產生對應于要測量的心肌肌鈣蛋白分子的標記物的任何樣品制備方法，其中，標記物在本文所述的儀器中可檢測到。本領域內已知，在其中將標記物加到一種或多種微粒中的樣品制備可以以均相或異相形式進行。在某些實施方式中，在均相形式下進行樣品制備。在采用均相形式的分析器系統(tǒng)中，未結合的標記物不會從樣品中除去。參見，美國專利申請11/048 660號，在本文完全引入作為參考。在某些實施方式中，通過加入與一種或多種目標微粒結合的經標記的一種或多種抗體來標記一種或多種目標微粒。
在某些實施方式中，使用異相的分析形式，其中，一般地，采用去除未結合標記物的步驟。這樣的分析形式在本領域內是熟知的。一種尤其有用的分析形式是夾心分析，例如夾心免疫分析。在這種形式中，使用捕獲結合伴體在固體載體上捕獲如生物學狀態(tài)的標志物的目標分子。不想要的分子及其它物質隨后可以任選地洗去，接著結合包含檢測結合伴體和如熒光部分的可檢測標記的標記物。進一步洗滌除去未結合的標記物，然后釋放可檢測的標記，其通常(盡管不是必需的)仍連接在檢測結合伴體上。在可選擇的實施方式中，向捕獲結合伴體加入樣品和標記物，而不在這其間(例如，同時)進行洗滌。對于本領域的技術人員來說，其它變化是顯而易見的。
在某些實施方式中，檢測肌鈣蛋白微粒的方法使用以抗體(例如單克隆抗體)作為捕獲結合伴體的夾心分析。該方法包括將樣品中的肌鈣蛋白分子結合到固定在結合表面的捕獲抗體上，并將檢測抗體結合到肌鈣蛋白分子上以形成“夾心”復合物。檢測抗體包括可檢測的熒光標記，如本文所述，其可使用例如本發(fā)明的單分子檢測器檢測。捕獲抗體和檢測抗體兩者都特異性地結合肌鈣蛋白。已知許多夾心免疫分析的實例，且其中一些在美國專利4168146號(Grubb等人)及美國專利4 366 241號(Tom等人)進行了描述，本文引入這兩者作為參考。在實施例部分描述了進一步的特別用于心肌肌鈣蛋白的例子。
捕獲結合伴體可以連接在例如微量滴定板或順磁性珠的固體載體上。在某些實施方式中，本發(fā)明提供了連接在順磁性珠上的心肌肌鈣蛋白的結合伴體?？梢允褂萌魏魏线m的對于將要捕獲的心肌肌鈣蛋白的類型是特異性的結合伴體。結合伴體可以是抗體，例如，單克隆抗體。抗體可以對于本文所述的游離的心肌肌鈣蛋白(cTnI或cTnT)或心肌肌鈣蛋白復合物、修飾的心肌肌鈣蛋白或心肌肌鈣蛋白片段是特異性的，或者，對于可能在感興趣的樣品中發(fā)現的所有或基本上所有形式的心肌肌鈣蛋白，例如cTnI或cTnT，是特異性的。本文其它地方也描述了心肌肌鈣蛋白的抗體的產生和來源。優(yōu)選的用于測量總肌鈣蛋白的抗體是那些基本上不被肝素、磷酸化作用、氧化作用及肌鈣蛋白復合物形成影響的，且不會與骨骼肌的肌鈣蛋白(例如肌鈣蛋白I)交叉反應的抗體。在某些實施方式中，抗體對于心肌肌鈣蛋白的特定區(qū)域是特異性的。在某些實施方式中，所述區(qū)域包括人心肌肌鈣蛋白I的氨基酸41-49。在某些實施方式中，所述區(qū)域包括人心肌肌鈣蛋白I的氨基酸87-91。這樣的抗體在本領域內是熟知的，且可以從例如BiosPacific，Emeryville，CA獲得。在本發(fā)明的實施方式中有用的捕獲抗體的示例是和游離的心肌肌鈣蛋白I(cTnI)的氨基酸41-49及和cTnI與其它肌鈣蛋白成分形成的復合物反應的抗體，例如單克隆抗體。優(yōu)選地，該抗體不會被肝素、磷酸化作用、氧化作用及肌鈣蛋白復合物形成影響，且不會與骨骼肌的肌鈣蛋白I交叉反應。此類型的一個示例性的抗體是可從BiosPacific，Emeryville，CA獲得的A34650228P號單克隆抗體。在本發(fā)明的實施方式中有用的捕獲抗體的另一個示例是與游離的心肌肌鈣蛋白I(cTnI)的氨基酸87-91及和cTnI與其它肌鈣蛋白成分形成的復合物反應的抗體，例如單克隆抗體。優(yōu)選地，該抗體不會被肝素、磷酸化作用、氧化作用及肌鈣蛋白復合物形成影響，且不會與骨骼肌的肌鈣蛋白I交叉反應。此類型的一個示例性的抗體是可從BiosPacific，Emeryville，CA獲得的A34440228P號單克隆抗體。可以理解，這里確認為可用作捕獲抗體的抗體也可以用作檢測抗體，反之亦然。
如抗體的結合伴體與固體載體的連接可以是共價的或非共價的。在某些實施方式中，連接是非共價的。本領域內熟知的一個非共價連接的示例是生物素-抗生物素蛋白/鏈霉親和素相互作用。因此，在某些實施方式中，如微量滴定板或順磁性珠的固體載體通過例如生物素-抗生物素蛋白/鏈霉親和素相互作用的非共價連接與例如抗體的捕獲結合伴體連接。在某些實施方式中，連接是共價的。因此，在某些實施方式中，如微量滴定板或順磁性珠的固體載體通過共價連接與例如抗體的捕獲結合蛋白連接。其中捕獲抗體的取向使得目標分子的捕獲最優(yōu)化的共價連接是尤其有用的。例如，在某些實施方式中，可以使用如微量滴定板或順磁性珠的固體載體，在使用中，如抗體的結合伴體的連接是定向連接，如共價定向連接。
抗體和固體載體的定向連接的示例性的方案如下將IgG溶于pH5.5的0.1M醋酸鈉緩沖液至最終濃度為1mg/ml。加入等體積的冰冷的溶于pH5.5的0.1M醋酸鈉的20mM高碘酸鈉。使IgG在冰上氧化0.5小時。通過加入0.15體積的1M甘油終止過量的高碘酸鹽試劑。通過超濾作用去除氧化反應的低分子量的副產物。將氧化的IgG成分稀釋至合適的濃度(一般為0.5微克IgG/毫升)，并在室溫下與酰肼活化的多孔板反應至少2小時。通過用硼酸鹽緩沖鹽水或另一種合適的緩沖液洗滌多孔板來除去未結合的IgG。如果需要，板可以干燥儲存。如果微珠材料適于這樣的連接，微珠可以遵循類似的方案。
在某些實施方式中，固體載體是微量滴定板。在某些實施方式中，固體載體是順磁性珠。示例性的順磁性珠是Streptavidin C1(Dynal，650.01-03)。其它合適的珠對于本領域的技術人員是顯而易見的。連接抗體和順磁性珠的方法在本領域內是熟知的。實施例部分給出了一個實例。
目標心肌肌鈣蛋白與固定于固體載體上的如捕獲抗體的捕獲結合伴體接觸。可以使用一些樣品制備；例如，在樣品與捕獲抗體接觸之前，從血液樣品制備血清或濃縮過程。在免疫分析中結合蛋白質的方案在本領域內是公知的，且包括在實施例中。
用于結合的時間隨條件而變化；很明顯，在一些情況中、尤其是臨床情況中，需要較短的結合時間。如順磁性珠的使用可以減少結合所需的時間。在某些實施方式中，用于目標蛋白質與如抗體的捕獲結合伴體結合的時間低于約12、10、8、6、4、3、2或1小時，或低于約60、50、40、30、25、20、15、10或5分鐘。在某些實施方式中，用于目標蛋白質與如抗體的捕獲結合伴體結合的時間低于約60分鐘。在某些實施方式中，用于目標蛋白質與如抗體的捕獲結合伴體結合的時間低于約40分鐘。在某些實施方式中，用于目標蛋白質與如抗體的捕獲結合伴體結合的時間低于約30分鐘。在某些實施方式中，用于目標蛋白質與如抗體的捕獲結合伴體結合的時間低于約20分鐘。在某些實施方式中，用于目標蛋白質與如抗體的捕獲結合伴體結合的時間低于約15分鐘。在某些實施方式中，用于目標蛋白質與如抗體的捕獲結合伴體結合的時間低于約10分鐘。在某些實施方式中，用于目標蛋白質與如抗體的捕獲結合伴體結合的時間低于約5分鐘。
在某些實施方式中，在肌鈣蛋白微粒與如捕獲抗體的捕獲結合伴體結合之后，洗去非特異性地結合的微粒及樣品中的其它不想要的物質，基本上只留下特異性結合的肌鈣蛋白微粒。在其它的實施方式中，在加入樣品和加入標記物之間不進行洗滌；可以理解，這更進一步減少了樣品制備時間。因此，在某些實施方式中，用于目標蛋白質與如抗體的捕獲結合伴體結合以及將標記物與目標蛋白質結合的時間低于約12、10、8、6、4、3、2或1小時，或低于約60、50、40、30、25、20、15、10或5分鐘。在某些實施方式中，用于目標蛋白質與如抗體的捕獲結合伴體結合以及將標記物與目標蛋白質結合的時間低于約60分鐘。在某些實施方式中，用于目標蛋白質與如抗體的捕獲結合伴體結合以及將標記物與目標蛋白質結合的時間低于約40分鐘。在某些實施方式中，用于目標蛋白質與如抗體的捕獲結合伴體結合以及將標記物與目標蛋白質結合的時間低于約30分鐘。在某些實施方式中，用于目標蛋白質與如抗體的捕獲結合伴體結合以及將標記物與目標蛋白質結合的時間低于約20分鐘。在某些實施方式中，用于目標蛋白質與如抗體的捕獲結合伴體結合以及將標記物與目標蛋白質結合的時間低于約15分鐘。在某些實施方式中，用于目標蛋白質與如抗體的捕獲結合伴體結合以及將標記物與目標蛋白質結合的時間低于約10分鐘。在某些實施方式中，用于目標蛋白質與如抗體的捕獲結合伴體結合以及將標記物與目標蛋白質結合的時間低于約5分鐘。
用于測量目標分析物的包括捕獲和信號抗體的一些免疫分析診斷試劑可以源自動物血清。具有結合其它種類的免疫球蛋白的能力的內源性的人類異嗜性抗體或人抗動物抗體存在于超過10％的病人血清或血漿中。這些循環(huán)的異嗜性抗體可能干擾免疫分析測量。在夾心免疫分析中，這些異嗜性抗體或者橋連捕獲抗體和檢測(診斷)抗體，從而產生假陽性信號；或者阻斷診斷抗體的結合，從而產生假陰性信號。在競爭免疫分析中，異嗜性抗體可能結合分析抗體，并抑制其結合肌鈣蛋白。它們也可能阻斷或者增強抗體-肌鈣蛋白復合物與游離肌鈣蛋白的分離，尤其在分離系統(tǒng)中使用抗種類的抗體時。因此，這些異嗜性抗體的干擾效應難以預測。所以，阻斷任何異嗜性抗體的結合是有利的。在本發(fā)明的某些實施方式中，免疫分析包括使用一種或多種異嗜性抗體阻斷劑耗盡樣品中的異嗜性抗體的步驟。從將要在免疫分析中測試的樣品中去除異嗜性抗體的方法是已知的，且包括在pH5.0的醋酸鈉緩沖液中在90℃加熱樣本15分鐘，并在1200g下離心10分鐘，或者使用聚乙二醇(PEG)沉淀異嗜性抗體；使用蛋白A或蛋白G從樣本中免疫提取干擾性的異嗜性免疫球蛋白；或者加入非免疫小鼠IgG。本發(fā)明方法的實施方式預期在使用單分子檢測器進行分析之前制備樣品。可以確定預處理方法的適用性。用于最小化由異嗜性抗體導致的免疫分析干擾的生化藥劑可商購。例如，稱為MAK33的產品，其是一種抗h-CK-MM的IgG1單克隆抗體，可從Boehringer Mannheim獲得。MAK33 plus產品包含IgG1和IgG1-Fab的組合。聚MAK33含有與IgG1聚合的IgG1-Fab，聚MAC 2b/2a含有與IgG2b聚合的IgG2a-Fab。用于中和異嗜性抗體的生化藥劑的另一種商購來源是由Bioreclamation Inc，East Meadow，NY銷售的免疫球蛋白抑制劑。該產品是來自多個物種的免疫球蛋白(IgG和IgM)的制品，主要是來自Balb/c小鼠的鼠IgG2a、IgG2b和IgG3。在某些實施方式中，可以使用本領域已知的方法從樣品中免疫提取異嗜性抗體，例如，通過將干擾性抗體結合到蛋白A或G上耗盡樣品中的異嗜性抗體。在某些實施方式中，使用一種或多種異嗜性抗體阻斷劑中和異嗜性抗體。異嗜性阻斷劑可以選自抗同種型異嗜性抗體阻斷劑、抗個體型異嗜性抗體阻斷劑和抗-抗個體型異嗜性抗體阻斷劑。在某些實施方式中，可以使用異嗜性抗體阻斷劑的組合。
在加入樣品的同時或之后加入標記物并洗滌。將抗體和其它免疫標記與蛋白質和其它分子結合的方案是本領域內熟知的。如果標記物結合步驟與捕獲結合是分離的，則用于標記物結合的時間在例如臨床情況中是重要的。在某些實施方式中，用于將目標蛋白質與如抗體-染料的標記物結合的時間低于約12、10、8、6、4、3、2或1小時，或低于約60、50、40、30、25、20、15、10或5分鐘。在某些實施方式中，用于將目標蛋白質與如抗體-染料的標記物結合的時間低于約60分鐘。在某些實施方式中，用于將目標蛋白質與如抗體-染料的標記物結合的時間低于約40分鐘。在某些實施方式中，用于將目標蛋白質與如抗體-染料的標記物結合的時間低于約30分鐘。在某些實施方式中，用于將目標蛋白質與如抗體-染料的標記物結合的時間低于約20分鐘。在某些實施方式中，用于將目標蛋白質與如抗體-染料的標記物結合的時間低于約15分鐘。在某些實施方式中，用于將目標蛋白質與如抗體-染料的標記物結合的時間低于約10分鐘。在某些實施方式中，用于將目標蛋白質與如抗體-染料的標記物結合的時間低于約5分鐘。通過洗滌去除過量的標記物。
然后從目標蛋白質上洗脫標記物。優(yōu)選的洗脫緩沖液對于釋放標記物是有效的而不產生明顯的背景。如果洗脫緩沖液是抑菌的，也是有利的。本發(fā)明使用的洗脫緩沖液包括離液劑(chaotrope)，例如，尿素或胍化合物；緩沖液，例如，硼酸鹽緩沖鹽水；蛋白質載體，例如，白蛋白，如人、牛或魚的白蛋白，或IgG，用來在檢測儀器中涂覆毛細管壁；和表面活性劑，例如，離子或非離子去污劑，挑選產生相對低的背景的，例如，Tween 20、Triton X-100或SDS。
采集到單分子檢測器內的洗脫緩沖液/標記物等分試樣被稱為“處理樣品”，以將其與從個體獲得的初始樣品相區(qū)別。
在另一實施方式中，固相結合分析可以采用競爭性結合分析形式。一種這樣的方法包括a)使i)樣品中的肌鈣蛋白微粒和ii)包含可檢測標記(檢測試劑)的肌鈣蛋白微粒的經標記類似物競爭性地結合固定于結合表面的捕獲抗體，和b)使用單微粒分析器測定標記物的量。另一種這樣的方法包括a)使i)樣品中的肌鈣蛋白微粒和ii)固定于結合表面(捕獲試劑)的肌鈣蛋白微粒類似物競爭性地結合具有可檢測標記(檢測試劑)的抗體，和b)使用單微粒分析器測定標記物的量。本文的“肌鈣蛋白類似物”指與肌鈣蛋白競爭結合捕獲抗體的物質。在美國專利4 235 601號(Deutsch等人)、美國專利4 442 204號(Liotta)和美國專利5 208 535號(Buechler等人)中公開了競爭性免疫分析的示例，本文完整引入作為參考。
C.肌鈣蛋白的檢測和濃度的測定 洗脫之后，通過單分子分析器運行例如洗脫緩沖液中的標記物。處理樣品可能不包含標記物、包含單個或多個標記物。標記物的數目對應于在捕獲步驟中捕獲的心肌肌鈣蛋白分子的數目或與后者成比例(如果使用樣品的稀釋液或部分)。
可以使用任何合適的能夠檢測與目標蛋白質一起使用的標記物的單分子檢測器。合適的單分子檢測器如本文所述。一般地，檢測器是系統(tǒng)的一部分，系統(tǒng)包括用于對制備的樣品取樣的自動取樣器，和任選的回收樣品的回收系統(tǒng)。
在某些實施方式中，處理樣品在利用毛細流動系統(tǒng)，并包括毛細流動池、照射處理樣品從其中通過的毛細管中的探詢空間的激光器、檢測從探詢空間發(fā)射的輻射的檢測器、和移動處理樣品通過探詢空間的動力源的單分子分析器中分析。在某些實施方式中，單分子分析器進一步包括收集處理樣品通過探詢空間時的發(fā)射光的顯微鏡物鏡，例如，高數值孔徑的顯微鏡物鏡。在某些實施方式中，激光器和檢測器是共焦排列。在某些實施方式中，激光器是連續(xù)波激光器。在某些實施方式中，檢測器是雪崩光電二極管檢測器。在某些實施方式中，動力源是提供壓力的泵。在某些實施方式中，本發(fā)明提供了分析器系統(tǒng)，其包括能夠對多個樣品自動取樣、在樣品容器和探詢空間之間提供流體連通的采樣系統(tǒng)。在某些實施方式中，探詢空間具有的體積為約0.001-500pL、或約0.01-100pL、或約0.01-10pL、或約0.01-5pL、或約0.01-0.5pL、或約0.02-約300pL、或約0.02pL-約50pL、或約0.02-約5pL、或約0.02-約0.5pL、或約0.02-約2pL、或約0.05-約50pL、或約0.05-約5pL、或約0.05-約0.5pL、或約0.05-約0.2pL、或約0.1-約25pL。在某些實施方式中，探詢空間具有的體積為約0.004-100pL。在某些實施方式中，探詢空間具有的體積為約0.02-50pL。在某些實施方式中，探詢空間具有的體積為約0.001-10pL。在某些實施方式中，探詢空間具有的體積為約0.001-10pL。在某些實施方式中，探詢空間具有的體積為約0.01-5pL。在某些實施方式中，探詢空間具有的體積為約0.02-約5pL。在某些實施方式中，探詢空間具有的體積為約0.05-5pL。在某些實施方式中，探詢空間具有的體積為約0.05-10pL。在某些實施方式中，探詢空間具有的體積為約0.5-約5pL。在某些實施方式中，探詢空間具有的體積為約0.02-約0.5pL。
在某些實施方式中，用于本發(fā)明方法的單分子檢測器利用毛細流動系統(tǒng)，且包括毛細流動池、照射處理樣品從其中通過的毛細管中的探詢空間的連續(xù)波激光器、收集處理樣品通過探詢空間時發(fā)射的光的高數值孔徑顯微鏡物鏡、檢測從探詢空間發(fā)射的輻射的雪崩光電二極管檢測器、和為移動處理樣品通過探詢空間提供壓力的泵，其中，探詢空間為約0.02-約50pL。在某些實施方式中，用于本發(fā)明方法的單分子檢測器利用毛細流動系統(tǒng)，且包括毛細流動池、照射處理樣品從其中通過的毛細管中的探詢空間的連續(xù)波激光器、收集處理樣品通過探詢空間時發(fā)射的光的高數值孔徑顯微鏡物鏡(其中，透鏡具有至少約0.8的數值孔徑)、檢測從探詢空間發(fā)射的輻射的雪崩光電二極管檢測器、和為移動處理樣品通過探詢空間提供壓力的泵，其中，探詢空間為約0.004-約100pL。在某些實施方式中，用于本發(fā)明方法的單分子檢測器利用毛細流動系統(tǒng)，且包括毛細流動池、照射處理樣品從其中通過的毛細管中的探詢空間的連續(xù)波激光器、收集處理樣品通過探詢空間時發(fā)射的光的高數值孔徑顯微鏡物鏡(其中，透鏡具有至少約0.8的數值孔徑)、檢測從探詢空間發(fā)射的輻射的雪崩光電二極管檢測器、和為移動處理樣品通過探詢空間提供壓力的泵，其中，探詢空間為約0.05-約10pL。在某些實施方式中，用于本發(fā)明方法的單分子檢測器利用毛細流動系統(tǒng)，且包括毛細流動池、照射處理樣品從其中通過的毛細管中的探詢空間的連續(xù)波激光器、收集處理樣品通過探詢空間時發(fā)射的光的高數值孔徑顯微鏡物鏡(其中，透鏡具有至少約0.8的數值孔徑)、檢測從探詢空間發(fā)射的輻射的雪崩光電二極管檢測器、和為移動處理樣品通過探詢空間提供壓力的泵，其中，探詢空間為約0.05-約5pL。在某些實施方式中，用于本發(fā)明方法的單分子檢測器利用毛細流動系統(tǒng)，且包括毛細流動池、照射處理樣品從其中通過的毛細管中的探詢空間的連續(xù)波激光器、收集處理樣品通過探詢空間時發(fā)射的光的高數值孔徑顯微鏡物鏡(其中，透鏡具有至少約0.8的數值孔徑)、檢測從探詢空間發(fā)射的輻射的雪崩光電二極管檢測器、和為移動處理樣品通過探詢空間提供壓力的泵，其中，探詢空間為約0.5-約5pL。
在某些實施方式中，單分子檢測器能夠測定樣品濃度可能在至少約100倍、或1000倍、或10000倍、或100000倍、或30000倍、或1000000倍、或10000000倍、或30000000倍的范圍內的樣品中目標分子的濃度。
在某些實施方式中，本發(fā)明的方法利用能夠檢測引入檢測器的第一樣品和第二樣品之間分析物濃度低于約50％、40％、30％、20％、15％或10％的差異的單分子檢測器，其中引入分析器的第一樣品和所述的第二樣品的體積低于約100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、10、5、4、3、2或1μl，且其中分析物以低于約100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、10、5、4、3、2或1飛摩爾的濃度存在。在某些實施方式中，本發(fā)明的方法使用能夠檢測引入檢測器的第一樣品和第二樣品之間分析物濃度低于約50％的差異的單分子檢測器，其中引入分析器的第一樣品和所述的第二樣品的體積低于約100μl，且其中分析物以低于約100飛摩爾的濃度存在。在某些實施方式中，本發(fā)明的方法使用能夠檢測引入檢測器的第一樣品和第二樣品之間分析物濃度低于約40％的差異的單分子檢測器，其中引入分析器的第一樣品和所述的第二樣品的體積低于約50μl，且其中分析物以低于約50飛摩爾的濃度存在。在某些實施方式中，本發(fā)明的方法使用能夠檢測引入檢測器的第一樣品和第二樣品之間分析物濃度低于約20％的差異的單分子檢測器，其中引入分析器的第一樣品和所述的第二樣品的體積低于約20μl，且其中分析物以低于約20飛摩爾的濃度存在。在某些實施方式中，本發(fā)明的方法使用能夠檢測引入檢測器的第一樣品和第二樣品之間分析物濃度低于約20％的差別的單分子檢測器，其中引入分析器的第一樣品和所述的第二樣品的體積低于約10μl，且其中分析物以低于約10飛摩爾的濃度存在。在某些實施方式中，本發(fā)明的方法使用能夠檢測引入檢測器的第一樣品和第二樣品之間分析物濃度低于約20％的差別的單分子檢測器，其中引入分析器的第一樣品和所述的第二樣品的體積低于約5μl，且其中分析物以低于約5飛摩爾的濃度存在。
下面更詳細地描述單分子檢測器和系統(tǒng)。在本發(fā)明的方法中有用的單分子分析器的進一步的實施方式，如含有多于一個的探詢窗口的檢測器，利用電動流或電泳流的檢測器，等等，可以在美國專利申請11/048 660號中發(fā)現，在本文完整引入作為參考。
在多次運行之間，可以洗滌儀器。在某些實施方式中可以使用維持樣品的鹽和表面活性劑濃度的洗滌緩沖液以保持毛細管的條件，即，保持毛細管表面在樣品之間的相對恒定以減少變異性。
對于本發(fā)明的方法和儀器的極高靈敏度起貢獻作用的一個特征是檢測和定量標記物的方法，在某些實施方式中，標記物連接在要檢測的單分子上，或更一般地，對應于要檢測的單分子。簡單地說，通過使毛細管的給定的探詢空間經受來自以標記物中使用的熒光部分的適當激發(fā)波長發(fā)射光的激光器的EM輻射預定的時間，并在那個時間內檢測發(fā)射的光子，而將流過毛細管的處理樣品有效地分為一系列檢測事件。各個預定的時間段是一個“箱元(bin)”。如果在給定的箱元內檢測的光子總數超過了預設的閾水平，就記錄該箱元為檢測事件，即，檢測到了標記物。如果光子總數沒有達到預設的閾水平，就不記錄檢測事件。在某些實施方式中，處理樣品的濃度足夠稀釋，從而對于大百分比的檢測事件，檢測事件代表只有一個標記物通過窗口，其對應于原始樣品中的單個目標分子，即，幾乎沒有檢測事件代表在單個箱元中多于一個標記物。在某些實施方式中，應用進一步的精制以允許處理樣品中更大濃度的標記物被精確地檢測到，即，兩個或更多個標記物作為單一檢測事件被檢測到的可能性不再是無關緊要的濃度。
盡管可以使用其它的箱元時間而不背離本發(fā)明的范圍，在某些實施方式中，箱元時間選自約1微秒-約5毫秒的范圍。在某些實施方式中，箱元時間多于約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、250、300、400、500、600、700、750、800、900、1000、2000、3000、4000或5000微秒。在某些實施方式中，箱元時間低于約2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、250、300、400、500、600、700、750、800、900、1000、2000、3000、4000或5000微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約1-1000微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約1-750微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約1-500微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約1-250微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約1-100微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約1-50微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約1-40微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約1-30微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約1-500微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約1-20微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約1-10微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約1-500微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約1-5微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約5-500微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約5-250微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約5-100微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約5-50微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約5-20微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約5-10微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約10-500微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約10-250微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約10-100微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約10-50微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約10-30微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約10-20微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約5微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約5微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約6微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約7微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約8微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約9微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約10微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約11微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約12微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約13微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約14微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約5微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約15微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約16微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約17微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約18微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約19微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約20微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約25微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約30微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約40微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約50微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約100微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約250微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約500微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約750微秒。在某些實施方式中，箱元時間為約1000微秒。
在某些實施方式中，通過平均噪音水平或均方根噪音確定背景噪音水平。在其它情況中，選擇代表性的噪音值或統(tǒng)計值。在大多數情況中，預期噪音遵循泊松分布。因此，在某些實施方式中，測定樣品中的微粒-標記復合物的濃度包括測定背景噪音水平。
因此，隨著標記物流經毛細流動池，它被激光束照射以產生光子脈沖。通過只考慮具有高于相當于樣品中存在的背景噪音量的預設閾能量水平的光子脈沖，標記物發(fā)射的光子區(qū)別于背景光或背景噪音發(fā)射。背景噪音一般包括例如由樣品、在制備用于分析的樣品時使用的緩沖液或稀釋液中存在的非標記微粒的固有熒光所產生的低頻發(fā)射、拉曼散射和電子噪音。在某些實施方式中，賦予背景噪音的值以在多個箱元中檢測到的平均背景信號噪音計算，這是在預設長度的時間內在探詢空間中檢測到的光子信號的量度。因此，在某些實施方式中，對于每個樣品，背景噪音以該樣品特定的數字來計算。
給定背景噪音值，就可以指定閾能量水平。如上討論，確定閾值以區(qū)分真實信號(由標記物的熒光產生)和背景噪音。在選擇閾值時必須注意使得來自隨機噪音的假陽性信號數最小化，而被排除的真實信號數值也最小化。選擇閾值的方法包括確定高于噪音水平的固定值，并基于噪音信號的分布計算閾值。在一種實施方式中，閾設定為高于背景水平的標準差的固定數值。假定噪音遵循泊松分布，使用這種方法能夠評估實驗過程的時間內的假陽性信號數。在某些實施方式中，閾水平計算為比背景噪音高4個標準差(sigma)的值。例如，給定200個光子的平均背景噪音水平，分析器系統(tǒng)確定閾水平比200個光子的平均背景/噪音水平高4√200，為256光子。因此，在某些實施方式中，確定樣品中的標記物濃度包括建立閾水平，高于閾水平的光子信號代表存在標記物。相反地，具有不高于閾水平的能量水平的光子信號表明不存在標記物。
采取多個箱元測量以測定樣品濃度，且對于每一個箱元測量確定是否存在標記物。一般地，1分鐘內能夠進行60000個或更多的測量(例如，在箱元大小為1毫秒的實施方式中，箱元大小越小，測量的數目相對地越大，例如，箱元大小為10微秒，則每分鐘6000000個測量)。因此，沒有一個測量是關鍵性的，因而本方法提供了高的誤差容限。在測定處理樣品中的標記物的濃度時不考慮確定不含標記物的箱元(“無”箱元)，只有在確定含有標記物的箱元(“有”箱元)中進行的測量才考慮在內。不考慮在“無”箱元中或缺乏標記物的箱元中進行的測量提高了信噪比和測量的準確性。因此，在某些實施方式中，確定樣品中的標記物濃度包括檢測反映標記物存在的箱元的測量。
通過使檢測微粒-標記復合物的箱元測量過程中檢測背景噪音的時間最小化，可以提高信噪比或分析器系統(tǒng)的靈敏度。例如，在持續(xù)1毫秒的箱元測量中，在這一過程中，一個微粒-標記復合物在250微秒內經過探詢空間而被檢測，而1毫秒中的750微秒則花在檢測背景噪音發(fā)射上。通過減少箱元時間能夠提高信噪比。在某些實施方式中，箱元時間是1毫秒。在其它實施方式中，箱元時間是750、500、250微秒、100微秒、50微秒、25微秒或10微秒。其它的箱元時間如本文所述。
影響測量的其它因素是熒光部分的亮度或暗度、流速和激光器的功率。使得能夠檢測標記物的相關因素的各種組合對于本領域的技術人員是顯而易見的。在某些實施方式中，不改變流速而調整箱元時間。本領域的技術人員可以理解，隨著箱元時間減少，指向探詢空間的激光器的功率輸出必須增加，以維持在箱元時間內應用于探詢空間的總能量恒定。例如，如果箱元時間從1000微秒減少到250微秒，作為第一近似值，激光器的功率輸出必須增加大約4倍。這些設置使得在250μs內檢測到的光子數目與在給定的先前設置下1000μs內檢測的光子數目相同，并使得以較低的背景而因此較高的靈敏度對樣品進行較快速的分析。另外，為了加速樣品處理，可以調整流速。這些數字僅僅是示例性的，技術人員可以根據需要調整參數以獲得預期結果。
在某些實施方式中，探詢空間涵蓋了樣品流的整個橫截面。當探詢空間涵蓋樣品流的整個橫截面時，為了計算處理樣品中的標記物的濃度，只需要在設定的長度時間內測定的標記物的數目和經過橫截面的樣品流的體積。在某些實施方式中，可以例如，通過激光束照射的點的大小對探詢空間進行限定而限定探詢空間小于樣品流的橫截面積。在某些實施方式中，通過調整分析器的孔306(圖1A)或358和359(圖1B)及減小物鏡向檢測器成像的照射體積來限定探詢空間。在某些實施方式中，當限定探詢空間小于樣品流的橫截面積時，可以通過復合物發(fā)射的信號的內插(interpolation)，由使用一種或多種已知濃度的標準樣品產生的標準曲線確定標記物的濃度。在再另外的實施方式中，可以通過比較測量的微粒與內標標準來確定標記物的濃度。在分析稀釋樣品的實施方式中，在計算起始樣品中的目標分子濃度時，要將稀釋因素考慮在內。
如上討論的，當探詢空間涵蓋樣品流的整個橫截面時，為了計算樣品的濃度，只需要計算在設定的長度時間(箱元)內經過橫截面的計數標記物的數目和在箱元中探詢的樣品的體積。確定“有”箱元中含有的標記物的總數并與由分析中使用的箱元的總數代表的樣品體積相關聯以確定處理樣品中的標記物濃度。因此，在一個實施方式中，確定處理樣品中的標記物的濃度包括確定檢測的“有”箱元的標記物總數，并將檢測的標記物的總數與分析的總樣品體積相關聯。分析的總樣品體積是在指定的時間間隔內經過毛細流動池且通過探詢空間的樣品體積?；蛘?，通過在多個箱元中由標記物發(fā)射的信號的內插，由標準曲線來確定樣品中的標記復合物的濃度，該標準曲線通過用含有已知濃度的標記物的標準樣品確定在同樣數目的箱元中標記物發(fā)射的信號而產生。
在某些實施方式中，箱元中檢測的單獨的標記物的數目與處理樣品中的微粒的相對濃度相關。在相對低的濃度時，例如，低于約10-16M的濃度時，標記物的數目與在箱元中檢測的光子信號成比例。因此，在標記物的低濃度時，光子信號提供作為數字信號。在相對較高的濃度時，例如，高于約10-16M的濃度時，由于兩個或多個標記物在大約同樣的時間越過探詢空間并被計為一個的可能性變得明顯，失去了光子信號與標記物的比例關系。因此，在某些實施方式中，通過減少箱元測量的時間長度來解析濃度大于約10-16M的樣品中的單獨微粒。
或者，在其它實施方式中，可檢測由存在于任一個箱元中的多個微粒發(fā)射的總光子信號。這些實施方式使得本發(fā)明的單分子檢測器動態(tài)范圍是至少3、3.5、4、4.5、5.5、6、6.5、7、7.5、8或大于8個數量級(logs)。
本文所用的術語“動態(tài)范圍”，指無需稀釋或其它處理來改變濃度不同的連續(xù)樣品的濃度即可用儀器定量的樣品濃度范圍，其中，以適于預期用途的準確度來確定濃度。例如，如果微量滴定板在一個孔中包含1飛摩爾濃度目標分析物的樣品，在另一個孔中包含10000飛摩爾濃度目標分析物的樣品，且在第三個孔中包含100飛摩爾濃度目標分析物的樣品，則具有至少4數量級的動態(tài)范圍和1飛摩爾的定量下限的儀器能夠準確地定量所有樣品的濃度而不需要如稀釋的進一步處理以改變濃度。通過標準方法可以確定準確度，例如，使用濃度跨越動態(tài)范圍的一系列標準物并建立標準曲線?？梢允褂卯a生的標準曲線擬合標準測量作為準確度的測量，例如，r2大于約0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98或0.99。
通過改變分析來自檢測器的數據的方式，和/或通過在檢測器和探詢空間之間使用衰減器來獲得增加的動態(tài)范圍。在范圍的低端，其中處理樣品足夠稀釋而使得每一個檢測事件，即，箱元中高于閾水平的每一次光子脈沖(“事件光子”)，很可能只代表一個標記物，對數據進行分析以將檢測事件計數作為單分子。即，如上文所述，每一個箱元分析為代表標記物存在的簡單的“有”或“無”。對于更濃縮的處理樣品，其中，兩個或多個標記物占據單一箱元的可能性變得明顯，在相當數目的箱元中的事件光子的數目實質上大于預期的單一標記物數目，例如，相當數目的箱元中事件光子的數目相當于預期的單一標記物數目的2倍、3倍或更多。對于這些樣品，儀器將其數據分析方法改變?yōu)閷τ谔幚順悠返南湓氖录庾涌倲的窟M行積分。這一總數目與所有箱元中標記物的總數目成比例。對于甚至更濃縮的處理樣品，其中大部分箱元中出現許多標記物，背景噪音變?yōu)閬碜悦恳粋€箱元中的總信號的無關緊要的一部分，因而儀器將其數據分析方法改變?yōu)橛嬎忝恳幌湓目偟墓庾?包括背景)。當濃度使得到達檢測器的光的強度另外超過檢測器精確計數光子的能力時，即檢測器飽和時，通過在流動池和檢測器之間使用衰減器能夠獲得動態(tài)范圍更進一步的增加。
儀器可以包括數據分析系統(tǒng)，其接受來自檢測器的輸入，并確定對于運行的樣品合適的分析方法，并輸出基于這樣的分析的值。如果在儀器中包括衰減器，數據分析系統(tǒng)可以進一步輸出使用或不使用衰減器的指令。
通過利用這樣的方法，儀器的動態(tài)范圍可以急劇增加。因此，在某些實施方式中，儀器能夠在高于約1000(3數量級)、10 000(4數量級)、100 000(5數量級)、350 000(5.5數量級)、1 000 000(6數量級)、3 500 000(6.5數量級)、10 000 000(7數量級)、35 000 000(7.5數量級)或1 00 000000(8數量級)的動態(tài)范圍上測量樣品的濃度。在某些實施方式中，儀器能夠在高于約100 000(5數量級)的動態(tài)范圍上測量樣品的濃度。在某些實施方式中，儀器能夠在高于約1 000 000(6數量級)的動態(tài)范圍上測量樣品的濃度。在某些實施方式中，儀器能夠在高于約100 0000(7數量級)的動態(tài)范圍上測量樣品的濃度。在某些實施方式中，儀器能夠在從約1-10飛摩爾到至少約1000、10 000、100 000、350 000、1 000 000、3 500 000、10 000 000或35 000 000飛摩爾的動態(tài)范圍上測量樣品的濃度。在某些實施方式中，儀器能夠在從約1-10飛摩爾到至少約10 000飛摩爾的動態(tài)范圍上測量樣品的濃度。在某些實施方式中，儀器能夠在從約1-10飛摩爾到至少約100 000飛摩爾的動態(tài)范圍上測量樣品的濃度。在某些實施方式中，儀器能夠在從約1-10飛摩爾到至少約1 000 000飛摩爾的動態(tài)范圍上測量樣品的濃度。在某些實施方式中，儀器能夠在從約1-10飛摩爾到至少約10 000 000飛摩爾的動態(tài)范圍上測量樣品的濃度。
在某些實施方式中，本發(fā)明的分析器或分析器系統(tǒng)能夠以低于1納摩爾、或1皮摩爾、或1飛摩爾、或1阿托摩爾、或1仄摩爾的檢測限檢測例如生物標志物的分析物。在某些實施方式中，當生物標志物以低于1納摩爾、或1皮摩爾、或1飛摩爾、或1阿托摩爾、或1仄摩爾的濃度在樣品中存在時，且當各樣品的大小為低于約100、50、40、30、20、10、5、2、1、0.1、0.01、0.001或0.0001μl時，分析器或分析器系統(tǒng)能夠檢測從一個樣品到另一個樣品的一種或多種分析物(例如生物標志物)的低于約0.1、1、2、5、10、20、30、40、50、60或80％的濃度改變。在某些實施方式中，當分析物以低于約1皮摩爾的濃度在樣品中存在時，且當各樣品的大小為低于約50μl時，分析器或分析器系統(tǒng)能夠檢測從第一樣品到第二樣品的分析物的低于約20％的濃度改變。在某些實施方式中，當分析物以低于約100飛摩爾的濃度在樣品中存在時，且當各樣品的大小為低于約50μl時，分析器或分析器系統(tǒng)能夠檢測從第一樣品到第二樣品的分析物的低于約20％的濃度改變。在某些實施方式中，當分析物以低于約50飛摩爾的濃度在樣品中存在時，且當各樣品的大小為低于約50μl時，分析器或分析器系統(tǒng)能夠檢測從第一樣品到第二樣品的分析物的低于約20％的濃度改變。在某些實施方式中，當分析物以低于約5飛摩爾的濃度在樣品中存在時，且當各樣品的大小為低于約50μl時，分析器或分析器系統(tǒng)能夠檢測從第一樣品到第二樣品的分析物的低于約20％的濃度改變。在某些實施方式中，當分析物以低于約5飛摩爾的濃度在樣品中存在時，且當各樣品的大小為低于約5μl時，分析器或分析器系統(tǒng)能夠檢測從第一樣品到第二樣品的分析物的低于約20％的濃度改變。在某些實施方式中，當分析物以低于約1飛摩爾的濃度在樣品中存在時，且當各樣品的大小為低于約5μl時，分析器或分析器系統(tǒng)能夠檢測從第一樣品到第二樣品的分析物的低于約20％的濃度改變。
V.適于肌鈣蛋白的高靈敏分析的儀器和系統(tǒng) 本發(fā)明的方法利用高靈敏度的分析儀器，例如，單分子檢測器。這樣的單分子檢測器包括如下文描述的實施方式。
A.裝置/系統(tǒng) 一方面，本文所述的方法利用能夠檢測樣品中的單一微粒的分析器系統(tǒng)。在一個實施方式中，分析器系統(tǒng)能夠進行熒光標記微粒的單一微粒檢測，其中，當單一微粒存在于限定在與分析器系統(tǒng)的采樣系統(tǒng)流體連接的毛細流動池之內的探詢空間中時，分析器系統(tǒng)檢測激發(fā)的熒光標記物響應電磁輻射源的照射而發(fā)射的能量。在分析器系統(tǒng)的進一步的實施方式中，單一微粒利用動力移動通過毛細流動池的探詢空間。在分析器系統(tǒng)的另一實施方式中，分析器系統(tǒng)中可以包括自動采樣系統(tǒng)，用來將樣品引入分析器系統(tǒng)。在分析器系統(tǒng)的另一實施方式中，分析器系統(tǒng)中可以包括用于制備樣品的樣品制備系統(tǒng)。在進一步的實施方式中，分析器系統(tǒng)可以含有樣品回收系統(tǒng)，用來在分析完成后回收至少一部分樣品。
一方面，分析器系統(tǒng)包括用來激發(fā)用熒光標記物標記的單一微粒的電磁輻射源。在一個實施方式中，分析器系統(tǒng)的電磁輻射源是激光器。在進一步的實施方式中，電磁輻射源是連續(xù)波激光器。
在一個典型的實施方式中，電磁輻射源在標記物通過毛細流動池的探詢空間時激發(fā)連接在標記物上的熒光部分。在某些實施方式中，熒光標記部分包括一個或多個熒光染料分子。在某些實施方式中，熒光標記部分是量子點。本文所述的任何熒光部分可用于標記物中。
當標記物通過位于毛細流動池之內的探詢空間時，標記物暴露于電磁輻射中。探詢空間一般與采樣系統(tǒng)流體連接。在某些實施方式中，標記物通過毛細流動池的探詢空間，是因為動力使得標記物通過分析器系統(tǒng)。探詢空間的位置使其接受來自輻射源發(fā)射的電磁輻射。在某些實施方式中，采樣系統(tǒng)是自動采樣系統(tǒng)，能夠采集多個樣品而不需要操作員的干涉。
標記物通過探詢空間，且當被電磁輻射源激發(fā)時，發(fā)射可檢測量的能量。在一個實施方式中，電磁輻射檢測器可操作地與探詢空間連接。電磁輻射檢測器能夠檢測標記物(例如標記物的熒光部分)發(fā)射的能量。
在分析器系統(tǒng)的進一步的實施方式中，系統(tǒng)進一步包括樣品制備機構，其中，樣品可以部分地或完全地制備而用于分析器系統(tǒng)的分析。在分析器系統(tǒng)的某些實施方式中，在系統(tǒng)分析樣品后可以拋棄樣品。在其它實施方式中，分析器系統(tǒng)進一步包括樣品回收機構，其中，在分析之后，至少一部分、或可選擇地全部或基本上全部的樣品可以回收。在這樣的一個實施方式中，樣品可以返回到樣品的來源處。在某些實施方式中，樣品可以返回到樣品微量滴定板的微量滴定孔中。分析器系統(tǒng)一般進一步包括數據獲取系統(tǒng)，用來收集并報告檢測到的信號。
B.單一微粒分析器 如圖1A所示，這里所述的是分析器系統(tǒng)300的一個實施方式。分析器系統(tǒng)300包括電磁輻射源301、鏡子302、透鏡303、毛細流動池313、顯微鏡物鏡305、孔306、檢測器透鏡307、檢測器濾光器308、單一光子檢測器309和可操作地與檢測器連接的處理器310。
在運行中，調準電磁輻射源301使得它的輸出311可以在鏡子302的前表面312反射出去。透鏡303將光束311聚焦于毛細流動池313中的單一探詢空間(圖2A顯示探詢空間314的一個示例)。顯微鏡物鏡305收集來自樣品微粒的光，并在孔306上形成光線的圖像?？?06影響毛細流動池313的探詢空間中的樣本發(fā)射的光的可以收集的部分。檢測器透鏡307收集經過孔306的光，并將經過檢測器濾光器308之后的光聚焦于檢測器309的活性區(qū)。檢測器濾光器308在最大化激發(fā)的微粒結合熒光部分發(fā)射的信號的同時，將由于光散射或周圍光引起的異常的噪音信號最小化。處理器310根據本文所述的方法處理來自微粒的光信號。
在一個實施方式中，顯微鏡物鏡305是高數值孔徑顯微鏡物鏡。本文所用的“高數值孔徑透鏡”，包括具有等于或大于0.6的數值孔徑的透鏡。數值孔徑是物鏡捕獲的高度衍射成像光線的數值量度。較大的數值孔徑允許逐漸增加的斜射光線進入物鏡透鏡，從而產生更高分辨率的圖像。另外，圖像的亮度隨較大的數值孔徑而增加。高數值孔徑透鏡可從各種廠商購買，且任一種具有等于或大于大約0.6的數值孔徑的透鏡可以在分析器系統(tǒng)中使用。在某些實施方式中，透鏡具有約0.6-約1.3的數值孔徑。在某些實施方式中，透鏡具有約0.6-約1.0的數值孔徑。在某些實施方式中，透鏡具有約0.7-約1.2的數值孔徑。在某些實施方式中，透鏡具有約0.7-約1.0的數值孔徑。在某些實施方式中，透鏡具有約0.7-約0.9的數值孔徑。在某些實施方式中，透鏡具有約0.8-約1.3的數值孔徑。在某些實施方式中，透鏡具有約0.8-約1.2的數值孔徑。在某些實施方式中，透鏡具有約0.8-約1.0的數值孔徑。在某些實施方式中，透鏡具有至少約0.6的數值孔徑。在某些實施方式中，透鏡具有至少約0.7的數值孔徑。在某些實施方式中，透鏡具有至少約0.8的數值孔徑。在某些實施方式中，透鏡具有至少約0.9的數值孔徑。在某些實施方式中，透鏡具有至少約1.0的數值孔徑。在某些實施方式中，顯微鏡物鏡305的孔徑為大約1.25。在使用0.8的顯微鏡物鏡305的一個實施方式中，可以使用Nikon 60X/0.8 NAAchromat透鏡(Nikon，Inc.，USA)。
在某些實施方式中，電磁輻射源301是在可見光譜內發(fā)射光的激光器。在所有的實施方式中，設定電磁輻射源，使得激光器的波長設定為足以激發(fā)連接在微粒上的熒光標記物的波長。在某些實施方式中，激光器是具有639nm波長的連續(xù)波激光器。在其它實施方式中，激光器是具有532nm波長的連續(xù)波激光器。在其它實施方式中，激光器是具有422nm波長的連續(xù)波激光器。在其它實施方式中，激光器是具有405nm波長的連續(xù)波激光器?？梢允褂萌魏尉哂羞m于激發(fā)本發(fā)明的方法和組合物中使用的熒光部分的波長的連續(xù)波激光器而不背離本發(fā)明的范圍。
在單微粒分析器系統(tǒng)300中，隨著每一個微粒通過電磁輻射源的光束311，微粒進入激發(fā)態(tài)。當微粒從其激發(fā)態(tài)弛豫時，發(fā)射可檢測的光的脈沖。每一個微粒在其通過光束的時間長度中，重復多次激發(fā)-發(fā)射循環(huán)，從而使得分析器系統(tǒng)300在每個微粒通過探詢空間314時對每個顆粒檢測幾十到幾千個光子。熒光微粒發(fā)射的光子被具有時間延遲的檢測器309記錄(圖1A)，時間延遲表明微粒標記復合物通過探詢空間的時間。檢測器309記錄光子強度，且采樣時間分成箱元，箱元是具有可自由選擇的時間道寬的均勻、任意的時間段。確定在每一個箱元獲得的信號的數目。為了確定微粒出現的時間，采用幾種統(tǒng)計分析方法中的一種或其組合。這樣的方法包括確定分析器系統(tǒng)的基線噪音和在基線噪音之上設定統(tǒng)計水平的熒光標記物的信號強度以消除來自檢測器的假陽性信號。
將電磁輻射源301聚焦于分析器系統(tǒng)300的毛細流動池313上，其中，毛細流動池313與采樣系統(tǒng)流體連接。探詢空間314如圖2A所示。來自圖1A的連續(xù)波電磁輻射源301的光束311光學聚焦于毛細流動池313內的特定深度。光束311以垂直于毛細流動池313的角度指向填充樣品的毛細流動池313。光束311以選擇來激發(fā)標記目標微粒的特定熒光標記物的預定波長操作。光束311的直徑和光束311聚焦的深度一起確定了探詢空間314的大小或體積?；蛘撸梢酝ㄟ^在分析器系統(tǒng)中運行已知濃度的校準樣品確定探詢空間。
當在樣品濃度中檢測單分子時，設定單分子檢測所需的光束大小和聚焦的深度，從而限定探詢空間314的大小。設定探詢空間314使得在具有合適的樣品濃度時在進行觀察的每個時間間隔中只有一個微粒出現于探詢空間314中?？梢岳斫猓晒馐薅ǖ臋z測探詢體積不是完美的球形，一般是“領結(bow-tie)”形狀。但是，為了定義的目的，探詢空間的“體積”這里定義為直徑等于光束的聚焦點直徑的球形包圍的體積。在不背離本發(fā)明范圍的情況下，光束311的聚焦點可以具有各種直徑。在某些實施方式中，光束聚焦點的直徑是約1-約5、10、15或20微米，或約5-約10、15或20微米，或約10-約20微米，或約10-約15微米。在某些實施方式中，光束聚焦點的直徑是約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20微米。在某些實施方式中，光束聚焦點的直徑是約5微米。在某些實施方式中，光束聚焦點的直徑是約10微米。在某些實施方式中，光束聚焦點的直徑是約12微米。在某些實施方式中，光束聚焦點的直徑是約13微米。在某些實施方式中，光束聚焦點的直徑是約14微米。在某些實施方式中，光束聚焦點的直徑是約15微米。在某些實施方式中，光束聚焦點的直徑是約16微米。在某些實施方式中，光束聚焦點的直徑是約17微米。在某些實施方式中，光束聚焦點的直徑是約18微米。在某些實施方式中，光束聚焦點的直徑是約19微米。在某些實施方式中，光束聚焦點的直徑是約20微米。
在單一微粒分析器系統(tǒng)的可代替的實施方式中，可以使用多于一個的電磁輻射源來激發(fā)用不同波長的熒光標記物標記的微粒。在另一可代替的實施方式中，可以使用多于一個的毛細流動池中的探詢空間。在另一可代替的實施方式中，可采用多重檢測器來檢測來自熒光標記物的不同的發(fā)射波長。圖1B顯示合并分析器系統(tǒng)的這些可代替實施方式中的每一個的圖解。這些實施方式從以前的美國專利申請11/048 660號中引入本文作為參考。
在分析器系統(tǒng)300的某些實施方式中，需要動力以移動微粒通過分析器系統(tǒng)300的毛細流動池313。在一個實施方式中，動力可以是壓力的形式。用來移動微粒通過毛細流動池的壓力可由泵產生。在某些實施方式中，可以使用Scivex，Inc.HPLC泵。在使用泵作為動力的某些實施方式中，樣品可以1微升/分鐘-約20微升/分鐘，或約5微升/分鐘-約20微升/分鐘的速度通過毛細流動池。在某些實施方式中，樣品可以約5微升/分鐘的速度通過毛細流動池。在某些實施方式中，樣品可以約10微升/分鐘的速度通過毛細流動池。在某些實施方式中，樣品可以約15微升/分鐘的速度通過毛細流動池。在某些實施方式中，樣品可以約20微升/分鐘的速度通過毛細流動池。在某些實施方式中，可以使用電動力來移動微粒通過分析器系統(tǒng)。這類方法以前已經公開，從美國專利申請11/048 660號中引入本文作為參考。
在分析器系統(tǒng)300的一方面，分析器系統(tǒng)的檢測器309檢測熒光標記物發(fā)射的光子。在一個實施方式中，光子檢測器是光電二極管。在進一步的實施方式中，檢測器是雪崩光電二極管。在某些實施方式中，光電二極管是具有190nm和1100nm檢測波長的硅光電二極管。當使用鍺光電二極管時，檢測光的波長是400-1700nm。在其它實施方式中，當使用銦砷化鎵光電二極管時，光電二極管檢測的光的波長是800-2600nm。當使用硫化鉛光電二極管作為檢測器時，檢測的光的波長是1000-3500nm。
在某些實施方式中，按常規(guī)光學排列來安排電磁輻射源301的光學器件和檢測器309的光學器件。在這樣的安排中，電磁輻射源和檢測器定位在不同的焦平面。如圖1A和1B所示的分析器系統(tǒng)的激光器和檢測器光學器件的安排是常規(guī)的光學排列。
在某些實施方式中，按共焦光學排列來安排電磁輻射源的光學器件和檢測器的光學器件。在這樣的安排中，電磁輻射源301和檢測器309定位在相同的焦平面。共焦安排使得分析器更加耐用，因為如果移動分析器系統(tǒng)，電磁輻射源301和檢測器的光學器件309不需要重新調整。這種安排也使得分析器的使用更加簡化，因為它不需重新調整分析器系統(tǒng)的組件。分析器300(圖1A)和分析器355(圖1B)的共焦安排分別如圖3A和3B所示。圖3A顯示來自電磁輻射源301的光束311被顯微鏡物鏡315聚焦，以在毛細流動池313之內形成一個探詢空間314(圖2A)。分色鏡316，其反射激光而讓熒光通過，用來分離熒光和激光。位于檢測器之前的濾光器317消除了檢測器的任何非熒光光線。在某些實施方式中，以共焦排列配置的分析器系統(tǒng)可以包括兩個或多個探詢空間。以前已經公開了這種方法，從以前的美國專利申請?zhí)?1/048 660中引入本文引入作為參考。
激光器可以是可調染料激光器，如氦-氖激光器?？梢栽O置激光器以發(fā)射632.8nm的波長?；蛘?，可以設置激光器的波長來發(fā)射543.5nm或1523nm的波長。或者，電磁激光器可以是氬離子激光器。在這樣的實施方式中，可以操作氬離子激光器作為在可見光譜內的約25種不同的波長處的連續(xù)氣體激光器，波長設置為408.9-686.1nm，但其最佳操作性能設置為488-514.5nm。
1 電磁輻射源 在分析器系統(tǒng)的某些實施方式中，可以使用化學發(fā)光標記物。在這樣的實施方式中，不必利用EM源來檢測微粒。在另一實施方式中，外來的標記物或微粒的內在特征是光作用標記或特征，例如，熒光標記物或光散射標記物。在這樣的實施方式中，使用EM輻射源來照射標記物和/或微粒。優(yōu)選激發(fā)熒光標記物的EM輻射源。
在某些實施方式中，分析器系統(tǒng)包括電磁輻射源301。在不背離本發(fā)明的范圍的情況下，在任一種分析器系統(tǒng)300中可以使用任何數目的輻射源。以前已經公開了多重電磁輻射源，從以前的美國專利申請11/048660號中引入本文作為參考。在某些實施方式中，所有的連續(xù)波電磁(EM)輻射源在相同的波長處發(fā)射電磁輻射。在其它實施方式中，不同的源發(fā)射不同波長的EM輻射。
在一個實施方式中，EM源301、351、352是產生200-1000nm波長的連續(xù)波激光器。這樣的EM源優(yōu)點在于體積小、持久耐用且相對便宜。另外，它們一般具有比其它光源產生更大的熒光信號的能力。合適的連續(xù)波EM源的具體例子包括但不限于氬、氪、氦-氖、氦-鎘型激光器，以及可調二極管激光器(紅-紅外區(qū)域)，每個具有頻率加倍的可能性。激光器提供連續(xù)照射而不需如光柵的附屬的電子或機械裝置以干擾其照射。在使用連續(xù)波激光器的一個實施方式中，3mW的電磁輻射源可提供足夠的能量來激發(fā)熒光標記。來自具有這樣的能量輸出的連續(xù)波激光器的光束可以是直徑為2-5μm。為了達到3mW的照射，微粒暴露于激光束的時間可以是約1毫秒。在可替換的實施方式中，暴露于激光束的時間可以等于或小于約500微秒。在可替換的實施方式中，暴露時間可以等于或小于約100微秒。在可替換的實施方式中，暴露時間可以等于或小于約50微秒。在可替換的實施方式中，暴露時間可以等于或小于約10微秒。
LED是另一類低成本、高可靠性的照射源。在超高亮LED和具有高吸收截面、量子產額的染料方面的最新進展支持LED在單微粒檢測中的適用性。這樣的激光器可以單獨使用或聯合其它光源使用，如水銀弧光燈、元素弧光燈、鹵素燈、弧光放電、等離子體放電、發(fā)光二極管或這些的組合。
在其它實施方式中，EM源可以是脈沖波激光器的形式。在這樣的實施方式中，激光器的脈沖大小是一個重要的因素。在這樣的實施方式中，大小、聚焦點及激光器發(fā)射的總能量是重要的，且必須具有足夠的能量以能夠激發(fā)熒光標記。當使用脈沖激光器時，需要較長持續(xù)時間的脈沖。在某些實施方式中，可以使用2納秒的激光脈沖。在某些實施方式中，可以使用5納秒的激光脈沖。在某些實施方式中，可以使用2-5納秒的激光脈沖。
最佳激光強度取決于單染料的光漂白特征和穿過探詢空間所需的時間長度(包括微粒的速度，探詢空間之間的距離(如果使用多于一個探詢空間)和探詢空間的大小)。為了獲得最大信號，需要以不會導致高百分比的染料產生光漂白的最高強度照射樣品。優(yōu)選的強度是使得不超過5％的染料在微粒穿過探詢空間的時間內被漂白的強度。
根據需要激發(fā)的染料分子的類型、染料分子的激發(fā)時間和/或染料分子經過毛細流動池的速度，設置激光器的功率。激光器的功率定義為光束傳遞能量的速度，且以焦耳/秒或瓦特的單位測量?？梢岳斫?，為了在微粒經過探詢空間時向探詢空間提供恒定量的能量，激光器輸出功率越大，激光器照射微粒的時間就可以越短。因此，在某些實施方式中，激光器的功率和照射時間的組合使得探詢空間在照射時間內接收的總能量大于約0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100微焦耳。在某些實施方式中，激光器的功率和照射時間的組合使得探詢空間在照射時間內接收的總能量小于約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或110微焦耳。在某些實施方式中，激光器的功率和照射時間的組合使得探詢空間在照射時間內接收的總能量約0.1-100微焦耳。在某些實施方式中，激光器的功率和照射時間的組合使得探詢空間在照射時間內接收的總能量約1-100微焦耳。在某些實施方式中，激光器的功率和照射時間的組合使得探詢空間在照射時間內接收的總能量約1-50微焦耳。在某些實施方式中，激光器的功率和照射時間的組合使得探詢空間在照射時間內接收的總能量約2-50微焦耳。在某些實施方式中，激光器的功率和照射時間的組合使得探詢空間在照射時間內接收的總能量約3-60微焦耳。在某些實施方式中，激光器的功率和照射時間的組合使得探詢空間在照射時間內接收的總能量約3-50微焦耳。在某些實施方式中，激光器的功率和照射時間的組合使得探詢空間在照射時間內接收的總能量約3-40微焦耳。在某些實施方式中，激光器的功率和照射時間的組合使得探詢空間在照射時間內接收的總能量約3-30微焦耳。在某些實施方式中，激光器的功率和照射時間的組合使得探詢空間在照射時間內接收的總能量約1微焦耳。在某些實施方式中，激光器的功率和照射時間的組合使得探詢空間在照射時間內接收的總能量約3微焦耳。在某些實施方式中，激光器的功率和照射時間的組合使得探詢空間在照射時間內接收的總能量約5微焦耳。在某些實施方式中，激光器的功率和照射時間的組合使得探詢空間在照射時間內接收的總能量約10微焦耳。在某些實施方式中，激光器的功率和照射時間的組合使得探詢空間在照射時間內接收的總能量約15微焦耳。在某些實施方式中，激光器的功率和照射時間的組合使得探詢空間在照射時間內接收的總能量約20微焦耳。在某些實施方式中，激光器的功率和照射時間的組合使得探詢空間在照射時間內接收的總能量約30微焦耳。在某些實施方式中，激光器的功率和照射時間的組合使得探詢空間在照射時間內接收的總能量約40微焦耳。在某些實施方式中，激光器的功率和照射時間的組合使得探詢空間在照射時間內接收的總能量約50微焦耳。在某些實施方式中，激光器的功率和照射時間的組合使得探詢空間在照射時間內接收的總能量約60微焦耳。在某些實施方式中，激光器的功率和照射時間的組合使得探詢空間在照射時間內接收的總能量約70微焦耳。在某些實施方式中，激光器的功率和照射時間的組合使得探詢空間在照射時間內接收的總能量約80微焦耳。在某些實施方式中，激光器的功率和照射時間的組合使得探詢空間在照射時間內接收的總能量約90微焦耳。在某些實施方式中，激光器的功率和照射時間的組合使得探詢空間在照射時間內接收的總能量約100微焦耳。
在某些實施方式中，激光器的輸出功率設置為至少約1mW、2mW、3mW、4mW、5mW、6mw、7mW、8mW、9mW、10mW、13mW、15mW、20mW、25mW、30mW、40mW、50mW、60mW、70mW、80mW、90mW、100mW或大于100mW。在某些實施方式中，激光器的輸出功率設置為至少約1mW。在某些實施方式中，激光器的輸出功率設置為至少約3mW。在某些實施方式中，激光器的輸出功率設置為至少約5mW。在某些實施方式中，激光器的輸出功率設置為至少約10mW。在某些實施方式中，激光器的輸出功率設置為至少約20mW。在某些實施方式中，激光器的輸出功率設置為至少約30mW。在某些實施方式中，激光器的輸出功率設置為至少約40mW。在某些實施方式中，激光器的輸出功率設置為至少約50mW。在某些實施方式中，激光器的輸出功率設置為至少約60mW。在某些實施方式中，激光器的輸出功率設置為至少約90mW。
激光器照射探詢空間的時間可以設置為不低于約1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、150、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000微秒。激光器照射探詢空間的時間可以設置為不高于約2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、150、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1500或2000微秒。激光器照射探詢空間的時間可以設置為約1-1000微秒。激光器照射探詢空間的時間可以設置為約5-500微秒。激光器照射探詢空間的時間可以設置為約5-100微秒。激光器照射探詢空間的時間可以設置為約10-100微秒。激光器照射探詢空間的時間可以設置為約10-50微秒。激光器照射探詢空間的時間可以設置為約10-20微秒。激光器照射探詢空間的時間可以設置為約5-50微秒。激光器照射探詢空間的時間可以設置為約1-100微秒。在某些實施方式中，激光器照射探詢空間的時間可以設置為約1微秒。在某些實施方式中，激光器照射探詢空間的時間可以設置為約5微秒。在某些實施方式中，激光器照射探詢空間的時間可以設置為約10微秒。在某些實施方式中，激光器照射探詢空間的時間可以設置為約25微秒。在某些實施方式中，激光器照射探詢空間的時間可以設置為約50微秒。在某些實施方式中，激光器照射探詢空間的時間可以設置為約100微秒。在某些實施方式中，激光器照射探詢空間的時間可以設置為約250微秒。在某些實施方式中，激光器照射探詢空間的時間可以設置為約500微秒。在某些實施方式中，激光器照射探詢空間的時間可以設置為約1000微秒。
例如，在激光器提供3mW、4mW、5mW或超過5mW的功率輸出的情況下，激光器照射探詢空間的時間可以設置為1毫秒、250微秒、100微秒、50微秒、25微秒或10微秒。在某些實施方式中，用提供輸出功率為3mW的激光器照射標記物，且照射標記物約1000微秒。在其它實施方式中，用提供輸出功率為不高于約20mW的激光器照射標記物少于1000毫秒。在其它實施方式中，用提供輸出功率為20mW的激光器照射標記物少于或等于約250微秒。在某些實施方式中，用提供輸出功率為約5mW的激光器照射標記物少于或等于約1000微秒。
2.毛細流動池 毛細流動池流體連接樣品系統(tǒng)。在一個實施方式中，通過相應的光束311的橫截面積和檢測器309視野內光束之內的片段來確定分析器系統(tǒng)的探詢空間314。在分析器系統(tǒng)的實施方式中，探詢空間314具有的如這里定義的體積為約0.01-500pL、或約0.01-100pL、或約0.01-10pL、或約0.01-1pL、或約0.01-0.5pL、或約0.02-約300pL、或約0.02pL-約50pL、或約0.02pL-約5pL、或約0.02-約0.5pL、或約0.02-約2pL、或約0.05-約50pL、或約0.05-約5pL、或約0.05-約0.5pL、或約0.05pL-約0.2pL、或約0.1pL-約25pL。在某些實施方式中，探詢空間具有的體積為約0.01-10pL。在某些實施方式中，探詢空間314具有的體積為約0.01-1pL。在某些實施方式中，探詢空間314具有的體積為約0.02-約5pL。在某些實施方式中，探詢空間314具有的體積為約0.02-約0.5pL。在某些實施方式中，探詢空間314具有的體積為約0.05-約0.2pL。在某些實施方式中，探詢空間314具有的體積為約0.1pL。其它有用的探詢空間體積如本文所述。本領域的技術人員可以理解，可以為了分析器的最高性能選擇探詢空間314。盡管非常小的探詢空間顯示出最小化的背景噪音，但較大的探詢空間具有以下優(yōu)點能夠在合理的時間分析低濃度樣品。在使用兩個探詢空間370和371的實施方式中，可以使用如本文所述的那些單一探詢空間314的體積。
在本發(fā)明的一個實施方式中，探詢空間足夠大以能夠進行濃度范圍為約1000飛摩爾(fM)-約1仄摩爾(zM)的微粒的檢測。在本發(fā)明的一個實施方式中，探詢空間足夠大以能夠進行濃度范圍為約1000fM-約1阿托摩爾(aM)的微粒的檢測。在本發(fā)明的一個實施方式中，探詢空間足夠大以能夠進行濃度范圍為約10fM-約1阿托摩爾(aM)的微粒的檢測。在許多情況下，大的探詢空間使得能夠進行濃度為低于約1fM的微粒的檢測而不需要額外的預濃縮設備或技術。本領域的技術人員公認，最合適的探詢空間的大小取決于待檢測微粒的亮度、背景信號的水平和待分析樣品的濃度。
可以通過調整分析器的光學器件來限制探詢空間314的大小。在一個實施方式中，可以調整光束311的直徑以改變探詢空間314的體積。在另一實施方式中，檢測器309的視野可以改變。因此，可以調整源301和檢測器309使得在探詢空間314之內照射并檢測單一微粒。在另一實施方式中，決定檢測器309的視野的孔306(圖1A)的寬度可以改變。這種構造使得能夠接近實時地改變探詢空間，以補償或多或少地濃縮的樣品，確保兩個或多個微粒同時處于探詢空間之內的低概率?？梢詫蓚€或多個探詢空間370和371進行類似的改變。
在另一實施方式中，可以通過使用已知濃度的校準樣品限定探詢空間，校準樣品在檢測真實樣品之前經過毛細流動池。當樣品經過毛細流動池，每次在校準樣品中只檢測一個單一微粒時，聚焦的深度連同電磁輻射源的光束的直徑決定毛細流動池中的探詢空間的大小。
對探詢空間的物理約束也可以由固體壁來提供。在一個實施方式中，當樣品流體包含于毛細管內時，壁是流動池313的一個或多個壁(圖2A)。在一個實施方式中，流動池由玻璃制成，但在不背離本發(fā)明的范圍的情況下，可以使用其它的可透過約200-約1000nm或更高范圍內的光的物質，如石英、熔融石英及有機材料，如特氟綸、尼龍、塑料如聚氯乙烯、聚苯乙烯和聚乙烯，或其任意組合。盡管在不背離本發(fā)明的范圍的情況下，可以使用其它橫截面形狀(例如，矩形、圓柱形)，但在一個實施方式中，毛細流動池313具有正方形的橫截面。在另一實施方式中，可以至少部分地由在芯片(未示出)內蝕刻的通道(未示出)限定探詢空間。同樣的考慮應用于使用兩個探詢空間的實施方式中(370和371，在圖2B中)。
探詢空間浸浴在流體中。在一個實施方式中，流體是水性的。在其它實施方式中，流體是非水性的或水性和非水性流體的組合。另外，流體可以含有調節(jié)pH的試劑、離子成分或篩分劑(sieving agents)，例如可溶性大粒子或聚合物或膠體?？梢灶A期，在探詢空間之間可以存在閥或其它設備，以暫時性地中斷流體連接。暫時性地中斷的探詢空間被認為是通過流體連接的。
在本發(fā)明的另一實施方式中，探詢空間是存在于流動池313之內的單一的探詢空間，其被稀釋體積之內的樣品材料的層流(也稱為鞘流)的大小所限制。在這些和其它實施方式中，探詢空間可以由單獨的鞘流限定，也可以由鞘流和照射源尺寸或檢測器視野的組合來限定。鞘流可由許多方式形成，包括樣品材料是同中心層流的內部材料，稀釋體積在外部；稀釋體積是在樣品體積的一側；稀釋體積是在樣品材料的兩側；稀釋體積是在樣品材料的多個側面上，但沒有完全圍繞樣品材料；稀釋體積完全圍繞樣品材料；稀釋體積同心地完全圍繞樣品材料；樣品材料是不連續(xù)液滴系列中的內部材料，稀釋體積完全圍繞每一滴樣品材料。
在某些實施方式中，本發(fā)明的單分子檢測器包括不超過一個探詢空間。在某些實施方式中，使用多個探詢空間。多個探詢空間已經在以前公開，且從美國專利申請11/048 660號中引入本文作為參考。本領域的技術人員可以認識到，在一些情況下，分析器含有2、3、4、5、6或更多個獨立的探詢空間。
3.動力 在分析器系統(tǒng)的一個實施方式中，使用動力移動微粒穿過探詢空間。在某些實施方式中，移動微粒的動力是壓力。在某些實施方式中，由泵和空氣壓力源、真空源、離心機或其組合供應壓力。在某些實施方式中，移動微粒的動力是電動力。以前已經在在先申請中公開了作為動力的電動力的使用，從美國專利申請11/048 660號中引入本文作為參考。
在一個實施方式中，使用壓力作為動力移動微粒通過毛細流動池的探詢空間。在進一步的實施方式中，通過泵施加壓力來移動樣品。合適的泵是本領域內已知的。在一個實施方式中，使用那些由Scivax，Inc.為HPLC應用而制造的泵來作為動力。在其它實施方式中，當用泵抽取較小體積的樣品時，可以使用為微流體應用而制造的泵。在美國專利5 094594、5 730 187、6 033 628和6 533 553號中描述了這樣的泵，其公開了能夠用泵抽取納升或皮升范圍的體積的流體的設備。與樣品接觸的泵內的所有材料優(yōu)選地由高度惰性的材料制成，例如，聚醚醚酮(PEEK)、熔融石英或藍寶石。
有必要使用動力以移動樣品通過毛細流動池來推動樣品通過探詢空間從而進行分析。也需要動力以在樣品通過之后推動沖洗樣品通過毛細流動池。當進行樣品回收時，也需要動力以推動樣品返回樣品回收管。標準泵有各種大小，可以選擇合適的大小以適應預期的樣品大小和流動需求。在某些實施方式中，使用單獨的泵來進行樣品分析和系統(tǒng)的洗脫。分析泵可以具有大約0.000001-大約10mL、或大約0.001-大約1mL、或大約0.01-大約0.2mL、或大約0.005、0.01、0.05、0.1或0.5mL的容積。洗脫泵可以比分析泵具有更大的容積。洗脫泵可以具有約0.01-約20mL、或約0.1-約10mL、或約0.1-約2mL、或約0.05、0.1、0.5、1、5或10mL的體積。這些泵的大小僅是示例性的，本領域的技術人員可以理解，泵的大小可以根據應用、樣品的大小、用泵抽取的樣品的粘性、管的尺寸、流速、溫度及其它本領域內熟知的因素來選擇。在某些實施方式中，通過步進電機來驅動系統(tǒng)的泵，其易于通過微處理器非常精確地控制。
在優(yōu)選的實施方式中，串聯使用洗脫泵和分析泵，具有特定的止回閥以控制流動方向。管件設計為當分析泵抽取最大量的樣品時，樣品不會到達泵本身。這一點通過選擇分析泵和分析毛細管之間的管道的內徑和長度，使得管道的體積大于分析泵的行程排量來實現。
4.檢測器 在一個實施方式中，檢測在熒光標記暴露于電磁輻射后發(fā)射的光(例如，紫外、可見或紅外范圍的光)。檢測器309(圖1A)、或檢測器(364、365，圖1B)能夠捕捉來自熒光標記-部分復合物的光子脈沖的幅度和持續(xù)時間，并進一步將光子脈沖的幅度和持續(xù)時間轉化為電信號。使用諸如CCD照相機、視頻輸入模塊照相機及超高速掃描照相機的檢測設備來產生具有連續(xù)信號的圖像。在另一實施方式中，可以使用諸如測輻射熱儀、光電二極管、光電二極管陣列、雪崩光電二極管及光電倍增管的設備，其產生序列信號。也可以使用前述檢測器的任意組合。在一個實施方式中，使用雪崩光電二極管檢測光子。
在探詢空間314(圖2A)和其對應的檢測器309(圖1A)之間使用特定的光學器件，可以檢測電磁輻射發(fā)射的一些獨特特征，包括發(fā)射波長、發(fā)射強度、脈沖大小、脈沖持續(xù)時間和熒光偏振。在某些實施方式中，檢測器309是在反向偏壓中使用的光電二極管。反向偏壓中的光電二極管裝置通常具有極高的電阻。當合適頻率的光照射P/N結時，這種電阻減少。因此，通過追蹤通過它的電流，可以使用反向偏壓二極管作為檢測器?；谶@種效應的電路比基于零偏壓的電路對于光更靈敏。
在分析器系統(tǒng)的一個實施方式中，光電二極管可以是雪崩光電二極管，其比起常規(guī)的光電二極管，可以以更高的反向偏壓操作，因而允許各個光生載體被雪崩擊穿放大，在光電二極管內產生內部的增益，其增加了設備的有效的響應率(靈敏度)。光電二極管的選擇取決于熒光標記的微粒發(fā)射的能量或發(fā)射波長。在某些實施方式中，光電二極管是硅光電二極管，其檢測190-1100nm范圍的能量；在另一實施方式中，光電二極管是鍺光電二極管，其檢測800-1700nm范圍的能量；在另一實施方式中，光電二極管是銦砷化鎵光電二極管，其檢測800-2600nm范圍的能量；在其它的實施方式中，光電二極管是硫化鉛光電二極管，其檢測低于1000-3500nm范圍的能量。在某些實施方式中，雪崩光電二極管是單一光子檢測器，設計為檢測400-1100nm波長范圍的能量。單一光子檢測器可商購(例如，Perkin Elmer，Wellesley，MA)。
在某些實施方式中，檢測器是檢測300-1700nm的能量的雪崩光電二極管檢測器。在一個實施方式中，可以使用硅雪崩光電二極管檢測器來檢測300-1100nm的波長?？梢允褂勉熒榛壒怆姸O管檢測器來檢測900-1700nm的波長。在某些實施方式中，分析器系統(tǒng)可以包含至少一個檢測器；在其它實施方式中，分析器系統(tǒng)可以包含至少兩個檢測器，且每一個檢測器選擇和配置為檢測特定波長范圍的光能量。例如，可以使用兩個單獨的檢測器來檢測已經用不同的標記物標記的微粒，其一經EM源激發(fā)，就發(fā)射具有不同光譜的能量的光子。在一個實施方式中，分析器系統(tǒng)可以包括能夠檢測如綠色染料(例如，Alexa 546)發(fā)射的450-700nm范圍的熒光能量的第一檢測器，和能夠檢測如遠紅外染料(例如，Alexa 647)發(fā)射的620-780nm范圍的熒光能量的第二檢測器。也可以使用用來檢測如藍色染料(例如，Hoechst 33342)發(fā)射的400-600nm范圍的熒光能量和用來檢測如紅色染料(Alexa 546和Cy3)發(fā)射的560-700nm范圍的熒光能量的檢測器。
可以使用包括兩個或多個檢測器的系統(tǒng)來檢測用兩個或多個發(fā)射不同光譜的光的標記物標記的單獨的微粒。例如，兩個不同的檢測器能夠檢測已經用兩個不同的染料標記物標記的抗體。或者，可以使用包括兩個檢測器的分析器系統(tǒng)來檢測不同類型的微粒，每一類型用不同的染料分子或用兩個或多個染料分子的混合物標記。例如，兩個不同的檢測器可以用來檢測兩個不同類型的識別兩種不同的蛋白質的抗體，每一類型用不同的染料標記或用兩種或多種染料標記分子的混合物標記。通過改變兩種或多種染料標記分子的比例，使用兩個檢測器，可以單獨地檢測兩個或多個不同的微粒類型?？梢岳斫猓诓槐畴x本發(fā)明的范圍的情況下，可以使用三個或多個檢測器。
本領域的技術人員可以理解，對每一個探詢空間可以配置一個或多個檢測器，不論在流動池之內限定一個或多個探詢空間，且可以配置每一個檢測器來檢測以上所列的發(fā)射的電磁輻射的任一特征。例如用于多探詢空間的多檢測器的使用，已經在以前的在先申請中公開，且從美國專利申請11/048 660號引入本文作為參考。一旦微粒經標記而使其可檢測(或者如果微粒擁有使其可檢測的內在特征)，在不背離本發(fā)明的范圍的情況下，可以使用本領域內已知的任何合適的檢測機構，例如，CCD照相機、視頻輸入模塊照相機、超高速掃描照相機、測輻射熱儀、光電二極管、光電二極管陣列、雪崩光電二極管和產生序列信號的光電倍增管，及其組合?？梢詸z測電磁輻射的不同特征，包括發(fā)射波長、發(fā)射強度、脈沖大小、脈沖持續(xù)時間、熒光偏振及其任何組合。
C.采樣系統(tǒng) 在進一步的實施方式中，分析器系統(tǒng)可能包括準備引入分析器系統(tǒng)的樣品的采樣系統(tǒng)。包括的采樣系統(tǒng)能夠自動采集多個樣品，并在樣品容器和第一探詢空間之間提供流體連接。
在某些實施方式中，本發(fā)明的分析器系統(tǒng)包括將樣品的等分試樣引入單一微粒分析器進行分析的采樣系統(tǒng)。可以使用任何能夠引入樣品的機構。可以使用或者由泵產生的真空吸力，或者施加到樣品上的將液體推向管內的壓力，或者任何一種其它將樣品引入采樣管的機構來抽取樣品。一般地，但不是必需地，采樣系統(tǒng)將已知樣品體積的樣品引入單一微粒分析器；在檢測微粒是否存在的某些實施方式中，樣品大小的準確信息不是關鍵的。在優(yōu)選的實施方式中，采樣系統(tǒng)提供了單個或多個樣品的自動采集。在將已知體積的樣品引入系統(tǒng)的實施方式中，采樣系統(tǒng)提供了多于約0.0001、0.001、0.01、0.1、1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500、1000、1500或2000μl的用于分析的樣品。在某些實施方式中，采樣系統(tǒng)提供了低于約2000、1000、500、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、5、2、1、0.1、0.01或0.001μl的用于分析的樣品。在某些實施方式中，采樣系統(tǒng)提供了約0.01-1500μl、或約0.1-1000μl、或約1-500μl、或約1-100μl、或約1-50μl、或約1-20μl的用于分析的樣品。在某些實施方式中，采樣系統(tǒng)提供了約5-200μl、或約5-100μl、或約5-50μl的用于分析的樣品。在某些實施方式中，采樣系統(tǒng)提供了約10-200μl、或約10-100μl、或約10-50μl的用于分析的樣品。在某些實施方式中，采樣系統(tǒng)提供了約0.5-約50μl的用于分析的樣品。
在某些實施方式中，采樣系統(tǒng)提供了樣品之間可以改變的樣品大小。在這些實施方式中，樣品大小可以是本文所述的任一個樣品大小，并且如所期望的，可能隨著每種樣品或樣品組而改變。
對于即將進行的分析，需要樣品體積的準確度和采樣系統(tǒng)的樣品體積之間的精密度。在某些實施方式中，采樣體積的精密度由所用的泵決定，一般地由樣品體積的低于約50、40、30、20、10、5、4、3、2、1、0.5、0.1、0.05或0.01％的變異系數(CV)代表。在某些實施方式中，采樣系統(tǒng)的樣品之間的精密度由低于約50、40、30、20、10、5、4、3、2、1、0.5、0.1、0.05或0.01％的變異系數(CV)代表。在某些實施方式中，采樣系統(tǒng)的批內精密度由低于約10、5、1、0.5或0.1％的變異系數(CV)代表。在某些實施方式中，采樣系統(tǒng)的批內精密度顯示低于約5％的變異系數(CV)。在某些實施方式中，采樣系統(tǒng)的批間精密度由低于約10、5或1％的變異系數(CV)代表。在某些實施方式中，采樣系統(tǒng)的批間精密度顯示低于約5％的變異系數(CV)。
在某些實施方式中，采樣系統(tǒng)提供了低的樣品遺留率，優(yōu)點在于在樣品之間不需要另外的洗滌步驟。因此，在某些實施方式中，樣品遺留率低于約1、0.5、0.1、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01、0.005或0.001％。在某些實施方式中，樣品遺留率低于約0.02％。在某些實施方式中，樣品遺留率低于約0.01％。
在某些實施方式中，取樣器提供了進樣環(huán)路。在這些實施方式中，順序將多個樣品吸入管路，且每一個被緩沖“塞”與其它分開。一般地相繼地讀取樣品，之間不需要沖洗。在環(huán)路末端沖洗一次。在使用緩沖“塞”的實施方式中，將緩沖塞噴射進入微量滴定板的單獨的孔中可以回收塞子。
采樣系統(tǒng)可以適用于標準分析裝置，例如，96孔微量滴定板，或優(yōu)選384孔板。在某些實施方式中，系統(tǒng)包括96孔板的定位器和用來將樣品管浸到孔內和孔外的機械裝置，例如，提供沿X、Y和Z軸移動的機械裝置。在某些實施方式中，采樣系統(tǒng)提供了多個采樣管，當開始測試時，樣品可以儲藏在其中并從其中抽取。在某些實施方式中，用一個檢測器分析所有的來自多個管的樣品。在其它實施方式中，多個單一分子檢測器可以連接到樣品管上?？梢酝ㄟ^包括在使用采樣系統(tǒng)采樣之前在板孔內對樣品進行操作的步驟制備樣品，或在分析器系統(tǒng)內制備樣品，或兩者的一些組合。
D.樣品制備系統(tǒng) 樣品制備包括制備用于分析的原始樣品的必需的步驟。這些步驟可能包括，例如，一種或多種以下步驟如離心、過濾、蒸餾、層析的分離步驟，濃縮、細胞裂解、改變pH、加入緩沖液、加入稀釋劑、加入試劑、加熱或冷卻、加入標記物、結合標記物、通過照射交聯、分離未結合的標記物、滅活和/或除去干擾化合物，及任何其它制備用于通過單一微粒分析器分析的樣品的必需步驟。在某些實施方式中，處理血液以分離血漿或血清。也可以對血清或血漿樣品進行另外的標記、去除未結合的標記物和/或稀釋步驟。
在某些實施方式中，分析器系統(tǒng)包括樣品制備系統(tǒng)，該樣品制備系統(tǒng)進行提供單粒子分析器分析用樣品所需的某些或全部步驟。這一系統(tǒng)可以進行任一或全部以上所列的樣品制備的步驟。在某些實施方式中，通過分析器系統(tǒng)的樣品制備系統(tǒng)部分地處理樣品。因此，在某些實施方式中，可以首先在分析器系統(tǒng)之外部分地處理樣品。例如，可以首先離心處理樣品。然后，可以通過樣品制備系統(tǒng)在分析器之內部分地處理樣品。在分析器之內處理樣品包括標記樣品、將樣品和緩沖液混合及其它本領域的技術人員已知的處理步驟。在某些實施方式中，在分析器系統(tǒng)以外處理血液樣品以提供血清或血漿樣品，血清或血漿樣品被引入分析器系統(tǒng)，并被樣品制備系統(tǒng)進一步處理以對一種或多種目標微粒標記并任選地除去未結合的標記物。在其它實施方式中，樣品的制備可以包括樣品的免疫耗盡法，以除去非目標微?；虺ジ蓴_樣品分析的微粒。在再另外的實施方式中，可以除去樣品中的干擾樣品分析的微粒。例如，樣品制備可以包括耗盡異嗜性抗體，已知其干擾使用非人類抗體直接地或間接地檢測目標微粒的免疫分析。類似地，可以使用識別干擾蛋白質的抗體從樣品中除去干擾目標微粒的測量的其它蛋白質。
在某些實施方式中，樣品在分析之前可以進行固相萃取，然后再進行分析。例如，分析cAMP的血清樣品可以首先使用與其結合的c18柱進行固相萃取。其它的如蛋白酶、脂肪酶和磷酸酶的蛋白質從c18柱洗下，且cAMP可以洗脫而基本上不含能夠降解cAMP或干擾cAMP測定的蛋白質。固相萃取可以用來除去降低分析靈敏度的樣品的基質。在再另外的實施方式中，樣品中存在的目標微?？梢酝ㄟ^干燥或凍干樣品并將微粒溶于比初始樣品更小的體積來濃縮。例如，呼出氣冷凝液(EBC)樣品可以干燥并再懸浮于小體積的合適的緩沖溶液中，以增強目標微粒的檢測。
在某些實施方式中，分析器系統(tǒng)提供了在系統(tǒng)中對待分析的樣品進行完全制備的樣品制備系統(tǒng)，例如，對血液樣品、唾液樣品、尿液樣品、腦脊髓液樣品、淋巴樣品、BAL樣品、呼出氣冷凝液(EBC)樣品、活組織檢查樣品、法醫(yī)樣品、生物恐怖襲擊樣品等的完全制備。在某些實施方式中，分析器系統(tǒng)提供進行某些或全部的樣品制備的樣品制備系統(tǒng)。在某些實施方式中，初始樣品是需要分析器系統(tǒng)進一步處理的血液樣品。在某些實施方式中，初始樣品是需要分析器系統(tǒng)進一步處理的血清或血漿樣品。血清或血漿樣品可以通過例如與結合一種或多種目標微粒的標記物接觸的方式進一步處理，然后在除去或未除去未結合的標記物的情況下使用樣品。
在某些實施方式中，或者在分析系統(tǒng)之外，或者在分析系統(tǒng)的樣品制備組件中，在一種或多種微量滴定板如96孔板上進行樣品制備。試劑儲庫、緩沖液，等等，可以與板孔通過本領域內熟知的管件或其它合適的結構間斷地流體連接?？梢栽?6孔板或管件中單獨地制備樣品。樣品分離、結合標記物和(如果需要的話)分離標記物的步驟可以在一個板上進行。在某些實施方式中，制備的微粒然后從板中釋放，并將樣品移入管中采樣到樣品分析系統(tǒng)內。在某些實施方式中，樣品制備的所有步驟在一個板上進行，且分析系統(tǒng)直接從板上獲得樣品。盡管描述了關于96孔板的實施方式，但是可以理解，可以使用任何一個用于容納一種或多種樣品和適于制備樣品的容器。例如，可以使用384或1536孔的標準微量滴定板。更一般地，在某些實施方式中，樣品制備系統(tǒng)能夠容納并制備多于約5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、500、1000、5000或10000個樣品。在某些實施方式中，可以采集多個樣品用于在多個分析器系統(tǒng)中分析。因此，在某些實施方式中，可以從樣品制備系統(tǒng)采集2個樣品、或多于約2、3、4、5、7、10、15、20、50或100個樣品，并在多個樣品分析器系統(tǒng)中平行運行。
微流體系統(tǒng)也可以用于樣品制備，且作為是分析器系統(tǒng)的一部分的樣品制備系統(tǒng)，尤其是用于懷疑含有足夠高的微粒濃度的樣品，因而檢測需要較小體積的樣品。微流體操作的原理和技術是本領域已知的。見美國專利4 979 824、5 770 029、5 755 942、5 746 901、5 681 751、5 658413、5 653 939、5 653 859、5 645 702、5 605 662、5 571 410、5 543 838、5 480 614、5 716 825、5 603 351、5 858 195、5 863 801、5 955 028、5 989402、6 041 515、6 071 478、6 355 420、6 495 104、6 386 219、6 606 609、6 802 342、6 749 734、6 623 613、6 554 744、6 361 671、6 143 152、6 132580、5 274 240、6 689 323、6 783 992、6 537 437、6 599 436、6 811 668號和PCT專利申請公開WO9955461(A1)號?？梢赃B續(xù)或平行制備樣品用于單一或多個分析器系統(tǒng)。
優(yōu)選地，樣品包括緩沖液。緩沖液可以在分析器系統(tǒng)外與樣品混合，或它可以由樣品制備機構提供。盡管能夠使用任何合適的緩沖液，但優(yōu)選的緩沖液具有低的熒光背景、對于可檢測標記過的微粒為惰性、能夠維持工作pH、且在動力是電力的實施方式中具有適于電泳的離子強度。緩沖液濃度可以是任何合適的濃度，如約1-約200mM的范圍?？梢允褂萌魏尉彌_液系統(tǒng)，只要它提供了目標分子的溶解性、功能及可檢測性(delectability)。優(yōu)選地，對于使用泵的應用，緩沖液選自磷酸鹽、甘氨酸、醋酸鹽、檸檬酸鹽、酸化(acidulate)、碳酸鹽/碳酸氫鹽、咪唑、三乙醇胺、甘氨酰胺、硼酸鹽、MES、Bis-Tris、ADA、aces、PIPES、MOPSO、Bis-Tris丙烷、BES、MOPS、TES、HEPES、DIPSO、MOBS、TAPSO、氨基丁三醇(Trizma)、HEPPSO、POPSO、TEA、EPPS、三(羥甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、Gly-Gly、N-二(羥乙基)甘氨酸(Bicine)、HEPBS、TAPS、AMPD、TABS、AMPSO、CHES、CAPSO、AMP、CAPS和CABS。緩沖液也可以選自Gly-Gly、N-二(羥乙基)甘氨酸、三(羥甲基)甲基甘氨酸、2-嗎啉代乙磺酸(MES)、4-嗎啉代丙磺酸(MOPS)和2-氨基-2-甲基-1-丙醇鹽酸鹽(AMP)緩沖液。有用的緩沖液是pH8.1的2mM Tris/硼酸鹽，但Tris/甘氨酸和Tris/HCl也是可接受的。其它緩沖液如本文所述。
用于電泳的緩沖液在在先申請中公開，從美國專利申請11/048660號引入本文作為參考。
E.樣品回收 本發(fā)明的分析器和分析系統(tǒng)的實施方式的一個非常有用的特征是，不需要消耗樣品即可分析。這在樣品材料有限時尤其重要?；厥諛悠芬彩谷藗兡軌驅ζ溥M行另外的分析或再分析。對于樣品量有限和/或期望能夠再分析樣品的應用，例如法醫(yī)、藥物篩選和臨床診斷應用，這一特征的優(yōu)點對于本領域技術人員來說是顯而易見的。
因此，在某些實施方式中，本發(fā)明的分析器系統(tǒng)進一步提供了在分析后用于樣品回收的樣品回收系統(tǒng)。在這些實施方式中，該系統(tǒng)包括將樣品吸入分析器內、分析然后返回(例如通過同一路徑)樣品容器(例如樣品管)的機構和方法。因為樣品沒有破壞，且樣品不會進入任何一個閥或其它管件，樣品未被污染。另外，因為樣品通路中的所有的材料是非常惰性的，例如，PEEK、熔融石英、或藍寶石，所以極少有來自樣品通路的污染。步進電機控制的泵(尤其是分析泵)的使用允許精密控制抽取和推回的體積。這使得能夠完全地或幾乎完全地回收樣品，而很少(即便有)被沖洗緩沖液稀釋。因此，在某些實施方式中，在分析之后，回收多于約50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％的樣品。在某些實施方式中，回收的樣品未稀釋。在某些實施方式中，回收的樣品被稀釋低于約1.5倍、1.4倍、1.3倍、1.2倍、1.1倍、1.05倍、1.01倍、1.005倍、或1.001倍。
對于采樣和/或樣品回收，可以使用任何將液體樣品從樣品管轉移到分析器的機構。在某些實施方式中，分析毛細管的進口末端連接有一段短的管件(例如，PEEK管件)，能夠浸入樣品容器(如測試管或樣品孔)或能夠保持在廢液容器以上。當通過沖洗來清洗裝置中原有的樣品時，該管位于廢物容器之上，吸取沖洗廢液。當吸取樣品時，該管放進樣品孔或測試管中。一般地，快速吸入樣品，然后當觀察樣品中的微粒時緩慢推出?；蛘?，在某些實施方式中，在至少部分吸入循環(huán)中，緩慢吸入樣品；可以在緩慢吸取的同時分析樣品。然后樣品快速返回和快速沖洗。在某些實施方式中，可以在內向循環(huán)(吸入)和外向循環(huán)(抽出)中分析樣品，其改善了例如小稀釋樣品的計數統(tǒng)計學，并確認結果，等等。如果需要保留樣品，可以將樣品推回到其來自的同樣的樣品孔，或另一個孔。如果不需要保留樣品，將管件安置于廢液容器之上。
VI.使用心肌肌鈣蛋白的高靈敏分析的方法 本發(fā)明的方法使得遠低于以前測量的濃度的心肌肌鈣蛋白水平的測量成為可能。盡管心肌肌鈣蛋白是公認的心肌損傷標志物，但其實用性受以下事實限制使用當前的分析方法，只有在心肌損傷已經相當大時才能檢測到心肌肌鈣蛋白，因為當前方法缺乏靈敏度。對于心肌梗塞重新定義的聯合歐洲心臟病協(xié)會/美國心臟病學院委員會推薦，心肌肌鈣蛋白濃度升高應被定義為超過參照組中心肌肌鈣蛋白濃度分布的第99百分位數的測量值，一個非常低的閾。推薦在該確定極限下<10％的總變異系數(CV)。但是，主要在低濃度范圍，對于心肌肌鈣蛋白的目前可用的免疫分析獲得的分析變異系數不是均勻的。另外，對于檢測非臨床(正常)受試者的肌鈣蛋白水平，目前可用的分析缺乏足夠的靈敏度，而且正常人群的肌鈣蛋白的真實基線或水平并未定義。本發(fā)明的檢測器系統(tǒng)顯示出能夠一貫地以低于10％的總變異系數、在低于10pg/ml的濃度下檢測cTnI的水平(見實施例)。因此，本發(fā)明提供了基于個體心肌肌鈣蛋白的高靈敏度檢測確定診斷、預后或治療方法的方法。
在某些實施方式中，本發(fā)明提供了確定個體的診斷、預后或治療方法的方法，包括i)測定樣品中的心肌肌鈣蛋白濃度，或測定個體的系列樣品中的心肌肌鈣蛋白濃度，其中，通過對所述樣品中的心肌肌鈣蛋白的檢測限低于約50、40、30、10、5、4、3、2或1pg/ml(例如，低于約20pg/ml)的心肌肌鈣蛋白分析確定濃度；和ii)根據樣品的濃度或系列樣品的濃度，確定所述的個體的診斷、預后或治療方法。測定心肌肌鈣蛋白濃度的方法包括任何具有必要靈敏度的合適的方法，例如，本文所述的方法。在某些實施方式中，本方法利用測定樣品中心肌肌鈣蛋白濃度的方法，其中，該方法包括檢測肌鈣蛋白的單一分子或其復合物或片段。
在某些實施方式中，通過分析來自明顯健康的人群的樣品，例如，血液、血清或血漿樣品中的心肌肌鈣蛋白，例如心肌肌鈣蛋白I，并確定高于80、90、95、96、97、98、99、99.5或99.9％的人群的水平的水平(濃度)，從而確定肌鈣蛋白的閾濃度。該值是閾值。在某些實施方式中，設定閾值為第99百分位數值。在某些實施方式中，使用對心肌肌鈣蛋白的檢測水平低于約50、20、10、5或1pg/ml(例如，低于約5pg/ml)的方法進行分析。
在某些實施方式中，本發(fā)明提供了確定個體的診斷、預后或治療方法的方法，包括比較來自個體的樣品的心肌肌鈣蛋白的濃度值與心肌肌鈣蛋白的正常值或正常值的范圍，其中，通過對所述樣品中心肌肌鈣蛋白的檢測限低于約50、40、30、10、5、4、3、2或1pg/ml(例如，低于約20pg/ml)的心肌肌鈣蛋白分析確定正常值或正常值的范圍；和ii)根據比較，確定所述個體的診斷、預后或治療方法。
在某些實施方式中，心肌肌鈣蛋白是心肌肌鈣蛋白I或心肌肌鈣蛋白T。在某些實施方式中，心肌肌鈣蛋白是心肌肌鈣蛋白T。在某些實施方式中，心肌肌鈣蛋白是心肌肌鈣蛋白I。本方法可以在確定診斷、預后或治療方法中使用本文所述的總肌鈣蛋白，例如，總的cTnI、或cTnT、或總的cTnI+cTnT。在某些實施方式中，本方法可以使用游離的心肌肌鈣蛋白、復合的心肌肌鈣蛋白、或心肌肌鈣蛋白片段的濃度，或它們的比較(例如，比例)，以確定診斷、預后或治療方法。
A.樣品 樣品或系列樣品可以是任何合適的樣品；在某些實施方式中，樣品是血液、血清或血漿。在某些實施方式中，樣品或系列樣品是血清樣品。個體可以是動物，例如，哺乳動物，例如，人類。
可以采集單一樣品或系列樣品。如果采集系列樣品，可以以任何合適的間隔來采集，例如，幾分鐘、幾小時、幾天、幾周、幾個月、或幾年的間隔。在急性臨床情況中，一般地，在數小時和數天的時間過程中采集系列樣品，樣品間隔大約數小時。當對個體進行更長時期的處理時，樣品間隔可以是幾個月或幾年。可以從單一樣品，或系列樣品中的一個或多個，或系列樣品的改變來確定診斷、預后或治療方法，例如，濃度以一定速度增加可能表明嚴重的狀況，反之，以較慢的速度增加或沒有增加可能表明相對良性或較不嚴重的狀況。改變的速度可以在幾小時、幾天、幾周、幾個月、或幾年的過程中測量。在一些情況下，指定的個體的改變速度比絕對值更有意義。在急性情況中，例如“尖峰”的極其快的改變速度表明危急的、進行中的或新近的心臟事件。在其它情況中，個體的值在幾天、幾周、幾個月或幾年的時間中提高可能表明心肌損傷正在進行和惡化，例如，由于心臟狀態(tài)(例如，心臟肥大或充血性心力衰竭)引起的心肌損傷，或由于非心臟狀態(tài)(例如，藥物接觸引起的毒性)引起的心肌損傷。
在某些實施方式中，在心臟應力試驗過程中或之后，至少采集一個樣品。例如，可以在心臟應力試驗之前采集一個樣品，并在心臟應力試驗過程中采集一個或多個樣品。在試驗前或試驗過程中采集的樣品的肌鈣蛋白水平之間的偏差能夠提供診斷或預后的信息，例如，表明存在冠心病或其它與心肌相關的病理學的可能性。也可以進行其它的比較，例如，任一個樣品與正常水平或閾水平的比較，或樣品中的心肌肌鈣蛋白濃度的改變速度的確定，所有這些可以產生關于心臟與心血管健康，以及本文所述的其它狀況的有用信息。
在某些實施方式中，在個體向醫(yī)療專業(yè)人員呈現一種或多種表明可能涉及心肌損傷的狀態(tài)的癥狀時或在接近該時間的時刻，至少采集一個樣品。個體呈現給醫(yī)療專業(yè)人員的情況包括，但不限于流動診所、緊急護理、病危護理、重癥監(jiān)護、監(jiān)護系統(tǒng)、住院病人、門診病人、醫(yī)務所、醫(yī)療診所、包括救護車的急癥反應情況和健康普查情況。在某些實施方式中，從個體采集一個或多個樣品，并就地分析心肌肌鈣蛋白，即，在樣品采集處或其附近分析心肌肌鈣蛋白。例如，可以對出現在醫(yī)院的個體采集一個或多個樣品，并在醫(yī)院內分析心肌肌鈣蛋白。例如，可以對出現在醫(yī)院的個體采集一個或多個樣品，并在醫(yī)院內分析心肌肌鈣蛋白。在某些實施方式中，從個體采集一個或多個樣品，并在CLIA實驗室分析心肌肌鈣蛋白。在某些實施方式中，所述個體顯示一種或多種符合急性冠狀動脈綜合征的癥狀。在某些實施方式中，所述個體顯示一種或多種符合AMI的癥狀。這類癥狀包括但不限于胸痛、胸悶、臂痛、不正常的EKG、不正常的酶水平和呼吸短促。
B.診斷、預后或治療方法的確定 在某些實施方式中，步驟ii)包括比較所述濃度或系列濃度與所述濃度的正常值，比較所述濃度或系列濃度與預設的閾水平，比較所述濃度或系列濃度與基線值，或對于所述系列濃度確定濃度改變的速度。
在某些實施方式中，步驟ii)包括比較所述樣品中的所述肌鈣蛋白的濃度與預設的閾濃度，并且如果樣品濃度大于閾水平，則確定診斷、預后或治療方法。例如，可以通過確定一組個體中肌鈣蛋白的第99百分位數濃度，并設定所述閾濃度在所述第99百分位數肌鈣蛋白濃度來確定閾濃度。實施例部分給出了這樣的一個示例。
可以通過本領域內熟知的方法建立正常值、閾值、改變的速度、值的比例及其它有用的診斷和預后指標。例如，可以通過比較病例群體與對照群體的樣品來確定這些值，其中，病例群體顯示需要診斷、預后或治療方法的生物學狀態(tài)，而對照群體則不顯示這樣的生物學狀態(tài)。在某些實施方式中，可以進行縱向調查，例如，病例群體可以是隨著時間的過去顯示生物學狀態(tài)的對照群體的一部分。可以理解，可以使用來自多個調查的數據來確定正常、預后或診斷水平公認值或值的范圍。
在發(fā)展診斷或預后測試中，可以從受試者組獲得一種或多種潛在標志物的數據。受試者組至少分為兩小組，且優(yōu)選第一小組和第二小組的每一組具有大致相等數目的受試者。第一小組包括證實患有疾病，或更一般地，處于第一情況狀態(tài)的受試者。例如，第一小組的病人可以是那些最近已經發(fā)病的受試者，或可以是那些已經具有一類特定的疾病如AMI的受試者。通過更嚴格的和/或昂貴的測試如MRI或CT，可以證實情況狀態(tài)。在下文中，第一小組的受試者稱為“患病者”。第二小組的受試者只是那些沒有進入第一小組的受試者。第二組的受試者可以是“未患病者”，即，正常受試者。或者，第二小組的受試者可以選自顯示一種癥狀或類似于“患病的”受試者的多種癥狀。在另一種可選擇的方式中，第二小組可以代表那些在不同的時間點發(fā)病的受試者。優(yōu)選地，可以獲得每一個病人的同一組標志物的數據。這一組標志物可以包括可能懷疑與特定的疾病或狀態(tài)的檢測相關的所有候選標志物。不需要實際已知的相關性。本文所述的組合物、方法和系統(tǒng)的實施方式可用來確定哪些候選標志物與疾病或狀態(tài)的診斷最相關。兩小組受試者中各標志物的水平可以在寬范圍內分布，例如，高斯分布。但是，不需要分布擬合。
1.急性心肌梗塞 本發(fā)明的方法對于懷疑患有急性心肌梗塞(AMI)的病人的診斷、預后和/或治療的選擇尤其有用。對于懷疑患有急性心肌梗塞(AMI)的病人，單一或系列心肌肌鈣蛋白的測量提供了改善預后并表明合適的和早期的治療介入的逐漸增加的預后信息，以最小化不良后果的風險。
因此，本發(fā)明通過對來自個體的樣品(例如，血液樣品、血漿樣品和/或血清樣品)分析例如cTnI的心肌肌鈣蛋白，并以低于約50、40、30、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1pg/ml(例如，低于約20pg/ml)的檢測限檢測樣品中的心肌肌鈣蛋白濃度，來提供診斷、預測和/或預防或治療個體的AMI的方法，其中，樣品中的心肌肌鈣蛋白濃度表明或預測AMI。心肌肌鈣蛋白可以是cTnI或cTnT，且可以是總肌鈣蛋白或特定形式的測量，例如，游離的、復合的或片段；在某些實施方式中，使用如本文所述的一種或多種形式的肌鈣蛋白的比例。在某些實施方式中，測量樣品或系列樣品中的總cTnI。在某些實施方式中，測量樣品或系列樣品中的總cTnT。在某些實施方式中，測量樣品或系列樣品中的總cTnI+cTnT。在某些實施方式中，在個體向醫(yī)療專業(yè)人員呈現表明AMI的癥狀時或在接近該時間的時刻測定心肌肌鈣蛋白的水平。這樣的癥狀包括但不限于胸痛、胸悶、臂痛、不正常的EKG、不正常的酶水平和呼吸短促。
在某些實施方式中，進行系列測量，并且樣品中的心肌肌鈣蛋白濃度的尖峰信號表明、預測或提供了AMI預后的基礎。在某些實施方式中，超過基線50％、100％、150％、200％、250％、300％、400％、500％的尖峰信號表明、預測或提供了AMI預后的基礎。在某些實施方式中，如果獲得單一樣品的心肌肌鈣蛋白水平，不管基線水平如何，單一樣品中的超過約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50pg/ml的心肌肌鈣蛋白水平表明、預測或提供了AMI預后的基礎。在某些實施方式中，約1-10、或約5-15、或約10-50、或約10-200、或約10-100、或約10-40、或約15-50、或約15-40、或約20-200、或約20-150、或約20-100、或約20-50、或約20-40、或約20-30pg/ml的心肌肌鈣蛋白水平表明、預測或提供了AMI預后的基礎。
在某些實施方式中，診斷或預后包括根據樣品或系列樣品中的心肌肌鈣蛋白濃度對個體分級。這樣的分級可以基于單個樣品中的心肌肌鈣蛋白的濃度、系列樣品中的尖峰信號的存在和/或尖峰信號距基線的大小、不同形式的心肌肌鈣蛋白的比例、不同形式的心肌肌鈣蛋白的絕對值、系列樣品中心肌肌鈣蛋白或一種或多種形式的心肌肌鈣蛋白的濃度改變速度、系列樣品中不同形式的心肌肌鈣蛋白的比例隨時間的改變、和至少部分基于樣品或系列樣品中的心肌肌鈣蛋白濃度的任何其它信息。如本文所述，分級可以基于由正常和患病受試者的群體獲得的值。也可以基于個體的分級確定合適的治療。
在某些實施方式中，結合一種或多種其它標志物，例如，心肌缺血、心肌梗塞的標志物，或中風的標志物，確定心肌肌鈣蛋白的濃度，且在確定診斷、預后或治療方法時考慮各標志物的濃度。一般地也考慮其它臨床指標，例如，EKG、癥狀、病史，等等，這對于本領域的技術人員是顯而易見的?？梢砸罁@樣的標志物與臨床指標與肌鈣蛋白的水平的結合構建診斷、預后或治療的合適的規(guī)則。
本發(fā)明方法中可用于與心肌肌鈣蛋白結合的標志物包括但不限于肌酸激酶(CK)及其心肌部分CK心肌帶(MB)、天冬氨酸氨基轉移酶、乳酸脫氫酶(LDH)、α-羥丁酸脫氫酶、肌紅蛋白、谷草轉氨酶、糖原磷酸化酶BB、未結合的游離脂肪酸、心型脂肪酸結合蛋白(H-FABP)、缺血修飾白蛋白、肌球蛋白輕鏈1、肌球蛋白輕鏈2。本發(fā)明的方法中用于與心肌肌鈣蛋白結合的炎癥和斑塊不穩(wěn)定性的標志物包括但不限于C反應性蛋白、白細胞計數、可溶性CD40配體、髓過氧化物酶、單核細胞趨化蛋白-1、全血膽堿和妊娠相關血漿蛋白A。其它炎癥標志物可被檢測，且包括IL-8、IL-1β、IL6、IL10、TNF和IL-12p70的組合，以及其它本領域技術人員明白的細胞因子或標志物。
在某些實施方式中，例如cTnI的心肌肌鈣蛋白在例如同一樣品中或在同時或相同時間點前后采自同一個體的多個樣品中與選自肌酸激酶(CK)及其心肌部分CK心肌帶(MB)、天冬氨酸氨基轉移酶、乳酸脫氫酶(LDH)、α-羥丁酸脫氫酶、肌紅蛋白、谷草轉氨酶、糖原磷酸化酶BB、未結合的游離脂肪酸、心型脂肪酸結合蛋白(H-FABP)、缺血修飾白蛋白、肌球蛋白輕鏈1和肌球蛋白輕鏈2的標志物一起測量。在某些實施方式中，例如cTnI的心肌肌鈣蛋白例如在同一樣品中或在同時或相同時間點前后采自同一個體的樣品中與CK-MB一起測量。
在某些實施方式中，如本文所述測量的心肌肌鈣蛋白單獨或與其它標志物或臨床征兆結合用來確定再梗塞。在某些實施方式中，如本文所述測量的心肌肌鈣蛋白單獨或與其它標志物或臨床征兆結合用來確定梗塞的特征，例如，大小、或出現梗塞以來的持續(xù)時間。在后一情況下，血液中由蛋白水解產生的肌鈣蛋白的片段可以與總肌鈣蛋白相比；片段的比例越大，出現梗塞以來的時間就越長。
2.AMI以外的狀態(tài) 本發(fā)明的方法也包括用于AMI以外的狀態(tài)的基于樣品中的肌鈣蛋白濃度的診斷、預后及治療方法。
許多狀態(tài)包括潛在的或實際的心肌損傷，因而在本文所述的各種水平測量心肌肌鈣蛋白的能力使得能夠進行這樣的損傷的早期檢測和早期介入。通過本發(fā)明的方法和組合物測量的心肌肌鈣蛋白的濃度的信息對于這樣的狀態(tài)的診斷、預后和治療的確定是有用的。狀態(tài)包括經皮的冠狀介入、心臟手術、心力衰竭、急性風濕熱、淀粉樣變性、心臟創(chuàng)傷(包括挫傷、切除、起搏、放電、心臟復律、導管插入和心臟手術)、再灌注損傷、癌癥治療引起的心臟毒性、充血性心力衰竭、末期腎衰竭、II型糖原貯積病(龐普病)、心臟移植、具有輸血性含鐵血黃素沉著癥的血紅蛋白病(haeomoglobinopathy)、高血壓(包括妊娠期高血壓)、低血壓(常伴有心律不齊)、甲狀腺功能減退、心肌炎、心包炎、術后非心臟手術、肺栓塞及敗血癥。
在這些實施方式中，可以測定肌鈣蛋白的水平，同時測定對于所述非心臟疾病特異性的標志物的水平或疾病的其它癥狀或臨床體征；標志物的濃度和/或關于其它癥狀或臨床體征的信息與本文所述測定的關于心肌肌鈣蛋白濃度的信息結合用來確定診斷、預后和/或治療方法。例如，本發(fā)明的實施方式除了測定心肌肌鈣蛋白的濃度外，還可以測定一種或多種上述的多肽的濃度，或在疾病的診斷、預后或區(qū)別中有用的其它蛋白質標志物。在某些實施方式中，提供了疾病的標志物組，其中，該組包括本文所述的心肌肌鈣蛋白的濃度和該疾病的至少一種其它標志物。該組可以包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多的個別標志物，包括一種或多種例如總cTnI的心肌肌鈣蛋白。可以由本領域的技術人員進行單一標志物或標志物的子集的分析，以優(yōu)化各種臨床情況下的臨床靈敏度或特異性。這些包括但不限于流動診所、緊急護理、病危護理、重癥監(jiān)護、監(jiān)護系統(tǒng)、住院病人、門診病人、醫(yī)務室、醫(yī)療診所、和健康普查情況。進一步，本領域的技術人員能夠在前述的各情況中使用單一標志物或標志物的子集結合診斷閾的調整，以優(yōu)化臨床靈敏度和特異性。
a.心臟毒性 本發(fā)明的組合物和方法在確定和監(jiān)測由治療產生的心臟毒性(例如，藥物治療的心臟毒性)方面尤其有用。因此，例如，本發(fā)明提供了通過測量個體的心肌肌鈣蛋白來評價心臟毒性的方法，包括i)測定樣品中的心肌肌鈣蛋白濃度，或測定來自個體的系列樣品中的心肌肌鈣蛋白濃度，其中，至少一個樣品在個體正接受治療時或治療之后從個體采集，其中，通過對所述樣品中的心肌肌鈣蛋白的檢測限低于約50、40、30、10、5、4、3、2或1pg/ml(例如，低于約20pg/ml)的心肌肌鈣蛋白分析測定一個或多個濃度；和ii)根據所述的一個或多個濃度，評價治療的心臟毒性的程度。在某些實施方式中，治療是藥物治療。在某些實施方式中，治療是非藥物治療。測定心肌肌鈣蛋白濃度的方法包括任何具有需要的靈敏度的合適的方法，例如，本文所述的方法。在某些實施方式中，本方法利用測定樣品中的心肌肌鈣蛋白濃度的方法，其中該方法包括檢測肌鈣蛋白的單一分子或其復合物或片段。
利用本文所述的交叉反應性抗體，即，與來自例如人類和另一種諸如大鼠、狗、小鼠或猴的物種的至少兩個物種的肌鈣蛋白作用的抗體，來確定心臟毒性的方法尤其有用。這樣的抗體可用于藥物毒性的動物研究，其中，評價毒性的個體是，例如哺乳動物，如大鼠、小鼠、狗、猴，或其它用于這樣的研究的動物。當用于分析中的抗體是同樣的抗體時，可以直接比較在各種物種中的毒性，從而減少變異性。
可以理解，本發(fā)明的組合物和方法可以結合副作用包括心臟毒性的特定的藥物一起使用，以監(jiān)測心臟毒性。因此，本發(fā)明提供了通過測定一個或多個從接受已知可引起心臟毒性的藥物的個體獲得的樣品中的心肌肌鈣蛋白的濃度，來監(jiān)測個體中的心臟毒性的方法，其中，通過對所述樣品中的心肌肌鈣蛋白的檢測限低于約50、40、30、10、5、4、3、2或1pg/ml(例如，低于約20pg/ml)的心肌肌鈣蛋白分析測定一個或多個濃度；和ii)根據所述的一個或多個濃度分析藥物治療的心臟毒性的程度。在某些實施方式中，該方法進一步包括步驟iii)根據步驟ii)的評價，確定是否繼續(xù)藥物治療。副作用包括心臟毒性的藥物是本領域內熟知的。
C.商業(yè)方法 本發(fā)明涉及用于建立心肌肌鈣蛋白標志物的系統(tǒng)和方法(包括商業(yè)方法)，其可用于生物體的生物學狀態(tài)或狀況的診斷、預后或處理方法的確定、基于這樣的標志物制備診斷劑和使診斷劑和利用這樣的診斷劑的服務商業(yè)化/市場化。生物學狀態(tài)可以是急性心肌梗塞或由于本文所述的藥物毒性或非AMI狀態(tài)引起的心肌損傷。
在一個實施方式中，本文的商業(yè)方法包括使用包括以下步驟的方法建立一種或多種心肌肌鈣蛋白標志物通過在低于約50、20、10、5或1pg/ml的檢測水平檢測一種或多種標志物的單一分子，測量從第一群體獲得的生物學樣品中的所述一種或多種標志物的濃度從而建立生物學樣品中的一種或多種標志物的濃度范圍；并將在上述步驟建立的一種或多種標志物商業(yè)化，例如制成診斷產品。本文的診斷產品包括一種或多種特異性結合心肌肌鈣蛋白標志物的抗體，和能夠在被以其激發(fā)波長發(fā)射光的激光器激發(fā)時發(fā)射至少約200個光子的熒光部分，其中激光聚焦于包含熒光部分的直徑不小于約5微米的點，而且其中激光指向該點的總能量不超過約3微焦耳。
在一個實施方式中，本文的商業(yè)方法包括使用一種系統(tǒng)建立心肌肌鈣蛋白標志物的正常值的范圍，該步驟包括通過在低于約50、20、10、5或1pg/ml的檢測水平下檢測標志物的單一分子測量從第一群體獲得的生物學樣品中的所述心肌肌鈣蛋白標志物的濃度，從而建立生物學樣品中的所述心肌肌鈣蛋白標志物的濃度范圍；并提供診斷服務以確定生物體是否具有感興趣的狀態(tài)或情況，例如，AMI、由于藥物治療引起的心臟毒性或非AMI狀態(tài)。本文的診斷服務可由經營者許可的CLIA批準的實驗室或經營者本身提供。本文的診斷服務可以直接提供給衛(wèi)生醫(yī)療提供者、衛(wèi)生醫(yī)療保險公司或病人。因此，本文的商業(yè)方法能夠從銷售例如診斷服務或診斷產品中獲得收益。
本文的商業(yè)方法也打算向例如衛(wèi)生醫(yī)療提供者、衛(wèi)生醫(yī)療保險公司或病人等等提供診斷服務。這里的經營者能夠通過或者與服務實驗室簽訂合約或者設置服務實驗室(遵守臨床實驗室改進修正法案(ClinicalLaboratory Improvement Amendments(CLIA))或其它規(guī)范)來提供診斷服務。然后這樣的服務實驗室執(zhí)行本文公開的方法以確認心肌肌鈣蛋白標志物是否存在于樣品內。
VII.組合物 本發(fā)明提供了用于檢測和定量心肌肌鈣蛋白的組合物。組合物包括可通過本發(fā)明的方法檢測的經合適的標記物標記的心肌肌鈣蛋白的結合伴體、其中一個或兩個結合伴體經可通過本發(fā)明的方法檢測的合適的標記物標記的結合伴體對、連接有捕獲結合伴體的固體載體，在某些實施方式中，也具有檢測結合伴體。
示例的實施方式包括用于檢測心肌肌鈣蛋白的組合物，其包括連接在熒光部分的心肌肌鈣蛋白的結合伴體，其中，熒光部分在被以其激發(fā)波長發(fā)射光的激光器激發(fā)時，能夠發(fā)射至少約200個光子，其中，激光聚焦于包含熒光部分的直徑不小于約5微米的點，而且其中，激光指向該點的總能量不超過約3微焦耳。在某些實施方式中，結合伴體包括心肌肌鈣蛋白的抗體。在某些實施方式中，該抗體是多克隆抗體。在某些實施方式中，該抗體是單克隆抗體。在某些實施方式中，抗體是交叉反應性抗體，例如，與來自包括人類、猴、狗和小鼠的至少兩個物種的心肌肌鈣蛋白交叉反應的抗體。在某些實施方式中，抗體與來自人類、猴、狗和小鼠的所有心肌肌鈣蛋白交叉反應。在某些實施方式中，心肌肌鈣蛋白選自cTnI和cTnT。在某些實施方式中，心肌肌鈣蛋白是cTnI。在某些實施方式中，心肌肌鈣蛋白是cTnT。抗體對于肌鈣蛋白分子的特定區(qū)域是特異性的，例如，對于包含心肌肌鈣蛋白I的氨基酸27-41的區(qū)域是特異性的。熒光部分可以包含一個或多個含有至少一個取代的吲哚環(huán)系統(tǒng)的分子，其中，在吲哚環(huán)3位碳上的取代基包含化學反應性的基團或偶聯物質基團。標記組合物可以包括熒光部分，熒光部分包括一個或多個選自AlexaFluor 488、532、647、700或750的染料分子。標記組合物可以包括熒光部分，熒光部分包括一個或多個選自AlexaFluor 488、532、700或750的染料分子。標記組合物可以包括熒光部分，熒光部分包括一個或多個AlexaFluor 488染料分子。標記組合物可以包括熒光部分，熒光部分包括一個或多個AlexaFluor 555染料分子。標記組合物可以包括熒光部分，熒光部分包括一個或多個AlexaFluor 610染料分子。標記組合物可以包括熒光部分，熒光部分包括一個或多個AlexaFluor 647染料分子。標記組合物可以包括熒光部分，熒光部分包括一個或多個AlexaFluor 680染料分子。標記組合物可以包括熒光部分，熒光部分包括一個或多個AlexaFluor 700染料分子。標記組合物可以包括熒光部分，熒光部分包括一個或多個AlexaFluor 750染料分子。
在某些實施方式中，本發(fā)明提供了包括用于測定心肌肌鈣蛋白濃度的一組標準物的組合物，其中，至少一個標準物的心肌肌鈣蛋白濃度低于約20、15、10、5、4、3、2或1pg/ml。在某些實施方式中，本發(fā)明提供了包括用于測定心肌肌鈣蛋白濃度的一組標準物的組合物，其中，至少一個標準物的心肌肌鈣蛋白濃度低于約20pg/ml。在某些實施方式中，本發(fā)明提供了包括用于測定心肌肌鈣蛋白濃度的一組標準物的組合物，其中，至少一個標準物的心肌肌鈣蛋白濃度低于約10pg/ml。在某些實施方式中，本發(fā)明提供了包括用于測定心肌肌鈣蛋白濃度的一組標準物的組合物，其中，至少一個標準物的心肌肌鈣蛋白濃度低于約5pg/ml。在某些實施方式中，本發(fā)明提供了包括用于測定心肌肌鈣蛋白濃度的一組標準物的組合物，其中，至少一個標準物的心肌肌鈣蛋白濃度低于約1pg/ml。
本發(fā)明的其它組合物如本文所述。
VIII.試劑盒 本發(fā)明進一步提供了試劑盒。本發(fā)明的試劑盒包括一種或多種在合適的包裝中用于本文所述的心肌肌鈣蛋白靈敏檢測的組合物。在某些實施方式中，本發(fā)明的試劑盒提供了標記物，例如，諸如心肌肌鈣蛋白特異性抗體的結合伴體，其中，結合伴體連接在熒光部分上。在某些實施方式中，本發(fā)明的試劑盒提供了心肌肌鈣蛋白特異性的結合伴體對，例如，抗體對，其中，至少一個結合伴體是本文所述的心肌肌鈣蛋白的標記物。在某些實施方式中，例如抗體的結合伴體以單獨容器提供。在某些實施方式中，例如抗體的結合伴體以同一容器提供。在某些實施方式中，一種結合伴體(例如抗體)固定在例如微量滴定板或順磁性珠的固體載體上。在某些這樣的實施方式中，另一結合伴體(例如抗體)用如本文所述的熒光部分標記。
例如抗體的結合伴體、固體載體和熒光標記作為試劑盒的組分可以是任何如本所述的這樣的組分。
試劑盒可以額外地包括在本發(fā)明的方法中有用的試劑，例如，用于結合反應的緩沖液和其它試劑、預處理運行分析的儀器的洗液、緩沖液或其它試劑和洗脫緩沖液或通過儀器運行樣品的其它試劑。
試劑盒可以包括一種或多種標準物，例如，用于本發(fā)明分析的標準物(如高度純化的標準物)，例如，重組的人類cTnI或人類cTnT、或它的各種片段、復合物，等等。試劑盒可以進一步包括說明書。
實施例 以下的實施例是說明性的，而非限制其余的公開內容。
除非另有說明，在本文所述的單分子檢測器(SMD)中分析實施例的處理樣品，使用以下參數激光器波長639nm的連續(xù)波亞砷酸鎵二極管激光器(Blue Sky Research，Milpitas，CA)，聚焦于大小約為2微米的點(本文限定的0.004pL的探詢空間)；通過正內徑(ID)為100微米和正外徑(OD)為300微米的熔融石英毛細管的流速＝5微升/分鐘；透鏡為非共焦排列(見，例如，圖1A)；0.8數值孔徑的聚焦透鏡(Olympus)；硅雪崩光電二極管檢測器(Perkin Elmer，Waltham，MA)。
實施例1.生物標志物的夾心分析心肌肌鈣蛋白I(cTnI) 分析本分析的目的是為了檢測人血清中心肌肌鈣蛋白I(cTNI)的存在。分析形式是基于小鼠單克隆捕獲抗體和山羊多克隆檢測抗體的兩步夾心免疫分析。需要10微升樣品。分析的工作范圍是0-900pg/ml，典型的分析檢測限是1-3pg/ml。分析需要約4小時的工作臺時間來完成。
材料在下文所述的方法中使用以下材料分析板Nunc Maxisorp，產品464718，384孔，透明，用單克隆抗體BiosPacific A34440228P Lot#A0316被動包被(以5μg/ml溶于pH9.6的0.05M碳酸鈉，室溫下過夜)；用5％蔗糖、溶于PBS的1％BSA封閉，并在4℃下儲藏。對于標準曲線，使用人類心肌肌鈣蛋白I(BiosPacific Cat# J34000352)。用于標準濃度的稀釋液是經免疫耗盡內源性cTNI、等分并在-20℃儲藏的人類血清。在96孔、圓錐形、聚丙烯板(Nunc產品#249944)上進行標準物的稀釋。使用下列緩沖液和溶液(a)分析緩沖液含有1％ BSA和0.1％ TritonX-100的BBS；(b)含有2mg/ml小鼠IgG(Equitech Bio)、2mg/ml山羊IgG(EquitechBio)及2mg/ml MAK33 poly，Roche# 11939661的分析緩沖液中的被動封閉溶液；(c)檢測抗體(Ab)親和純化的山羊抗肽3多克隆抗體，(BiosPacific G129C)，它被熒光染料AlexaFluor 647標記，且在4℃下儲藏；檢測抗體稀釋液50％分析緩沖液，50％被動封閉溶液；洗滌緩沖液硼酸鹽緩沖鹽水Triton Buffer(BBST)(1.0M硼酸鹽、15.0M氯化鈉、10％Triton X-100，pH8.3)；洗脫緩沖液含有4M尿素的BBS、0.02％Triton X-100及0.001％ BSA。
AlexaFluor 647標記抗體的制備通過以下步驟將檢測抗體G-129-C與AlexaFluor 647偶聯首先將100μg的G-129-C溶解于400μl的偶聯緩沖液(0.1M NaHCO3)。然后通過將溶液轉移到YM-30過濾器內，并將溶液與過濾器進行離心過濾而將抗體溶液濃縮至50μl。然后通過加入400μl的偶聯緩沖液洗滌YM-30過濾器和抗體3次。通過向過濾器加入50μl、倒置過濾器并以5000xg離心1分鐘來回收抗體。產生的抗體溶液為1-2μg/μl。通過向AlexaFluor 647的一個小瓶中加入20μl DMSO來重配AlexaFluor 647 NHS酯，該溶液在-20℃下儲藏最多達1個月。向抗體溶液中加入3μl AlexaFluor 647原液，然后混合并在黑暗中溫育1小時。1小時后，向抗體AlexaFluor 647溶液中加入7.5μl的1M tris，并混合。用YM-30超濾器過濾溶液以去除低分子量成分。含有結合AlexaFluor 647的抗體的滲余物的體積通過加入PBS而調整為200-400μl。向溶液中加入3μl的10％ NaN3，將產生的溶液轉移到Ultrafree 0.22離心單元中，并以12000xg旋轉2分鐘。收集含有偶聯抗體的濾出液，并用于分析。
方法cTnI標準物和樣品的制備和分析 如下制備標準曲線通過將cTnI的原液系列稀釋成標準稀釋液來制備工作標準物(0-900pg/ml)，以獲得cTnI的濃度范圍1.2pg/ml-4.3μg/ml。
向每孔中加入10μl的被動封閉溶液和10μl的標準物或樣品。標準物是一式四份的。用Axyseal密封膜封閉板，以3000轉/分離心1分鐘，并在25℃下搖動溫育2小時。洗滌板5次，在紙巾上以倒置位置進行離心直至轉子達到3000轉/分。制備1nM的檢測抗體的工作稀釋液，并向每孔中加入20μl的檢測抗體。封閉板、離心，并在25℃下搖動溫育分析物1小時。向每孔中加入30μl洗脫緩沖液，封閉板，并在25℃下溫育分析物0.5小時。或者在分析前在4℃下儲藏板最多達48小時，或者立即分析樣品。
為了分析，在40微升/分下需要20微升/孔，在5微升/分下分析5微升?；?個標準差(sigma)的閾分析數據。繪制原始信號相對于標準物濃度的曲線。在低濃度范圍進行線性擬合，并在全部標準曲線進行非線性擬合。以[LOD＝(3 x 零點的標準偏差)/線性擬合的斜率]來計算檢測限(LoD)。通過適于樣品信號的方程(線性或非線性)來確定樣品的濃度。
將等分試樣用泵吸入分析器。在毛細流動過程中，通過設定探詢體積使得在激光器激發(fā)之后的限定的空間內只檢測到1個熒光標記的發(fā)射，來測量單獨標記的抗體。各信號代表一個數字事件，這種構造使得實現極高的分析靈敏度。以單獨數字事件的總和來確定總的熒光信號。各計數的分子是具有成百上千個DMC事件/樣品的陽性數據點。通過平均值+3SD方法確定本發(fā)明的cTnI分析的檢測限。
結果使用分析方案的一式四份的代表性的cTnI標準曲線的數據如表2所示。
表2 cTnI標準曲線 在15次運行中測試分析器系統(tǒng)的靈敏度，發(fā)現分析器系統(tǒng)的靈敏度常規(guī)地檢測亞飛摩爾/升(fM)水平的校準物，如表3的數據所示。精密度是10％，在4和12pg/ml cTnI。
表3 儀器的靈敏度 cTnI的濃度范圍的線性標準曲線如圖5所示。
通過15個連續(xù)分析確定檢測的分析限(LoD)。LoD是0標準的平均值+3SD(n＝4)批內測定。平均LoD是1.7pg/ml(0.4-2.8pg/ml的范圍)。
通過分析已經被免疫耗盡cTnI和具有已知量cTnI的尖峰信號的血清樣品確定樣品的回收率。表4表明系統(tǒng)分析的超過3天的樣品回收率的數據。
表4 樣品回收率 在具有cTnI尖峰信號且被標準稀釋液稀釋的混合人血清中確定分析的線性。表6中的結果顯示稀釋度及對相應的稀釋度預期的信號的百分率。
表5 分析的線性 這些數據表明本發(fā)明的分析器系統(tǒng)允許對亞飛摩爾濃度的cTnI進行高靈敏度的激光誘導的免疫分析。
實施例2.對于TnI的基于珠的夾心分析 上述分析使用同樣的微量滴定板形式，其中，使用塑料表面來固定靶分子。為了實現結合體與未結合體的分離，單一微粒分析器系統(tǒng)也與在溶液中使用微粒或珠進行的分析相容。
材料從Dynal(650.01-03，10mg/ml原液)獲得MyOne Streptavidin C1微粒(MP)。在分析中使用的緩沖液包括10X硼酸鹽緩沖鹽水Triton緩沖液(BBST)(1.0M硼酸鹽、15.0M氯化鈉、10％Triton X-100，pH8.3)；分析緩沖液(溶于0.1M Tris(pH8.1)、0.025M EDTA、0.15M NaCl、0.1％BSA、0.1％ Triton X-100和0.1％ NaN3的2mg/ml正常山羊IgG、2mg/ml正常鼠IgG及0.2mg/ml的MAB-33-IgG-聚合體，在4℃儲藏)；和洗脫緩沖液(含有4M尿素、0.02％ Triton X-100和0.001％ BSA的BBS，在2-8℃儲藏)。在基于珠的夾心分析中使用的抗體包括Bio-Ab(每個IgG具有1-2個生物素的A34650228P(BiosPacific))和Det-Ab(與A647偶聯的G-129-C(BiosPacific)，每個IgG具有2-4個熒光染料)。標準物是重組人心肌肌鈣蛋白I(BiosPacific，Cat# J34120352)。校準稀釋液是溶于TBS wEDTA的30mg/ml BSA。
微粒包被將100μl的MP原液置于eppendorf管中。通過應用磁體、除去上清液、除去磁體并在洗滌緩沖液中再懸浮，用100μl的BBST洗滌緩沖液洗滌MP3次。洗滌之后，MP再懸浮于100μl的分析緩沖液中，并加入15μg的Bio-Ab。然后在持續(xù)混合下、室溫下溫育混合物1小時。如上所述，用1ml的洗滌緩沖液洗滌MP5次。洗滌之后，MP再懸浮于15ml的分析緩沖液(或100μl在4℃儲藏)中。
標準物和樣品的制備用校準稀釋液稀釋標準物以制備合適的標準曲線(通常為200pg/ml，下至0.1pg/ml)。冷凍的血清和血漿需要以13000轉/分在室溫下離心10分鐘。仔細地除去澄清的血清/血漿以避免帶走任何可能的沉淀物或漂浮物，并放入干凈的管中。將每份50μl的標準物或樣品注入合適的孔中。
捕獲靶標向每孔中加入150μl的MP(在再懸浮于15ml的分析緩沖液+400mM NaCl之后)。在室溫下在JitterBug，5上溫育混合物1小時。
洗滌和檢測將板置于磁體上，并在確信所有的MP被磁體捕獲之后除去上清液。在從磁體上取下板之后，加入250μl的洗滌緩沖液。然后將板置于磁體上，并在確信所有的MP被磁體捕獲之后除去上清液。每孔中加入20μl Det-Ab(在分析緩沖液+400mM NaCl中將Det-Ab稀釋至500ng/ml)。在室溫下在JitterBug，5上溫育混合物30分鐘。
洗滌和洗脫將板置于磁體上，并用洗滌緩沖液洗滌3次。在確信所有的MP被磁體捕獲之后除去上清液，并加入250μl的洗滌緩沖液。在洗滌之后，將樣品轉移至新的96孔板中。然后將新板置于磁體上，并在確信所有的MP被磁體捕獲之后除去上清液。在從磁體上取下板之后，再加入250μl的洗滌緩沖液。然后將板置于磁體上，并在確信所有的MP別磁體捕獲之后除去上清液。然后加入20μl的洗脫緩沖液，并在室溫下在JitterBug，5上溫育混合物30分鐘。
過濾出MP并轉移至384孔板將標準物和樣品轉移至置于384孔分析板頂端的384孔過濾板中。然后在室溫下在板式旋轉器中以3000轉/分離心板。除去過濾板并加入合適的校準物。覆蓋板并準備在SMD上運行。
SMD將等分試樣用泵吸入分析器。在毛細流動過程中，通過設定探詢體積使得在激光器激發(fā)之后的限定的空間內只檢測到1個熒光分子的發(fā)射，來測量單獨標記的抗體。各信號代表一個數字事件，這種構造使得實現極高的分析靈敏度。以單獨數字事件的總和來確定總的熒光信號。各個計數的分子是具有成百上千個DMC事件/樣品的陽性數據點。通過平均值+3 SD的方法確定本發(fā)明的cTnI分析的檢測限。
實施例3.在正常非患病受試者群體中的cTnI的濃度范圍 使用來自88個明顯健康的受試者(非患病者)的血清樣品建立人類血清中的cTnI濃度的參考范圍或正常范圍。進行如實施例1所述的夾心免疫分析，并如上所述使用本發(fā)明的單微粒分析器系統(tǒng)對信號或事件的數目進行計數。通過將分析器檢測的信號與上述標準曲線相關，確定血清肌鈣蛋白I的濃度。所有的分析一式四份地進行。
按照目前的歐洲與美國心臟病協(xié)會(ESC/ACC)的建議，為了可靠地區(qū)分患有ACS的病人與不患有缺血性心臟病的病人，并對不良的心臟病事件危險分級，肌鈣蛋白分析的定量應該在具有低于10％的變異系數(CV)的情況下精確到正常范圍的第99百分位數。分析表明TnI的生物學閾(臨界濃度)是7pg/ml的TnI濃度，其為在具有相應的10％的變異系數(CV)的情況下建立的第99百分位數(圖5)。在10％的變異系數水平時，精密度分布指向4和12pg/ml的TnI濃度。
另外，該分析良好地與由標準與技術國家研究所(National Instituteof Standards and Technology)提供的肌鈣蛋白-I標準測量相關(圖6)。
本發(fā)明的分析足夠靈敏與精確以滿足ESC/ACC的要求，而且，當與Koerbin等人(Ann Clin Biochem，4219-23(2005))描述的分析比較時，本發(fā)明的分析對于心肌肌鈣蛋白I的分析最靈敏。本發(fā)明的分析比確定生物閾范圍為111-333pg/ml的cTnI的當前可用的分析的靈敏度高出10-20倍。
實施例4.TnI早期釋放進入患有急性心肌梗塞(AMI)的病人循環(huán)的檢測 研究1從18個由于胸痛而出現在急診部門(ED)的病人連續(xù)獲得47個樣品。這些病人都具有非ST的ECG升高，且被診斷患有AMI。在進入急診室時根據商用分析測定來自所有18個病人的初始樣品中的cTnI濃度，測定為<350pg/ml(10％臨界點)，其中12個<100pg/ml(第99百分位數)。后期使用同樣的商用分析測試這些樣品，且對于cTnI測定為測試陽性。根據實施例1和實施例3所述的本發(fā)明的分析，對同樣的血清樣品也進行TnI分析，而且將此結果與使用商用分析獲得的結果比較。
當病人出現胸痛時第一次取血(樣品1)，并以4-8小時的間隔隨后取血(在12小時，樣品2；在16小時，樣品3；在24小時，樣品4；在30小時，樣品5；在36小時，樣品6；在42小時，樣品7；和在48小時，樣品8)。通過本發(fā)明的方法和當前的商用方法分析血清，獲得的結果如圖7所示。本發(fā)明的分析器在病人出現胸痛時檢測到TnI(樣品1)，而商用分析法在遲很多的時刻(在36小時，樣品6)第一次檢測到cTnI。樣品3的TnI濃度超過了使用本發(fā)明的分析器確定的生物閾水平(7pg/ml，見圖5)，并說明樣品3對于TnI是陽性的表明心臟事件的發(fā)生。商用分析法的生物閾是111-333pg/ml的TnI。因而，樣品3不會被認為是可能的心臟事件。
另外，從病人取得的第一個樣品的結果表明，本發(fā)明的方法和組合物使得能夠基于心肌肌鈣蛋白水平(如由從病人取得的第一個樣品的結果證明的水平)進行早許多的診斷和可能的介入。在初始商用分析的cTnI值為100-350ng/ml的3個例子中，對于本發(fā)明的分析方法的cTnI全部為陽性(即，cTnI超過7pg/ml)。在初始商用分析的cTnI值低于100pg/ml的12個例子中，根據cTnI的本發(fā)明的分析方法，確定5個為心血管事件陽性(即，cTnI超過7pg/ml)。當測試允許入院的樣品時，使用本發(fā)明的分析預期將比目前的商用分析法多檢測出53％的AMI案例。
研究2使用本發(fā)明的分析器和分析來測試50個另外的根據商用分析檢測為陰性的血清樣品。結果如圖8所示。在50個樣品中，36個在第99百分位數內，因而確定為在本發(fā)明分析確定的正常范圍之內。但是，確定為在商用分析的“正常”或非疾病范圍之內的剩余的14個樣品，經測試超過本發(fā)明確定的生物閾。
因此，當cTnI的血清水平低于商用分析技術的閾值時，本發(fā)明的cTnI分析的高靈敏度能夠對病人的心肌損傷進行檢測。本發(fā)明的高靈敏、精確的cTnI分析的使用，使得AMI的檢測早于現有的cTnI分析，從而提供合適的診斷和早期醫(yī)學介入的機會以改善結果。
權利要求
1.測定樣品中是否存在肌鈣蛋白的單一分子或其片段或復合物的方法，包括
i)用標記物標記可能存在的所述分子、片段或復合物；和
ii)檢測是否存在所述標記物，其中，檢測到所述標記物的存在表明所述樣品中存在所述肌鈣蛋白的單一分子、片段或復合物。
2.如權利要求1所述的方法，其中，所述肌鈣蛋白是肌鈣蛋白的心肌異型體。
3.如權利要求2所述的方法，其中，所述肌鈣蛋白選自心肌肌鈣蛋白I(cTnI)和心肌肌鈣蛋白C(cTnC)。
4.如權利要求3所述的方法，其中，所述肌鈣蛋白是cTnI。
5.如權利要求1所述的方法，其中，所述檢測能夠以低于約50pg/ml的檢測限檢測所述的肌鈣蛋白單一分子。
6.如權利要求1所述的方法，其中，所述方法能夠以低于約20pg/ml的檢測水平檢測所述的肌鈣蛋白。
7.如權利要求1所述的方法，其中，所述標記物包括熒光部分。
8.如權利要求1所述的方法，其中，所述熒光部分在被以其激發(fā)波長發(fā)射光的激光器激發(fā)時，能夠發(fā)射至少約200個光子，其中激光聚焦于包含熒光部分的直徑不小于約5微米的點上，而且其中激光指向該點的總能量不超過約3微焦耳。
9.如權利要求1所述的方法，其中，所述熒光部分包括含有至少一個取代的吲哚環(huán)系統(tǒng)的分子，其中吲哚環(huán)3位碳上的取代基含有化學反應性的基團或偶聯基團。
10.如權利要求1所述的方法，其中，所述熒光部分包括選自AlexaFluor 488、AlexaFluor 532、AlexaFluor 647、AlexaFluor 680或AlexaFluor 700的染料。
11.如權利要求1所述的方法，其中，所述熒光部分包括AlexaFluor647。
12.如權利要求1所述的方法，其中，所述標記物進一步包括所述肌鈣蛋白分子、片段或復合物的結合伴體。
13.如權利要求12所述的方法，其中，所述結合伴體包括對于所述肌鈣蛋白分子、片段或復合物特異性的抗體。
14.如權利要求13所述的方法，其中，所述抗體對于肌鈣蛋白分子的特定區(qū)域是特異性的。
15.如權利要求14所述的方法，其中，所述抗體對于包含心肌肌鈣蛋白I的氨基酸27-41的區(qū)域是特異性的。
16.如權利要求13所述的方法，其中，所述抗體包括多克隆抗體。
17.如權利要求13所述的方法，其中，所述抗體是單克隆抗體。
18.如權利要求1所述的方法，進一步包括在固體載體上捕獲所述肌鈣蛋白或肌鈣蛋白復合物。
19.如權利要求18所述的方法，其中，所述固體載體選自微量滴定板和順磁性珠。
20.如權利要求18所述的方法，其中，所述固體載體包括連接在所述固體載體上的對于所述肌鈣蛋白或肌鈣蛋白復合物特異性的捕獲伴體。
21.如權利要求20所述的方法，其中，所述捕獲伴體與所述固體載體的所述連接是非共價的。
22.如權利要求20所述的方法，其中，所述捕獲伴體與所述固體載體的所述連接是共價的。
23.如權利要求22所述的方法，其中，所述捕獲伴體的所述共價連接使得所述捕獲伴體以特定取向連接到所述固體載體上。
24.如權利要求23所述的方法，其中，所述的特定取向使得所述肌鈣蛋白或肌鈣蛋白復合物與所述捕獲伴體的特異性結合最大化。
25.如權利要求20所述的方法，其中，所述捕獲伴體包括抗體。
26.如權利要求25所述的方法，其中，所述抗體是單克隆抗體。
27.如權利要求25所述的方法，其中，所述抗體對于心肌肌鈣蛋白I的氨基酸87-91是特異性的。
28.如權利要求25所述的方法，其中，所述抗體對于心肌肌鈣蛋白I的氨基酸41-49是特異性的。
29.如權利要求1所述的方法，其中，所述樣品是血液、血清或血漿樣品。
30.如權利要求29所述的方法，其中，所述樣品是血清樣品。
31.如權利要求1所述的方法，其中，所述標記物包括熒光部分，且其中，步驟ii)包括使所述的標記物穿過單分子檢測器。
32.如權利要求31所述的方法，其中，所述單分子檢測器包括
a)激發(fā)所述熒光部分的電磁輻射源；
b)供所述熒光部分穿過的毛細流動池；
c)在所述毛細流動池中移動所述熒光部分的動力源；
d)限定在所述毛細流動池內部的用于接收由所述電磁源發(fā)射的電磁輻射的探詢空間；
e)可操作地連接于所述探詢空間的用于測量所述激發(fā)的熒光部分的電磁特征的電磁輻射檢測器；和
f)位于所述探詢空間和所述檢測器之間的顯微鏡物鏡，其中，該物鏡具有0.6或更大的數值孔徑。
33.確定個體的診斷、預后或治療方法的方法，包括
i)測定所述個體的樣品中的心肌肌鈣蛋白濃度，或測定所述個體的系列樣品中的心肌肌鈣蛋白濃度，其中，所述濃度通過對所述樣品中所述心肌肌鈣蛋白的檢測限低于約50pg/ml的心肌肌鈣蛋白分析進行測定；和
ii)根據所述樣品的所述濃度或所述系列樣品的所述濃度，確定所述個體的診斷、預后或治療方法。
34.如權利要求33所述的方法，其中，步驟ii)包括選自下列分析的步驟將所述的濃度或系列濃度與所述濃度的正常值比較，將所述的濃度或系列濃度與預定的閾水平比較，將所述的濃度或系列濃度與基線值比較，和確定所述的系列濃度的濃度變化率。
35.如權利要求34所述的方法，其中，步驟ii)包括將所述樣品中所述肌鈣蛋白濃度與預定的閾濃度比較，并且如果樣品濃度高于該閾水平，則確定診斷、預后或治療方法。
36.如權利要求35所述的方法，其中，所述的閾濃度是通過確定一組正常個體中的第99百分位數肌鈣蛋白濃度，并設定所述的閾濃度在所述的第99百分位數肌鈣蛋白濃度而確定的。
37.如權利要求33所述的方法，其中，在心臟應力試驗過程中或之后采集至少一個樣品。
38.如權利要求33所述的方法，其中，所述心肌肌鈣蛋白選自心肌肌鈣蛋白I和心肌肌鈣蛋白T。
39.如權利要求33所述的方法，其中，所述心肌肌鈣蛋白是心肌肌鈣蛋白I。
40.如權利要求38所述的方法，其中，所述心肌肌鈣蛋白的濃度是總心肌肌鈣蛋白的濃度。
41.如權利要求40所述的方法，其中，所述心肌肌鈣蛋白的濃度是心肌肌鈣蛋白復合物、心肌肌鈣蛋白片段、磷酸化的心肌肌鈣蛋白、氧化的心肌肌鈣蛋白或其組合的濃度。
42.如權利要求41所述的方法，其中，所述心肌肌鈣蛋白的濃度相比于總的心肌肌鈣蛋白。
43.如權利要求33所述的方法，其中，所述的診斷、預后或治療方法是心肌梗塞的診斷、預后或治療方法。
44.如權利要求43所述的方法，其中，所述的診斷、預后或治療方法包括對于心肌梗塞風險水平的風險分級。
45.如權利要求43所述的方法，其中，在個體向醫(yī)療專業(yè)人員呈現一種或多種表明心肌缺血或心肌梗塞或其可能性的癥狀時或在接近該時間的時刻測定所述濃度或系列濃度。
46.如權利要求45所述的方法，其中，所述的一種或多種癥狀選自胸痛、胸悶、臂痛、不正常的EKG、不正常的酶水平和呼吸短促。
47.如權利要求33所述的方法，其中，通過包括檢測肌鈣蛋白的單一分子或其復合物或片段的方法測定所述的濃度。
48.如權利要求47所述的方法，包括用包含熒光部分的標記物標記所述肌鈣蛋白或肌鈣蛋白復合物。
49.如權利要求33所述的方法，其中，所述熒光部分在被以其激發(fā)波長發(fā)射光的激光器激發(fā)時，能夠發(fā)射至少約200個光子，其中激光聚焦于包含該部分的直徑5微米的點上，而且其中激光指向該點的總能量不超過約3微焦耳。
50.如權利要求33所述的方法，其中，所述熒光部分包括含有至少一個取代的吲哚環(huán)系統(tǒng)的分子，其中，在吲哚環(huán)3位碳上的取代基含有化學反應性的基團或偶聯物質基團。
51.如權利要求33所述的方法，其中，所述熒光部分包括選自AlexaFluor 488、AlexaFluor 532、AlexaFluor 647、AlexaFluor 680或AlexaFluor 700的染料。
52.如權利要求51所述的方法，其中，所述熒光部分包括AlexaFluor647。
53.如權利要求33所述的方法，其中，所述標記物進一步包括所述肌鈣蛋白的結合伴體。
54.如權利要求53所述的方法，其中，所述結合伴體包括對所述肌鈣蛋白特異性的抗體。
55.如權利要求54所述的方法，其中，所述抗體包括多克隆抗體。
56.如權利要求33所述的方法，進一步包括在固體載體上捕獲所述肌鈣蛋白或肌鈣蛋白復合物。
57.如權利要求56所述的方法，其中，所述固體載體選自微量滴定板和順磁性珠。
58.如權利要求56所述的方法，其中，所述固體載體包括連接在所述固體載體上的對于所述肌鈣蛋白或肌鈣蛋白復合物特異性的捕獲伴體。
59.如權利要求33所述的方法，其中，步驟i)進一步包括評估所述個體的另一個指標，且步驟ii)包括基于所述樣品中所述肌鈣蛋白的濃度和所述非肌鈣蛋白標志物的所述其它指標的所述評估，或者基于所述系列樣品中的所述濃度，確定所述個體的診斷、預后或治療方法。
60.如權利要求59所述的方法，其中，所述其它指標是心肌缺血或心肌梗塞的臨床指標。
61.如權利要求60所述的方法，其中，所述其它指標是所述樣品或所述系列樣品中的一種或多種非肌鈣蛋白標志物的濃度。
62.如權利要求59所述的方法，其中，所述一種或多種標志物是心肌缺血的標志物、或炎癥和斑塊不穩(wěn)定性的標志物。
63.如權利要求62所述的方法，其中，所述一種或多種心肌缺血標志物選自肌酸激酶(CK)及其心肌部分CK心肌帶(MB)、天冬氨酸氨基轉移酶、乳酸脫氫酶(LDH)、α-羥丁酸脫氫酶、肌紅蛋白、谷草轉氨酶、糖原磷酸化酶BB、未結合的游離脂肪酸、心型脂肪酸結合蛋白(H-FABP)、缺血修飾白蛋白、肌球蛋白輕鏈1、肌球蛋白輕鏈2。
64.如權利要求63所述的方法，其中，所述一種或多種標志物包括一種或多種心肌損傷的特異性標志物。
65.如權利要求33所述的方法，其中，所述的診斷、預后或治療方法是非心肌梗塞的狀態(tài)的診斷、預后或治療方法。
66.如權利要求65所述的方法，其中，所述狀態(tài)是心臟毒性。
67.如權利要求66所述的方法，其中，所述心臟毒性與向個體施用藥物有關。
68.如權利要求65所述的方法，其中，所述狀態(tài)選自急性風濕熱、淀粉樣變性、心臟創(chuàng)傷(包括挫傷、切除、起搏、放電、心臟復律、導管插入和心臟手術)、再灌注損傷、充血性心力衰竭、末期腎衰竭、II型糖原貯積病(龐普病)、心臟移植、具有輸血性含鐵血黃素沉著癥的血紅蛋白病、高血壓，包括妊娠期高血壓、低血壓，常伴有心律不齊、甲狀腺功能減退、心肌炎、心包炎、術后非心臟手術、肺栓塞及敗血癥。
69.用于檢測肌鈣蛋白異型體的組合物，包括與熒光部分連接的該肌鈣蛋白異型體的結合伴體，其中，所述熒光部分在被以其激發(fā)波長發(fā)射光的激光器激發(fā)時，能夠發(fā)射至少約200個光子，其中激光聚焦于包含熒光部分的直徑不小于約5微米的點上，而且其中激光指向該點的總能量不超過約3微焦耳。
70.如權利要求69所述的組合物，其中，所述結合伴體包括所述肌鈣蛋白異型體的抗體。
71.如權利要求70所述的組合物，其中，所述抗體是多克隆抗體。
72.如權利要求70所述的組合物，其中，所述抗體是單克隆抗體。
73.如權利要求69所述的組合物，其中，所述肌鈣蛋白異型體是心肌異型體。
74.如權利要求73所述的組合物，其中，所述心肌異型體選自cTnI和cTnT。
75.如權利要求74所述的組合物，其中，所述心肌異型體是cTnI。
76.如權利要求75所述的組合物，其中，所述抗體對于肌鈣蛋白分子的特定區(qū)域是特異性的。
77.如權利要求76所述的組合物，其中，所述抗體對于包含心肌肌鈣蛋白I的氨基酸27-41的區(qū)域是特異性的。
78.如權利要求69所述的組合物，其中，所述熒光部分包括含有至少一個取代的吲哚環(huán)系統(tǒng)的分子，其中，在吲哚環(huán)3位碳上的取代基包含化學反應性的基團或偶聯物質基團。
79.如權利要求69所述的組合物，其中，所述熒光部分包括選自AlexaFluor 488、AlexaFluor 532、AlexaFluor 647、AlexaFluor 680或AlexaFluor 700的染料。
80.如權利要求79所述的組合物，其中，所述熒光部分包括AlexaFluor647。
81.含有一組用于測定心肌肌鈣蛋白濃度的標準物的組合物，其中，所述標準物中的至少一種的心肌肌鈣蛋白濃度低于約10pg/ml。
82.包括含有連接在熒光染料部分上的心肌肌鈣蛋白抗體的組合物的試劑盒，其中，所述熒光染料部分在被以其激發(fā)波長發(fā)射光的激光器激發(fā)時，能夠發(fā)射至少約200個光子，其中激光聚焦于包含該部分的直徑不小于約5微米的點上，并且其中激光指向該點的總能量不超過約3微焦耳，其中，所述組合物包裝在合適的包裝中。
83.如權利要求82所述的試劑盒，其中，所述心肌肌鈣蛋白是心肌肌鈣蛋白I或心肌肌鈣蛋白T。
84.如權利要求82所述的試劑盒，其中，所述心肌肌鈣蛋白是心肌肌鈣蛋白I。
85.如權利要求82所述的試劑盒，進一步包括說明書。
86.如權利要求82所述的試劑盒，進一步包括含有連接在固體載體上的所述心肌肌鈣蛋白I的捕獲抗體的組合物。
87.如權利要求86所述的試劑盒，其中，所述固體載體包括微量滴定板或順磁性微粒。
88.如權利要求82所述的試劑盒，進一步包括選自洗滌緩沖液、分析緩沖液、洗脫緩沖液及校準物稀釋液的成分。
89.如權利要求82所述的試劑盒，進一步包括心肌肌鈣蛋白的標準物。
全文摘要
本發(fā)明提供了靈敏檢測心肌肌鈣蛋白的方法、組合物、試劑盒和系統(tǒng)，這樣的方法、組合物、試劑盒和系統(tǒng)可用于對涉及心肌肌鈣蛋白釋放的狀態(tài)進行診斷、預后和治療方法的確定。
文檔編號G01N33/53GK101432626SQ200780015772
公開日2009年5月13日 申請日期2007年4月4日 優(yōu)先權日2006年4月4日
發(fā)明者P·戈伊克斯, R·普斯卡斯, J·托德, R·利文格斯頓, D·赫爾德 申請人:神谷來克斯公司