專利名稱：：利用bcl-2水平的增高檢測(cè)癌腫的制作方法利用BCL-2水平的增高檢測(cè)癌腫相關(guān)申請(qǐng)的交互引用本申請(qǐng)要求2006年2月9日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)60/771,677的優(yōu)先權(quán)，所述申請(qǐng)的全文均在本文引用作為參考，包括其中任意圖、表、核餅列、M^列以及附圖。
背景技術(shù)：
：癌腫標(biāo)志物是癌腫(cancer)出現(xiàn)時(shí)可在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的物質(zhì)(通常為血液或尿液中)。它們可能是癌肺細(xì)胞自身的產(chǎn)物，也可能是機(jī)體對(duì)癌腫或其他病癥的應(yīng)答產(chǎn)物。由于若干原因，通常癌腫標(biāo)志物本身不足以診斷(或除外)某一特定類型的癌腫。大部分癌腫標(biāo)志物既可由正常細(xì)胞產(chǎn)生，也可由癌腫細(xì)胞產(chǎn)生，即^更前者產(chǎn)量較小。有時(shí)非癌性疾病也會(huì)導(dǎo)致某些癌腫標(biāo)志物水平高于正常。因此，僅有一小部分癌腫標(biāo)志物為大多數(shù)醫(yī)生所常用。當(dāng)醫(yī)生確實(shí)關(guān)注某一癌腫標(biāo)志物水平時(shí)，他或她通常會(huì)同時(shí)考慮患者的病史和體格檢查，及其他實(shí)驗(yàn)室測(cè)試或影像學(xué)測(cè)試的結(jié)果。篩查是指在沒(méi)有相應(yīng)疾病癥狀的個(gè)體中檢查癌腫，而早期診斷是指在疾病的早期階仗良現(xiàn)癌腫，此時(shí)癌腫已發(fā)生擴(kuò)散的可能性較小(或能有效治療的可能性更大)。雖然起初研究和發(fā)展癌腫標(biāo)記物時(shí)為了在無(wú)癥狀人群中發(fā)現(xiàn)癌腫，但4艮少有癌腫標(biāo)記物能真正有助于這一需求。卵巢癌是病死率最高的婦科癌腫。缺乏早期癥狀和檢測(cè)卵巢癌的可靠篩查測(cè)試，使得70%以上診斷為該病的女性都發(fā)生了卵巢外轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致預(yù)后較差，每年約有12,000人死于卵巢癌(5年生存率僅為37%)。目前，由醫(yī)師進(jìn)行的物理盆腔檢查、超聲波或測(cè)量血CA125水平，是僅有的檢測(cè)卵巢癌的標(biāo)準(zhǔn)方法。然而，這些方法都不能提供可靠一致及準(zhǔn)確的卵巢癌檢測(cè)方法。例如，雖然80。/。以上的卵巢癌女性血CA125水平都會(huì)增高，血CA125水平用于檢測(cè)早期疾病的準(zhǔn)確性僅為約50%。迫切需求發(fā)展另一種能夠可靠準(zhǔn)確檢測(cè)所有卵巢癌的新測(cè)試方法。因此，需要技術(shù)來(lái)克服目前可靠、準(zhǔn)確、安全且成本有效的卵巢癌檢測(cè)方法的缺乏。此外，需要能夠準(zhǔn)確檢測(cè)所有卵巢癌(其中很多目前未被檢測(cè))，并在卵巢癌病程中監(jiān)測(cè)疾病負(fù)擔(dān)的技術(shù)。用于診斷卵巢癌的準(zhǔn)確、安全、簡(jiǎn)便且可靠的測(cè)試，將惠及美國(guó)及世界范圍內(nèi)的所有女性，包括醫(yī)療服務(wù)不足的地區(qū)，特別是卵巢癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)高的女性人群?？紤]到美國(guó)每年約有25,000女性被診斷為卵巢癌，在疾病早期和晚期均可檢測(cè)的卵巢癌生物標(biāo)志物不僅能證實(shí)卵巢癌的診斷，而且也可能檢測(cè)出數(shù)以千計(jì)的以往未被診斷的卵巢癌。在疾病尚局限于卵巢時(shí)早期檢測(cè)卵巢癌尤其重要，而目前卵巢癌診斷中早期檢測(cè)還不到10%。在這些情況下，手術(shù)切除患側(cè)卵巢可提高患者存活率至90。/。以上，且預(yù)計(jì)可降低醫(yī)療花費(fèi)。在每一患者病程中對(duì)其卵巢癌進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)和監(jiān)測(cè)的能力，不僅有助于初始印巢癌診斷，也能預(yù)測(cè)療效和/或疾病復(fù)發(fā)。例如，發(fā)展市售的、FDA批準(zhǔn)的基于ELISA的測(cè)試，可以成為卵巢癌臨床診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。凋亡是正常發(fā)展和維護(hù)組織穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵生物過(guò)程，但它也參與很多病理過(guò)程包括組織損傷、退行性疾病、免疫疾病和癌腫(Lowe，S.W.和Lin，A.W.Carcinogenesis,2000，21:485-495)。不論是由結(jié)合膜的死亡受體活化(Ashke認(rèn)i，A.等人J.Clin.Invest"1999，104:155-162;Walczak，H.Krammer，P.H.Exp.CellRes,2000，256:58-66),還是由應(yīng)激誘導(dǎo)的線粒體破壞(mitochondrialperturbation)及隨后的細(xì)胞色素c釋放(Loeffler,M.和Kroemer,G.Exp.CellRes.，2000，256:19-26;Wernig,F.和Xu，Q.Prog.Biophys.Mol.Biol"2002，78:105-137;Takano，T.等人.Antiox.Redox.Signal,2002，4:533-541),下游級(jí)聯(lián)反應(yīng)的活化通過(guò)破壞細(xì)胞骨架、關(guān)閉DNA復(fù)制和4奮復(fù)、降解染色體DNA并最終將細(xì)胞分解為凋亡小體，導(dǎo)致細(xì)胞損傷逐步發(fā)生(Nagata，S.Exp.CellRes.，2000,256:12-18)。凋亡的核心調(diào)節(jié)物包括bcl-2蛋白家族的成員(Farrow,S.N.和Brown，R.Curr.Opin.Gen.Dev，，1996，6:45-49)。bcl-2蛋白家族包括作用于凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)不同水平以對(duì)凋亡加以調(diào)節(jié)的促-和抗-凋亡蛋白家族成員。bcl-2家族成員含有至少一個(gè)Bcl-2-同源(BH)結(jié)構(gòu)域(Farrow,S.N.和Brown，R.Curr.Opin.Gen.Dev"1996，6:45-49)。雖然所有bcl-2家族成員都具有膜通道形成活性，Bcl-2(原始bcl-2家族成員)通道為陽(yáng)離子(Ca++)選擇性，且由于其專有的ER和線粒體膜位置(Thomenius，M.J.和Distelhorst，CW.J.CellSci"2003，116:4493-4499)，Bcl-2的抗凋亡功能至少部分是由其阻斷鈣離子從ER釋放的能力所介導(dǎo)，進(jìn)而防止了線粒體膜的破壞和細(xì)胞色素c的釋放。由于Bcl-2在包括卵巢癌在內(nèi)的多種類型腫瘤中均過(guò)量表達(dá)(Sharma，H.等人.HeadNeck，2004，26:733-740;Ha謂ka，T.等人.Intl.J.Clin.Oncol，2002，7:152-158;Trisciuoglio，D.等人.J.CellPhysiol,2005，205:414-421;Khalifeh，I.等人.Int.J.Gynecol.Pathol,2004,23:162-169;O'Neill,CJ等人Am.J.Surg.Pathol,2005，29:1034-1041)，它穩(wěn)定了凋亡攻擊中的線粒體膜，從而有助于化學(xué)抗性的產(chǎn)生。目前，臨床前研究集中研發(fā)抑制Bcl-2的物質(zhì)，包括反義寡核苦酸如G3、139(Ackermann，EJ.等人J.Biol.Chem.，1999，274:11245-11252),以及Bcl-2的小分子抑制物(Lickliter,丄D.等人Leukemia,2003,17:2074-2080)。盡管此類研究將Bcl-2作為治療干預(yù)的耙位，文獻(xiàn)中尚無(wú)有關(guān)尿Bcl-2定量的報(bào)道。擁有能對(duì)癌腫如卵巢癌提供安全、靈敏、特異及經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)方法的可用檢測(cè)非常有利，將惠及整個(gè)社會(huì)。發(fā)明概述本發(fā)明涉及癌腫篩查。Bcl-2是癌腫如生殖系統(tǒng)癌腫預(yù)后、診斷和監(jiān)測(cè)用生物標(biāo)志物。例如，Bcl-2可用于診斷和監(jiān)測(cè)早期及晚期卵巢癌。Bcl-2可用作手術(shù)前及復(fù)發(fā)后癌腫的生物標(biāo)志物。Bcl-2以及與Bcl-2多核苷酸或多肽結(jié)合的物質(zhì)，可用于檢測(cè)和監(jiān)測(cè)卵巢癌，及其他生殖系統(tǒng)或非生殖系統(tǒng)癌腫。因此，更具體而言，本發(fā)明涉及通過(guò)篩查生物樣本中Bcl-2水平的增高來(lái)檢測(cè)癌腫，所述生物樣本如尿液、血液(例如全血、血清或血漿)和腹水。在一個(gè)實(shí)施方案中，癌腫為卵巢癌。在另一實(shí)施方案中，癌胂為選自乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、黑素瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、肉瘤、膀胱癌及頭頸癌的類型。任選本方法還包括確認(rèn)受試者確實(shí)患有所檢測(cè)癌肺(例如評(píng)估存在的一種或多種癌肺癥狀、檢測(cè)其他癌肺標(biāo)志物、通過(guò)影像學(xué)設(shè)備如X光、CT、核成像(PET和SPECT)、超聲波、MRI等檢測(cè)癌腫存在)，和/或治療受試者中所檢測(cè)到的癌胂(例如通過(guò)手術(shù)、化療，和/或放射療法)。本發(fā)明也涉及實(shí)施本發(fā)明方法的試劑盒。本發(fā)明的另一方面涉及在體液如血液或尿液中快速檢測(cè)Bcl-2的裝置。優(yōu)選該裝置為側(cè)流裝置。在某一實(shí)施方案中，該裝置包括接受體液如血液或尿液樣本的加樣區(qū)；含有與樣本中Bcl-2結(jié)合的結(jié)合劑的標(biāo)記區(qū)；以及結(jié)合Bcl-2的結(jié)合劑滯留并發(fā)出信號(hào)的檢測(cè)區(qū)，其中Bcl-2水平低于閾值濃度的受試者樣本發(fā)出的信號(hào)，與Bcl-2水平等于或高于闊值濃度的受試者樣本發(fā)出的信號(hào)不同。本發(fā)明的另一方面涉及簡(jiǎn)便、迅速、可靠、準(zhǔn)確且成本有效的檢測(cè)體液(如血液或尿液)中Bcl-2的測(cè)試，類似于現(xiàn)有的家用受孕測(cè)試，可在家中、醫(yī)生辦公室或患者床旁使用。在某一實(shí)施方案中，該測(cè)試為測(cè)量體液Bcl-2的方法，其包括(a)獲取受試者體液樣本，如血液或尿液；(b)將樣本與能結(jié)合樣本中任意Bcl-2的結(jié)合劑接觸；(c)分離結(jié)合Bcl-2的結(jié)合劑；(d)檢測(cè)從(c)中分離的結(jié)合劑中攜帶的信號(hào)；以及(e)將步驟(d)檢測(cè)的信號(hào)與參照信號(hào)進(jìn)行比較，所述參照信號(hào)為Bd-2水平等于閾值濃度的受試者樣本所發(fā)出的信號(hào)。在某一實(shí)施方案中，體液為尿液，而閾值濃度介于0ng/ml和2.0ng/ml間。在另一實(shí)施方案中，體液為尿液，而闊值濃度為1.8ng/ml。為評(píng)估尿Bcl-2水平能否用于檢測(cè)卵巢癌，收集正常健康志愿者及卵巢癌患者的尿液，并用ELISA測(cè)量其Bcl-2。癌腫患者尿中Bcl-2的平均含量通常至少為健康對(duì)照者的10倍。此外，采自35名患有良性婦科疾病(包括畸胎瘤、卵巢嚢腫、平滑肌瘤、多嚢卵巢疾病、腺纖維瘤或嚢腺瘤)女性的尿樣中無(wú)一Bcl-2水平高于正常健康志愿者。外科切除術(shù)后卵巢癌患者尿Bcl-2水平下降多達(dá)100%。尿Bcl-2升高與卵巢癌相關(guān)的敏感性和特異性幾乎均為100%，而血CA125水平〉35U/ml僅能鑒別出68%的卵巢癌患者。對(duì)臨床參數(shù)的比較提示，尿Bcl-2水平與肺瘤的分期和分級(jí)間相關(guān)性良好。然而，尿Bcl-2水平與患者年齡或腫瘤大小并不相關(guān)。因此，通過(guò)基于ELISA的檢測(cè)定量尿Bcl-2，提供了一種安全、靈敏、特異且經(jīng)濟(jì)的用于檢測(cè)卵巢癌、全病程監(jiān)測(cè)卵巢癌，并預(yù)測(cè)治療和預(yù)后結(jié)局的方法。附圖簡(jiǎn)述圖1為描述尿Bcl-2水平的柱狀圖。卵巢癌患者尿Bcl-2水平高于正常健康志愿者。收集正常健康志愿者、卵巢癌(包括漿液性癌和粘液性癌組織學(xué)亞型)患者以及腹膜癌患者的尿樣。進(jìn)一步將漿液性卵巢癌再分為1期(漿液癌分組左側(cè)的前三個(gè)柱形)、2期(漿液癌分組中其后八個(gè)柱形(即漿液癌組中左起4-11柱形)以及3期(漿液癌分組右側(cè)部分的十一個(gè)柱形(即漿液癌組中左起12-22柱形)。利用ELISA檢測(cè)尿Bd-2三次(ELISA試劑盒，獲自BenderMedSystems，目錄號(hào)BMS244/3)，其結(jié)果以均值ng/mlBcl-2±S.E表示。數(shù)據(jù)提示，癌胂患者尿Bcl-2水平持續(xù)升高。Studentt檢驗(yàn)分析顯示，正常樣本和癌腫樣本中存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，pO.OOOOl。圖2為描述正常人和癌腫患者尿Bcl-2水平的柱形圖。再次收集正常健康志愿者、卵巢癌(包括子宮內(nèi)膜樣癌、漿液性癌和粘液性癌組織學(xué)亞型)患者以及腹膜癌患者的尿樣。進(jìn)一步將漿液性卵巢癌再分為l期(漿液癌組中最左側(cè)7個(gè)柱形)、2期(漿液癌組中左起8-17柱形)以及3期(漿液癌組中最右側(cè)12個(gè)柱形)。利用ELISA檢測(cè)尿Bcl-2三次(ELISA試劑盒，獲自BenderMedSystems)，結(jié)果以均值ng/mlBd-2表示，并代表了目前為止測(cè)試的所有正常及手術(shù)前癌腫樣本。與圖1一致，數(shù)據(jù)提示癌腫患者尿Bcl-2水平持續(xù)升高。Studentt檢驗(yàn)分析顯示正常樣本和癌腫樣本中存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，p<0.00001。圖3A和3B為柱狀圖，顯示尿Bcl-2與胂瘤分期和分級(jí)分別相關(guān)。繪制所有可得的卵巢癌亞型(漿液性、子宮內(nèi)膜樣、粘液性)中尿Bcl-2水平對(duì)腫瘤分期的分布圖。I、II、III及V期以羅馬數(shù)字表示，分組情況示于其下。圖3A說(shuō)明疾病分別局限于卵巢和腹膜腔的I和II期癌腫患者尿Bcl-2水平最低(均值ng/mlBcl-2二2.2)，盡管其仍顯著高于正常對(duì)照。疾病擴(kuò)散至卵巢外的III期和疾病復(fù)發(fā)的V期中尿Bcl-2水平最高(均值ng/mlBcl-2=4.22)。圖4A和4B為一組柱狀圖，顯示尿Bcl-2(圖4A)與檢測(cè)血漿CA125水平(圖4B)相比檢測(cè)卵巢癌的能力。將前圖1-3所示的尿Bcl-2水平盡可能與來(lái)自同一正常健康志愿者和癌腫患者的血漿CA125水平進(jìn)行比較。其中癌腫患者包括患粘液性卵巢癌(Muc)、原發(fā)腹膜癌(PP)以及漿液性卵巢癌(Serous)的患者。ELISA檢測(cè)CA125水平三次(試劑盒來(lái)自Bio-Quant，SanDiego，CA，目錄號(hào)BQ1013T)。數(shù)據(jù)表示為均值ng/mlBcl-2(A)和均值U/mlCA125(圖4B)。提高的尿Bcl-2水平檢測(cè)卵巢癌的敏感性和特異性幾乎均為100%。與之相對(duì)，目前用于卵巢癌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的血CA125水平〉35U/ml，僅能正確鑒別出68%的卵巢癌患者。圖5為柱狀圖，顯示尿Bd-2水平與患者年齡無(wú)關(guān)。為檢查癌腫患者尿中Bd-2水平增高是否與患者年齡相關(guān)，比較尿Bcl-2水平(如前表1-3和4A-4B所確定)與患者年齡。盡管^研究中正常健康志愿者的平均年齡(54.8歲)略低于癌腫患者(66.2歲)，由于年齡跨度較大(見(jiàn)圖5插頁(yè))，兩組年齡間并不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。此外，癌腫患者的平均年齡與文獻(xiàn)和臨床數(shù)據(jù)一致，提示卵巢癌通常多發(fā)于圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后女性。然而，在尿Bcl-2水平和患者年齡間似乎并不存在相關(guān)性。圖6為柱狀圖，顯示尿Bcl-2與卵巢肺瘤大小不相關(guān)。為檢查癌腫患者尿Bd-2水平增高是否與腫瘤大小相關(guān)，比較尿Bcl-2水平(如前表1-3和4A-4B所確定)與腫瘤大小。肺瘤分為1=微型腫瘤；3-小于3cm的肺瘤；6=介于3和6cm間的腫瘤；10=大于6cm上至10cm的腫瘤；11=大于10cm的腫瘤。數(shù)據(jù)提示尿Bcl-2水平和肺瘤大小間似乎并不存在相關(guān)性。圖7A和7B為一組柱狀圖，顯示卵巢癌外科切除術(shù)后尿Bcl-2下降。為進(jìn)一步測(cè)試尿Bd-2檢測(cè)卵巢癌的準(zhǔn)確性，比較可獲得的卵巢癌患者在初次切除手術(shù)前(黑色柱)和首次切除術(shù)(去除所有可見(jiàn)腫瘤)后2周內(nèi)(灰色柱)尿Bcl-2水平(圖7A)。對(duì)于收集術(shù)前術(shù)后尿樣的7名患者而言，初次手術(shù)切除胂瘤后Bcl-2水平的下降多達(dá)100。/。。因而，這些數(shù)據(jù)提示，腫瘤是印巢癌患者尿中Bcl-2增高的來(lái)源，而尿Bcl-2水平與卵巢癌平行存在。此外，收集了圖7A中7名患者中5人的后續(xù)臨床隨訪尿樣并測(cè)量其中的Bcl-2(藍(lán)色柱)，隨訪時(shí)間為初次手術(shù)后7至11個(gè)月不等(圖7B)。在3名隨訪患者中尿Bcl-2仍保持較低水平(#41、43、54)，而2名患者出現(xiàn)升高(#5、27)。初步的病歷回顧(chartreview)提示#41、43、54患者在隨訪當(dāng)時(shí)正在接受化療，其卵巢癌疾病得到控制。與"M目反，病歷回顧提示#5、27患者疾病出現(xiàn)復(fù)發(fā)(5B、27B),而患者^(guò)27b接受了二次肺瘤切除術(shù)。與臨床信息一致，接受化療且無(wú)明顯或很少殘留疾病的患者中尿Bcl-2水平持續(xù)較低(#41、43、54)。與之相似，尿Bcl-2水平的增高與疾病的復(fù)發(fā)(#5b、27B)相關(guān)，且隨再次切除術(shù)而降〗氐(#27c)。圖8A和8B顯示了良性婦科疾病患者中Bcl-2測(cè)試的結(jié)果。利用ELISA法檢查良性婦科疾病患者尿樣中的Bcl-2。樣^查重復(fù)三次，數(shù)據(jù)以均值ng/mlBcl-2士S.E表示(圖8A)。根據(jù)類型(良性嚢性畸胎瘤、單純嚢腫、平滑肌瘤、多嚢卵巢、腺纖維瘤、粘液性和漿液性嚢腺瘤)劃分良性婦科疾病樣本，以卵巢癌患者樣本#41(白色柱)作為內(nèi)部正對(duì)照。良性疾病的平均尿Bcl-2ng/ml±S.E.顯示于其相應(yīng)標(biāo)題下。重新繪制圖2和圖3A中樣品，以顯示該研究組(n=92)中Bcl-2的表達(dá)，如圖8B所示。良性疾病患者、癌腫患者及正常人的Bcl-2水平分別為0.115-1.016ng/ml、1.12-9.8ng/ml及0-1.26ng/ml，其均值分別為0.614ng/ml、3.4ng/ml及0.21ng/ml。圖9為柱狀圖，顯示Bcl-2可被分泌至細(xì)胞培養(yǎng)條件培養(yǎng)基內(nèi)。收集建立的卵巢癌(OV2008、SKOV3、PA1)、宮頸癌(Hela)、前列腺癌(LNCap、DU145、PC-3)、頭頸癌(HN5a)及淋巴瘤(Raji)癌肺細(xì)胞系的條件培養(yǎng)基(CM)，并用ELISA檢查其中的Bcl-2。數(shù)據(jù)以三份樣本的均值表示。在卵巢癌、宮頸癌及前列腺癌細(xì)胞培養(yǎng)CM中存在Bcl-2，提示這些癌腫細(xì)胞產(chǎn)生并分泌Bcl-2。圖10顯示在某些癌腫細(xì)胞內(nèi)Bcl-2過(guò)量表達(dá)。對(duì)建立的卵巢癌(SW626、C13)、頭頸癌(HN5a)、宮頸癌(Hela)及前列腺癌(DU145)的癌肺細(xì)胞系細(xì)胞的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物進(jìn)行Bcl-2的western免疫印跡。以肌動(dòng)蛋白作為加樣對(duì)照，以FHIOSE118細(xì)胞(SV-40大T抗原轉(zhuǎn)染人卵巢表面上皮細(xì)胞)作為正常非惡性卵巢表面上皮對(duì)照細(xì)胞。根據(jù)密度分析，將Bcl-2水平對(duì)肌動(dòng)蛋白歸一化，標(biāo)注在圖像下面。正常細(xì)胞幾乎不含bcl-2，而卵巢癌和宮頸癌細(xì)胞Bcl-2的含量最高。圖11顯示保存后Bcl-2蛋白濃度。作為該研究的一部分，起初測(cè)試正常健康個(gè)體(#506、508)和卵巢癌患者(#77、97)尿樣中的Bcl-2(對(duì)照)，并在室溫(25°C)、冰箱(4。C)、-20°(:冰箱(-20匸)或-80。C水箱(-80匸)中保存4天后再次測(cè)試。使用ELISA試劑盒(BenderMedSystems)測(cè)試所有樣本尿Bd-2水平兩次。圖12顯示了溶血磷脂酸(LPA)治療后，癌腫細(xì)胞系的條件培養(yǎng)基(CM)中Bcl-2蛋白的濃度，包括前列腺癌細(xì)胞系DU145。數(shù)據(jù)表明，LPA治療通常以自分泌循環(huán)的形式反饋至癌腫細(xì)胞，刺激某些類型的癌腫細(xì)胞向CM中分泌Bcl-2。由于這些癌腫細(xì)胞系與卵巢癌細(xì)胞系一樣向其CM中分泌Bcl-2,體內(nèi)這些細(xì)胞系的癌腫對(duì)應(yīng)物會(huì)向生物液體中分泌Bcl-2,如尿液和/或血液，從而可能被本發(fā)明所檢測(cè)。序列簡(jiǎn)述SEQIDNO:l為人Bcl-2DNA(GenBank登錄號(hào)M14745);編碼區(qū)(CDS):第32-751位堿基。SEQIDNO:2為人Bcl陽(yáng)2蛋白(GenBank登錄號(hào)AAA35591)。SEQIDNO:3為人Bcl-2DNA，轉(zhuǎn)錄變體ot(GenBank登錄號(hào)NM000633);CDS:第494-1213位堿基。SEQIDNO:4為人Bcl-2蛋白，轉(zhuǎn)錄變體oc(GenBank登錄號(hào)NP—000624)。SEQIDNO:5為人Bcl-2DNA，轉(zhuǎn)錄變體P(GenBank登錄號(hào)NM000657);CDS:第494-1111位堿基。SEQIDNO:6為人Bcl-2蛋白，轉(zhuǎn)錄變體P(GenBank登錄號(hào)NP—000648)。發(fā)明詳述Bcl-2是癌胂如卵巢癌的有效分子標(biāo)志物。癌腫標(biāo)志物(也稱為腫瘤標(biāo)志物)為體內(nèi)出現(xiàn)的與癌腫相關(guān)的分子，如激素、酶及免疫球蛋白，對(duì)其測(cè)量或鑒定有助于患者的診斷或臨床管理。它們可能為癌腫細(xì)胞自身產(chǎn)物，或者為機(jī)體應(yīng)答癌胂或其他病癥的產(chǎn)物。大部分癌肺標(biāo)志物為蛋白質(zhì)。某些癌腫標(biāo)志物僅見(jiàn)于一種類型的癌腫，而另一些則可見(jiàn)于數(shù)種類型的癌肺。如同其他癌腫標(biāo)志物一樣，Bcl-2可有多種用途，如篩查健康人群或高風(fēng)險(xiǎn)人群中癌肺的發(fā)生；i貪斷癌腫或某一特定類型的癌胂如卵巢癌；確定受試者的預(yù)后；并監(jiān)測(cè)受試者消退期或接受手術(shù)、放療、化療或其他癌腫治療時(shí)的病程逸艮。為評(píng)估尿Bcl-2水平是否可用于檢測(cè)卵巢癌，收集正常健康志愿者(N=21)和卵巢癌患者(N=34)和原發(fā)性腹膜癌患者(N=2)的尿液，并根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明、利用市售ELISA試劑盒(BenderMedSystems，目錄號(hào)BMS244/3)重復(fù)三次檢測(cè)其Bcl-2。結(jié)果以均值ng/mlBcl-2±S.E.表示。健康志愿者尿中Bcl-2的平均量為0.204ng/ml，而術(shù)前癌腫患者尿中平均量為3.12ng/ml，通常為正常對(duì)照者的至少10倍。Studentt檢驗(yàn)分析顯示，正常和癌癥樣本之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，p<0.00001。對(duì)臨床參數(shù)的比較提示，尿Bcl-2水平與肺瘤分期和分級(jí)的相關(guān)性良好(圖3A和3B)。根據(jù)生產(chǎn)商^兌明、利用市售ELISA試劑盒(Bio-Quant，目錄號(hào)BQ1013T)重復(fù)三次檢測(cè)某些上述相同受試者的血漿樣本中CA125水平。尿BcI-2升高檢測(cè)卵巢癌的敏感性和特異性幾乎均為100%，而目前用于卵巢癌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的血CA125水平〉35U/ml，僅能正確鑒別出68%的卵巢癌患者。為進(jìn)一步測(cè)試尿Bcl-2水平檢測(cè)卵巢癌的準(zhǔn)確性，比較可獲得的卵巢癌患者在初次切除手術(shù)前和首次切除術(shù)(去除所有可見(jiàn)肺瘤)后2周內(nèi)尿Bcl-2水平。對(duì)于收集術(shù)前術(shù)后尿樣的7名患者而言，初次手術(shù)切除肺瘤后Bcl-2水平的下降多達(dá)100%。因而，這些數(shù)據(jù)提示，癌腫是卵巢癌患者尿中Bcl-2增高的來(lái)源。此外，收集了7名患者中5人的后續(xù)臨床隨訪尿樣并測(cè)量其中的Bcl-2，隨訪時(shí)間為初次手術(shù)后7至11個(gè)月不等。在3名隨訪患者中尿Bcl-2仍保持較低水平(#41、43、54)，而2名患者出現(xiàn)升高(#5、27)。初步的病歷回顧提示糾1、43及54患者在隨訪當(dāng)時(shí)正在接受化療，其卵巢癌疾病得到控制。與之相反，病歷回顧提示#5、27患者疾病出現(xiàn)復(fù)發(fā)，而#27患者接受了二次肺瘤切除術(shù)。與臨床信息一致，接受化療且無(wú)明顯或很少殘留疾病的患者中尿Bcl-2水平持續(xù)較低(#41、43、54)。與之相似，尿Bcl-2水平的增高與疾病的復(fù)發(fā)(#5、27)相關(guān)，且隨再次切除術(shù)而降^f氐(#27c)?？傊@些數(shù)據(jù)說(shuō)明利用基于ELISA的測(cè)定對(duì)尿Bcl-2進(jìn)行定量，提供了檢測(cè)卵巢癌的安全、靈敏、特異且經(jīng)濟(jì)的新方法。此外，尿Bcl-2水平可用于監(jiān)測(cè)整個(gè)病程中卵巢癌的存在，可用于預(yù)測(cè)治療和預(yù)后結(jié)局。本發(fā)明的一個(gè)方面包括檢測(cè)受試者癌腫的方法，其包括檢測(cè)受試者生物樣本中的Bcl-2的存在，所述生物樣本例如尿液、血液、腹膜液或腹水，其中Bcl-2水平高于預(yù)設(shè)閾值提示受試者患有癌腫。優(yōu)選該檢測(cè)并非通過(guò)狹線印跡測(cè)定實(shí)施(如可自BioRad購(gòu)買(mǎi))。使用本發(fā)明的方法、裝置及試劑盒進(jìn)行檢測(cè)和/或監(jiān)測(cè)的癌腫，包括但不僅限于乳腺癌(例如浸潤(rùn)性(侵潤(rùn)性)、侵潤(rùn)前、炎性、Paget，s病、轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā))；胃腸il/消化系統(tǒng)癌腫(例如闌尾、膽管、結(jié)腸、食道、膽嚢、胃、小腸、肝、胰腺、直腸和胃)；生殖泌尿系統(tǒng)癌肺(例如腎上腺、膀胱、腎、陰莖、前列腺、睪丸和泌尿道)；婦科癌腫(例如宮頸、子宮內(nèi)膜、輸卵管、印巢、子宮、陰道及外陰)；頭頸癌(例如眼、頭頸、下頜、喉、鼻腔、口腔癌、咽、唾液腺、鼻竇、喉嚨、甲狀腺、舌及扁桃體)；造血/血癌(例如Hodgkin，s病、白血病(急性淋巴細(xì)胞白血病、急性粒細(xì)胞白血病、急性髓系白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、慢性髓系白血病)、多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤及、淋巴結(jié))；骨骼肌肉/軟組織癌腫(例如骨、骨肉瘤、黑素瘤、皮膚(基底細(xì)胞、鱗狀細(xì)胞)、肉瘤(Ewing，s肉瘤、Kaposis肉瘤))；神經(jīng)系統(tǒng)癌腫(例如腦(星形細(xì)胞瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、膠質(zhì)細(xì)胞瘤)、垂體、脊髓)；以及呼吸系統(tǒng)/肺部癌腫(例如肺(腺癌、燕麥細(xì)胞、非小細(xì)胞、小細(xì)胞、鱗狀細(xì)胞)以及間皮瘤)。在某一實(shí)施方案中，癌腫為卵巢癌。在另一實(shí)施方案中，癌腫為選自乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、黑素瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、肉瘤、膀胱癌及頭頸癌的類型。在本發(fā)明方法的某一實(shí)施方案中，檢測(cè)包括(a)使生物樣本與結(jié)合Bcl-2蛋白的結(jié)合劑接觸以形成復(fù)合物；以及(b)檢測(cè)復(fù)合物；并將檢測(cè)復(fù)合物對(duì)應(yīng)于樣本中Bcl-2蛋白的量，其中Bcl-2蛋白增高提示癌腫。在特定實(shí)施方案中，(b)的檢測(cè)還包括向試劑中連接或摻入標(biāo)記，或使用基于ELISA的酶聯(lián)免疫檢測(cè)。任選本發(fā)明的方法還包括在所述Bcl-2檢測(cè)前、檢測(cè)中及檢測(cè)后，檢測(cè)受試者同一生物樣品或不同生物樣品中的癌腫生物標(biāo)志物。在某一實(shí)施方案中，癌腫生物標(biāo)志物為生殖系統(tǒng)癌肺的生物標(biāo)志物，例如婦科癌腫。在另一實(shí)施方案中，生物標(biāo)志物為CA125或OVXI。在實(shí)施Bcl-2檢測(cè)的同時(shí)，受試者血中CA125水平可能增高，也可能并不增高。在某些實(shí)施方案中，受試者患有癌胂如卵巢癌，且為癌腫治療前、治療中或治療后監(jiān)測(cè)受試者的一部分，在若干時(shí)間點(diǎn)定期進(jìn)行檢測(cè)。任選本發(fā)明的方法還包括將生物樣本中Bcl-2的水平與正常對(duì)照樣本中Bcl-2水平進(jìn)行比較，其中生物樣本中Bcl-2水平高于正常對(duì)照樣本水平提示存在癌腫如卵巢癌。在某些實(shí)施方案中，受試者在實(shí)施Bcl-2檢測(cè)時(shí)并無(wú)任何癌肺癥狀。在另一些實(shí)施方案中，受試者在實(shí)施Bcl-2檢測(cè)時(shí)具有一種或多種癌肺表現(xiàn)。例如，就婦科癌腫而言(例如卵巢癌)，婦科癌腫的一種或多種癥狀包括盆腔痛、異常陰道出血、腹脹(abdominalswellingorbloating)、持續(xù)背痛、持續(xù)胃部不適、排便或排尿習(xí)慣改變(如便秘、腹瀉、血便、排氣、稀便、尿頻或尿急、便秘)、性交疼痛、非計(jì)劃的體重減輕10磅或以上、外陰或陰道異常(例如水皰、膚色改變或出現(xiàn)分泌物)、乳房改變(如肺塊、疼痛、乳頭分泌物、下陷、紅或腫)，以及疲乏。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明包括評(píng)估患有或疑似患有癌腫的受試者預(yù)后的方法，其包括a)確定受試者生物樣本如尿液、血液或腹水內(nèi)的Bcl-2水平；b)將步驟(a)中確定的水平與未患癌腫的正常受試者生物樣本中已知的Bd-2范圍進(jìn)行比較；且c)根據(jù)步驟(b)的比較確定受試者預(yù)后，其中步驟(a)中Bcl-2水平高提示選艮型癌肺(aggressiveformofcancer),因而預(yù)后較差。術(shù)語(yǔ)"檢測(cè)"包括測(cè)定或確定是否存在目標(biāo)Bcl-2(Bcl-2編碼核#列或Bcl-2基因產(chǎn)物(多肽))、其亞基或試劑結(jié)合目標(biāo)組合物等，或測(cè)定、查問(wèn)、確i^、建立或確定婦科癌腫、轉(zhuǎn)移、分期或其他類似病癥的一個(gè)或幾個(gè)事實(shí)特征。該術(shù)語(yǔ)包括Bcl-2及其他癌肺標(biāo)志物在診斷、預(yù)后及監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用。該術(shù)語(yǔ)包括定量、半定量及定性檢測(cè)方法。在涉及Bcl-2蛋白(相對(duì)于編碼Bcl-2蛋白的核酸分子而言)檢測(cè)的本發(fā)明實(shí)施方案中，檢測(cè)方法優(yōu)選為基于ELISA的方法。優(yōu)選在本發(fā)明的多種實(shí)施方案中，該檢測(cè)方法提供了有關(guān)受試者樣本中Bd-2存在與否及其量的信息輸出(即讀數(shù)或信號(hào))。例如，該輸出可為定性(例如"陽(yáng)性"或"陰性")，或定量的(例如用每毫升納克表示的濃度)。在某一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過(guò)定量受試者生物樣本如尿中Bd-2蛋白或其編碼核酸(DNA或RNA),從而檢測(cè)受試者癌腫的方法，其包括，(a)使該生物樣本與直接或間接標(biāo)記有可檢測(cè)物質(zhì)的Bcl-2特異性抗體接觸(反應(yīng))；以及(b)檢測(cè)該可檢測(cè)物質(zhì)。在某一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過(guò)定量受試者生物樣本如尿液或血液中Bcl-2，從而診斷和/或監(jiān)測(cè)受試者癌腫的方法，其包括(a)使該生物樣本與直接或間接標(biāo)記有可檢測(cè)物質(zhì)的Bcl-2特異性抗體反應(yīng)；以及(b)檢測(cè)該可檢測(cè)物質(zhì)。本發(fā)明方法的實(shí)施方案包括(a)使受試者生物樣本與直接或間接酶標(biāo)記的Bcl-2特異性抗體接觸；(b)加入該酶的底物，其中所選擇的底物能4吏底物或酶和底物的反應(yīng)產(chǎn)物形成焚光復(fù)合物；(c)通過(guò)測(cè)量焚光復(fù)合物的熒光，定量樣本中的Bcl-2;以及(d)將該定量水平與標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較。優(yōu)選的本發(fā)明實(shí)施方案包括以下步驟(a)將生物樣本與直接或間接標(biāo)記有可檢測(cè)物質(zhì)的Bcl-2特異性第一抗體，以及Bcl-2特異的固化第二抗體孵育；(b)將第一抗體與第二抗體分開(kāi)，提供第一抗體相和第二抗體相；(c)檢測(cè)第一或第二抗體相中可檢測(cè)的物質(zhì)，從而定量該生物樣本中的Bcl-2;并(d)將定量的Bcl-2與標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較。本發(fā)明方法中所用的標(biāo)準(zhǔn)是指，健康對(duì)照受試者、良性疾病患者(例如良性婦科疾病)、早期婦科癌腫患者樣本或受試者的其他樣本的Bcl-2水平。Bcl-2水平相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)增高可能提示癌腫，如早期或晚期卵巢癌。本發(fā)明也涉及將本文所述的方法、裝置及試劑盒與一種或多種其他癌腫標(biāo)志物(生物標(biāo)志物)聯(lián)合使用。因此，本發(fā)明涉及分析生物樣本中是否存在Bd-2、并分析同一樣本或同一受試者另一生物樣本中其他特異性提示癌腫的標(biāo)志物的方法?？捎趯?shí)施Bcl-2檢測(cè)前、檢測(cè)中和/或檢測(cè)后檢測(cè)該一種或多種其他標(biāo)志物。標(biāo)志物的實(shí)例包括CA125、LPA及OVXI。在優(yōu)選實(shí)施方案中，標(biāo)志物為Bcl-2和CA125?？砂ㄎ镔|(zhì)以改進(jìn)本文所述的方法、裝置和試劑盒，所述物質(zhì)用于檢測(cè)其他標(biāo)志物或標(biāo)志物編碼核酸?？膳c本發(fā)明聯(lián)用的癌腫標(biāo)志物包括但不僅限于a甲胎蛋白(AFP)，如用于胰腺、腎、卵巢、宮頸及睪丸癌；癌胚抗原(CEA)，如用于肺、胰腺、腎、乳腺、子宮、肝、胃及結(jié)直腸癌；糖抗原15-3(CA15-3)，如用于肺、胰腺、乳腺、卵巢及肝癌；糖抗原19-9(CA19-9)，如用于肺、卵巢、子宮、肝、胃、結(jié)直腸及膽管癌；癌抗原125(CA125),如用于肺、胰腺、乳腺、卵巢、宮頸、子宮、肝、胃及結(jié)直腸癌；游離前列腺特異抗原和前列腺特異抗原-otl(PSA)，用于前列腺癌；游離前列腺特異抗原(PSAF)，用于前列腺和結(jié)直腸癌；前列腺特異抗原-al抗胰凝乳蛋白酶復(fù)合物(PSAC)，用于前列腺癌；前列腺酸性砩酸酶(PAP)，用于前列腺癌；人甲狀腺球蛋白(hTG),用于甲狀腺癌或Wilm，s瘤；人絨毛膜促性腺激素P(hCGb)，如用于肺、胰腺、腎、卵巢、子宮、睪丸、肝、結(jié)直腸、膀胱及腦癌腫；鐵蛋白(Ferr)，如用于肺癌、睪丸癌、喉癌、Burkitt，s淋巴瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤及白血??；神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)，用于肺癌、甲狀腺癌、Wilm，s瘤及神經(jīng)母細(xì)胞瘤；白介素2(IL-2)，用于腎癌及多發(fā)性骨髓瘤；白介素6(IL-6)，用于腎癌、乳腺癌、卵巢癌及多發(fā)性骨髓瘤；P2微球蛋白(B2M)，用于腎癌、卵巢癌、前列腺癌、白血病、多發(fā)性骨髓瘤及淋巴瘤；以及ot2微球蛋白(A2M),用于前列腺癌。上述癌腫標(biāo)志物具有診斷和/預(yù)后意義的生物樣本(如血液或尿液)的選擇可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。如上所述，本發(fā)明提供了通過(guò)檢測(cè)受試者生物樣本中Bcl-2，對(duì)受試者癌腫如卵巢癌進(jìn)行監(jiān)測(cè)、診斷或預(yù)后的方法。在某一實(shí)施方案中，本發(fā)明包括使該樣本與直接或間接標(biāo)記有可檢測(cè)物質(zhì)的Bcl-2特異性抗體接觸，并檢測(cè)該可檢測(cè)物質(zhì)。本發(fā)明的方法可用于檢測(cè)相對(duì)于非疾病狀態(tài)Bcl-2過(guò)多或過(guò)少，或用于檢測(cè)是否存在經(jīng)修飾的Bcl-2(例如小于全長(zhǎng))，后者與疾病狀態(tài)(如卵巢癌)或向疾病狀態(tài)的*相關(guān)。本文所述的方法可用于評(píng)估存在惡性或惡性前細(xì)胞的概率。此類方法可用于檢測(cè)癌肺、定量其生長(zhǎng)，并協(xié)助對(duì)婦科癌腫進(jìn)行診斷和預(yù)后。這些方法可用于檢測(cè)癌腫轉(zhuǎn)移，并證實(shí)手術(shù)、癌腫化療和/或放療后是否除去了所有的腫瘤組織。它們還可用于監(jiān)測(cè)癌肺化療及癌腫復(fù)發(fā)。本發(fā)明方法尤其適用于診斷早期卵巢癌(例如當(dāng)受試者無(wú)癥狀時(shí))，以及預(yù)后卵巢癌疾病的*和死亡率。正如本文所述，樣本(例如尿液、血清、血漿、全血、腹水)中檢測(cè)的Bcl-2水平相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)水平(例如正常人或良性疾病的水平)的增高，提示疾病逸艮狀態(tài)、漿液型組織學(xué)類型、次佳切除、大的殘存肺瘤，和/或疾病#及致死的風(fēng)險(xiǎn)增加。術(shù)語(yǔ)"樣本"、"生物樣本"等是指已知或可能表達(dá)或含有Bcl-2的材料類型，例如尿液。測(cè)試樣本可自來(lái)源獲取后直接使用，或經(jīng)過(guò)預(yù)處理以修飾所取樣本的特性。樣本可來(lái)自任何生物來(lái)源，例如組織或提取物，包括細(xì)胞(如腫瘤細(xì)胞)及生理性液體，例如全血、血漿、血清、皿液、腹水等。樣本可獲自動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選人類?？墒褂萌我夥椒▽?duì)樣本進(jìn)行預(yù)處理，和/或利用任意方^t而不干擾測(cè)定的培養(yǎng)基配制樣本?？稍谑褂们疤幚順颖荆鐝难褐兄苽溲獫{、稀釋粘液、向樣本如尿液中添加一種或多種蛋白酶抑制劑(例如4-(2氨乙基)-苯磺酰氟、EDTA、抑酶醛肽，和/或胃蛋白酶抑制劑)等。樣本處理包括過(guò)濾、蒸餾、提取、濃縮、滅活干擾成分、添加試劑等?？稍诙喾N生物樣本(包括組織或其提取物)中檢測(cè)是否存在bcl-2。優(yōu)選在人尿液中檢測(cè)Bcl-2。在本發(fā)明實(shí)施方案中，本文所述的方法通過(guò)定量受試者生物樣本中的Bcl-2，用于診斷和監(jiān)測(cè)婦科癌腫。優(yōu)選將待測(cè)受試者樣本中定量Bcl-2的量，與該受試者的另一樣本或其早期樣本的定量水平，或?qū)φ諛颖镜亩克竭M(jìn)行比較?？梢酝ㄟ^(guò)前瞻性和/或回顧性統(tǒng)計(jì)學(xué)研究，確定來(lái)自健康受試者的對(duì)照樣本水平。選擇無(wú)臨床顯性疾病或異常的健康受試者進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)研究。根據(jù)Bcl-2水平相對(duì)于對(duì)照樣本或相同受試者以前定量水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可以4故出診斷。術(shù)語(yǔ)"Bcl-2"是指人B細(xì)胞淋巴瘤蛋白2(也稱為B細(xì)胞CLL/淋巴瘤2)，系一種能阻斷某些細(xì)胞如淋巴細(xì)胞凋亡的線粒體外整合蛋白(integraloutermitochondrialprotein,ClearyMX.等人,Cell,1986，47(1》1928;TsujimotoY.和CroceCM.，Proc.Natl.Acad.Sd.USA,1986，83:5214-5218，均在本文全部引用作為參考)。術(shù)語(yǔ)"Bcl-2"包括編碼Bcl-2基因產(chǎn)物(多肽)的核紗列(如GenBank登錄號(hào)M14745;SEQIDNO:l),以及Bcl-2多肽(如GenBank登錄號(hào)AAA35591;SEQIDNO:2)。該術(shù)語(yǔ)包括GenBank登錄號(hào)M14745和AAA35591的人Bcl-2所有同源物、天然存在的等位基因變體、同種型及前體。一般而言，天然存在的人Bcl-2等位基因變體與GenBank登錄號(hào)M14745和AAA35591所示的序列具有顯著的序列同源性(70-90%)。等位基因變體可能含有Bcl-2序列的保守性氨基酸取代，或含有某一Bd-2同源物中相應(yīng)位點(diǎn)的氨基酸取代。由于不同剪切產(chǎn)生的oc和P兩種轉(zhuǎn)錄子變體在其C末端有所不同。a變體(GenBank登錄號(hào)NP—000624(SEQIDNO:4)以及GenBank登錄號(hào)NM—000633(SEQIDNO:3))是較長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄子，編碼較長(zhǎng)的同種型(a)，而P變體較短(GenBank登錄號(hào)NM—000648(SEQIDNO:6);GenBank登錄號(hào)NP—000657(SEQIDNO:5))。與a變體相比，P變體的3，UTR和編碼區(qū)，以及C末端不同。在某一特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法、裝置和試劑盒具有Bcl-2(例如SEQIDNO:1、2、3、4、5和/或6)特異性，但在本領(lǐng)域已知的"Bcl-2樣"分子的核酸分子或多肽(如使用Bcl-2特異性(如免疫反應(yīng)性)結(jié)合劑，但對(duì)Bcl-2樣分子并不反應(yīng))并無(wú)特異性，例如Ruben等人，2002年8月8日公開(kāi)的美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)2002/0106731Al中所述的，該申請(qǐng)于本文全部引用作為參考。術(shù)語(yǔ)"受試者"和"患者，，本文可互換使用，指可罹患癌腫的溫血?jiǎng)游锶绮溉閯?dòng)物。對(duì)于某些癌腫而言，受試者為女性或雌性非人哺乳動(dòng)物。對(duì)于另一些癌腫而言，受試者為男性或雄性非人哺乳動(dòng)物。能夠在受試者生物樣本中檢測(cè)Bcl-2的物質(zhì)，能夠與Bcl-2多肽或編碼Bcl-2的核酸分子發(fā)生反應(yīng)或結(jié)合。此類物質(zhì)的實(shí)例(本文也稱為結(jié)合劑)包括但不僅限于，結(jié)合Bcl-2的Bcl-2抗體或其片段、Bcl-2結(jié)合配偶體，以及可與Bcl-2多肽編碼核酸分子雜交的核酸分子。優(yōu)選該結(jié)合劑標(biāo)記有可檢測(cè)物質(zhì)(如可檢測(cè)部分)。結(jié)合劑本身也可作用如標(biāo)記。Bcl-2抗體可從科研或商業(yè)途徑得到用于本發(fā)明方法的Bcl-2特異性抗體?；蛘?，也可^f吏用分離的天然Bcl-2或重組Bcl-2制備抗體、單克隆或多克隆抗體以及免疫活性片段(例如Fab或(Fab)2片段)、抗體重鏈、抗體輕鏈、人源化抗體、遺傳工程生產(chǎn)的單鏈Fv分子(Ladne等人.，美國(guó)專利號(hào)4，946，778)，或嵌合抗體如含有鼠抗體結(jié)合特異性但其他部分來(lái)源于人的抗體?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備抗體，包括單克隆和多克隆抗體、片段及嵌合體。優(yōu)選如用于本發(fā)明方法的抗體與Bcl-2結(jié)合的Ka大于或等于107M，則該抗體具有Bcl-2反應(yīng)性。在本發(fā)明的夾心免疫測(cè)定中，使用小鼠多克隆抗體及兔多克隆抗體。為生產(chǎn)單克隆抗體，用Bcl-2蛋白或多肽接種宿主哺乳動(dòng)物然后進(jìn)行加強(qiáng)。在末次加強(qiáng)數(shù)天后收集接種哺乳動(dòng)物的脾臟。根據(jù)Kohler和Milstein(Nature,1975,256:495-497)所述的一般方法，將脾臟的細(xì)胞懸浮液與腫瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。肽片段應(yīng)當(dāng)含有足夠的氨基酸殘基以用于定義待測(cè)Bcl-2分子的表位。若該片段太短而不具有免疫原性，可將其綴合于載體分子。某些合適的載體分子包括鑰孔血藍(lán)蛋白和牛血清白蛋白。可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法實(shí)施綴合。此類方法之一是將片段的半胱氨酸殘基與載體分子中的半胱氨酸殘基結(jié)合?？捎帽绢I(lǐng)域已知的方法合成該肽片段。Stuart和Young在"SolidPhasePeptideSynthesis"第二版，PierceChemicalCompany(1984)中描述了一些合適的方法?？赏ㄟ^(guò)技術(shù)人員已知的多種方法完成抗體或片段的純化，包括硫酸銨或硫酸鈉沉淀法后對(duì)生理鹽水進(jìn)行透析、離子交換色i普法、親和或免疫親和色譜法，以及凝膠過(guò)濾、區(qū)帶電泳等(Godingin,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,第二版，104-126頁(yè),Orlando,FIa.，AcademicPress)。優(yōu)選使用純化抗體或純化的含有至少一部分Bcl-2結(jié)合區(qū)域的抗體片段，包括如Fv、F(ab，)2、Fab，片段(Harlow和Lane,1988，AntibodyColdSpringHarbor)，來(lái)檢測(cè)婦科癌腫患者或具有患病風(fēng)險(xiǎn)者體液中的Bcl-2，優(yōu)選于卵巢癌患者尿液或血液中檢測(cè)。為用于檢測(cè)和/或監(jiān)測(cè)癌腫，可將純化抗體直接或通過(guò)連接物共價(jià)連于可用作報(bào)告基團(tuán)的化合物上，以便檢測(cè)Bcl-2的存在。多種不同類型物質(zhì)可用作報(bào)告基團(tuán)，包括但不僅限于酶、染料、放射活性金屬及非金屬同位素、產(chǎn)熒光化合物(fluorogeniccompound)、熒光化合物等。用于檢測(cè)、監(jiān)測(cè)的本發(fā)明抗體(或其片段)的抗體綴合物的制備方法描述于美國(guó)專利號(hào)4,671,958、4，741，卯0和4,867,973。本發(fā)明的一方面中，可于已知的Bcl-2基因序列及其編碼的氨基#列中鑒定優(yōu)選的結(jié)合表位，并將其用于產(chǎn)生具有高度結(jié)合親和力的Bcl-2抗體。同時(shí)，對(duì)Bcl-2上結(jié)合表位的鑒定可用于設(shè)計(jì)和構(gòu)建優(yōu)選抗體。例如，可重組表達(dá)編碼優(yōu)選Bcl-2表位的DNA，并用于選擇與該表位選擇性結(jié)合的抗體。然后于足以使抗體與Bd-2上特異性結(jié)合表位發(fā)生特異性結(jié)合的條件中，將所選抗體暴露于樣本，隨后檢測(cè)形成的復(fù)合物的量。文獻(xiàn)中已有對(duì)特異性抗體方法的成熟理解和描述。有關(guān)其制備更詳細(xì)的描述可見(jiàn)于如PracticalImmunology,Butt,W.R.編著，MarcelDekker，NewYork,1984中所述。本發(fā)明也涉及Bcl-2抗體的檢測(cè)。Bcl-2是婦科癌腫特異性標(biāo)志物。因此，對(duì)受試者生物液體中Bcl-2抗體的檢測(cè)有助于診斷婦科癌腫。蛋白質(zhì)結(jié)合測(cè)定與Bcl-2特異性反應(yīng)的抗體或^t生物，如酶綴合物或標(biāo)記f汙生物，可用于檢測(cè)多種生物樣本中的Bcl-2，例如可將其用于任意已知的基于蛋白質(zhì)中抗原決定簇和抗體結(jié)合反應(yīng)的免疫測(cè)定。此類測(cè)定的實(shí)例為放射性免疫測(cè)定、酶免疫測(cè)定(例如ELISA)、免疫熒光法、免疫沉淀法、乳膠凝集法、血凝法及組織化學(xué)測(cè)試。可將Bcl-2特異性抗體標(biāo)記可檢測(cè)物質(zhì)，并基于該可檢測(cè)物質(zhì)的存在在生物樣本中進(jìn)行定位?？蓹z測(cè)物質(zhì)的實(shí)例包括但不僅限于，以下放射性同位素(如3H、"C、35S、1251、1311)、熒光標(biāo)記(如FITC、羅丹明、鑭系熒光物)、發(fā)光標(biāo)記如魯米諾、酶標(biāo)記(如辣才艮過(guò)氧化物酶、P半乳糖普酶、熒光素酶、堿性磷酸酶、乙酰膽堿酯酶)、生物素化基團(tuán)(可被標(biāo)記的親和素檢測(cè)，例如可通過(guò)光學(xué)或量熱法檢測(cè)的含有熒光標(biāo)記或酶活性的鏈酶親和素)、可由第二報(bào)告子識(shí)別的預(yù)定多^i位(如亮氨酸拉鏈序列、第二抗體的結(jié)合位點(diǎn)、金屬結(jié)合位點(diǎn)、表位標(biāo)志)。也可使用間接方法，其中初級(jí)抗原抗體反應(yīng)因第二抗體的引入而,iUt大，所述第二抗體對(duì)Bcl-2反應(yīng)性抗體具有特異性。例如，若Bcl-2特異性抗體為兔IgG抗體，則第二抗體可為標(biāo)記有本文所迷可檢測(cè)物質(zhì)的羊抗兔y球蛋白。本領(lǐng)域普通4支術(shù)人員可熟練完成上述綴合或標(biāo)記抗體的方法。(見(jiàn)如Imman，MethodsInEnzymology，34巻，AffinityTechniques,EnzymePurification:B部分，Jakoby和Wichek編著，AcademicPress,NewYork,30頁(yè)，1974;以及Wilchek和Bayer,"TheAvidin-BiotinComplexinBioanalyticalApplications"，Anal.Biochem.171:1-32,1988，其中有關(guān)用酶或配體結(jié)合部分綴合或標(biāo)記抗體的方法)。時(shí)間分辨熒光測(cè)定法可用于檢測(cè)信號(hào)。如ChristopoulosT.K.和I)iamandisE.P，,Anal.Chem.，1992:64:342-346所述的方法可用于常規(guī)時(shí)間分辨測(cè)定法。因此，本發(fā)明實(shí)施方案提供了一種方法，其中用酶標(biāo)記Bcl-2抗體，選擇該酶的底物^f吏該底物，或酶和底物的反應(yīng)產(chǎn)物可與鑭系金屬形成熒光復(fù)合物。加入鑭系金屬，并通過(guò)測(cè)量熒光復(fù)合物的熒光強(qiáng)度定量樣本中的Bcl-2?？芍苯踊蜷g接用酶標(biāo)記Bcl-2特異性抗體。基于該酶底物，或酶與底物的反應(yīng)產(chǎn)物與鑭系金屬如銪及鋱復(fù)合的能力，對(duì)酶加以選擇。合適的酶實(shí)例包括堿性磷酸酶和P半乳糖苷酶。優(yōu)選該酶為堿性磷酸酶。也可間接用酶標(biāo)記Bcl-2抗體。例如，可將抗體綴合于配體結(jié)合對(duì)的一個(gè)配偶體，而將酶偶聯(lián)于該配體結(jié)合對(duì)的另一配偶體。代表性實(shí)例包括親和素-生物素，以及核黃素-核黃素結(jié)合蛋白。優(yōu)選該抗體為生物素化，而酶偶聯(lián)于鏈酶親和素。在本方法的某一實(shí)施方案中，添加酶的底物，從而檢測(cè)結(jié)合于樣本中Bcl-2的抗體。選擇底物使當(dāng)存在鑭系金屬時(shí)(如銪、鋱、釤及鏑，優(yōu)選銪及鋱)，底物，或酶和底物的反應(yīng)產(chǎn)物與鑭系金屬形成熒光復(fù)合物。可提供此類熒光復(fù)合物的酶及酶的底物實(shí)例描述于Diamandis的美國(guó)專利號(hào)5,3112,922。例如，當(dāng)抗體直接或間接標(biāo)記堿性磷酸酶時(shí)，該方法使用的底物可為4-甲基傘形酮磷酸酯(4-methylumbeliferylphosphate)或5-氟7JC楊酸磷酸酯(5-fluorpsalicylphosphate)。通常使用時(shí)間分辨熒光儀如CyberFluor615Immoanalyzer(NordionInternational,KanataOntario),測(cè)量復(fù)合物的熒光強(qiáng)度?？蓪颖?、Bcl-2特異性抗體或Bcl-2固化于載體上。合適載體的實(shí)例為瓊脂糖、纖維素、葡聚糖、葡聚糖凝膠，瓊脂糖、脂質(zhì)體、羧甲基纖維素聚苯乙烯、濾紙、離子交換樹(shù)脂、塑料薄膜、塑料管、玻璃珠、聚氨甲基乙烯醚-馬來(lái)酸共聚物、氨基酸共聚物、乙烯-馬來(lái)酸共聚物、尼龍、絲等。栽體形狀可如管、測(cè)試平板、孑L、珠、盤(pán)、球等?？赏ㄟ^(guò)已知的化學(xué)或物理方法如溴化氰偶聯(lián)，將金屬與合適的不可溶性載體反應(yīng)來(lái)制備固定的抗體。本發(fā)明的某一實(shí)施方案，提供了通過(guò)免疫測(cè)定測(cè)量Bcl-2來(lái)確定適當(dāng)樣本如尿液中Bcl-2的模式。對(duì)于技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，多種免疫測(cè)定方法可用于測(cè)量Bcl-2。一般而言，Bcl-2免疫測(cè)定方法可為竟?fàn)幮曰蚍蔷範(fàn)幮苑椒?。竟?fàn)幮苑椒ㄒ话闶褂肂cl-2的固化或固定抗體(抗Bcl-2)及Bcl-2的標(biāo)記形式。樣本Bcl-2及標(biāo)記Bcl-2竟?fàn)幗Y(jié)合抗Bcl-2。將產(chǎn)生的與抗Bcl-2結(jié)合的標(biāo)記Bcl-2(結(jié)合級(jí)分)與未結(jié)合的Bcl-2(非結(jié)合級(jí)分)分離后，測(cè)量結(jié)合或非結(jié)合級(jí)分的標(biāo)記量，并以任意常規(guī)方法將其與生物樣本中Bcl-2的量相關(guān)，例如與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比。優(yōu)選使用非竟?fàn)幮苑椒ù_定Bcl-2，其中最常用的方法為夾心法。在該測(cè)定中，使用了兩種抗Bcl-2抗體?？笲cl-2抗體之一為直接或間接標(biāo)記的(也稱為檢測(cè)抗體)，另一則為固化或固定的(也稱為捕獲抗體)?？蓪⒉东@及檢測(cè)抗體同時(shí)或順序接觸生物樣本。將捕獲抗體與樣本孵育，并在其后的預(yù)定時(shí)間添加檢測(cè)抗體(有時(shí)稱為"前向"方法)，可完成順序方法；或者可先將檢測(cè)抗體與樣本孵育然后加入捕獲抗體(有時(shí)稱為"反向"方法)，來(lái)完成順序方法。經(jīng)過(guò)必要的孵育后，將捕獲抗體從液態(tài)測(cè)試混合物中分離以完成測(cè)定，并測(cè)量至少一部分分離的捕獲抗體相或剩余液態(tài)測(cè)試混合物中的標(biāo)記。一般而言，在捕獲抗體相進(jìn)行測(cè)量，因?yàn)槠渲泻胁东@抗體及檢測(cè)抗體結(jié)合(夾心)的Bd-2。在通常的Bcl-2雙位點(diǎn)免疫測(cè)定中，捕獲及檢測(cè)抗體之一或兩者均為多克隆抗體。檢測(cè)抗體所用的標(biāo)記可選自本領(lǐng)域已知的任意常規(guī)標(biāo)記。如同蛋白質(zhì)檢測(cè)測(cè)定的其他實(shí)施方案一樣，該標(biāo)記可為如酶或化學(xué)發(fā)光部分，或放射活性同位素、熒光素；可檢測(cè)配體(例如可通過(guò)標(biāo)記的配體結(jié)合配偶體進(jìn)行二次結(jié)合檢測(cè))等。優(yōu)選抗體標(biāo)記有可通過(guò)添加底物而檢測(cè)的酶，其中選擇底物使酶與底物的反應(yīng)產(chǎn)物形成熒光復(fù)合物。選擇捕獲抗體，從而使其提供與剩余測(cè)試混合物分離的模式。因此，可向測(cè)定中引入已固化或非可溶形式的捕獲抗體，或者捕獲抗體也可為固定形式，該形式可在向測(cè)定中引入捕獲抗體后即刻完成固化。固化的捕獲抗體中可含有與固相共價(jià)或非共價(jià)相連的抗體，所述固相如磁性顆粒、乳膠顆粒、微滴定多孔平板、珠、槽或其他反應(yīng)容器。固定捕獲抗體的實(shí)例為經(jīng)配體部分(如半抗原、生物素等)化學(xué)修飾的抗體，所述抗體在接觸配體固化形式的結(jié)合配偶體(如抗體、親和素等)后即被固定。在某一實(shí)施方案中，可使用一系列結(jié)合于固相的捕獲抗體的特異性抗體來(lái)固定捕獲抗體。本發(fā)明中具體的夾心免疫測(cè)定法使用兩種與Bcl-2反應(yīng)的抗體，酶標(biāo)記的對(duì)Bcl-2反應(yīng)性抗體具有特異性的第二抗體，以及產(chǎn)熒光的酶底物。在某一實(shí)施方案中，酶為堿性磷酸酶(ALP)，而底物為5-氟水楊酸磷酸酯。ALP裂解出產(chǎn)焚光底物5-氟水楊酸磷酸酯的磷酸基團(tuán)，產(chǎn)生5-氟水楊酸(FSA)。5-氟水楊酸隨后可形成FSA-Tb(3+)-EDTA形式的強(qiáng)熒光三元復(fù)合物，后者可通過(guò)時(shí)間分辨模式測(cè)量Tb"熒光而進(jìn)行定量。一般使用本文所述的時(shí)間分辨熒光儀測(cè)量熒光強(qiáng)度。上述免疫測(cè)定方法和形式僅為舉例而并不具有限制性，因?yàn)橐话愣?，認(rèn)為任意免疫測(cè)定方法或形式均可用于本發(fā)明。本發(fā)明的檢測(cè)方法、裝置及試劑盒可使用納米線傳感技術(shù)(Zhen等人，NatureBiotechnology,2005,23(10):1294誦1301;Lieber等人，Anal.Chem"2006，78(13):4260-4269，均在本文引用作為參考)，或微梁諧振技術(shù)(Lee等人，Biosens.Bioelectron，2005，20(10):2157-2162;Wee等人.，Biosens.Bioelectron.，2005，20(10):1932-1938;Campbell和Mutharasan，Biosens.Bioelectron.，2005，21(3):462-473;Campbell和Mutharasan,Biosens.Bioelectron"2005，21(4):597-607;Hwang等人，LabChip,2004，4(6):547-552;Mukhopadhyay等人，Nano.Lett,2005，5(12):2835畫(huà)2388,均在本文引用作為參考)檢測(cè)樣本中的Bcl-2。此外，Huang等人描述了在市售表面等離子體共振生物傳感器中進(jìn)行前列腺特異性抗原免疫測(cè)定(Biosens.Bioelectron"2005，21(3):483-4卯，本文引用作為參考)，可修改其用于檢測(cè)Bcl-2。高靈敏度小型免疫測(cè)定也可用于Bcl-2檢領(lǐng)，KCesaro-Tadic等人，LabChip,2004，4(6):563畫(huà)569;Zimmerman等人，Biomed.Microdevices，2005,7(2):99-110，本文均引用作為參考)。核酸核酸包括與Bcl-2編碼核酸雜交的天然核酸、寡核苷酸、反義寡核普酸以及合成寡核苷酸，均可用作試劑來(lái)檢測(cè)婦科癌腫患者或具有婦科癌肺患病風(fēng)險(xiǎn)者生物樣本中的Bcl-2，優(yōu)選對(duì)卵巢癌患者或具有卵巢癌患病風(fēng)險(xiǎn)者的尿液進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明涉及使用對(duì)應(yīng)于Bcl-2編碼序列的核酸序列及其互補(bǔ)序列，以及與Bcl-2轉(zhuǎn)錄物編碼序列較上游或較下游的序列(例如5，及3，非翻譯區(qū)中含有的序列或延伸至其中的序列)互補(bǔ)的序列，作為檢測(cè)婦科癌腫患者或具有婦科癌肺患病風(fēng)險(xiǎn)者生物樣本中的Bcl-2表達(dá)的試劑，優(yōu)選對(duì)卵巢癌患者或具有卵巢癌患病風(fēng)險(xiǎn)者的尿液進(jìn)行檢測(cè)。優(yōu)選用于檢測(cè)生物樣本中Bcl-2的寡核苷酸為與編碼Bcl-2的cDNA序列至少部分互補(bǔ)的寡核苷酸。這些互補(bǔ)序列為本領(lǐng)域已知的"反義，，序列。這些寡核苷酸可為寡核糖核苷酸或寡脫氧核糖核苷酸。此外，寡核苷酸可為由具有生物意義的核苷酸形成的寡聚物，即A(腺嘌呤)、dA(脫氧腺嘌呤)、G(鳥(niǎo)嘌呤)、dG(脫氧鳥(niǎo)嘌呤)、C(胞嘧啶)、dC(脫氧胞嘧啶)、T(胸腺嘧啶)以及U(尿嘧啶)，或經(jīng)修飾的寡核苷酸類型，例如用甲基或硫原子取代核苷酸間的磷酸二酯鍵內(nèi)的磷酸氧原子。此外，這些核苷酸本身和/或核糖部分可經(jīng)過(guò)修飾。可利用本領(lǐng)域任意熟知的化學(xué)寡核苷酸合成方法，化學(xué)合成寡核苷酸。例如，可使用任意市售自動(dòng)核酸合成儀制備寡核苦酸?；蛘咄ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)重組I)NA技術(shù)如誘導(dǎo)非編碼鏈的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生寡核苷酸。可將編碼Bcl-2的DNA序列插入重組DNA系統(tǒng)，例如以反向插入合適的啟動(dòng)子下游，從而使非編碼鏈進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。雖然可以使用任意長(zhǎng)度的寡核苷酸雜交Bcl-2編碼核酸，優(yōu)選通常為8-100個(gè)核苷酸的寡核苷酸。最優(yōu)選用于尿樣中Bcl-2檢測(cè)的寡核苷酸，為15-50個(gè)核苷酸長(zhǎng)的寡核苷酸。然后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離并純化用于雜交Bcl-2核酸分子的寡核苷酸(化學(xué)合成或是通過(guò)重組DNA技術(shù)得到)，并優(yōu)選通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記方法進(jìn)行標(biāo)記(如用35S或32P)。本發(fā)明也涉及寡核苷酸對(duì)用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，以檢測(cè)生物樣本中Bcl-2的表達(dá)。寡核苷酸對(duì)包括正向Bcl-2引物和反向Bcl-2引物?？赏ㄟ^(guò)核酸雜交方法確定患者樣本中的Bcl-2，例如但并不僅限于Northern印跡分析、點(diǎn)印跡、Southern印跡分析、原位熒光雜交(FISH)和PCR。色鐠法(優(yōu)選HPLC)及其他已知的測(cè)定也可用于確定樣本中Bcl-2的信4吏RNA水平。Bcl-2編碼核酸分子可見(jiàn)于Bcl陽(yáng)性癌腫細(xì)胞的生物體液中，所述Bcl陽(yáng)性癌腫細(xì)胞系脫落或釋放至所檢測(cè)液體中所致。本發(fā)明的某一方面涉及核酸作為檢測(cè)患者生物樣本Bcl-2的試劑的用途，其中所述核酸經(jīng)過(guò)標(biāo)記。核酸試劑可標(biāo)記放射活性標(biāo)記、熒光標(biāo)記、酶、化學(xué)發(fā)光標(biāo)志、比色標(biāo)志，或其他上述討論的或本領(lǐng)域已知的標(biāo)記或標(biāo)志。本發(fā)明的另一方面涉及使用Northern印跡分析檢測(cè)體液樣本中是否存在Bcl-2mRNA。該分析的第一步涉及通過(guò)凝膠電泳分離出含有Bcl-2核酸的樣本。然后將*的核酸轉(zhuǎn)移至硝化纖維素濾膜(filter)或其他濾膜上。然后將標(biāo)記寡核苷酸于適當(dāng)雜交條件下暴露于濾膜，所述雜交條件如42。C下50%曱醛、5xSSPE、2xDenhardt，s溶液、0.1%SDS，如MolecularCloning:ALaboratoryManual,Maniatis等人(1982，CSHLaboratory)中所述。其他本領(lǐng)域已知的有用方法包括溶液雜交、點(diǎn)及狹線RNA雜交以瓦基于探針的微陣列。利用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)量雜交片段的放射活性，定量患者生物液體中含有的Bcl-2核酸的量。點(diǎn)印跡涉及將含有目標(biāo)核酸的樣本加樣至膜上?？捎诩訕又聊ど锨盎蚝笞冃院怂帷⒛づc標(biāo)記探針一同孵育。點(diǎn)印跡方法為技術(shù)人員所熟知，且更詳細(xì)描述于美國(guó)專利號(hào)4,582,789及4,617,261中，其公開(kāi)在本文引用作為參考。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是擴(kuò)增核酸樣本中含有的一條或多條特定核酸序列的方法，該法使用聚合反應(yīng)所需的引物及試劑，并檢測(cè)擴(kuò)增序列。一種引物的延伸產(chǎn)物若與另一雜交,即成為產(chǎn)生所需特定核酸序列的模板，反之亦然，重復(fù)該過(guò)程足夠多次以產(chǎn)生所需量的序列。技術(shù)人員檢測(cè)所需序列是否存在(美國(guó)專利號(hào)4，683，195)通常使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。技術(shù)人員常規(guī)實(shí)施用于檢測(cè)所需序列的PCR特定實(shí)例AA轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR;Saiki等人，Science,1985，230:1350;Scharf等人，Science,1986，233:1076)。RT-PCR涉及從生物液體中分離總RNA、在識(shí)別所需核*列的引物存在時(shí)變性RNA、使用該引物通過(guò)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生RNA的cDNA拷貝、使用特定引物通過(guò)PCR擴(kuò)增cDNA，并通過(guò)電泳法或技術(shù)人員已知的其他方法檢測(cè)擴(kuò)增的cDNA。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在婦科癌腫患者或具有婦科癌腫患病風(fēng)險(xiǎn)者的生物液體(優(yōu)選卵巢癌患者或具有卵巢癌患病風(fēng)險(xiǎn)者的尿液)中檢測(cè)Bcl-2核酸的方法，包括Northern印跡分析、點(diǎn)印跡、Southern印跡分析、FISH和PCR。裝置可在固相支持物上實(shí)施本發(fā)明方法。所用的固相支持物可為測(cè)定生物樣本中分析物常規(guī)使用者，通常由纖維素、多糖如葡聚糖凝膠等材料構(gòu)建而成，可能部分具有外罩以保護(hù)和/或處理固相支持物。根據(jù)所需用途，固相支持物可為剛性、半剛性、柔韌性、彈性(具有形狀記憶)等?？稍隗w內(nèi)或體外(離體)檢測(cè)樣本中的Bcl-2。根據(jù)本發(fā)明某一實(shí)施方案，當(dāng)需要不將樣本移出體外而確定樣品中Bcl-2的量時(shí)(即體內(nèi))，支持物應(yīng)當(dāng)對(duì)受試者無(wú)害，且為任意便于插入機(jī)體合適部分的形式。例如，支持物可為由聚四氟乙烯、聚苯乙烯或其他剛性無(wú)害塑料材料合成的探針，其大小和形狀均適于引入體內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠選擇合適的惰性支持物及其所需用途的大小。本發(fā)明測(cè)定(方法)中的接觸步驟包括將生物樣本與固相支持物進(jìn)行接觸、結(jié)合或混合，所述固相支持物如反應(yīng)器、微反應(yīng)器、試管、微管、孔、多孔平板或其他固相支持物。在本發(fā)明實(shí)施方案中，與生物樣本(如尿液)接觸的固相固載具有針對(duì)待測(cè)液體基質(zhì)側(cè)流的吸收墊或膜，例如可獲自MilliporeCorp.(Bedford,MA),包括但不僅限于Hi-FlowPlusTM膜及膜卡，以及SureWickTM墊材料。可構(gòu)建任何適于所需用途形式的實(shí)施本發(fā)明方法的診斷裝置。因此，在某一實(shí)施方案中，可構(gòu)建本發(fā)明裝置為一次性或重復(fù)4吏用性測(cè)試條或棒，以接觸Bcl-2水平待測(cè)的生物樣本如尿液或血液。在另一實(shí)施方案中，可使用本領(lǐng)域公認(rèn)的微米尺度制造技術(shù)構(gòu)建裝置，從而生產(chǎn)出能夠移植或注射入解剖位點(diǎn)(如腹腔)的針樣實(shí)物，以實(shí)現(xiàn)診斷性應(yīng)用。在其他實(shí)施方案中，可構(gòu)建用于重復(fù)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的延長(zhǎng)探針形式的裝置。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明裝置包括固相支持物(例如條或試紙棒)，其表面作用如側(cè)流基質(zhì)以限制生物樣本如尿液、全血、血清、血漿、液或腹水的流經(jīng)途徑。用于檢測(cè)多種目標(biāo)分析物的免疫色謙測(cè)定(也稱為側(cè)向流動(dòng)試紙條或簡(jiǎn)易試紙條測(cè)試)已問(wèn)世多時(shí)，也可用于檢測(cè)Bcl-2。側(cè)向流動(dòng)測(cè)試的益處包括其形式用戶友好、結(jié)果迅速、在較大范圍的氣候條件下具有長(zhǎng)期穩(wěn)定性，以及相對(duì)較^f氐的生產(chǎn)成本。這些特征使得側(cè)向流動(dòng)測(cè)試成為包括家庭測(cè)試、快速醫(yī)護(hù)點(diǎn)測(cè)試以及多種分析物的現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試等在內(nèi)的應(yīng)用的理想之選。該測(cè)試的原理非常直觀。其關(guān)鍵之處在于，可以定性測(cè)試能與可視的可檢測(cè)固相支持物(例如染色微球)結(jié)合的任意配體，甚至在許多情況下可以進(jìn)4亍半定量測(cè)量。例如，F(xiàn)ernandez-Sanchez等人(J.Immuno.Methods,2005，307(1-2):1-12，本文引用作為參考)描述了某種用于檢測(cè)血清中游離和總前列腺特異抗原的一步側(cè)向流動(dòng)免疫試紙條，可改造其用于檢測(cè)生物樣本如血液或尿液中的Bcl-2。目前市場(chǎng)上更為常見(jiàn)的某些免疫色鐠測(cè)定為妊娠(例如非處方(OTC)測(cè)試試劑盒)、鏈球菌咽炎及衣原體測(cè)試。近來(lái)使用免疫色語(yǔ)測(cè)定法研發(fā)出許多針對(duì)已有抗原的新測(cè)試。例如，自1917年就已知社區(qū)獲得性肺炎的最常見(jiàn)病原，但直至最近才研發(fā)出簡(jiǎn)便的測(cè)定，而這一測(cè)定即是使用該簡(jiǎn)便測(cè)試試紙條方法完成的(Murdoch,D.R.等人,JClinMicrobiol,2001，39:3495-3498)。使用類似測(cè)定可以迅速在混合血液中檢測(cè)人免疫缺陷病毒(HIV)(Soroka，S.D.等人,JClinVirol,2003，27:卯-96)。已有一種硝化纖維素膜卡用于通過(guò)檢測(cè)碳納米粒子的移動(dòng)和結(jié)合來(lái)診斷血吸蟲(chóng)病(vanI)am，GJ.等人.JClinMicrobiol,2004，42:5458-5461)。免疫色i普測(cè)定常用的兩種方法為非竟?fàn)幮?或直接)及竟?fàn)幮?或竟?fàn)幮砸种?反應(yīng)方法(TechNote#303，Rev.#001，1999，BangsLaboratories,Inc.,Fishers,IN)。通常使用直接(雙抗體夾心法)方法測(cè)試具有多重抗原位點(diǎn)的較大分析物，例如促黃體激素(LH)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)以及HIV。此處，所需的樣本分析物不過(guò)量，因此一部分孩i球不會(huì)在捕獲線捕獲，而將繼續(xù)向二線固化抗體(控制區(qū))前進(jìn)。該控制線使用對(duì)孩t球上綴合抗體特異的物種特異性抗免疫球蛋白抗體。游離抗原若存在，則通過(guò)向加樣墊上加樣(尿液、血清等)引入裝置內(nèi)。隨后游離抗原結(jié)合于抗體-微球復(fù)合物。將樣本抗原表位1特異性抗體1與染色微球偶聯(lián)，并于裝置內(nèi)干燥。加樣時(shí)，微球-抗體復(fù)合物再水化并由液體攜帶至捕獲區(qū)及控制線。將樣本抗原中另一抗原位點(diǎn)(表位2)特異性抗體2干燥置于捕獲線處的膜上。將可與抗體l反應(yīng)的物種特異性抗免疫球蛋白抗體(抗體3)，干燥置于控制線處的膜上。當(dāng)樣本中存在抗原時(shí)(即陽(yáng)性測(cè)試)，該抗原可通過(guò)其兩個(gè)抗原位點(diǎn)同時(shí)與抗體l(綴合于孩i球)和抗體2(干燥置于捕獲線處的膜上)結(jié)合。不論是否存在抗原，抗體1包被的微球均在控制線處與抗體3結(jié)合。若樣本中不含有抗原(陰性測(cè)試)，則孩吏球不受阻礙通過(guò)捕獲線，但會(huì)被控制線滯留。通常使用竟?fàn)幮苑磻?yīng)方法測(cè)試攜有單個(gè)抗原決定簇、無(wú)法同時(shí)結(jié)合兩種抗體的小分子。如同雙抗體夾心測(cè)定一樣，游離抗原如存在，可通過(guò)向樣本墊上加樣引入裝置內(nèi)。樣本中含有的游離抗原與抗體-微球復(fù)合物結(jié)合?？贵w1對(duì)樣本抗原具有特異性，并與染色孩i球偶聯(lián)。將抗原載體分子(一般為BSA)綴合物干燥置于捕獲線處的膜上?？贵w2(Ab2)則被干燥置于控制線處膜上，其是能夠捕獲試劑顆粒并確認(rèn)測(cè)試完成的物種特異性抗免疫球蛋白。若樣本中含有抗原(陽(yáng)性測(cè)試)，微球上的抗體(Abl)已經(jīng)被樣本內(nèi)抗原飽和，因此捕獲線處結(jié)合的抗原綴合物不會(huì)與之結(jié)合。不含有抗原(陰性測(cè)試)，抗體包被的干燥微球能夠被控制線處結(jié)合的抗原綴合物所捕獲。通常，用于在這些裝置中固定抗體的膜是由原生疏水材料制成，如硝化纖維素。用于固相支持的微球以及綴合抗體均為疏水，且其與膜間的反應(yīng)使其能有效干燥于膜上。可將樣本和/或Bd-2特異性結(jié)合劑列陣于固相支持物上，也可使用多種支持物進(jìn)行多重檢測(cè)或分析。"列陣"是指將某一文庫(kù)(例如靶定同一目標(biāo)分子或不同目標(biāo)分子的一列不同樣本或一列裝置)或其他集合中的成員進(jìn)行組織或排列，以使其成為合乎邏輯或有形的陣列。因此，"陣列"是指如生物樣本的合乎邏輯或有形的排列。有形陣列可為任意"空間格式"或"物理劃分格式"，其中相應(yīng)文庫(kù)成員的物理形式以有序的方式排列，以供進(jìn)行組合篩選。例如，可將個(gè)體樣本或樣本文庫(kù)的集群成員在如多孔平板上排為一系列編號(hào)的排和列。與^M目似，可將結(jié)合劑鋪板或置于微滴定板(或盤(pán))上，如96孑L、384孔或1536孔板。任選將Bcl-2特異性結(jié)合劑固化于固相支持物上。Bcl-2和癌肺生物標(biāo)志物的檢測(cè)，以及其他需在樣本上實(shí)施的測(cè)定，均可與其他目標(biāo)分子的檢測(cè)同時(shí)或序貫進(jìn)行，也可以自動(dòng)化、高通量形式進(jìn)行?？蓪cl-2特異性結(jié)合劑沉積于結(jié)合區(qū)，但仍保持"游離，，(非固化)；在捕獲區(qū)則固化于固相支持物。Bd-2特異性結(jié)合劑可通過(guò)如支持物的非特異性吸附或與支持物共價(jià)成鍵而得以固化。將結(jié)合劑固定于支持物上的技術(shù)為本領(lǐng)域^^p，且描述于如美國(guó)專利號(hào)4,399,217、4,381,291、4,357,311、4,343,312及4,260,678中，均在本文引用作為參考。此類沖支術(shù)可用于固定本發(fā)明的結(jié)合劑。當(dāng)固相支持物為聚四氟乙烯時(shí)，使用鈉和銨胺化支持物并通過(guò)碳二亞胺反應(yīng)將抗體共價(jià)連接于活化的支持物，可以活化支持物而將激素抗體偶聯(lián)于支持物(yonKlitzing,Schultek，Strasburger，F(xiàn)ricke和Wood,"RadioimmunoassayandRelatedProceduresinMedicine1982"，InternationalAtomicEnergyAgency,Vienna(1982)，57-62頁(yè))。本發(fā)明的診斷裝置利用側(cè)流試紙條(LFS)技術(shù)，后者已應(yīng)用于多種其他快速試紙條測(cè)定系統(tǒng)，如基于人絨毛膜促性腺激素(hCG)抗體的非處方早孕試紙條。與許多其他診斷裝置一樣，本裝置使用結(jié)合劑以結(jié)合目標(biāo)分子(Bcl-2)。該裝置具有接收生物樣本如血液或尿液的加樣區(qū)、含有結(jié)合樣本中Bcl-2標(biāo)記的標(biāo)記區(qū)，以及滯留Bcl-2標(biāo)記的檢測(cè)區(qū)。滯留于檢測(cè)區(qū)的結(jié)合劑發(fā)出信號(hào)，該信號(hào)隨著生物樣本中Bcl-2水平是低于、等于還是高于給定閾值濃度而有所不同。例如，在使用尿Bcl-2檢測(cè)卵巢癌時(shí)，閾值濃度為0ng/ml至2.0ng/ml。在另一實(shí)施方案中，使用尿Bcl-2檢測(cè)卵巢癌的閾值濃度為1.8ng/ml。受試者樣本中Bcl-2水平等于或高于給定參照Bd-2濃度，可稱為"闊值水平"、"閾值量"或"閾值樣本"。裝置中的加樣區(qū)適于接收待測(cè)定的生物樣本。通常加樣區(qū)由吸收性材料如印跡紙制成。標(biāo)記區(qū)含有可與樣本中任意Bcl-2結(jié)合的結(jié)合劑。在某一實(shí)施方案中，結(jié)合劑為抗體(例如單克隆抗體、多克隆抗體、抗體片段)。為便于檢測(cè)，結(jié)合劑優(yōu)選連接能發(fā)出肉眼可見(jiàn)信號(hào)的標(biāo)記，例如標(biāo)志有焚光標(biāo)記或彩色標(biāo)記如綴合膠體金，其視覺(jué)效果為粉色。檢測(cè)區(qū)滯留已結(jié)合結(jié)合劑的Bcl-2。這通常是由固化結(jié)合劑如固化抗體實(shí)現(xiàn)的。若標(biāo)記區(qū)和檢測(cè)區(qū)的結(jié)合劑均為抗體，它們通常識(shí)別目標(biāo)分子(Bcl-2蛋白)上的不同表位。從而可形成含有抗體-Bcl-2-抗體的"夾心"。檢測(cè)區(qū)位于加樣區(qū)的下游，而標(biāo)記區(qū)通常位于二者之間。因此樣本會(huì)由加樣區(qū)遷移至標(biāo)記區(qū)，此處任意樣本與標(biāo)記結(jié)合。Bcl-2-結(jié)合劑復(fù)合物以及過(guò)量的結(jié)合劑則繼續(xù)向檢測(cè)區(qū)遷移。當(dāng)Bcl-2-結(jié)合劑復(fù)合物遇到捕獲試劑時(shí)，復(fù)合物被滯留而樣本及過(guò)量的結(jié)合劑仍繼續(xù)遷移。隨著樣本中Bcl-2水平的增高，滯留于檢測(cè)區(qū)的結(jié)合劑(Bcl-2-結(jié)合劑復(fù)合物的形式)的量也成比例增加。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的裝置能夠根據(jù)閾值濃度區(qū)別樣本。這一點(diǎn)可通過(guò)多種方法實(shí)現(xiàn)。某一類裝置中含有包括固定強(qiáng)度的信號(hào)的參照區(qū)，滯留于檢測(cè)區(qū)的結(jié)合劑的量可與之進(jìn)行比較——若檢測(cè)區(qū)信號(hào)等于參照區(qū)信號(hào)，該樣本即為閾值樣本；若檢測(cè)區(qū)信號(hào)強(qiáng)度低于參照區(qū)，則該樣本所含Bd-2少于閾值樣本；若檢測(cè)區(qū)的信號(hào)強(qiáng)度高于參照區(qū)，則該樣本中所含Bcl-2多于閾值樣本?？扇菀字苽洳⑿?zhǔn)合適的參照區(qū)。在該類裝置中，一般結(jié)合劑對(duì)于櫸本中的Bcl-2而言為過(guò)量，而參照區(qū)可處于檢測(cè)區(qū)上游，或優(yōu)選下游。參照區(qū)信號(hào)與檢測(cè)區(qū)信號(hào)為同一類型的信號(hào)，即它們通常均為肉眼可見(jiàn)，例如使用相同的標(biāo)志。優(yōu)選的該型裝置參照區(qū)包括膠體金標(biāo)志的固化蛋白(例如胎牛血清白蛋白)。在本發(fā)明的另一種裝置中，參照區(qū)位于檢測(cè)區(qū)下游，且包括能捕獲結(jié)合劑的試劑(例如固化的抗結(jié)合劑抗體)。流經(jīng)該裝置的結(jié)合劑并不過(guò)量，設(shè)置其濃度使得其中50。/。被含閾值濃度的Bcl-2的樣本所結(jié)合。因此，閾值樣本中50%結(jié)合劑將滯留于檢測(cè)區(qū)，而50%留在參照區(qū)。若樣本中Bcl-2的水平高于閣值樣本，則到達(dá)參照區(qū)的結(jié)合劑將不足50%，而檢測(cè)區(qū)發(fā)出的信號(hào)強(qiáng)于參照區(qū)；相反，若樣本中Bcl-2的水平低于閾值樣本，留在檢測(cè)區(qū)的結(jié)合劑將不足50%，而參照區(qū)發(fā)出的信號(hào)強(qiáng)于檢測(cè)區(qū)。在本發(fā)明的另一類似運(yùn)作的裝置中，參照區(qū)處于檢測(cè)區(qū)下游，其中含有有限量可捕獲結(jié)合劑的試劑(例如固化的抗結(jié)合劑抗體)。該試劑的水平使得在閾值樣本中，其滯留標(biāo)記的量與檢測(cè)區(qū)可結(jié)合的標(biāo)記量相同，而過(guò)多的標(biāo)記將繼續(xù)遷移至參照區(qū)以外。因此，在這三種裝置中，利用檢測(cè)區(qū)和參照區(qū)間的對(duì)比以將樣本與閾值濃度進(jìn)行比較。優(yōu)選可肉眼確定檢測(cè)參照結(jié)合比例。優(yōu)選檢測(cè)區(qū)和參照區(qū)定位鄰近，以有助于視覺(jué)比較兩區(qū)域的信號(hào)強(qiáng)度。第四類裝置中不需要參照區(qū)，但構(gòu)建檢測(cè)區(qū)使之主要產(chǎn)生開(kāi)/關(guān)應(yīng)答，例如閾值濃度以下無(wú)信號(hào)，而閾值或閾值以上發(fā)出信號(hào)。第五類裝置中也不需要參照區(qū)，但使用對(duì)應(yīng)于閾值濃度的外部參照。可采用多種形式，例如可比較檢測(cè)區(qū)信號(hào)的印制卡片，或?qū)z測(cè)區(qū)測(cè)量絕對(duì)值(如比色信號(hào))與機(jī)器中儲(chǔ)存的參照值進(jìn)行比較的機(jī)器讀數(shù)儀。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，該裝置包括位于檢測(cè)區(qū)下游的控制區(qū)。控制區(qū)一般用于捕獲流經(jīng)檢測(cè)和/或參照區(qū)的過(guò)量結(jié)合劑(例如使用固化抗結(jié)合劑抗體)。若結(jié)合劑滯留于控制區(qū)內(nèi)，則證實(shí)發(fā)生了結(jié)合劑的固化和通過(guò)裝置的遷移。該功能也可由參照區(qū)完成。在優(yōu)選實(shí)施方案中，優(yōu)選將檢測(cè)區(qū)、參照區(qū)和控制區(qū)成型在硝化纖維素支持物上。通常由檢測(cè)區(qū)下游的棉芯協(xié)助毛細(xì)運(yùn)動(dòng)，幫助從加樣區(qū)到檢測(cè)區(qū)的遷移。該棉芯通常由吸收性材料制成如印跡或色譜紙?？珊?jiǎn)單便宜地生產(chǎn)本發(fā)明裝置，簡(jiǎn)便形式為試紙棒。此外，其使用也很方便，如家庭4吏用。因此，本發(fā)明提供了可在家庭使用的篩查癌腫如卵巢癌的裝置。診斷或監(jiān)測(cè)婦科癌腫的試劑盒本發(fā)明的一方面包括含有診斷或監(jiān)測(cè)癌腫必需元件的試劑盒。優(yōu)選該試劑盒包括用于收集患者生物液體的容器，以及用于檢測(cè)液體中是否含有Bcl-2或其編碼核酸的試劑。可將該試劑盒的成分包裝于水性基質(zhì)中或以凍干形式包裝。本發(fā)明的方法可利用診斷試劑盒實(shí)施，以定性或定量檢測(cè)樣本如血液或尿液中的Bcl-2。例如，該試劑盒中可含有Bcl-2特異性結(jié)合劑(例如抗體)、針對(duì)標(biāo)記有酶的抗體的抗體；以及酶的底物。該試劑盒也可含有固相支持物如微滴定多孔平板、標(biāo)準(zhǔn)品、測(cè)定稀釋液、洗滌緩沖物、自粘平板蓋和/或利用該試劑盒實(shí)施本發(fā)明方法的說(shuō)明書(shū)。在某一實(shí)施方案中，該試劑盒包括用于待測(cè)定生物樣本(如血液或尿液)的一種或多種蛋白酶抑制劑(例如蛋白酶抑制劑組合)?？梢灾苽湓\斷或監(jiān)測(cè)婦科癌腫的試劑盒，其包括一種或多種可檢測(cè)Bcl-2蛋白的試劑，例如但并不僅限于Bcl-2抗體、其片段或Bcl-2結(jié)合對(duì)象?？蓪⑦@些試劑與用于收集患者生物液體的容器包裝在一起。若該試劑盒中所用的抗體或結(jié)合對(duì)象為帶有標(biāo)記(例如放射活性金屬鐵或基團(tuán))的綴合物形式，則提供的此類綴合物成分可以為完全綴合的形式、中間體形式或分離的部分以供試劑盒使用者自行綴合。也可制^^有一種或多種檢測(cè)Bcl-2核酸的試劑的試劑盒，所述Bcl-2核酸例如但不僅限于全長(zhǎng)Bcl-2核酸、Bcl-2寡核苷酸以及Bcl-2引物對(duì)?？蓪⑦@些試劑與用于收集患者生物液體的容器包裝在一起。核酸可為標(biāo)記形式或待標(biāo)+己形式。試劑盒的其他成分包括但不僅限于，收集生物樣本的用具、標(biāo)記檢測(cè)試劑(結(jié)合試劑)的用具、用于在生物樣本中固化Bcl-2蛋白或Bcl-2核酸的成員、將生物樣本加樣至膜上的用具、使試劑結(jié)合至受試者生物樣本中Bcl-2的用具、第二抗體、將總RNA從受試者生物液體中分離的用具、實(shí)施凝膠電泳的用具、從分離的總RNA中產(chǎn)生cDNA的用具、實(shí)施雜交測(cè)定的用具，以及進(jìn)4亍PCR的用具等。本文所用的術(shù)語(yǔ)"ELISA"包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定，即使用結(jié)合于固相的抗體或抗原以及酶-抗原或酶-抗體綴合物以檢測(cè)并定量樣本中抗原(如Bcl-2)或抗體量的方法。有關(guān)ELISA技術(shù)的描述見(jiàn)于D.P.Sites等人BasicandClinicalImmunology第22章,第4版(1982，LangeMedicalPublicationsofLosAltos，Calif出版)，以及美國(guó)專利號(hào)3,654,090、3,850,752，和4,016,043，其公開(kāi)均在本文引用作為參考。ELISA測(cè)定可以用于定量樣本中抗原、蛋白質(zhì)或其他目標(biāo)分子的量。具體而言，可以通過(guò)在固相支持物(例如聚氯乙烯)上附著目標(biāo)抗原或蛋白質(zhì)的特異性抗體來(lái)實(shí)施ELISA?？杉尤爰?xì)胞提取物或其他目標(biāo)樣本如尿液以形成抗體-抗原復(fù)合物，而多余的未結(jié)合的樣本則被洗掉。加入對(duì)抗原上另一不同位點(diǎn)特異的酶聯(lián)抗體。洗滌支持物以除去未結(jié)合的酶聯(lián)第二抗體。酶聯(lián)抗體包括但不僅限于堿性磷酸酶。第二抗體上的酶能將所加的無(wú)色底物轉(zhuǎn)化為有色產(chǎn)物，或能將無(wú)熒光底物轉(zhuǎn)化為熒光產(chǎn)物?？捎趩蝹€(gè)容器中實(shí)施此處提供的基于ELISA的測(cè)定方法，或在一列容器中進(jìn)行，也可改裝為自動(dòng)程序。在這些示例性的實(shí)施方案中，抗體可標(biāo)記FRET染料對(duì)、生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(BRET)蛋白、熒光染料-淬滅染料組合、P-半乳糖苷互補(bǔ)測(cè)定蛋白質(zhì)片段。例如，抗體可參與FRET、BRET、熒光淬滅或P-半乳糖苷互補(bǔ)，以產(chǎn)生熒光、比色或增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光(ECL)信號(hào)。這些方法通常用于抗原特異性抗體應(yīng)答的檢測(cè)中，在基本免疫學(xué)教科書(shū)中有詳細(xì)描述,如Immunology(IvanRoitt，JonathanBrostoff和DavidMale,London:Mosby，c1998.第5版)，以及Immunobiology:ImmuneSysteminHealthandDisease/CharlesA.Janeway和PaulTravers.Oxford:BlackwellSci.出版1994),其內(nèi)容均在本文引用作為參考。定義本文所用的術(shù)語(yǔ)"癌腫"和"癌性的"，是指或描述通常以細(xì)胞生長(zhǎng)失調(diào)為特征的哺乳動(dòng)物生理情況，即增殖紊亂。此類增殖紊亂的實(shí)例包括癌腫如癌癥、淋巴瘤、母細(xì)胞瘤、肉瘤及白血病，以及其他本文公開(kāi)的癌胂。此類癌腫的更具體實(shí)例包括乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、消化道癌腫、胰腺癌、宮頸癌、卵巢癌、■癌、肝癌(如肝細(xì)胞癌)、膀胱癌、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、腎癌及甲狀腺癌。癌胂的其他非限制性實(shí)例為基底細(xì)胞癌、膽道癌、骨癌、腦及CNS癌腫、絨毛膜癌、結(jié)締組織癌、食管癌、眼癌、頭頸癌、胃癌、上皮內(nèi)腫瘤、喉癌、淋巴瘤包括Hodgkin，s及非Hodgkin，s淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、口腔癌(例如唇、舌、嘴和咽)、胰腺癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤；直腸癌、呼吸系統(tǒng)癌腫、肉瘤、皮膚癌、胃癌、睪丸癌、子宮癌、泌尿系統(tǒng)癌肺，以及其他癌及肉瘤。癌腫類型的實(shí)例列于表1。表l.癌腫類型實(shí)例□急性淋巴細(xì)胞白血病，成人□毛細(xì)胞白血病急性'淋巴細(xì)胞白血病，兒童急性髓系白血病，成人急性髓系白血病，兒童腎上腺皮質(zhì)癌腎上腺皮質(zhì)癌，兒童AIDS相關(guān)癌腫AIDS相關(guān)淋巴瘤肛門(mén)癌星形細(xì)胞瘤，兒童小腦星形細(xì)胞瘤，兒童大腦□基底細(xì)胞癌膽管癌，肝外膀胱癌膀胱癌，兒童骨癌骨肉瘤/惡性纖維性組織細(xì)胞瘤腦千膠質(zhì)瘤，兒童腦腫瘤，成人腦腫瘤，腦干膠質(zhì)瘤，兒童腦腫瘤，小腦星形細(xì)胞瘤，兒童腦腫瘤，大腦星形細(xì)胞瘤/惡性膠質(zhì)瘤，兒童腦腫瘤，室管膜瘤，兒童腦腫瘤，髓母細(xì)胞瘤，兒童□□□頭頸癌腫肝細(xì)胞(肝)癌，成人(原發(fā))肝細(xì)胞(肝)癌，兒童(原發(fā))Hodgkin，s淋巴瘤,成人Hodgkin，s淋巴瘤，兒童妊娠期Hodgkin，s淋巴瘤下咽癌下丘腦及^L通路膠質(zhì)瘤，兒童眶內(nèi)黑素瘤胰島細(xì)胞癌(胰腺內(nèi)分泌部分)Kaposi's肉瘤腎(腎細(xì)胞)癌腎癌，兒童喉癌喉癌，兒童白血病，急性淋巴細(xì)胞，成人白血病，急性淋巴細(xì)胞，兒童白血病，急性髓系，成人白血病，急性髓系，兒童白血病，慢性、淋巴細(xì)胞白血病，慢性髓系白血病,毛細(xì)胞唇及口腔癌胂肝癌，成人(原發(fā))肝癌，兒童(原發(fā))肺癌，非小細(xì)胞腦腫瘤，幕上原始神經(jīng)外胚層腫瘤，兒童腦腫瘤，纟見(jiàn)通路及下丘腦l^t瘤，兒童腦腫瘤，兒童乳腺癌乳腺癌，兒童乳腺癌，男性支氣管腺癌/類癌，兒童Burkitt，s淋巴瘤□類癌腫瘤，兒童類癌腫瘤，胃腸道原發(fā)不明癌癥中fe神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤，原發(fā)小腦星形細(xì)胞瘤，兒童大腦星形細(xì)胞瘤/惡性膠質(zhì)瘤，兒童宮頸癌兒童癌腫慢性淋巴細(xì)胞白血病慢性髓系白血病慢性骨髓增生性疾病結(jié)腸癌結(jié)直腸癌，兒童皮膚T細(xì)胞、淋巴瘤，見(jiàn)萆樣肉芽腫和S&ary綜合征□子宮內(nèi)膜癌室管膜瘤，兒童食管癌食管癌，兒童Ewing，s家族腫瘤顱外生殖細(xì)胞腫瘤，兒童性腺外生殖細(xì)胞肺瘤肝外膽管癌眼癌，眶內(nèi)黑素瘤肺癌，小細(xì)胞淋巴瘤，AIDS相關(guān)性淋巴瘤，Burkitt，s淋巴瘤，皮膚T細(xì)胞，見(jiàn)蕈樣肉芽腫和S6zary綜合征淋巴瘤，Hodgkin，s，成人'淋巴瘤，Hodgkin，s，兒童淋巴瘤，妊娠期Hodgkin，s淋巴瘤，非Hodgkin，s，成人淋巴瘤，非Hodgkin，s，兒童淋巴瘤，妊娠期非Hodgkin，s淋巴瘤，原發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)□瓦爾斯特倫巨球蛋白血癥，骨惡性組織細(xì)胞瘤/骨肉瘤髓母細(xì)胞瘤，兒童黑素瘤黑素瘤，眶內(nèi)(眼)Merkel細(xì)胞癌間皮瘤，成人惡性間皮瘤，兒童原發(fā)不明的轉(zhuǎn)移頸部鱗狀細(xì)胞癌多發(fā)內(nèi)分泌腺瘤綜合征，兒童多發(fā)性骨髓瘤/漿細(xì)胞腫瘤萆樣肉芽胂骨髓增生異常綜合征骨髓增生異常/骨髓增殖性疾病髓系白血病，'H性髓系白血病，成人急性髓系白血病，兒童急性骨髓瘤，多發(fā)骨髓增殖性疾病，慢性□鼻腔及副鼻竇癌腫鼻咽癌眼癌，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤□膽嚢癌胃癌胃癌，兒童胃腸道類癌生殖細(xì)胞肺瘤，顱外，兒童生殖細(xì)胞腫瘤，性腺外□生殖細(xì)胞腫瘤，印巢妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤膠質(zhì)瘤，成人膠質(zhì)瘤，兒童腦干膠質(zhì)瘤，兒童大腦星形細(xì)胞瘤膠質(zhì)瘤，兒童視通路及下丘腦□□皮膚癌腫(黑素瘤)皮趺癌，Merker細(xì)胞小細(xì)胞肺癌小腸癌軟組織肉瘤，成人軟組織肉瘤，兒童鱗狀細(xì)胞癌，見(jiàn)皮膚癌腫(非黑素瘤)原發(fā)不明的頸部鱗狀細(xì)胞癌，轉(zhuǎn)移胃癌胃癌，兒童幕上原始神經(jīng)外胚層腫瘤，兒童□T細(xì)胞淋巴瘤，皮膚，見(jiàn)蕈樣肉芽腫和S6zary綜合征睪丸癌胸腺瘤，兒童胸腺瘤及胸腺癌甲狀腺癌口曱狀腺癌，兒童腎盂及輸尿管移行細(xì)胞癌鼻咽癌，兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤非Hodgkin，s淋巴瘤，成人非Hodgkin，s淋巴瘤，兒童妊娠期非Hodgkin，s淋巴瘤非小細(xì)胞肺癌口癌肺，兒童口腔癌肺，唇及口咽癌腫骨肉瘤/骨惡性纖維組織細(xì)胞瘤卵巢癌，兒童卵巢上皮細(xì)胞癌卵巢生殖細(xì)胞腫瘤卵巢低惡性度腫瘤胰腺癌，兒童胰腺癌，胰島細(xì)胞副鼻竇及鼻腔癌腫曱狀旁腺癌陰莖癌嗜鉻細(xì)胞瘤成松果體細(xì)胞瘤及幕上原始神經(jīng)外胚層腫瘤，兒童垂體瘤漿細(xì)胞瘤/多發(fā)骨髓瘤胸膜肺母細(xì)胞瘤妊娠及乳腺癌妊娠及Hodgkin，s淋巴瘤妊娠及非Hodgkin，s淋巴瘤原發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤前列腺癌直腸癌腎細(xì)胞(腎)癌腎細(xì)胞(腎)癌，兒童滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤，□原發(fā)不明，癌，成人原發(fā)不明，癌腫，兒童兒童少見(jiàn)癌腫輸尿管及腎盂，移行細(xì)胞癌尿道癌子宮癌腫，子宮內(nèi)膜子宮肉瘤□陰道癌腫視通路及下丘腦膠質(zhì)瘤，兒童外陰癌肺□瓦爾斯特倫巨球蛋白血癥Wilms，腫瘤本文所用的術(shù)語(yǔ)"肺瘤"是指惡性或良性所有胂瘤性細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，以及所有癌前及癌性細(xì)胞和組織。例如，一類特殊癌腫的特征在于實(shí)體胂塊腫瘤。該實(shí)體肺瘤肺塊若存在，可能為原發(fā)腫瘤肺塊。原發(fā)腫瘤肺塊是指由組織正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來(lái)的癌腫細(xì)胞在組織中的生長(zhǎng)。大多數(shù)情況下，可以通過(guò)3見(jiàn)i貪或觸診方法發(fā)現(xiàn)嚢肺的存在而鑒定原發(fā)腫瘤腫塊，或通過(guò)組織形狀、組織或重量的不規(guī)整鑒定之。然而，某些原發(fā)腫瘤無(wú)法觸及，僅能通過(guò)醫(yī)學(xué)影像技術(shù)如X光(例如乳腺成像)、超聲、CT和MRI，或細(xì)針抽吸進(jìn)行檢測(cè)。后面這些技術(shù)的應(yīng)用更常見(jiàn)于早期檢測(cè)。對(duì)組織中癌肺細(xì)胞的分子和表型分析通?？梢宰C實(shí)該癌腫是否源于該組織，或該病損是由另一位置轉(zhuǎn)移而來(lái)。"樣本"(生物樣本)可為來(lái)自人或非人受試者的任意生理狀態(tài)(如固體、液體、半固體、蒸氣)、任意復(fù)雜性的任意目標(biāo)物質(zhì)組合。樣本可為理應(yīng)可能含有Bcl-2的任意組合物，所述組合物可通過(guò)本發(fā)明的方法、裝置及試劑盒分析。優(yōu)選樣本為液體(生物液體)。樣本包括人或動(dòng)物樣本。可將樣本置于試管、培養(yǎng)器、多孔平板或任意其他容器或支持底物中。例如，樣本可為細(xì)胞培養(yǎng)物、人或動(dòng)物組織。細(xì)胞組織的液體勻漿為可能含有本發(fā)明可檢測(cè)的Bcl-2的生物液體。樣本的"復(fù)雜性"是指樣本中存在的不同分子種類的相對(duì)數(shù)目。腎盂及輸尿管，移行細(xì)胞癌視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤橫紋肌肉瘤，兒童□涎腺癌涎腺癌，兒童肉瘤，Ewing，s家族腫瘤肉瘤，Kaposi's肉瘤，軟組織，成人肉瘤，軟組織，兒童肉瘤，子宮S6zary綜合征皮膚癌胂(非黑素瘤)皮膚癌，兒童本文所用的術(shù)語(yǔ)"體液"是指從人或動(dòng)物受試者中得到的組合物。體液包括但不僅限于尿液、全血、血漿、血清、淚液、精液、涎液、痰、呼出氣體、鼻腔分泌物、咽滲出物、支氣管肺泡洗出液、氣管吸出物、小腸液、淋巴液、腦脊液、羊膜液、腺體液、糞便、汗液、粘液、陰道或尿道分泌物、腦脊液，以及經(jīng)皮漏出液。體液也包括前述所有含有勻漿固體材料(如糞便、組織及活檢樣本)的溶液或混合物中試驗(yàn)分離的級(jí)分。本文所用的術(shù)語(yǔ)"離體"，是指受試者體外的環(huán)境。因此，采集自受試者的體液樣本為本發(fā)明涉及體液的離體樣本。本發(fā)明的方法及裝置的留置實(shí)施方案于體內(nèi)獲取樣本。本文所用的術(shù)語(yǔ)"綴合物"是指包括兩個(gè)或多個(gè)分子彼此相連而形成單結(jié)構(gòu)的化合物，任選其間通過(guò)連接基團(tuán)連接。該連接可為分子間的直接連接(如化學(xué)鍵)或通過(guò)使用連接基團(tuán)的連接。本文所用的術(shù)語(yǔ)"支持物"、"底物"及"表面"是指由多孔或非多孔的不溶于水的材料形成的固相，該固相可具有多種形狀如條、棒、顆粒、珠或多孔平板中任意一種。在某些實(shí)施方案中，支持物具有固定組織的支持物基質(zhì)，該基質(zhì)優(yōu)選作用如組織基質(zhì)，例如孩i滴定盤(pán)。固相支持物材料包括但不僅限于，纖維素、多糖如葡聚糖凝膠、玻璃、聚丙烯酰嗎啉、硅膠、可控孔度玻璃(CPG)、聚苯乙烯、聚苯乙烯/乳膠、聚乙烯如超高分子量聚乙烯(UPE)、聚酰胺、聚偏l，l-二氟乙烯(PVDF)、聚四氟乙烯(PTFE;TEFLON)、氣基改性的特氟隆、尼龍、硝化纖維素以及金屬和合金如金、鉑和鈀。根據(jù)具體用途不同，固相支持物可為生物性、非生物性、有機(jī)、無(wú)機(jī)或這些的任意組合，存在如顆粒、繩束、沉淀物、凝膠、片、墊、卡、條、棒、試紙條、管道、球、容器、毛細(xì)管、墊、切片、薄膜、平板、滑動(dòng)片等。優(yōu)選該固相支持物為平面形狀，以有助于接觸生物樣本如尿液、全血、血漿、血清、腹膜液或腹水。其他合適的固相支持物材料對(duì)于本領(lǐng)域才支術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)。固相支持物為具有或不具內(nèi)襯(例如聚苯乙烯或聚酯卡內(nèi)襯)的膜，如可購(gòu)自MilliporeCorp.(Bedford,MA)者，例如Hi-FlowTMPlus膜卡。固相支持物表面可含有反應(yīng)性基團(tuán)，如羧基、氨基、羥基、巰基等以連接核酸、蛋白質(zhì)等。雖然并非全部，有時(shí)固相支持物表面的組成材料與支持物相同。因此，該表面可由多種材料中的任意種組成，如聚合物、塑料、樹(shù)脂、多糖、硅膠或基于硅膠的材料、碳、金屬、無(wú)機(jī)玻璃、膜或任意上述支持物材料(例如作為一層包被)。本文所用的術(shù)語(yǔ)"標(biāo)記"和"標(biāo)志"是指可發(fā)出可檢測(cè)信號(hào)的物質(zhì)，包括但不僅限于酶如堿性磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶及辣根過(guò)氧化物酶、核酶、復(fù)制酶如QB復(fù)制酶的底物、啟動(dòng)子、染料、熒光劑(如熒光素、異硫氰酸鹽、羅丹明化合物、藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白、鄰苯二醛及熒光胺)、化學(xué)發(fā)光劑如異魯米諾、增敏劑、輔酶、酶底物、放射標(biāo)記、顆粒如乳膠或碳顆粒、脂質(zhì)體、細(xì)胞等，可進(jìn)一步用染料、催化劑或其他可檢測(cè)基團(tuán)對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記。本文所用的術(shù)語(yǔ)"受體"及"受體蛋白"是指與其他分子如Bcl-2特異性結(jié)合的生物活性蛋白性分子。本文所用的術(shù)語(yǔ)"配體"是指含有能與特定受體蛋白特異性相互作用而結(jié)合的結(jié)構(gòu)部分的分子。本文所用的術(shù)語(yǔ)"抗體"是指免疫球蛋白分子以及免疫球蛋白分子的免疫活性部分(片段)，即含有抗體結(jié)合位點(diǎn)或抗原互補(bǔ)位的分子。該術(shù)語(yǔ)包括單克隆抗體及多克隆抗體。本文所用的術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體"或"單克隆抗體組合物"是指抗體分子中僅含有一種能與特定抗原發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體結(jié)合位點(diǎn)。因此，單克隆抗體組合物對(duì)發(fā)生免疫反應(yīng)的任意抗原一般都表現(xiàn)為單一結(jié)合親和力。單克隆抗體組合物一般由單細(xì)胞克隆產(chǎn)生的抗體組成，所述單細(xì)胞克隆稱為雜交瘤，僅分泌(產(chǎn)生)一類抗體分子。雜交瘤細(xì)胞是由抗體產(chǎn)生細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞或其他自持細(xì)胞系融合而成。此類抗體由Kohler和Milstein，Nature,1975，256:495-497首次描述，其公開(kāi)在本文引用作為參考。示例性的雜交瘤技術(shù)描述于Niman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1983，80:4949-4953中。產(chǎn)生單克隆抗體、雜交瘤細(xì)胞或雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)物的其他方法也為公知。見(jiàn)如Antibodies:ALaboratoryManual,Harlow等人，ColdSpringHarborLaboratory,1988;或從所有免疫性組分中分離單克隆抗體的方法描述如Sasatry等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989，86:5728-5732;及Huse等人，Science,1981，246:1275-1281。本文引用的文獻(xiàn)在此引用作為參考。本文所用的"半透膜，，是指液體不通透而氣體可通過(guò)其轉(zhuǎn)移的生物相容性材料。此類氣體包括但不僅限于氧氣、水蒸氣及二氧化碳。半透膜是可用于形成封閉限流腔室的至少一部分的材料實(shí)例。半透膜能夠?qū)t生物污染排除在外(例如孔特征性小至足以阻止可污染分析物(如細(xì)胞)的微生物通過(guò))。某一特定方面而言，半透膜的光學(xué)穿透性和清晰程度足以允許觀察分析物如細(xì)胞的顏色、生長(zhǎng)、大小、形態(tài)、成〗象及其他本領(lǐng)域已知的目的。本文所用的術(shù)語(yǔ)"結(jié)合"是指任何永久性或暫時(shí)性的物理連接或緊密關(guān)聯(lián)。例如，結(jié)合可為氬鍵、疏水作用、范德瓦爾斯力、共價(jià)鍵或離子鍵作用的結(jié)果。本文所用的術(shù)語(yǔ)"顆粒"包括任何構(gòu)型的不可溶材料，所述構(gòu)型包括但不僅限于球形、線狀、刷狀及不規(guī)則形狀。顆?？蔀槎嗫椎?，內(nèi)部含有規(guī)則或隨機(jī)通道。顆?？蔀榇判灶w粒。顆粒的實(shí)例包括但不僅限于硅膠、纖維素、瓊脂糖珠、聚苯乙烯(固體、多孔、衍生)珠、可控孔度玻璃、凝膠珠、磁珠、溶膠、生物細(xì)胞、亞細(xì)胞顆粒、微生物(原生動(dòng)物、細(xì)菌、酵母、病毒及其他感染病原)、微團(tuán)、脂質(zhì)體、環(huán)糊精及其他不可溶材料。"編碼序列，，或"編碼區(qū)域"為轉(zhuǎn)錄為mRNA和/或翻譯為多肽的多核苷酸序列。例如，編碼序列可編碼目標(biāo)多肽。編碼序列的邊界由5，端的翻譯起始密碼子和3，端的翻譯終止密碼子所確定。編碼序列包括但不僅限于mRNA、cDNA及重組多核苷酸序列。本文所用的術(shù)語(yǔ)"多肽"是指包括兩個(gè)或多個(gè)M酸之中任意數(shù)目的任意聚合物，本文與術(shù)語(yǔ)"蛋白質(zhì)"、"基因產(chǎn)物"及"肽"可互換使用。本文所用的術(shù)語(yǔ)"核苷"是指含有嘌呤或嘧咬威基，并與核糖或脫氧核糖共價(jià)連接的分子。核苷酸的實(shí)例包括腺嘌呤核苷、鳥(niǎo)噤呤核苷、胞嘧啶核苷、尿嘧咬核苷;^腺嘧吱核苷。本文所用的術(shù)語(yǔ)"核苷酸"是指含有一個(gè)或多個(gè)磷脧基團(tuán)以酯鍵連于糖部分的核苷。核苷酸實(shí)例包括單磷酸核苷、雙磷酸核苷以及三磷酸核苷。本文術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"、"核酸分子"以及"核苷酸分子，，可互換使用，是指由5，和3'碳原子之間形成磷酸二酯鍵連接而成的核苷酸聚合物。例如，多核苷酸可編碼多肽如Bcl-2多肽(不論是否表達(dá))，也可為短干擾RNA(siRNA)、反義核酸(反義寡核苷酸)、適體、核酶(催化性RNA)或三鏈寡核苷酸(即抗基因)。本文所用的術(shù)語(yǔ)"RNA"或"RNA分子"或"核糖核酸分子"一般是指核糖核苷酸聚合物。術(shù)語(yǔ)"DNA"或"DNA分子"或"脫氧核糖核酸分子"一般是指脫氧核糖核苷酸聚合物?？梢蕴烊缓铣蒁NA和RNA分子(例如分別通過(guò)DNA復(fù)制或DNA轉(zhuǎn)錄)。RNA分子可經(jīng)轉(zhuǎn)錄后^f務(wù)飾。也可化學(xué)合成DNA和RNA分子。DNA和RNA分子可為單鏈(即分別為ssRNA和ssDNA)或多鏈(例如雙鏈，即分別為dsRNA和dsDNA)。然而，基于本發(fā)明的性質(zhì)，術(shù)語(yǔ)"RNA"或"RNA分子"或"核糖核酸分子"也可指基本(即大于80%或優(yōu)選大于卯％)由核糖核苷酸組成的聚合物，但任選含有至少一個(gè)非核糖核苷酸分子，例如至少一個(gè)脫氧核糖核苷酸和/或至少一個(gè)核苷酸類似物。本文所用的術(shù)語(yǔ)"核苷酸類似物，，或"核酸類似物"在此處也指經(jīng)改變的核苷酸/核酸，或經(jīng)修飾的核苦^/核酸，是指非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸，包括非天然存在的核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸。優(yōu)選核苷酸類似物可在任意位點(diǎn)進(jìn)行修飾，只要其改變核苷酸的某些化學(xué)性質(zhì)但仍保留該核苷酸類似物行使其預(yù)期功能的能力。例如，鎖定核酸(LNA)為一類核苷酸類似物，具有對(duì)互補(bǔ)DNA和RNA的極高度親和力和出眾的特異性。LNA寡核苷酸已尋皮用作體外及體內(nèi)的反義分子(JepsenJ.S.等人，Oligonucleotides,2004，14(2):130-146)。本文所用的術(shù)語(yǔ)"RNA類似物，，是指與未改變或未修飾的相應(yīng)RNA相比，具有至少一處改變或修飾的核苷酸的多核苷酸(如化學(xué)合成的多核苷酸)，^f旦仍保留了與未改變或未修飾的相應(yīng)RNA相同或相似的性質(zhì)或功能。如上所述，寡核苷酸可被連接相連，所述連接使RNA類似物相對(duì)于磷酸二酯鍵連接的RNA分子水解率下降。RNA類似物的實(shí)例包括糖-和/或主干修飾的核糖核苷酸和/或脫氧核糖核苦酸。此類改變或修飾還可包括添加非核苷酸材料，例如向RNA末端或內(nèi)部(在RNA的一個(gè)或多個(gè)核苷酸上)添加。術(shù)語(yǔ)"包括"、"由組成，，以及"主要由組成"根據(jù)其標(biāo)準(zhǔn)含義定義。這些術(shù)語(yǔ)在本申請(qǐng)中可以相互替換，以共享每一術(shù)語(yǔ)所含的特定含義。術(shù)語(yǔ)"分離的"或"生物純凈"是指材料基本不含有天然狀態(tài)材料中通常伴隨的成分。除非另行說(shuō)明，本說(shuō)明書(shū)中使用的單數(shù)形式"一個(gè)"和"某個(gè)"包括復(fù)數(shù)含義。因此，例如提及"某一抗體"包括超過(guò)一個(gè)此類抗體。提及"某一分子"包括超過(guò)一個(gè)此類分子，諸如此類。除非另有說(shuō)明，本發(fā)明的實(shí)施使用本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA技術(shù)、電生理學(xué)以及藥理學(xué)的常規(guī)技術(shù)。此類技術(shù)詳細(xì)描述于文獻(xiàn)中(見(jiàn)如Sambrook,Fritsch&Maniatis,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版(1989);DNACloning，第I及II巻(D.N.Glover編著.1985);Perbal，B.，APracticalGuidetoMolecularCloning(1984);系列MethodsInEnzymology(S.Colowick和N.Kaplan編著，AcademicPress,Inc.);TranscriptionandTranslation(Hames等人編著.1984);GeneTransferVectorsForMammalianCells(J.H.Miller等人編著.(1987)ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.);Scopes,ProteinPurification:PrinciplesandPractice(第2版,Springer-Verlag);以及PCR:APracticalApproach(McPherson等人編著(1991)IRLPress)),其中每一部均全部在本文引用作為參考。以下為說(shuō)明實(shí)施本發(fā)明的材料、方法及步驟的實(shí)例。這些實(shí)例為說(shuō)明性，并無(wú)限制性。材料和方法患者隊(duì)列.根據(jù)以前的制度審批，收集正常健康對(duì)照志愿者(N=21)、患有良性婦科疾病女性(N=35)以及H.LeeMoffitt癌癥中心的卵巢癌患者(N=34)的尿液及血液樣本。除了8份樣本外其余均在首次手術(shù)切除前收集，而后8份樣本在研究募集時(shí)已出現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)。若可能則鑒定福爾馬林蠟塊，并回顧切片以根據(jù)FIGO評(píng)分確認(rèn)其組織學(xué)診斷。同時(shí)也回顧這些女性的醫(yī)療記錄，并拔^取可得的有關(guān)患者年齡、腫瘤類型、分期、分級(jí)、大小及手術(shù)治療的摘要。樣本制備.在患者知情同意前提下，收集患者的尿樣和血漿，匿名并編碼以保護(hù)患者身份，從H.LeeMoffitt癌癥中心取出以進(jìn)行此項(xiàng)研究。所用的樣本均保存于冰內(nèi)。用標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶抑制劑組合(80ng/ml4-(2氨乙基)-苯磺酰氟、200ng/mlEDTA、0.2jig/ml抑酶醛肽、0.2叫/ml胃蛋白酶抑制劑，SigmaScientific,St.Louis，MI)處理尿樣，并于3000xg下離心。然后將尿上清液和血漿樣本等分并貯存于-20匸。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定.為測(cè)量患者尿中Bcl-2水平，根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明，使用定量夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA;R&DSystems,Minneapolis,MN)測(cè)定樣本。為測(cè)量受試者的血漿CA125水平，根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明用ELISA(Bio-Quant，SanDiego,CA)測(cè)定樣本。使用DynexMRX平板讀數(shù)器(DynexTechnologies,Chantilly，VA)于450nm處檢測(cè)酶反應(yīng)，Bcl-2的結(jié)果以三次重復(fù)樣本的吸收均值士S.E表示，而CA125結(jié)果表示為兩次重復(fù)樣本的均值。統(tǒng)計(jì)分析.Bcl-2ELISA的樣本重復(fù)檢測(cè)三次，采用Kruskal-Wallis測(cè)試進(jìn)行其數(shù)據(jù)的正態(tài)分布性。然后用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)以確定正常對(duì)照樣本、良性疾病患者樣本以及卵巢癌患者樣本間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。與^目似，利用SAS系統(tǒng)進(jìn)行的判別分析被用于確定每組成員的正確性(正常vs.良性vs.癌腫)。實(shí)施例1-卵巢癌患者尿Bcl-2水平增高收集90人的尿液及血液，其中樣本收集自正常對(duì)照(N=21)、患有良性疾病女性(N=35)及患有卵巢癌女性(N=34)。后一組由診斷為子宮內(nèi)膜樣癌(N=l)、粘液性(N=7)及漿液性卵巢癌(N=24)以及常與卵巢癌相關(guān)的原發(fā)腹膜癌(N=2)的女性組成。樣本收集自良性婦科疾病女性，所述女性包括良性嚢性畸胎瘤(N=2)、單純嚢胂(N=10)、平滑肌瘤(N=8)、多嚢卵巢疾病(N=l)、卵巢腺纖維瘤(N=4)、粘液性嚢腺瘤(N=2)以及漿液性嚢腺瘤(N=8)女性。雖然這一隊(duì)列僅為一個(gè)小型預(yù)試驗(yàn)，它在組織性、分級(jí)及分期分布上具有典型臨床實(shí)踐的代表性。為確定尿Bcl-2水平是否適合作為新的卵巢癌分子標(biāo)志物，通過(guò)ELISA分析篩查正常對(duì)照、良性婦科疾病疾病女性及卵巢癌患者的尿樣(圖l)。正常對(duì)照樣本中尿Bcl-2量通常很低(均值0.21ng/ml)。與之相對(duì)，卵巢癌及原發(fā)腹膜癌中尿Bcl-2通常大于正常對(duì)照樣本10倍以上(3.4ng/ml)(圖1A)。正常尿液中Bcl-2含量均小于1.8ng/ml，而僅有2份癌癥樣本的Bcl-2低于1.8ng/ml(1.12ng/ml和1.78ng/ml)。由于漿液性癌是卵巢上皮細(xì)胞癌的主要類型，對(duì)漿液性腺癌患者而言，根據(jù)疾病分級(jí)(圖1A)和分期(圖IB)檢查其尿Bcl-2水平。盡管隨著腫瘤分級(jí)和分期增高Bcl-2水平有增高的趨勢(shì)，腫瘤分級(jí)和分期間Bcl-2水平的差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。與之類似，測(cè)量了尿液收集時(shí)的血清肌酸酐，提示尿Bcl-2水平與腎功能不全并無(wú)相關(guān)性(數(shù)據(jù)未顯示)。特別是一名患者(#77)尿Bcl-2水平出現(xiàn)了極顯著增高(>9ng/ml)，而并無(wú)其他顯著臨床癥狀。表2總結(jié)了圖1和圖2所示尿樣平均Bcl-2水平的結(jié)果。括號(hào)內(nèi)的數(shù)字表示每一組中的樣本數(shù)目。此外，將這些數(shù)據(jù)進(jìn)行分組，以顯示正常個(gè)體及卵巢癌組織學(xué)亞型、腫瘤分級(jí)和腫瘤分期間的平均Bcl-2水平(ng/ml)。數(shù)據(jù)顯示健康志愿者尿中Bcl-2的平均水平為0.204ng/ml,所有癌癥患者的尿Bcl-2水平一般為其10倍(3.12ng/ml)。此外，在漿液性卵巢癌(最常見(jiàn)的卵巢癌類型)中，尿Bcl-2水平似乎與腫瘤分期顯著相關(guān)，而與腫瘤分級(jí)中度相關(guān)。表2.正常及卵巢癌患者的尿Bcl-2水平<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>實(shí)施例2—良性婦科疾病患者的尿Bcl-2并未增高ELISA測(cè)量35名良性婦科疾病患病女性尿Bcl-2(在患者治療前收集尿液)，提示Bcl-2水平均值為0.02ng/ml,樣本中無(wú)一Bcl-2>1.8ng/ml,如圖8A所示。這些良性疾病包括良性畸胎瘤、單純嚢腫、平滑肌瘤、多嚢卵巢、纖維瘤及腺瘤。這些檢測(cè)值與正常對(duì)照類似，但顯著低于卵巢癌樣本，提示增高的尿Bcl-2水平(大于1.8ng/ml)與卵巢癌相關(guān)。Kruskal-Wallis檢驗(yàn)用于測(cè)試數(shù)據(jù)的正態(tài)分布性。由于"正常"組不符合正態(tài)分布(可能是由于樣本數(shù)過(guò)小)，以Mann-WhitneyU檢驗(yàn)分析組間差異。結(jié)果提示正常和良性組間無(wú)顯著差異(p<0.5)，但正常和癌癥或良性和癌癥組間p<0.001。圖8B是對(duì)該研究組尿Bcl-2水平的總結(jié)。與之類似，使用SAS系統(tǒng)進(jìn)行的判別分析顯示，正常/良性或癌癥組中成員正確性的纟既率大于90%。實(shí)施例3-尿Bcl-2與患者年齡或腫瘤大小無(wú)關(guān)對(duì)臨床參數(shù)的比較提示尿Bcl-2水平與患者年齡無(wú)關(guān)(見(jiàn)圖5)。雖然正常對(duì)照(29-81歲，均值48.5±S.D.12.7歲)以及良性婦科疾病患者女性(28-84歲，均值55.9±S.D.13.9歲)的年齡范圍及平均年齡略低于卵巢癌患者(26-92歲，均值62.2±S.D.13.8歲)，^研究中該差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。與之類似，尿Bcl-2水平與切除手術(shù)時(shí)測(cè)量的腫瘤大小并不相關(guān)(圖6)，肺瘤大小從微型至〉10cm，這可能反映了個(gè)體間的生物變異或胂瘤組成的變異。實(shí)施例4-尿Bcl-2檢測(cè)卵巢癌比血CA125更準(zhǔn)確為證實(shí)尿Bcl-2增高是否是比癌抗原125(CA125)更好的卵巢癌診斷指標(biāo)，比較12名正常對(duì)照以及23名卵巢癌患者中的尿Bcl-2與CA125水平(圖4A和4B)。在檢查的患者中尿Bcl-2增高與卵巢癌檢測(cè)的相關(guān)性幾乎為100%。尿Bcl-2水平增高(〉1.8ng/ml)鑒定了17/17漿液性腺癌患者、4/4粘液性腺癌患者，以及1/2原發(fā)腹膜癌患者為卵巢癌陽(yáng)性(圖4A)。正常對(duì)照中無(wú)一尿Bcl-2水平〉1.8ng/ml，從而正確被歸為癌癥陰性。與》L4目對(duì)，現(xiàn)行的卵巢癌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)血CA125水平〉35U/ml鑒定了13/17或76%漿液性腺癌患者(圖4B)。與之類似，CA125分析鑒定了3/4或75%粘液性卵巢癌患者(盡管這些患者的CA125水平為41-43U/ml)，以及1/2或50%原發(fā)性腹膜癌患者為癌癥陽(yáng)性。CA125水平增高也錯(cuò)誤地將2/12或16%健康個(gè)體鑒定為癌癥陽(yáng)性，這提示尿Bcl-2增高用于檢測(cè)卵巢癌似乎比CA125更準(zhǔn)確。實(shí)施例5—手術(shù)切除后尿Bcl-2下降為進(jìn)一步測(cè)試高水平尿Bcl-2檢測(cè)卵巢癌的準(zhǔn)確性，比較7名卵巢癌患者初次手術(shù)切除除去所有可見(jiàn)腫瘤前(圖7A和7B，黑色柱)以及手術(shù)后2周內(nèi)(白色柱)尿Bd-2的水平。對(duì)于這些收集初次術(shù)前及術(shù)后尿液的患者而言，手術(shù)移除肺瘤后Bcl-2水平下降多達(dá)100。/0，表明卵巢癌患者中腫瘤的存在與尿Bcl-2增高相關(guān)性良好。目前，臨床前研究集中關(guān)注研發(fā)Bcl-2抑制物，包括反義寡核普酸及小分子Bcl-2抑制物。雖然此類研究以Bcl-2為治療性干預(yù)的耙位，目前的數(shù)據(jù)提示利用基于ELISA的測(cè)定對(duì)尿Bcl-2進(jìn)行定量提供了用于檢測(cè)卵巢癌的安全、靈敏、特異且經(jīng)濟(jì)的新方法，將惠及美國(guó)及世界范圍內(nèi)的所有女性包括醫(yī)療服務(wù)不足的地區(qū)，特別是卵巢癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)高的女性人群。此外，考慮到每年美國(guó)約有25,000女性被診斷為卵巢癌，在疾病早期和晚期利用尿Bcl-2檢測(cè)卵巢癌不但可以證實(shí)卵巢癌的診斷，也有可能檢測(cè)出數(shù)以千計(jì)的以往未被診斷的卵巢癌。這對(duì)于早期檢測(cè)卵巢癌尤其重要，在診斷的卵巢癌中早期卵巢癌不超過(guò)10%，但手術(shù)切除患側(cè)卵巢可使患者存活率提高至卯％以上，并可預(yù)見(jiàn)減少終生醫(yī)療費(fèi)用。最后，除了發(fā)揮新的診斷功能以外，尿Bcl-2水平可用于監(jiān)測(cè)病程中卵巢癌的存在與否，從而可能影響治療和預(yù)后結(jié)局。顯而易見(jiàn)，需要更大樣本人群的研究以證實(shí)尿Bcl-2水平是否能作為卵巢癌生物標(biāo)志物，并研究卵巢癌中尿Bcl-2增高的分子機(jī)制。然而，由于并無(wú)報(bào)道使用尿液檢測(cè)或Bcl-2作為卵巢癌的生物標(biāo)志物，該試點(diǎn)研究表明，利用ELISA測(cè)量尿Bcl-2，提供了檢測(cè)所有卵巢癌腫的新的簡(jiǎn)<更方法，并可能降低該導(dǎo)致每年數(shù)千女性死亡的隱匿疾病的致死率。實(shí)施例6一Bcl畫(huà)2測(cè)試的尿保存條件檢查尿Bcl-2的保存穩(wěn)定性的研究表明，若制備樣本時(shí)添加了蛋白酶抑制劑組合，則這些尿液可于-20'C保存1年以上而不致喪失其中Bcl-2的可檢測(cè)性(見(jiàn)圖11中"對(duì)照"及"-20'C")。這有益于那些需要重復(fù)測(cè)試以前樣本及現(xiàn)有樣本的個(gè)體。或者，也可將這些樣本保存在4。C最多4天，而不會(huì)對(duì)尿Bcl-2的檢測(cè)產(chǎn)生不良影響。這些結(jié)果很重要，因?yàn)樗鼈兲崾?，只要向尿樣中添加蛋白酶抑制劑并保持尿樣冷凍，將患者尿液運(yùn)送(從可能較遠(yuǎn)的地區(qū))到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行Bcl-2檢測(cè)可能需要的時(shí)間就不會(huì)對(duì)尿Bcl-2檢測(cè)的結(jié)果造成不良影響。然而，室溫保存4天的樣本中Bcl-2測(cè)量值降低，而-80"C保存的尿樣中無(wú)法檢測(cè)到Bcl-2;因此，應(yīng)當(dāng)禁止將用于Bcl-2檢測(cè)的尿樣保存于室溫或-80"C。本文提及或引用的所有專利、專利申請(qǐng)、臨時(shí)申請(qǐng)及出版物(見(jiàn)上或見(jiàn)下)在此處均全部引用作為參考，包括其中所有的圖和表格，只要它們與本說(shuō)明中的明確教導(dǎo)無(wú)矛盾之處。應(yīng)當(dāng)理解本文所述的實(shí)施例和實(shí)施方案均僅用于說(shuō)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)其提出多種修飾或改變建議，其也包括在本申請(qǐng)的精神和范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.檢測(cè)受試者癌腫的方法，其包括檢測(cè)受試者生物樣本中是否存在Bcl-2，其中Bcl-2水平高于預(yù)設(shè)閾值提示受試者患有癌腫。2.權(quán)利要求l的方法，其中所述檢測(cè)包括檢測(cè)生物樣本中的Bcl-2蛋白。3.權(quán)利要求1的方法，其中所述檢測(cè)包括檢測(cè)生物樣本中編碼Bcl-2蛋白的核^列。4.權(quán)利要求l的方法，其中所述檢測(cè)包括(a)使生物樣本與結(jié)合Bcl-2蛋白的結(jié)合劑接觸以形成復(fù)合物；(b)檢測(cè)該復(fù)合物；并將檢測(cè)的復(fù)合物對(duì)應(yīng)于樣本中Bcl-2蛋白的量，其中Bcl-2蛋白增高提示癌腫。5.權(quán)利要求l的方法，其中生物樣本為選自尿液、全血、血清、血漿、腹水及腹膜液的生物液體。6.權(quán)利要求l的方法，其中生物樣本為尿液。7.權(quán)利要求l的方法，其中癌腫選自卵巢癌、原發(fā)性腹膜癌及子宮內(nèi)膜癌。8.權(quán)利要求l的方法，其中癌腫為卵巢癌。9.權(quán)利要求8的方法，其中生物樣本為尿液或血液，而癌腫為卵巢癌。10.權(quán)利要求l的方法，其中癌腫選自乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、黑素瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、肉瘤、膀胱癌及頭頸癌。11.權(quán)利要求1的方法，其中生物樣本為尿液或血液，而癌腫為前列腺癌。12.權(quán)利要求4的方法，其中結(jié)合劑固化于支持物上。13.權(quán)利要求4的方法，其中結(jié)合劑為單克隆或多克隆抗體。14.權(quán)利要求4的方法，其中所述(b)中的檢測(cè)還包括將標(biāo)記與結(jié)合劑連接或摻入結(jié)合劑中。15.權(quán)利要求13的方法，其中所述(b)中的檢測(cè)4吏用基于ELISA的免疫酶聯(lián)檢測(cè)。16.權(quán)利要求1的方法，其還包括在所述Bcl-2檢測(cè)前、檢測(cè)中及檢測(cè)后，檢測(cè)受試者同一生物樣品或不同生物樣品中的癌腫生物標(biāo)志物。17.權(quán)利要求16的方法，其中癌肺生物標(biāo)志物為婦科癌腫的生物標(biāo)志物。18.權(quán)利要求16的方法，其中生物標(biāo)志物為CA125、LPA或OVXI。19.權(quán)利要求1的方法，其中所述受試者患有癌腫，且其中作為癌腫治療前、治療中或治療后監(jiān)測(cè)受試者的一部分，在若干時(shí)間點(diǎn)定期進(jìn)行所述檢測(cè)。20.權(quán)利要求1的方法，其還包括將生物樣本中Bcl-2的水平與正常對(duì)照樣本中Bcl-2的水平進(jìn)行比較，其中生物樣本中Bcl-2水平高于正常對(duì)照樣本中的水平提示存在癌腫。21.權(quán)利要求1的方法，其中受試者在實(shí)施所述檢測(cè)時(shí)并無(wú)任何癌腫癥狀。22.權(quán)利要求1的方法，其中受試者在實(shí)施所述檢測(cè)時(shí)具有一種或多種癌腫癥狀。23.權(quán)利要求1的方法，其中受試者具有選自以下的一種或多種癥狀盆腔痛、異常陰道出血、腹脹、持續(xù)背痛、持續(xù)胃部不適、排便或排尿習(xí)慣改變、性交疼痛、非計(jì)劃的體重減輕10磅或以上、外陰或陰道異常、乳房改變，以及疲乏。24.權(quán)利要求l的方法，其中受試者在所述檢測(cè)時(shí)血CA125水平增高。25.權(quán)利要求l的方法，其中受試者在所述檢測(cè)時(shí)血CA125水平不增高。26.預(yù)后評(píng)估患有或疑似患有癌腫的受試者的方法，其包括a)確定受試者生物樣本中的Bcl-2水平；b)將步驟(a)中確定的水平與未患癌肺的正常受試者生物樣本中已知的Bcl-2范圍進(jìn)行比較；且c)才艮據(jù)步驟(b)的比較確定受試者預(yù)后，其中步驟(a)中Bd-2水平高提示i^艮型癌腫，因而預(yù)后較差。27.快速檢測(cè)體液樣本中Bcl-2的裝置，其包括接受體液樣本的加樣區(qū)；含有與樣本中Bcl-2結(jié)合的結(jié)合劑的標(biāo)記區(qū)；以及結(jié)合Bcl-2的結(jié)合劑滯留并發(fā)出信號(hào)的檢測(cè)區(qū)，其中Bcl-2水平低于閾值濃度的受試者樣本發(fā)出的信號(hào)與Bcl-2水平高于閾值濃度的受試者樣本發(fā)出的信號(hào)不同。28.權(quán)利要求27的裝置，其中體液為尿液且所述閾值濃度為0ng/ml至2.0ng/ml。29.權(quán)利要求27的裝置，其中體液為尿液且所述閾值濃度為1.8ng/ml。30.權(quán)利要求27的裝置，其中所述裝置含有參照區(qū)，所述參照區(qū)發(fā)出的信號(hào)強(qiáng)度與Bcl-2水平等于閾值濃度的受試者樣本在檢測(cè)區(qū)發(fā)出的信號(hào)強(qiáng)度相同。31.權(quán)利要求27的裝置，其中結(jié)合劑為標(biāo)志的抗體。32.權(quán)利要求31的裝置，其中抗體為膠體金標(biāo)志。33.權(quán)利要求27的裝置，其中檢測(cè)區(qū)包括固化的抗Bcl-2抗體。34.權(quán)利要求27的裝置，其中裝置在檢測(cè)區(qū)下游含有控制區(qū)，所述控制區(qū)滯留通過(guò)檢測(cè)區(qū)的結(jié)合劑。35.權(quán)利要求27的裝置，其中控制區(qū)與參照區(qū)為相同區(qū)域。36.權(quán)利要求27的裝置，其中結(jié)合劑為標(biāo)志的單克隆抗體。37.測(cè)量體液中Bcl-2的方法，其包括(a)獲取受試者的體液樣本；(b)將樣本與結(jié)合樣本中任意Bcl-2的結(jié)合劑接觸；(c)分離結(jié)合了Bcl-2的結(jié)合劑；(d)檢測(cè)(c)中分離的結(jié)合劑攜帶的信號(hào)；以及(e)將步驟(d)檢測(cè)的信號(hào)與參照信號(hào)進(jìn)行比較，所述參照信號(hào)為Bcl-2水平等于閾值濃度的受試者樣本所發(fā)出的信號(hào)。38.權(quán)利要求37的方法，其中體液為尿液且所述閾值濃度為Ong/ml至2.0ng/ml。39.權(quán)利要求37的方法，其中體液為尿液且所述閾值濃度為1.8ng/ml。40.檢測(cè)生物樣本中癌肺的試劑盒，其包括Bcl-2特異性結(jié)合劑，以及利用結(jié)合劑檢測(cè)生物液體中癌腫的印刷說(shuō)明書(shū)。41.權(quán)利要求40的試劑盒，其還包括一種或多種用于生物樣本的蛋白酶抑制劑。全文摘要本發(fā)明涉及通過(guò)檢測(cè)受試者生物樣本中的Bcl-2對(duì)受試者癌腫如早期或晚期卵巢癌進(jìn)行診斷、預(yù)后和監(jiān)測(cè)的方法，所述樣本優(yōu)選為尿液或血液樣本?？梢岳媚軝z測(cè)或結(jié)合Bcl-2蛋白，或能檢測(cè)或結(jié)合其編碼核酸的物質(zhì)測(cè)量Bcl-2，所述物質(zhì)如與Bcl-2蛋白或其部分特異性反應(yīng)的抗體。本發(fā)明還涉及用于實(shí)施本發(fā)明方法的試劑盒。本發(fā)明還涉及快速檢測(cè)體液中Bcl-2的裝置，以及快速測(cè)量體液中Bcl-2的方法。文檔編號(hào)G01N33/53GK101384903SQ200780004960公開(kāi)日2009年3月11日申請(qǐng)日期2007年2月9日優(yōu)先權(quán)日2006年2月9日發(fā)明者P·A·克魯克申請(qǐng)人:南佛羅里達(dá)大學(xué)