亞微米表面等離子體激元諧振傳感器系統(tǒng)的制作方法

文檔序號：6123711閱讀：406來源：國知局

專利名稱：亞微米表面等離子體激元諧振傳感器系統(tǒng)的制作方法
亞微米表面等離子體激元諧振傳感器系統(tǒng) 相關申請的交叉參考
本申請要求2005年12月16日提交的名稱為"Sub-micron Cavity Surface Plasmon Sensors and Their Micro-fluidic Applications" 的共同未決的臨時申請?zhí)?0/750872的優(yōu)先權，在此將其全部內容通過引用結合進來。
政府利益
本發(fā)明的開發(fā)過程中的部分工作得到了授權號為IBM-0083653的來自National Science Foundation和授4又號為NAG2-1619的來自NASA 的政府支持。依照這些授權，美國政府在此處公開的發(fā)明中享有一定的權利。
背景技術：
醫(yī)學中的顯著趨勢是引入即時檢驗(pointofcare， POC)器械用于快速的床側診斷。這些器械能夠由第一響應者或醫(yī)務人員快速診斷用于時間危急的診斷，例如用于指示患者是否存在心臟癥狀。還開發(fā)了用于其它指示的測試，例如傳染病、藥物濫用、腦血管疾病，其用于防止常規(guī)室內實驗室化驗伴隨的過長的處理時間和高的費用。目前的POC器械僅僅具有單一用途。盡管這對于很多應用而言是合適的，但還不能滿足持續(xù)監(jiān)控器械的需要。
最初的臨床需求是能夠監(jiān)控和檢測重病看護患者中感染的存在。目前，4艮多重病看護患者產生的感染沒有快速檢測到，通常導致敗血癥或休克，導致高的死亡率。對于能夠連續(xù)跟蹤患者血流中例如指示感染的特定蛋白質標記物的濃度的器械存在顯著的需求。
直接與樣品分子相互作用以^供鑒別測試分子^信號。生物傳f器通常經過化學官能化，使其具有選擇性。讀數可以是電化學的，對于小分子 (例如葡萄糖)而言常常如此，或者對于例如蛋白質或DNA可以使用
熒光或其它光學技術。典型的生物傳感器通?？梢栽谶B續(xù)讀數模式下操作，或者可以使用多次。這與需要大量試劑處理通常僅產生一次測試結果的常規(guī)實驗室測定是不同的。
與常規(guī)實驗測定相比生物傳感器提供的最小化可能性暗示著即時
測試(POC)能夠提供顯著改善的診斷能力。POC測試的優(yōu)點包括有助于治療決策的快速轉向；快速向患者發(fā)布測試結果，由此降低醫(yī)師的工作負擔并提高患者的滿意度；減少書面工作和簡化樣品跟蹤；降低對特殊技師的需求。以一組實驗對象形式管理的POC測試提供了其它顯著的優(yōu)點。例如，幾種心臟病標記物的同時篩選節(jié)約了時間，并提供了有效的其據。各種類型的流感的篩選與僅對單一菌林進行的更有限制性的測試相比，將有助于診斷。
生物傳感器的新興應用包括例如食物和水的測試、藥物的濫用、生物防御和"白粉，，的檢測，以及獸醫(yī)測試。這些應用中的一些具有獨特的需求，例如與生物防御手段相關的對超快響應時間的需求，或在食物或水的測試中用于檢測非常低數量的大腸桿菌菌落形成單元所需的高靈敏性。典型的水測試產品使用必須在燒瓶中培養(yǎng)18~24小時或更長時間的試劑，改變顏色表明存在病原體。盡管這些產品都是非常有效地，但其長的24小時培養(yǎng)時間會存在問題。當污染的水位于公用自來水時，在檢測病原體問題之前，該水可能長期使用。連續(xù)監(jiān)控水質的產品可以在實際污染的幾分鐘內提供警報。
隨著政府和軍事機構研究快速和交互式檢測炭疽熱、肉毒桿菌中毒、瘧疾、埃博拉病毒、蓖麻病毒和其它潛在的恐怖試劑的方法，生物防護呈現獨特的問題。目前US Postal Service使用昂貴的測試套件，其引入了實時PCR,用于放大和分析來自空氣或包裹和信封上的可疑"白粉"的粗試樣。
新品種的生物傳感器使用由光和金屬表面相互作用產生的現象。該現象被稱作"表面等離子體激元諧振(Surface Plasmon resonance )，，，具體化為電荷密度(電子云)振動，其可能存在于兩種具有不同介電常數或相反信號的介電常數的介質的界面處。這種情況通常在介電質(玻璃)和金屬(通常為金或銀)的界面處會遇到。電荷密度波(電子云) 與電磁波(進入的光子)有關，這種耦合在界面處達到最大值，指數性衰減進入到兩種介質中。實際上，這種耦合是表面邊界等離子體激元波
10
(SPW)。
這種耦合不能直接在平坦的金屬-介電界面處通過入射光子激發(fā)，因
為SPW的傳播常數總是高于波在介電質中傳播的常數。因此為了提高該耦合，使用了衰減的全反射(ATR)、棱鏡耦合器和光波導管，或在衍射光柵表面處的衍射。由于光子對SPW的激發(fā)導致能量諧振轉移進入SPW，因此表面等離子體激元諧振(SPR)通過光子能量的諧振吸收而本身得以體現。由于介電質中的電磁場的強度高(比使用介電波導的典型漸逝場傳感器中高數量級)，因此SPW的傳播常數以及由此形成的SPR對與支持SPW的金屬層相鄰的介電質的光學性質(即可由SPR 的光詢問確定的介電質的折射系數)的變化非常敏感。敏感區(qū)域的厚度隨著施加能量的波長而變化，但通常對于可見光范圍內的波長約為 500nm。表面處材料或雜質的存在改變了折射系數。這是可以用于高精度確定材料或雜質的基本效應。
金屬是可以提供負信號介電常數的材料。其具有在由適當波長的電磁輻射激發(fā)時組成電子產生諧振的諧振模式。特別是金具有在510nm附近的可見波長處具有諧振的光譜。在棱鏡耦合器中的衰減全反射的情況下，衰減波對與介質接觸的金屬表面在約200 400nm表面內是敏感的，通過表面等離子體激元波的存在得以提高。這種材料有效地改變了折射系數，因此改變了臨界衰減全反射的精確角。因此可以探測結合基體和樣品之間的相互作用，測定在最大SPR產生處反射角的微小變化。
這種丈丈應可用于研究分子之間(例如蛋白質、RNA和/或DNA之間) 或者蛋白質和病毒或細菌之間的結合。例如，用特異性抗體官能化的表面將僅探測一種抗原(例如抗原A)并將特異性結合與非特異性結合區(qū) 分開。即，將檢測抗原A,但可以區(qū)分結合到表面上的官能化蛋白質與另一抗原(即抗原B)之間較弱的相互作用。通常，需要幾毫度的角分辨率來區(qū)分選擇性和非選擇性結合。因此可以實現稀釋到lpg/ml的溶液中的蛋白質A的檢測。此外，可以解釋表面蛋白質和抗原A之間結合的反應動力學。
大多數商業(yè)SPR儀器包括樣品引入器械或傳感器，所述器械或傳感器包括涂覆有貴金屬(例如Au或Ag)的薄層(50nm)的半球形介電棱鏡。該金屬涂層進而涂覆有將特異性結合目標分析物的分子。這些商用器械進一步包括在測角器上的光源、陣列檢測器和各種校準和過濾光學
儀器，一般如

圖1中所示。
使用半球形棱鏡，在介電/空氣界面處的入射角與第一空氣/介電界面處相同，在此處來自光源的射線進入該棱鏡。在光與金屬膜中的非輻射衰減波(表面等離子體激元)相結合的精確入射角，膜的反射率大致
降低90%,產生位于遠離玻璃的金屬表面處的衰減等離子體激元場。該衰減波的性質取決于與傳感器的自由金屬表面接觸的介質(例如生物分子)的性質。介質(例如與表面上的分子吸收相關的那些)折射指數的精細改變，會引起表面等離子體激元諧振角O的可檢測到的改變。然后 SPR儀器調節(jié)檢測器位置以發(fā)現這一新角度，由此測定SPR角度的改變。
這些類型的SPR器械具有多個固有局限，包括敏感性、樣品尺寸、復雜性和費用?，F有的商業(yè)儀器需要大的復雜的和脆弱的運動部件，以使入射光束和檢測器位置最優(yōu)化。例如，光源的測角器相對較大和較重，但易碎。而且，光源本身必須提供偏振光。通常敏感性的極限是約為l(T6 折射率單位，其通常足以檢測具有l(wèi)pg/mn^濃度的吸附分子和尺寸為至少200Da的目標物，但靈敏性不足以提供對某些政府標準需要的對濃度為O.Olppb的生物恐怖物質試劑的有效檢測。通常的平坦傳感器底座 (footprint)在數mm2范圍內(在Biacore Flexichip中為1/16th mm2,在 Biacore 3000中為2.2mm2),這對于使這些傳感器最小化的能力上產生了技術限制。較大的傳感器面積意味著必須提供更多的測試流體以在該平坦傳感器上流動。而且，精確度的限制也需要更多的測試流體以提供足夠的待檢測的分子或微顆粒。由于SPR傳感器的宏觀尺寸，因此對于分析綜合所用的大多數技術而言，用于多元分析的傳感元件的陣列需要的樣品體積過大。所有這些傳統(tǒng)平坦傳感器的限制都降低了該傳感器的
通量容量。
此外，大多數目前的SPR傳感器需要p-偏振光(即電矢量分量平行于入射平面)及其光學元件的精確對準，其復雜性可與桌面分光計相當。這就導致費用高，通常約為數十萬美元。
附圖描述
圖l是現有技術的平坦基體SPR傳感器的操作示意圖。
圖2是依照本發(fā)明的一種實施方案的SPR傳感器的放大示意圖。
圖3是依照本發(fā)明制造的SPR珠子傳感器的電子顯微鏡圖像。圖4是使用依照本發(fā)明的SPR傳感器的微流體芯片的示意圖。圖5是用于評估依照本發(fā)明的SPR傳感器的性能的實驗裝置的示意圖。
圖6a和6b是圖5中所示實驗裝置中SPR傳感器的光譜性能的圖表。圖7a和7b是在進一步試驗條件下本發(fā)明的SPR傳感器的光譜性能的圖表。
圖8是依照本發(fā)明的另一實施方案的微流體SPR傳感器的示意圖。圖9是與本發(fā)明的SPR傳感器的金層進行磺基-DSP反應用于SPR
傳感器官能化的圖示。
圖10a和10b是使用碳二亞胺耦合劑進行官能化反應的圖示。
圖11是安裝在本發(fā)明的微流體SPR傳感器上的微流體部件的圖示。
圖12是具有微流體過濾和預濃縮模塊的本發(fā)明的微流體SPR傳感
器的圖示。
圖13是具有用于檢測多種分子、配體或分析物的映射官能化 (mapped functionalization )的本發(fā)明的微流體SPR傳感器的圖示。圖14是依照本發(fā)明的微流體SPR傳感器系統(tǒng)的部件的圖示。圖15是能夠同時評估多種化學物質的依照本發(fā)明的傳感器的示意圖。
發(fā)明概述
使用SPR技術用于例如生物分子相互作用分析的衰減波傳感器提供了一些優(yōu)點，例如非侵入性、實時監(jiān)控目標分析物、配體或分子的結合、以及無標記的狀態(tài)。用于提高SPR傳感器的敏感性同時降低傳感器的尺寸的機理會是非常合意的，特別是在醫(yī)療診斷、藥物篩選、生物醫(yī) 學研究和生物分析領域中。另一個合意的目標是消除通常易碎的機械和光學部件，其會增加傳感器的體積、增加響應時間和降低敏感性。依照
本發(fā)明的一個方面，使用駐波代替該傳遞的等離子體激元波，或者換言之，通過增加形狀諧振提高SPR傳感器的敏感性。這種駐波將多次越過活性表面，所述次數次數與諧振的品質因數成正比，因此提高了波和粘合劑之間相互作用的可能性。
在高度對稱的微結構內部光的循環(huán)通常包括這種形狀諧振。對于尺
寸為10~ 100^im的介電球，發(fā)生特定等級的諧振，已知稱作耳語廊才莫式。該術語源自和微弱的聲音沿London的St. Paul's Cathedral的走廊壁的圓周引導現象的類似性。生物分析和分光應用可以利用在介電微球形和液滴內部的耳語廊沖莫式的強表面定域和高品質因數的優(yōu)點。然而，隨著微球形尺寸的降低，該耳語廊模式逐漸損失其表面定域性質，通常使得耳語廊模式在微球環(huán)境中無效。
對于亞微米尺寸(即直徑小于1pm),用于保持光約束(light confinement)的一種途徑是用支持表面等離子體激元(SP)的金屬膜涂布該球形。這種涂布有金屬膜的微球的一個特征是在某些直徑，與腔室模式相關的全內反射角可以與金屬膜的SPR角相一致，由此導致在幾何對稱表面上更有效形式的SP激發(fā)。這一特征消除了對現有傳感器中發(fā) 現的偏振光源、光學校準和機械掃描的需求，使得施加于平坦傳感器的嚴格的幾何條件降低。
本發(fā)明包括新型的傳感器，其可以最優(yōu)化地與微流體系統(tǒng)結合使用。對有限空間(例如微流體器械)內部(生物)化學濃度和反應動力學的測定是非常難的。本發(fā)明考慮了覆蓋有支持表面等離子體激元的金屬(例如Au、 Ag、 Cu)的亞微米介電珠子。由于傳感器元件的幾何形狀以及金屬殼中誘導的表面等離子體激元相結合產生的周期邊界條件，因此該SPR顯示大大提高了特定波長的透射。本發(fā)明的傳感器對傳感器的極其表面處(即在約300nm范圍內)材料的折射系數的小變化是敏感的，比現有技術的遠場傳感器和檢測技術敏感得多。
因此，本發(fā)明考慮了微腔室器械，其使用由幾何或形狀諧振提高的表面等離子體激元諧振。為了本發(fā)明，該器械在此將稱作微腔室表面等離子體激元諧振(MSPR)傳感器。在如下描述中，已經選擇了球形腔室諧振器，但我們理解也可以使用其它能夠維持用于等離子體激元諧振駐波(stationary plasmon resonance wave )越過活性表面運行的邊界條件的其它對稱幾何形狀。
因此，在本發(fā)明的一個方面，該MSPR用越過傳感器元件的活性表面運行的駐波代替與傳統(tǒng)SPR傳感器相關的傳播性等離子體激元波。為了實現這種近場耦合，該介電腔室諧振器用特定厚度的SPR支持金屬涂布。該金屬層和該腔室諧振器材料的折射系數一起確定了腔室諧振器傳感器元件的諧振頻率(一個或多個)。然后與該諧振頻率相關確定該傳
感器元件的尺寸。特別地，在一個方面，該傳感器元件的尺寸約為諧振頻率的波長。
依照本發(fā)明，該傳感器元件或珠子安裝在透光性基體(例如玻璃)
上。該基體和珠子用SPR支持材料(例如金)涂布。在本發(fā)明的另一特征中，在珠子和沒有涂布材料的基體之間的界面處限定了針孔。該針孔的尺寸也校準到傳感器的諧振波長，使得該針孔直徑小于該波長。該 MSPR傳感器進一步包括朝向可操作以誘導SPR響應的傳感器珠子的光源。因此，該光源為傳感器提供諧振波長的光，可以優(yōu)選為所需波長的單色光。該光可以朝向珠子的涂覆表面或針孔，檢測器定位以接受通過 MSPR傳感器珠子的透射光。
由于其小尺寸，本發(fā)明的MSPR傳感器可以結合到微流體器械中，為了獲得關于在微流體通道內發(fā)生的(生物)化學的信息。這些器械將可以制造可以使用小試樣體積快速檢測和定量多種(生物)化學物質、病毒和細菌以及其濃度的緊湊的一次性傳感器。因此，本發(fā)明的MSPR 傳感器將在醫(yī)療診斷和治療(特別是敗血癥的診斷和治療)中、在監(jiān)控化學反應的實驗室儀器中以及在檢測生物化學物質和生物危害物(例如生物恐怖物質或污染物)中具有重要的應用。
總的來講，本發(fā)明的MSPR傳感器可以應用于其中和(生物)化學物質的反應改變與傳感器表面接觸的松散介質(bulk media)的折射指數的應用中。在官能化的探測器的情況下，本發(fā)明可以應用于其中化學相互作用造成覆蓋該傳感器珠子的表面并可以與分析物或配體發(fā)生化學相互作用的自組裝單層的厚度或致密性發(fā)生改變的應用中。本發(fā)明的 MSPR傳感器的一些通常(非限定性)應用包括
1. 官能化微流體器械內的檢測器的方法。
2. ;險測;微流體通道內部分子物種相互作用的應用。
3. 檢測小分子物種的應用。
4. 檢測分子之間的特異性結合。
5. 測定特定分子對(例如配體-受體對、配體-抗體對)的親和常數和離解常數。
6. 測定微流體器械內部分析物的化學濃度。
7. 測定有限幾何空間中化學物質的擴散系數。
8. 實時^r測和定量體液(例如血漿和尿液)中的分子物種。
9. 實時檢測和定量空氣和水中的(生物)化學物質或生物有害物。
10. 實時檢測用于控制治療試劑發(fā)射的分子物種，例如用于控制疾病狀態(tài)。
11. 實時檢測空氣或水中的有害廢物或工業(yè)化學物質。
12. 實時檢測血漿和其它體液中的病毒。
13. 確定人體和獸醫(yī)應用中的血液化學。
14. 檢測爆炸物或爆炸物/火器的殘余物。
15. 檢測DNA和/或RNA,或在大約單個細胞或至多幾個細胞的水平上檢測DNA/RNA與某些蛋白質的結合。
16. 化學或生物化學工業(yè)過程的工藝分析和/或控制。本發(fā)明的一個優(yōu)點是排除了常規(guī)平坦傳感器所需的復雜光學儀器。
例如，本發(fā)明的MSPR傳感器可以使用來自低成本的光源的漫射光。該光不必經過偏振、過濾或導向。本發(fā)明排除了對易碎的但體積大的光學校準部件的需求，例如現有技術中的測角計。
本發(fā)明的MSPR傳感器的另一個優(yōu)點在于其能夠整合到小包裝或芯片中的能力。本發(fā)明的MSPR傳感器可以將光源和光檢測器定位于非常接近傳感器珠子陣列，由此與現有技術的平坦傳感器相比顯著降低本發(fā)明的MSPR傳感器的體積。
本發(fā)明的一個目的是提供能夠檢測目標分析物、配體或分子在流體中存在的微傳感器。另一個目的是提高該微傳感器的敏感性和檢測速度。
本發(fā)明的另一個目的是提供可以在微環(huán)境中提供高通量檢測的傳感器。本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點將從以下的描述中變得顯而易見。
優(yōu)選實施方案
為了促進對本發(fā)明的原理的理解，現在參考附圖中示出和以下說明書中描述的實施方案。應該理解并不旨在由此對本發(fā)明的范圍進行限定。應該進一步理解本發(fā)明包括對所示實施方案的任意改變和變體，并且包括本發(fā)明的原理的進一步應用，這是本發(fā)明所屬領域的技術人員通常會想到的。
依照本發(fā)明的一種實施方案，諧振微腔室傳感器(MSPR)包括負
載在基體12上的球形介電微顆粒10，如圖2所示。該微顆粒涂覆有SPR 支持材料(例如金)的層14,其通過微顆粒和基體之間限定的近場針孔 16激發(fā)。從該涂覆的微顆粒上散射的光具有強的與表面等離子體激元才莫式的耦合有關的光譜諧振。這些諧振可以用于傳感目的，類似于用于研究在平坦表面等離子體激元傳感器上的分子結合的表面等離子體激元諧振，但具有微球形諧振器的亞微米底座和高質量因素的優(yōu)點，產生與需要光學校準的現有技術傳感器相比100倍的提高。
這些與現有的平坦傳感器相比顯著的改進的實現部分是因為本發(fā) 明的傳感器依賴于光透射而不是反射。已知納米范圍內的反射光在反射性基體的表面的遠側產生近場衰減波光。在微顆粒IO和基體12之間的界面處的針孔16具有小于導向基體表面的光的波長的直徑，因此只有近場衰減波光將通過該針孔。然而，通過針孔的光本身不足以使傳感器起作用。因此，依照本發(fā)明，在針孔上方的球形諧振腔室的增加將這種近場光轉化為能夠容易感應或觀察到的遠場光。在針孔上方的該對稱形狀的微顆粒可使光透過針孔進入諧振腔室以在微顆粒上面產生容易觀察到的光透射。在特定的實施方案中，激光二極管提供波長為590nm的光，因此針孔16具有小于該波長的直徑，更優(yōu)選地，直徑小于300nm。在此處所述的某些實施例中，對于直徑為771nm的介電微顆粒，在SPR 珠子和玻璃基體之間的接觸處建立的針孔直徑在150~200nm范圍內。我們考慮了對于更小的介電微顆粒直徑，將產生更小的針孔直徑。
如上所述，本發(fā)明的MSPR傳感器不需要與依賴沿平坦基體表面?zhèn)?播的表面等離子體激元波的現有技術的SPR器械相關的復雜光學儀器。特別地，圖2中所示的MSPR傳感器不需要與類似圖1中所示器械的現有技術器械有關的用于測定SPR角度改變的測角計或校準器或濾光儀器上的光源。相反，本發(fā)明的MSPR傳感器可以由與基體12基本垂直透入MSPR傳感器珠子的光照射。而且，與圖1中的現有技術器械相比，該光源可以位于基體的任一側，下面將更為詳細地解釋。
此外，從現有技術器械的光學約束中獲得的這種自由可使本發(fā)明的 MSPR傳感器使用廣泛范圍頻率的廣泛范圍的光源。對于本說明書，提及"光"并不限定于可見光波長。因此，該光源(或更寬泛地，該能量源)可以提供紫外、可見和紅外光譜范圍的光。盡管在UV和IR范圍之外的波長目前并不已知用于表面等離子體激元傳感器，但本發(fā)明并不排
除觀察到本發(fā)明的等離子體激元諧振特征的任何后發(fā)現的能量波長。
實施例1:制備MSPR珠狀傳感器
以下是圖2中所示MSPR傳感器的一種實驗室制備方法的描述。認識到對于特定應用可以使用其它制備技術。另外認識到以直接下面的描述主要用于適用于研究應用而不是商業(yè)應用的傳感器，盡管可以應用相同原理來制備有商業(yè)前景的傳感器。
用金剛石對30 x 24mm, 156pm厚的顯微鏡蓋玻片第1號劃線，并將其分為四等份。還將25mx75mm的顯微鏡載玻片劃線，并將其分為兩等份。使用公知的RCA清潔方案的改性形式(H202:H20: NH4OH = 2:1:2,加溫到70°C )清洗該載玻片和蓋玻片(在圖2和4中分別為物體 12、 62和64),然后在DI水中沖洗并用N2干燥。經清洗過的蓋玻片放置在鐘形罩中的干燥氣氛中，其可以與機械泵連接以在內部產生低真空。預先制備直徑為360nm、 480nm和770nm的約104珠子 1^的聚苯乙烯微球的稀溶液，在各片蓋玻片上分配50pL各溶液。由于清洗溶液的作用，該玻璃的表面變?yōu)橛H水性。在鐘形罩中的真空(~1托)下暴露2~3小時之后，液體變干，珠子保持固定在該蓋玻片上，形成珠子的不規(guī)則的單分散層。濃度的選擇使得相鄰珠子之間的平均距離足夠大 (至少20- 50jLim)以避免光學串擾。通過將其暴露于氬等離子體八分鐘，用150nm的金層賊射涂布這些樣品。
表3中示出了在玻璃基體上濺射涂覆有150nm金的771nm聚苯乙烯珠子的電子顯微鏡圖像。認識到濺射涂布能夠在珠子10和玻璃基體 12之間產生針孔界面——換言之，該針孔基本不含該涂布物質。在用來自該珠狀傳感器下面的白光照射時，本發(fā)明的MSPR傳感器發(fā)射的光線是透過相同厚度的平坦金層的光的約IOO倍強。
實施例2:制備具有MSPR傳感器的微流體芯片
依照本發(fā)明的另一實施方案，提供了在微流體芯片(例如圖4中所示的芯片50)中本發(fā)明的傳感器的制備方法。相同方案的變化將可以制備更復雜的傳感器。在該方法中，該MSPR傳感器安裝在外殼內，在優(yōu) 選的實施方案中，該外殼具有微芯片的形式。MSPR傳感器的微芯片格式可使該傳感器容易整合到微系統(tǒng)(例如此處所述的微流體芯片)中。
依照該實施方案，使用光刻技術和在聚二曱基硅氧烷(PDMS)中的芯片重復模制來制備流體芯片。使用底片色調(negative-tone )光致抗蝕劑SU-8作為用于鑄造PDMS通道結構的母版來制備該流體器械。該母版基體是50mm x 50mm載玻片。在HC1:HN03 ( 3:1 )中清洗該基體，用去離子水漂洗，用N2干燥，在曱醇和丙酮(2:1)中超聲，再次用N2干燥。用約lOO]iim厚的一個SU-8 2070光致抗蝕劑層制備母板。將光致抗蝕劑以3000rpm在玻璃基體上旋涂30秒，梯度為120rpm/sec。在65。C在熱板上預烘千15分鐘和在95。C預烘干90分鐘后，然后將該光致抗蝕劑暴露于365nm波長的UV光中。該UV暴露系統(tǒng)裝有過濾以通過360士45nm的高壓Hg弧光燈，暴露劑量為300mJ/cm2。將經暴露的光致抗蝕劑在相同的加熱板上在65 °C后烘干10分鐘以及在95 °C后烘干 30分鐘，冷卻到室溫。然后將該母版顯影IO分鐘，用2-丙醇漂洗，用
N2干燥。
通過使用AutoCAD2004 LT繪制且印刷在透明物上的光掩模將流體圖案轉印到該光致抗蝕劑上。在該示出的實施方案中的流體圖案表現為具有兩個相同通道(輸入通道56和輸出通道58 (5mm寬，10mm長)) 的矩形流體腔室54 ( 15mmx 10mm)。該流體腔室深度由用于分析該傳感器的60X浸油顯微鏡物鏡的景深(depth-of-field)來限定。該流體腔室必須能夠容納圖2中所示的固定著覆蓋有金層14的珠子IO的基體12 (本實施例中為156itim厚)。為了提供約300pm深的流體腔室，通過結合一片與固定該珠子的物體相同的玻璃基體62來改變該母版的流體腔室部分。優(yōu)選地，基體12和62具有基本相同的光學性質和厚度。
該硅彈性體套件(kit)包含以10:1比例混合5分鐘的聚合物基底和固化劑。在該模具周圍放置膠帶隔層以保持該彈性體混合物，將該彈性體澆在該母版上。模具中的PDMS在低真空(~1托)下放置一小時以提高流體圖案的復制，通過在120。C加熱固化二十分鐘。然后將該PDMS 基體與該母版分開，通過該彈性體用16G針沖出用于和通道流體連接的出入孔。
在PDMS芯片50的流體腔室的底部，固定覆蓋有金的珠子的基體 12附著在具有PDMS滴(50iuL)的PDMS芯片50的流體腔室的頂板上。放置該基體，使該傳感器背離該PDMS ^t具并暴露于該流體腔室的內部。在90。C焙燒IO分鐘后完成結合。
然后在接觸之前在空氣等離子體中暴露40秒之后，將制備的PDMS 基體和25mm x 50mm笫1號蓋玻片62永久結合。為了提高芯片50的剛性，以及為了消除流動中的機械紊亂，使用相同的空氣等離子體技術將一半顯微鏡載玻片64 ( 25mm x 38mm )永久結合在芯片的頂部。在該實施例中，在一種特定的實施方案中，流體腔室的深度估計小于50)Lim，使得該傳感器可以進入具有200|nm操作距離的60X油浸物鏡的焦距內。
實施例3:微流體MSPR傳感器芯片的操作
在一種使用該微流體芯片50 (圖4)的方法中，使用1.6mm OD聚丙烯管子進行流體芯片與流體儲存器(例如注射器或流體泵)的流體連接。通過相對于與出口通道58連接的儲存器的高度調節(jié)與輸入通道56 連接的儲存器的高度，或者通過流體泵，來控制流動，以實現約l|uL/s 的穩(wěn)定流動。在將芯片與儲存器連接之后，將其放置在能夠在所有三個方向上(3D)運動的壓力驅動臺上，其可以將該傳感器芯片以精確度 10nm在空間定位。整個集合體放置在倒置顯微鏡下，使用40X和60X 的顯微鏡物鏡來收集和分析來自單一傳感器的信號。
可以使用圖5中所示的實驗裝置來評估MSPR傳感器50的功能和敏感度。在一種實驗中，測試了該傳感器對蒸氣的敏感度。將保持傳感器的基體放置在可以將傳感器以精確度lOnm在空間定位的3D壓電驅動臺上。將整個集合體放置在倒置顯微鏡的試驗臺下，使用40X的顯微鏡物鏡來收集和分析來自單一傳感器的信號。將來自傳感器的光通過并行通道輸入由數據獲得接口單元驅動的單色器中?？梢栽诰哂?nm分辨率和1秒;險測器積分時間的PC記錄可見范圍400nm- 800nm的光譜。
依照一種實施方案，該實驗裝置包括和傳感器附近放置的起泡器相連的管子，將N2吹掃通過水200標準乙醇(2:1)溶液。將蒸氣周期性打開和關閉，以檢測傳感器對刺激的感應。記錄干傳感器和濕傳感器發(fā) 射的光的光譜，如圖6a所示。優(yōu)選選擇對蒸氣濃度最敏感的峰用于記錄透射光的時間序列，如圖6b所示。(兩個圖的橫坐標都等于SPR珠子和該珠子周圍的平坦膜之間的光強度之比)。圖6a中的圖顯示了由于水(實線對應于大氣壓下50%的濕度)和乙醇蒸氣的吸附(虛線對應于蒸氣通道開啟的75~80%濕度)，透射通過771nm Au涂布的珠子的光的光譜移動。圖6b中的圖顯示測定的傳感器對在50% ~80%之間變
化的循環(huán)濕度的響應(波長-715nm)。箭頭表示當蒸氣通道開啟(向下)或關閉(向上)時的瞬間。
為了進一步證實傳感器確實對表面改性是敏感的，可以使用鏈烷硫醇從乙醇吸附作為探針。已知單一單層的形成在10mM濃度下發(fā)生在 IOO分鐘內。在圖7a中提供了該光譜與相同條件下平坦金膜的光譜透射的對比。通過平坦膜的光譜透射的移動小于球形腔室SPR傳感器所期望記錄的信號。因此本發(fā)明的球形腔室傳感器比現有技術中的平坦膜傳感器的敏感性更高。在用純乙醇沖洗該十二烷疏醇溶液之后仍會保持圖7a 中的光鐠移動，這表明發(fā)生了鏈烷硫醇的不可逆吸附。因此這種移動是由于在金表面上形成了單層所致。一旦測定吸附動力學并用一階指數衰減進行擬合(圖7b),發(fā)現在lOOmM十二烷硫醇濃度膜形成的時間常數為382土7s。請注意盡管圖7b中的信號對應于約1.5nm厚的單一單層，但其信噪比;f艮好，足以檢測單層中部分的結合。
實施例4-可替代的MSPR傳感器構造
在上述實施例1中，該傳感器對通過針孔16 (圖2)的激發(fā)響應。在可替代的實施方案中，該傳感器經構造用于通過傳感器陣列的頭部激發(fā)，如圖8中所示。在該實施方案中，使用24mm x 50mm且厚度為160pm 的蓋玻片第1號作為基體。在曱醇中約104珠子/|111的濃度制備NIST標
相C:有非常低的表面張力系數，因此^制備適合的無規(guī)則單分散i子陣列)。在該實施例中，在各蓋玻片上分配70 pl的珠子溶液，得到約 5000珠子/mn^的珠子密度。在l托真空下千燥l小時之后，在約10mm 長和3mm寬的遮蔽區(qū)域內用140- 150nm金層濺射涂覆該基體。在空氣等離子體中將該基體燃燒約3分鐘，以確保該傳感器清潔。在接觸之前將基體和PDMS模具暴露在空氣等離子體中45秒。
在該實施方案中，該MSPR傳感器定位于微流體結構中，其可使流體流動穿過無規(guī)則的珠子陣列，如圖8所示。該結構可以構造為T形，具有兩個50pm寬且20]Lim深的微流體通道，其與lOO)tim寬且20pm深的共用通道相連。該MSPR傳感器位于該共用通道內。將該微流體結構模制到PDMS彈性體中，在該彈性體中形成用于訪問兩個流動通道的孔。該流動通道與兩個位于不同高度的相應儲存器相連。在該實施例中，
因此通過通道的流動是簡單通過靜水壓力實現的，約為100jxm/sec。當然，在其它實施方案或商業(yè)形式中，通過該微流體結構的流體流動可以以任何方式實現，例如通過流體泵。
在該實施例中，在該微流體器械的共用通道的底部安裝多個MSPR 傳感器，再次如圖8中所示。該傳感器并不是通過針孔照亮(如前述實施例中所示)，而是通過該器械的頭部照亮，即通過該珠子的球形表面。發(fā)現該實施例的傳感器表現出與圖2中所述的實施例中的傳感器相似的諧振響應，只是圖8的實施方案具有較高的信噪比。
圖8的實施方案的一個優(yōu)點在于便于該微流體芯片的封裝。為了封裝(enclose )本發(fā)明的微流體芯片，將玻璃基體和PDMS模具暴露于空氣等離子體激元中，其將化學結構改性以將兩種介質相結合。由于MSPR 傳感器非常小，而且珠子之間的間距在10-100nm范圍內，因此施加金層(例如通過濺射涂覆)存在問題。特別地，很難僅將金層施加到珠子上而不施加到玻璃基體上。另一方面，金與玻璃基體的結合并不好。本發(fā)明的實施方案可以在傳感器珠子和該傳感器的底部玻璃基體上涂覆連續(xù)的致密金層?？梢栽诓ＡЩw中添加對玻璃和金都具有親和性的材料層。在特別的實施方案中，該材料可以是以約1 ~5nm的厚度施加的鉻?？商娲兀梢詫⒃摶w經過化學處理以提高僅和基體之間的粘附性。然后可以施加PDMS, PDMS通過傳感器之間的微通道的流動良好。在80 ~ IO(TC下將PDMS模具進行后焙燒過夜使得聚合物固化，除去任何揮發(fā)性物質或松散的聚合物鏈，否則其可能滲入玻璃基體上賊射的金層中。
實施例5 - MSPR傳感器的官能化
圖2和8中所示的傳感器的金表面上的共價官能化使得該傳感器可以涂布有不同的目標分析物、配體或分子，特別是具有較高興趣的生物分子。為了本發(fā)明，術語"目標物"應當用于一般性地表示傳感器希望檢測的目標分析物、配體或分子。理解這些"目標物"可以包括生物分子，例如蛋白質、RNS、 DNA和酶，以及非生物分子的成分，例如病毒、細菌、非生物化學物等。然而，理解這些"目標物，，具有與本發(fā)明的 MSPR傳感器上提供的其它分子相結合的能力，而且以影響傳感器的諧振特征的方式進行。
依照本發(fā)明的某些實施方案，在該實施例中金層的官能化是通過兩種不同的化學物質以對蛋白質成共價活性的各自單層的形式實現的。第
一種化學物質是二硫代雙(N-琥珀酰亞胺基丙酸酯)(DSP, DTSP)，也稱作Lomant's試劑，其是均雙官能(homobifunctional)的、硫醇可解理 (thiol-cleavable)的交聯劑，通過二硫基團吸附在金表面上。DPS是可溶于二曱亞砜(DMSO )或二甲基甲酰胺(DMF )的高度疏水性化合物。使用水溶性的交聯劑磺基-DPS ( DTSSP )避免DMSO或DMF和金表面之間發(fā)生相互作用。官能化反應如圖9中所示。特別地，二硫鍵斷裂，與金表面反應。
DTSSP是半穩(wěn)定的胺活性NHS酯，其是蛋白質活性的。在該實施例中，使用兩種不同的工作緩沖液(磷酸鹽緩沖液pH5.8和DI水)來評估反應。反應動力學使得以105士8秒的時間常數產生281.52Da和約 0.6nm厚的單層分子，信噪比為5.5。
用于MSPR傳感器官能化的第二種化學物質包括碳二亞胺耦合劑。涉及該化學物質的反應在三個步驟中發(fā)生。第一步驟是零交聯劑(zero cross-linker)與金表面的反應，如圖10a所示。在該第一步驟中，交聯劑為3,3'-二硫代二丙酸(DTDPA)，其具有二硫鍵，在金存在下容易斷裂。該交聯劑以允許碳二亞胺耦合的羧基封端。該DTDPA反應動力學在傳感器表面產生僅104Da的分子和0.5nm的分子單層。使用碳二亞胺介體l-乙基-3-(3-二曱基氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)容易地與親核試劑反應。該EDC溶液是在乙醇中制備的，因為EDC會非?？焖俚匕l(fā)生水解。同一溶液還包含胺活性的酯，例如N-羥基琥珀酰亞胺酯(NHS)。在圖10b中所示的絡合反應中，EDC和NHS促進碳二亞胺耦合反應，將羧酸轉化為活性中間體，所屬中間體容易受到胺的攻擊。因此，最終產物是胺活性的，容易將蛋白質結合到該MSPR傳感器的表面。
發(fā)現該第二種化學物質的反應動力學以28.5±0.9秒的估算時間常數在零交聯劑的頂部上以16.2的信噪比形成了 98.1Da和約0.5nm厚的單層。
實施例6-蛋白質與官能化的SPR傳感器的結合
本發(fā)明的傳感器的一個重要應用是作為生物傳感器。因此，可以使用以實施例5中所述的方式官能化的傳感器來檢測能夠與該官能化的化學物質相結合的某些蛋白質分子。兩種重要的生物分子是葡糖氧化酶
Gox是有兩個相同的子單元制成的非常大的分子，具有160000 Da 的總MW。因此，Gox提供了很好的用于評估該MSPR傳感器和微流體器械對大分子的結合響應的能力的測試。已知Gox以特定的方向與金結合，并以不同的方向與EDC/NHS活化金表面結合。在該實施例中，一旦用胺活性NHS-酯基活化該MSPR傳感器的金表面，如上所述，與蛋白質的反應就是簡單的，但反應時間常數將取決于蛋白質的尺寸。對于 DTSSP官能化的傳感器，發(fā)現反應時間常數為562± 35秒，信噪比為 3.85。該反應在該傳感器的表面上涂覆了約10nm厚的單層。在該反應中，確定本發(fā)明的MSPR傳感器表現出42zepto-moles/SPR傳感器的敏感度，或者以覆蓋傳感器的Gox質量表示的可檢測性為6.7毫微微克 /MSPR傳感器。實施該程序的變體以監(jiān)控在PBS IX中100mM的卩-D十葡萄糖的流動，或PBS IX中l(wèi)mM的Glu的流動(用于沖莫擬人體血液中的正常葡萄糖濃度)或L-葡萄糖的流動，或2-脫氧-D-葡萄糖(2-DxGlu ) 的流動的影響下的Gox活性。本實施例的器械能夠檢測在100mM和 lmM的P-D+葡萄糖存在下的Gox的酶活性(除了在后一種情況下響應慢很多之外)，但對于暴露于L-葡萄糖或2-DxGlu的Gox沒有記錄到酶活性響應。
上述實施例顯示了本發(fā)明的MSPR傳感器和微流體特征在;f會測大的和小的目標物(包括生物分子，例如重要的蛋白質)中的效能。特別地，本發(fā)明的MSPR傳感器可以經構造為小于lpm的底座，仍能夠檢測未標記的目標物的zeptomoles的特異性結合。依照本發(fā)明，光學裝置中的光源可以是激光二極管。在這些實施例中，選擇的激光二極管在 590nm波長處諧振；然而，預期，在其它波長處可以使用其它小的激光二極管。相信在632.8nm波長處諧振的激光二極管可以有助于優(yōu)化本發(fā) 明的SPR傳感器的性能。
預期可以使用除上述激光二極管之外的光源。例如，在某些可替代的實施方案中，光源可以導入濾光器，其可操作用于將透射光限定到所需的波長。該濾光器可以在MSPR傳感器安裝時調節(jié)到特定的諧振頻率?？商娲兀摓V光器可以位于傳感器的檢測器側。
光學檢測器的選擇可以提高本發(fā)明的MSPR傳感器的功能和效率。在一種特定的實施方案中，該檢測器可以是弱暗電流硅雪崩光電二極管
(APD )光子計數檢測器?？商娲?，為了平行檢測多個目標物，可以使用CCD照相機或其它像素取向器械。該檢測器和相關電子儀器可以確定MSPR傳感器的基線諧振峰，用于校準該傳感器。在使用中，檢測器可以確定該諧振峰是否移動(紅移或藍移)，這是目標物與該MSPR 傳感器的諧振表面相結合的直接指示。
本發(fā)明考慮了定性的檢測器(即僅檢測特定目標物的存在)或定量的檢測器(即檢測目標物的含量或含量變化)。在后一種情況中，定量分析可以特別有用地測定分析物濃度隨時間的變化。例如，可以監(jiān)測病人血液中某些毒素的變化，而不只是離散的瞬時水平，因此便于有害醫(yī) 療狀態(tài)的及早診斷。此處關于敗血癥檢測的實施例可以獲益于這種定量方法。同樣地，在家庭中可以使用血糖水平的定量監(jiān)控來及早檢測糖尿病狀況。
在上述實施方案中，將金層濺射涂覆在MSPR珠子和玻璃基體上。由于金和玻璃的粘合性差，因此該制造方法可以包括在添加金層之前在玻璃上濺射鉻的薄層，這是由于鉻與玻璃結合良好而且金與鉻也結合良好。為了高產量的制備，可以通過雙頭濺射涂覆機涂覆兩層，以避免需要破壞基體周圍的真空。
在上述實施例中，通過微流體器械的流體流動是僅由靜水壓力完成的?？商娲兀撐⒘黧w傳感器芯片可以結合微閥門和蠕動泵以控制流體流動和樣品運送。該農i流體技術的使用也可以4吏本發(fā)明的孩"危體傳感器處理小的樣品體積，約2pl。因此，本發(fā)明的一種實施方案中的微流體MSPR傳感器可以構造如圖11所示。該傳感器70包括MSPR基體 72,在其上安裝有T形微流體結構74。該T形結構74以上述方式操作以將流體從該結構的通道75a、 75b越過MSPR傳感器引到共用通道76 中。該微傳感器70的第二級包括流體控制部件。特別地，在共用通道 76的排出端提供微流體泵78。在特定的實施方案中，該泵可以是蠕動、熱或壓電驅動的。各個通道75a、 75b具有響應微閥門79a、 79b以控制通過各自通道進入共用通道76的流體流動。在單一分析物檢測傳感器中，例如圖11中所示的微傳感器70, —個通道75a和閥門79a控制樣品進入共用通道的流動，而另一個通道75b和閥門79b控制官能化溶液的流動。
考慮了孩i流體部件可以用電控制以以預設順序操作，用于使MSPR
傳感器陣列官能化和分析流體樣品。特別地，閥門79a可以關閉，而閥門79b開啟，以允許通過通道75b引入官能化溶液，例如上述的官能化組合物。一旦SPR傳感器經過官能化，可以通過通道75b引入緩沖溶液。然后可以關閉閥門79b，開啟閥門79a,以通過通道75a接收流體，以接觸完全官能化的SPR傳感器陣列。當然，考慮了官能化步驟可以發(fā)生在遠離樣品分析的位置，即在預包裝的生物微傳感器的制備中。
此外，可以根據需要控制泵和微閥門，以確保在官能化的MSPR傳感器上形成目標物的單層。例如，在上述的Gox實施例中，用約562秒的時間常數檢測形成約10nm厚的160000 Da單層。因此，測試流體通過微流體腔室的流動必須足以確保形成顯著的和可檢溯'J到的目標物單層。
本發(fā)明的傳感器的流體元件的另一方面取決于評估的流體試樣的性質。特別地，復雜試樣需要在分析之前清潔和預濃縮以確保準確的檢測結果。這種復雜試樣包括人體血液(其可以如上官能化實施例中所述的方式評估特定的蛋白質)和天然水(例如來自正評估是否存在危險性病原體的河流的水)。生物樣品的預清潔和預濃縮可以發(fā)生在引入到 MSPR傳感器系統(tǒng)之前。例如，可以使用離心法清潔流體試樣，但離心機并不適用于微流體環(huán)境。大規(guī)模的試樣測試(例如飲用水純度監(jiān)測器) 可以承受這種規(guī)^t的預清潔和預濃縮。然而，本發(fā)明的一個特征是其非常適用于微流體應用，其中在單一的小芯片上存在整個傳感器和相關的樣品流體。
因此，本發(fā)明考慮了添加微流體過濾和預濃縮模塊，將其整合到 MSPR傳感器芯片上。因此，如圖12所示的系統(tǒng)80可以在MSPR傳感器芯片(例如圖11中所示的芯片70)的上游引入微流體過濾模塊82和預濃縮模塊84。在該實施方案中，上游模塊與流體樣品通道75a和閥門 79a相連。
在特定的實施方案中，微流體過濾器82包括夾在相對的PDMS沖莫具之間的多孔膜。該過濾器的流動面積取決于測試的流體樣品，例如，對于低體積過濾(例如至多l(xiāng)ml的血液)，約2.5cm2的過濾面積就足夠了。對于更高的體積，或更高的流速取樣，則可能需要更大的過濾面積。
總的來講，過濾除去了需要檢測的目標物中的一些。例如，4艮多蛋白質非特異性結合到過濾膜上。因此，在一些情況下，可如在過濾器沖莫
塊82和微流體傳感器芯片的樣品通道75a之間插入預濃縮模塊84。各種預濃縮方法都是可以接受的，例如電泳、毛細分離、官能化的磁性小珠、等速電泳、柱分離或光活化聚碳酸酯(PPC)微流體芯片。
本發(fā)明的MSPR傳感器芯片的小尺寸和準確性允許制備具有通量和整體平行處理能力大大超過目前的傳感器和生物傳感器的能力的傳感器。特別地，本發(fā)明的MSPR傳感器可以經構造用于檢測成千上萬甚至成百萬的目標物，所有都在單一的小傳感器芯片上。如圖13中所示，該傳感器芯片包括在單一芯片上的許多MSPR珠子，其可以以無規(guī)則的單分散陣列排列或以規(guī)則的陣列排列?？梢允褂霉饪毯?或全息光學鑷子或任何其它適用于將顯微尺寸的小物體放置在玻璃基體上的技術制備該MSPR傳感器的陣列。然而，本發(fā)明的一個特征是可以使用目前可得
下所述，盡管MSPR珠子的分散是無規(guī)則的，但依照本發(fā)明的這種實施方案制備的傳感器可以完全官能化用于檢測大量的目標物。
為了滿足檢測多種目標物的需求，目前的平面SPR傳感器技術需要均勻分布的SPR元件，以確保足夠的用于多個目標物的檢測能力。這些目前的傳感器的相對較低的敏感性必需足夠量的SPR元件與預設的"位點"有關，其中所有元件都官能化以針對特定的目標物。然而，精確設置均勻分布的SPR元件的能力是非常有限的，通常不超過100 x 100格的元件。這種限定以及目前平面?zhèn)鞲衅鞯木_度限制最終將可以檢測的離散目標物的數量限制在小于約1000,其最終嚴重地限制了這些傳感器的應用范圍。例如，基因治療和人類基因組繪制工程產生了成百萬的測試目標物。使用目前的平面技術，對于該自然界的工程將需要成千上百的大傳感器。
另一方面，能力在于無規(guī)則分散在本發(fā)明的傳感器中所用的微珠。然而，直至本發(fā)明為止，還沒有利用該能力將成百萬的SPR元件組裝在傳感器基體上而且各自都能夠單獨或按位點分組官能化的方法。依照本發(fā)明，實現這種離散官能化的一種方法是通過使試劑在使用微流體的傳感器芯片的特定帶上流動以操作傳感器組。換言之，如圖13中所示，該芯片72可以分成多個帶，例如四個長度方向的帶86a-d。然后將微流體系統(tǒng)將特定的試劑沿每個帶流動以通常使沿該帶的各MSPR傳感器官能化。這種方法將官能化的程度限制到芯片上帶的數量，在該帶上可
以精確流動各種試劑。在一種特定的實施方案中，可以將該MSPR芯片分成約20個帶，各自具有不同的官能化，使得同樣數量的目標物可以標記用于才全測。
在另一方法中，可以精確選擇各自的MSPR傳感器用于特定的官能化。實現這種單獨官能化的一種方法可以是使用光激活結合的交聯劑，例如光敏生物素。然而，這種方法本身很慢，由于一次可能只有很少的 SPR傳感器被官能化。另一種更通用的方法是使用微測位儀 (microspotter )以與現有的噴墨打印機相同的方式制備SPR珠子傳感器的微陣列。一些微測位儀打印機能夠放置墨滴到600 x 600dpi的分辨率，點尺寸在30itim范圍內，間距45itim,體積僅為10pl。甚至更精確的噴墨打印機能夠達到4800 x 4800 dpi的分辨率，各墨滴具有僅5pm的直徑。該打印技術可以適用于官能化選定的MSPR傳感器或傳感器組，產生官能化的位點，例如圖13中所示的位點88。各位點可以屬于不同的目標物。
在另一種方法中，可以使用多針測位儀實現離散的多個目標物官能化。這種多針測位儀可以精確地將交聯劑或試劑直接涂覆到且僅在 MSPR珠子上。特別官能化的珠子可以在整個MSPR珠子場范圍內成簇或不規(guī)則分布。
在另一種非常適用于整體并行處理的官能化方法中，可以使用掩模對MSPR珠子官能化。該掩模將交聯劑或試劑的應用限制到設置在基體上位點88內的MSPR珠子。考慮了官能化的位點將包括在明顯大于珠子自身面積的陣列上任意數量的無規(guī)則分散的MSPR珠子。因此，在特定的實施方案中，該官能化的位點可以占據直徑約為30jim的區(qū)域，然而MSPR珠子具有約770nm的直徑。能夠以低至10pl的量分散試劑的微測位儀可以用于對各位點中的珠子進行官能化。該傳感器芯片可以包括條形碼86或一些其它可閱讀的標記，表明不同的官能化以及對應各官能化的位點。如下所述，該條形碼86也可以包含與^r測器90產生的響應信號相對應的校準信息(圖14)。
使用如上所述的傳感器構造，多個無規(guī)則分散的MSPR珠子集中在基體上，通常將珠子的集合官能化以構成位點88。在圖13中所示的特定實施例中，描述了 18個這樣的位點；然而，預期在給定的傳感器芯片上可以限定幾百、幾千以及甚至幾百萬個這種位點。操作的傳感器芯
片需要光源和一些類型的傳感器，以感應各位點處的諧振響應。因此，
依照本發(fā)明的一種實施方案，可以存在如圖14中所示的構成微傳感器的堆積，MSPR傳感器芯片72夾在檢測器90 (其可以是CCD陣列)和光源96 (其可以是LED)之間。理解各種光學調節(jié)元件可以與光源和/ 或檢測器整合在一起，例如用于改進信噪比的濾光器。該光學調節(jié)元件也可以包括波長濾波器或與特定位點88或各自MSPR珠子相對應的不同的離散波長濾波器。
依照一種特征，該檢測器或CCD陣列可以映射入柵格92中，柵格的各像素93包含能夠感應光透射通過MSPR傳感器芯片72且構造以產生指代用于后續(xù)處理的光透射的信號的CCD。該映射的柵格92覆蓋該傳感器芯片，如圖14所示，或者可替代地，該位點88可以被認為投影到映射的柵格上，如圖13所示。最優(yōu)地，該檢測器柵格足夠精細，使得各位點88可以投影到該柵格的多個像素93上。期望各像素可以覆蓋一些MSPR珠子，盡管由于珠子在基體上的無規(guī)則分布使得與各像素對應的珠子的數量將是變化的。
首先通過確定從各位點88中閱讀透射數據的最優(yōu)像素(一個或多個)來進行檢測器的校準。因此，在特定的實施例中，特定的位點可以完全包括四個像素93，而且部分包括五個另外的像素。用光源96照射該MSPR芯片，評估在對應該位點的各像素處的測量強度。記錄最大響應的像素被選作對應特定位點的像素，其進而對應于特定的官能化。相對于其它像素，該選定的像素同樣映射到最大數量的MNPR珠子，因此與其它像素相比其響應更大。在該選定的像素內CCD的輸出數據可以關于光源96的強度和/或波長進行校準。對所有其它官能化的位點88重復相同的過程。因此，在該特定的實施例中，對于18個官能化位點(圖 13),可以確定在檢測器90的映射柵92上的18個像素93，以評估各個像素的校準輸出值。這種校準輸出之可以寫入到內存儲器上，或傳輸到外存儲器和/或處理器中?？梢詫⒕哂懈饔成湎袼氐男蕯祿男?表保持在存儲器中，并用外處理器訪問。因此該條形碼86可以提供用于從存儲器中儲存的多個表中提取適當的校準表的標識符。該校準表可以確定從檢測器中閱讀哪個像素，以及如何解釋來自各像素的輸出信號。該應用校準數據的外部設備可以經構造以從全局數據庫獲得需要的數據，例如通過網絡連接。
考慮了另外的像素也可以與特定的位點相結合，對相應的輸出響應的校準進行適當的改變。應當認識到在一些情況下，給定像素的輸出響
應可能來自僅通過一個在給定位點內存在且與給定像素對準的MSPR 珠子的光透射，而對于另一像素，光透射可以通過幾個MSPR珠子進行測定。珠子的無規(guī)則排列是指用于產生與各官能化位點相應的輸出信號的MSPR珠子的數量也是無規(guī)則的。然而，上述的校準步驟可以確保該目標物可以迅速并準確地檢測。本發(fā)明的MSPR傳感器中的各MSPR珠子的高敏感性是指甚至單一的MSPR珠子對于特定的官能化位點和檢測器陣列像素也是足夠的。
可以認識到圖14中所示的器械可以開啟用現有的傳感器器械無法進行的目標物檢測的領域。如上所述，單一的MSPR傳感器芯片可以在小包裝內針對成千上萬個目標物官能化。本發(fā)明的傳感器的小尺寸使得可以形成整體平行的用于DNA、 RNA和蛋白質檢測的傳感器陣列。微流體和傳感器芯片的應用使得測試流體可以連續(xù)流動越過傳感器芯片 70。該微流體特征有利于該整體平行的傳感器陣列，且提供了化學和生物化學狀態(tài)的實時精確感應的途徑。
特別有利的應用是實時檢測血液流中的目標物。本發(fā)明的多通道實施方案的一個重要應用是檢測敗血癥。敗血癥是術后恢復和外傷患者中死亡率的主要來源。敗血癥的治療大大受限于抗生素和用于支持心、肺和腎功能的緩和方法。依照2001年收集的數據，敗血癥綜合癥在美國每年感染約751000名患者，其中383000 ( 51.1 % )受到重病看護。估計全國的死亡率為215000例，隨年齡增長，從兒童的10%到85歲以上的38.4%。每例的花費平均約22000美元，這意味著每年大約170億美元。敗血癥的早期檢測和快速干預(在發(fā)作的2~4小時內)顯著降低死亡率和生還者的衰弱。然而，目前沒有方法來監(jiān)控病人敗血癥的發(fā)作。在很多情況下，由于缺乏能夠連續(xù)監(jiān)控患者血液中的細胞活素類含量的儀器，而導致用于敗血癥治療產生的藥物處理失敗。
敗血癥綜合癥是身體系統(tǒng)對傳染性刺激的炎癥反應。內毒素(例如來自革蘭氏陰性細菌的脂多糖(LPS)、來自革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌的肽聚糖和鞭毛蛋白(flagellan)、來自革蘭氏陽性細菌的脂磷壁質(lipotechoic acid)、來自真菌的甘露聚糖和其它來自傳染物的抗原) 刺激巨噬細胞和單核細胞以釋放a-瘤壞死因子(TNF-a),然后釋放細
胞因子流。在敗血癥的第一時期過程中(特別是最初的八個小時)，過度的炎癥反應會導致大量的器官損傷，特別是對腎臟和心臟，而且到達肝、肺和腦中，需要血壓和換氣的人工支持。這種器官損傷通常造成在敗血癥的急性期之后數月或數年衰弱或死亡。
促炎癥介質的釋放最初被認為是很大程度上無法控制的。然而，后
續(xù)的研究表明TNF-a也刺激白血球釋放抗炎細胞因子，包括IL-IO、 IL-1 和P-轉化生長因子(TGF-P ),其抑制促炎癥細胞因子的合成，并將抗炎作用直接作用在單核細胞、巨噬細胞和內皮細胞上。這種補償性抗炎癥反應綜合癥(CARS)用于使否則會是全身感染的無法控制的促炎癥反應實現定域。不幸的是，在敗血癥的后期，抗炎癥反應通常大于促炎癥反應，導致免疫癱瘓癥，即不能對另外的傳染性損害產生有效的免疫反應。
因此，能夠附著在所有術后和外傷后患者身上的最低限度侵入器械能夠監(jiān)控敗血癥的發(fā)作和過程，使得可以進行更早和更直接的干預，并最終降低死亡率和生還者的衰弱。依照特定的實施方案，如圖15中所示，提供了微流體器械100，其可以用于同時分析一組六種在敗血癥中非常重要的化學物質。(然而，該微流體結構可以改進以符合同時分析更多或更少化學物質，或者可以改進用于不同的驅動流體、流速或分析裝置)。敗血癥發(fā)作及其過程的一種診斷方法包括同時實時監(jiān)控化學物質TNF國a、 IL-1、 IL畫6、 IL-IO、 IL-13和TGF-p 。因此，如圖15中所示，微流體傳感器100包括一組六個通道102 ~ 107(在特定實施方案中，分別50pm寬，間距10(Him, llmm長)，一起會聚到微流體室110 ( 2mm 長，600pm寬)，各通道對應特定的監(jiān)控化學物質。所屬間距經選擇使得大約20kDa的分子的擴散不會干擾相鄰通道中的分子。這六個通道用于用上述化學物質的特異性抗體使傳感器陣列120官能化。不同抗體通過微流體室的流動將產生一系列六個平行的抗體條紋112,使該芯片官能化。在該特定的實施方案中，該芯片100設計用于抗體最低40(Him/s 的流動。這種處理和特別的校準可以在使用芯片評估樣品之前進行。
200|iim寬的橫向通道116和該微流體室110交叉。該通道較寬，以允許更粘性和更快的凝固性流體通過，例如血漿。交叉區(qū)域覆蓋200inm x 600ium的面積。該4黃向通道116包括通過其引入血液的入口 117和廢物出口 118。類似地，該樣￡流體室110包括廢物出口 111。
該傳感器陣列120優(yōu)選定向在室110與4黃向通道116的交點處，優(yōu) 選與該通道對準。在一種特定的實施方案中，該傳感器120可以包括六個SPR珠子傳感器124或傳感器位點的線性陣列，各單獨的傳感器或傳感器位點對應特定的官能化并對準相應的抗體條112 。
圖14中所示的微流體器械IOO可以使用聚二曱基硅氧烷(PDMS) 基體和蓋玻片以下述提出的方式制備。使用底片色調光致抗蝕劑
(negative-tone photoresist) SU-8作為用于鑄造PDMS通道結構的母版來制備該器械。該母版基體是50mmx50mm的載玻片。在HC1:HN03
(3:1 )中清洗該基體，用納米純水沖洗，用N2干燥，在曱醇和丙酮(2:1 ) 中超聲，再次用N2干燥。用兩個SU-8光致抗蝕劑層產生母版。第一下層(18 20jim厚的SU-8 2010層)用于促進通道結構與基體的粘合，第二較厚層(60 ~ 80pm厚的SU-8 2070層)的光致抗蝕劑用于產生通道結構。兩層處理相同，除了第一層的暴露沒有光掩模以外。將光致抗蝕劑以1000rpm在基體上旋涂30秒，梯度為40rpm/sec。在65。C在熱板上預烘干1分鐘和在95。C預烘干2分鐘后，然后將該光致抗蝕劑暴露于UV 光。通過使用AutoCAD2004 LT繪制且使用高分辨率激光打印機以8000 dpi印刷在透明物上的光掩;^莫將預期的通道設計轉印到該光致抗蝕劑上。該UV暴露系統(tǒng)裝有過濾以通過360士23nm的高壓Hg弧光燈，暴露劑量為300mJ/cm2。將經暴露的光致抗蝕劑在相同的熱板上在65。C二次烘干1分鐘以及在95。C二次烘干3分鐘。然后將該母版顯影5分鐘，用 2-丙醇沖洗，用氮氣干燥。
該硅酮彈性體套件包含以10:1比例混合5分鐘的聚合物基底和固化劑。在該模具周圍放置膠帶隔層，以保持該彈性體混合物，將該彈性體澆在該母版上。模具中的PDMS在低真空(~1托)下放置一小時以改善通道的復制，通過加熱在120。C二十分鐘固化。然后將該PDMS基體與該母版分開，通過該彈性體用16G針沖出用于和通道流體連接的出入孔。
在PDMS模具的底部，越過與橫向通道116的交點處的微流體腔室 110，可以使用光刻和/或全息光學鑷子或任何其它適用于將顯微尺寸的小物體放置在玻璃基體上的技術，比如顯微操作器和激光鑷子系統(tǒng)，制備該MSPR珠子120的線性陣列。該顯微操作器裝有103~ 102珠子/^ 的精確尺寸標準珠子的溶液。該濃度的選擇使得陣列120的MSPR珠子
分散具有約50~ lOOpm的間距?？梢允褂霉鈱W激光鑷子來保持珠子就位直至液體變干，用顯微操作器分散另一個珠子，用鑷子保持，直至液體變干，如此反復。一旦放置了珠子124,通過位于交叉點上的lmmxlmm 的窗口濺射涂覆該PDMS基體。用150nm的金覆蓋珠子。然后在接觸之前在空氣等離子體中暴露40分鐘之后，該PDMS基體和蓋玻片永久結合在一起。
在一種實施方案中，敗血癥檢測器器械可以包括與病人靜脈和泵系統(tǒng)相連用于定期將少量血液抽取到傳感器器械100中的導管。血液流動通過一次性過濾器以提取血漿，將血漿通過通道116輸送到一次性傳感器100中。傳感器的輸出提供血漿中細胞因子濃度的讀數。廢血液通過通道118收集在一次性的標有生物廢物的廢管中。本發(fā)明的MSPR傳感器和傳感器芯片的小尺寸使得該傳感器器械100和導管可以就位，只要病人處于醫(yī)療看護下即可。蠕動泵將血液吸取到傳感器芯片中的控制可以電動控制以預設間隔或響應一些其它醫(yī)療狀態(tài)傳感器而發(fā)生。傳感器的檢測器可以連接到相同的控制器上，如果檢測到特定的試劑就發(fā)出警報。
IL畫10、 IL-13和TGF- P的含量升高表示初期敗血癥，而IL畫10、 IL-13 和TGF-P的含量升高表示免疫麻痹。如果各傳感器的傳感時間過長，單一通道可能不能實時檢測細胞因子含量。在這種情況下，可以在單一的一次性芯片上制造一系列通道檢測器，以五分鐘間隔在通道之間切換血液供應?？梢允褂每煽刂频奈㈤y門來交替地將血液和清潔的無菌介質輸送到傳感器中以對其重新設置以用于下次測定。
已經開發(fā)了激動劑和拮抗劑藥物種類用于控制敗血癥中包括的各種細胞因子。然而，這些藥物都沒有廣泛應用，因此醫(yī)師無法監(jiān)控其效果，其根據不同的病人和隨時間變化很大。結果是目前選擇的治療包括以不足或過量的劑量提供的炎癥抑制劑和增強劑，兩者都對患者都可能是致命的。本發(fā)明的MSPR傳感器會使醫(yī)師可以提供激動劑和拮抗劑的定制"雞尾酒"，這將在感染早期抑制免疫反應，并在感染后期將其提高，同時在任何時間保持細胞因子在最佳的水平。
才企測敗血癥狀態(tài)的相同原理可以應用于其它醫(yī)療狀態(tài)的交互式抬r 測，以及作為間接治療器械的界面。通過適當的官能化，可以使用單傳感器或多傳感器器械來監(jiān)控病人在長期治療中的狀態(tài)。例如，可以將依
照此處所述的實施方案的MSPR傳感器芯片和微流體系統(tǒng)引入透析系統(tǒng)或其它為了治療連續(xù)從患者中抽取血液或其它流體的器械中。該 MSPR傳感器芯片可以整合到連續(xù)血液監(jiān)控系統(tǒng)中，用于實時檢測代表即將來臨的問題(例如心臟病發(fā)作、中風、腎衰竭等)的目標物。
可以提供多個傳感器陣列器械的第二種實施方案，其包括一系列包含細胞因子調節(jié)藥物且由上述細胞因子檢測器的輸出控制的注射器管。這種器械最終將通過靜脈內(IV)液滴輸送控制劑量的多種細胞因子調節(jié)劑到該病人中，連續(xù)改變激動劑和拮抗劑的供應以保持患者的細胞因子處于最佳水平。在上述血液監(jiān)控實施例中，例如可以使用指代心臟病開始發(fā)作的目標物的實時監(jiān)控來響應該狀態(tài)開始以提供瞬時實時定量給藥。
在如上所述4企測時，可以使用相同的介入治療來防止敗血癥。在這種情況下，某些抗敗血癥的治療依賴于特定蛋白質用于抑制某些目標分子產生的作用。然而，該治療本身可能是抑制免疫的，因此該治療必須小心管理。通過本發(fā)明的MSPR和微流體傳感器進行目標物水平的實時檢測可以迅速并準確地進行該抗敗血癥治療?？梢允褂妙愃频姆椒▉斫?低化學治療或HIV治療的毒性，或者用于其它產生表示出現或存在不希望的副作用的目標血生標記物的治療。
上迷一次性的MSPR傳感器器械適用于很多其它應用。例如，本發(fā) 明可以適用于公用和私用飲用水測試。該MSPR傳感器可以經官能化用于檢測各種有機物和無機污染物、毒素、細胞生物體和病毒。該傳感器可以位于供水系統(tǒng)內部，用于連續(xù)監(jiān)測水流中的選定目標物。由于本發(fā) 明的器械依賴于光檢測器械，例如上述的CCD陣列90,因此產生可以進行評估并用于起動預設的響應，例如可感知的警報，的電信號。
基于這些傳感器的器械可以開發(fā)用于檢測生物危害物、有害的化學物質、神經毒素、爆炸物、或HIV或其它血液、血漿或其它體液中的病毒或細菌。本發(fā)明可使傳感器足夠小，足以便攜和容易丟棄。在示例的實施方案中，該傳感器芯片在50mmx50mm面積之內。特定的裝置可以適用于機場或國內安全使用或用于水處理裝置或工廠。根據其用途，可以包括與芯片的輸入儲存器相連的自動化系統(tǒng)，可以同時和在相同的芯片上分析其它化學物質。
本發(fā)明的MSPR傳感器和微流體也可以適用于監(jiān)控化學反應或生
物反應。本發(fā)明的微芯片可以整合到流體流線中，或直接位于化學反應器或生物反應器中，以檢測該反應的一些目標產物或用于檢測反應器內
可能影響反應的化學條件。該MSPR傳感器可以用于優(yōu)化反應條件或確定反應完成的時間。該特別的實施方案可以具有有益的應用，作為藥物或化學制備的工藝控制的一部分，特別用于控制最終產物的純度。
具有本發(fā)明的亞微米腔室表面-等離子體激元生物傳感器的微流體器械克服了現有的傳感技術和器械中的一些缺陷。將微流體器械的性質和MSPR珠子傳感器的敏感性相結合通過在微流體芯片或有限空間內部增加檢測能力，延伸了 "芯片上實驗室(lab-on-a-chip )，，理想的界限。
目前的器械使用平坦的SPR或更老的ELIZA套件監(jiān)控分子的相互作用和分子動力學。為了激發(fā)在平坦金屬表面上的表面等離子體激元，必須遵守某些限制。特別地，光源必須是p-偏振的，而且為了在入射光子和表面偏振子之間產生最大的耦合，必須得到精確的臨界入射角。本發(fā)明的傳感器將表面等離子體激元的敏感性和球形傳感器的諧振性質相結合。除了敏感性的增強外，本發(fā)明降低了對光源的幾何學和偏振的限制。而且，該傳感器具有平方微米或更小的底座，這使其非常適用于小型化(具有比現有技術的SPR平坦傳感器小約1000倍的活性區(qū)域)，同時敏感性得以提高，而且整合到微流體結構中的能力得以改進。此外，與以反射形式工作的現有技術SPR傳感器相比，本發(fā)明的MSPR傳感器是以透射形式工作的。由于這一差別，引入本發(fā)明的MSPR傳感器的傳感微流體芯片可以放置在光源和檢測器的傳感窗之間非常近，導致非常緊湊的功能強大的和廉價的手提式器械。
目前微流體器械是用于處理少量分析物(從皮升到微升的范圍)和用于非常精確控制流動和梯度的最尖端的技術。其適用于多次重復模制，可以以非常低的成本制備新的通道和裝置構造，使其適用于單一用途的器械。這種性能使其方便地用于很多研究領域，特別是醫(yī)療應用。其適用于化學物質的整體并行操作，其可以節(jié)約大量地時間，特別是分析非常復雜的樣品，例如但不局限于血漿、體液、毒性廢物、食物等。唯一的時間限制是樣品中特定的分子物種和結合到官能化的MSPR檢
測器的表面上的受體之間的反應時間。
本發(fā)明的MSPR傳感器受益于微流體器械的這些性質。由于表面等
離子體激元和傳感器的幾何形狀的結合，其比現有器械的敏感性更高。目前的SPR傳感器僅僅能檢測大分子，而本發(fā)明的SPR傳感器可以檢測大分子和小粉子都具有良好的敏感性。傳感器的小型化可以在單一芯片上實現控制、檢測和分析，利用微流體器械用于進行多個并行的分析的能力，其可以縮短分析時間。而且，這些器械可以是一次性的，可以廉價地制備。
在示出的實施方案中，用金涂布該微球?？紤]了可以用其它金屬(例如銀、銅或金合金)來涂布該球。然而，目前的實驗表明在透射光中的光譜諧振僅對于金涂布的球或珠子發(fā)生，這被認為是由于表面等離子體
激元耦合的作用。金涂層的膜厚度可以根據特定MSPR傳感器的應用而
調節(jié)。然而，已經發(fā)現膜厚度的增加至少對于對稱(低頻)模式會造成觀察到的諧振發(fā)生藍移。相反，也已經發(fā)現高頻反對稱模式的頻率隨著膜厚度的增加而紅移。而且，本發(fā)明使用的球形幾何形狀優(yōu)先激發(fā)對SP模式，由此使紅移作用最小化。實驗進一步表明一些峰(例如對于涂布有150nm金層的770nm珠子在623nm處的峰)比其它峰對金屬膜厚度的敏感性要小得多。
盡管在附圖和前述描述中示出并描述了本發(fā)明，同樣應當理解為在性質上是示例性的，而非限定性的。應理解僅提出的優(yōu)選的實施方案，所有在本發(fā)明的范圍內的變化、改進和進一步的應用也希望被保護。
在示例性的實施方案中，形成MSPR傳感器的微顆粒的形狀是球形的，以構成球形諧振腔室。然而，對于珠子的形狀，也可以使用其它對稱的幾何形狀。例如，該珠子可以是橢圓形狀或多面體，例如十二面體，只要其形狀能夠維持等離子體激元駐波越過珠子表面運行的周期邊界條件即可。
本發(fā)明的MSPR傳感器和微流體系統(tǒng)所實現的功能。對MSPR傳感器的材料和尺寸的改變仍必須滿足本發(fā)明的MSPR傳感器的主要目的，即用于檢測目標物。而且，該改變必須不影響用于提高該微腔室傳感器的 SPR諧振特征的形狀或幾何諧振特征。本發(fā)明的MSPR傳感器的檢測容量取決于目標物與本身與SPR支持涂層相結合的耦合劑層的結合，最終取決于光響應的變化。
認為對于大多數目標物和耦合劑，施加光的波長并不重要。另一方
面，SPR支持層從定義而言是波長依賴性的，由于在該層中發(fā)生表面等離子體激元諧振。因此，認為對MSPR傳感器的材料和尺寸的改進集中在選擇SPR支持層材料及其特征波長。在該示例的實施方案中，該材料為金，其具有510nm的波長。依照本發(fā)明的某些方面，該波長確定微米顆?；蛑樽覫O和針孔16的直徑。該珠子的直徑也是介電材料的折射系數的函數。
在替代性的構造中，該SPR支持涂覆材料可以是銀、銅或其它非金 SPR支持材料，涂覆厚度有適當的變化。由于銀和銅分別具有不同的SPR 特征波長，因此其任一金屬選作涂層14材料將導致微顆粒IO和針孔16 的直徑的變化。依照本發(fā)明的某些實施方案，該微顆粒直徑將經尺寸設計為約為銀或銅涂層的特征波長，而針孔直徑將固定在小于該波長。同樣地，涂覆厚度可以用微顆粒和針孔直徑上發(fā)生相當的改變來改變。
就MSPR傳感器指定特征波長來講，光源和透射光檢測器(例如圖 14中的光源96和檢測器90)可以相應選擇。在某些實施方案中，白光可能是可接受的，而在一些實施方案中，選擇中心位于MSPR傳感器特征波長的單色光源可能是所需的。優(yōu)選地，將該光檢測器校準到該特征波長。
關于選擇用于本發(fā)明的MSPR傳感器和微流體芯片的材料，上述實施例和實施方案中的材料是示例性的。盡管描述MSPR珠子是由聚苯乙烯形成的，但也可以使用其它透光性材料，例如玻璃或氧化鋁。選擇的材料最優(yōu)選地是介電性地，具有與聚苯乙烯相似的折射系數。當然，如上所述珠子材料的折射系數會影響MSPR以及SPR支持涂層的光學響應和諧振模式。
同樣地，形成該MSPR珠子和基體周圍的外殼或芯片的材料也可以與示例性的實施例和實施方案中確定的PDMS材料不同。優(yōu)選地，該材料為基本透明的，對MSPR傳感器的光學和諧振特征僅有最小的影響。
關于本發(fā)明的MSPR傳感器和微流體傳感器的應用或用途，前述實施例和實施方案并不用于限定。應當理解本發(fā)明允許廣泛范圍的目標物的快速和精確檢測，無論是以小的試樣體積或以連續(xù)的流動系統(tǒng)。本發(fā) 明還可以在單一微傳感器或以整體并行的傳感器陣列中同時檢測成百、成千或甚至成百萬的目標物。因此，正如本發(fā)明可以大大提高目前的檢測技術，其同樣也將通向尚未預期的新技術和分析。
權利要求
1.用于檢測測試流體中目標分析物、配體或分子的存在的傳感器，包括透光性基體；安裝在所述基體表面上的表面等離子體激元諧振(SPR)元件；所述SPR元件的暴露表面，具有能夠與待檢測的目標物相結合的材料的表面涂層；經設置用于將光導向所述SPR元件中的光源；和相對于所述SPR元件設置以檢測透過其的光的檢測器。
2. 權利要求1的傳感器，其中所述SPR元件包括以能夠維持用于使等離子體激元諧振駐波越過其外表面運行的周期性邊界條件的幾何形狀形成的透光性珠子。
3. 權利要求2的傳感器，其中所述珠子是由介電材料構成的。
4. 權利要求3的傳感器，其中所述珠子具有小于l)nm的最大外尺寸。
5. 權利要求2的傳感器，其中該幾何形狀是球形。
6. 權利要求2的傳感器，其中所述珠子涂布有SPR支持材料層。
7. 權利要求6的傳感器，其中所述基體涂有相同的SPR支持材料的層。
8. 權利要求6的傳感器，其中該SPR支持材料為金。
9. 權利要求8的傳感器，其中該金層約為150nm厚。
10. 權利要求8的傳感器，其中該SPR支持材料包括對金和所述珠子和所述基體的材料都具有親和性的材料層。
11. 權利要求1的傳感器，其中所述光源經設置以將基本垂直于所述基體的光線導入所述SPR元件中。
12. 權利要求1的傳感器，進一步包括由透光性材料形成并在所述暴露表面周圍限定流體腔室的外殼，以及與所述腔室連接的流體入口和流體出口。
13. 權利要求12的傳感器，其中所述光源和所述探測器與所述外殼連接。
14. 權利要求12的傳感器，其中所述外殼由基本透明的模制聚合物構成。
15. 權利要求l的傳感器，其中在所述SPR元件和基體之間的界面處限定了針孔。
16. 權利要求15的傳感器，其中所述光源經設置以將光引導通過所述4十孔進入所述SPR元件。
17. 權利要求15的傳感器，其中所述光源經設置以與所述針孔相反的方向將光線導入所述SPR元件中。
18. 權利要求15的傳感器，其中所述SPR元件和所述基體涂布有 SPR支持材料層，所述層限定了在所述SPR元件和所述基體之間的界面處的所述針孔。
19. 權利要求15的傳感器，其中來自所述光源的光以預設波長提供；且所述針孔具有小于該預設波長的直徑。
20. 權利要求19的傳感器，其中該來自光源的光的預設波長是所述 SPR元件的幾何形狀諧振特征的函數。
21. 權利要求20的傳感器，其中該來自光源的光的預設波長是所述 SPR元件在所述暴露表面處的最大尺寸的函數。
22. 權利要求21的傳感器，其中所述SPR元件包括在所述暴露表面上的SPR支持材料涂層；和該來自光源的光的預設波長是該SPR支持材料的諧振波長的函數。
23. 權利要求22的傳感器，其中該來自光源的光的預設波長是該 SPR支持材料的所述涂層的厚度的函數。
24. 權利要求22的傳感器，其中該來自光源的光的預設波長是所述 SPR元件的材料的光學性質的函數。
25. 權利要求24的傳感器，其中該來自光源的光的預設波長是所述 SPR元件的材料的折射系數的函數。
26. 權利要求l的傳感器，進一步包括安裝在所述基體上的多個所述SPR元件。
27. 權利要求26的傳感器，其中所述多個SPR元件的第一組彼此相鄰設置以構成第一官能化位點，在所述第一官能化位點中的各SPR元件具有能夠與待檢測的第一分子相結合的笫一表面涂層。
28. 權利要求27的傳感器，其中所述多個SPR元件的第二組彼此相鄰設置以構成笫二官能化位點，在所述第二官能化位點中的各SPR元件具有能夠與和第一分子不同的待檢測的第二分子相結合的第二表面涂層。
29. 權利要求26的傳感器，其中所述多個SPR元件包括多個元件組，各組限定了官能化位點，各官能化位點中的SPR元件具有能夠與和通過其它官能化位點檢測的目標物不同的待檢測的相應目標物相結合的相同表面涂層。
30. 用于安裝在光源和檢測器之間的用于檢測測試流體中多種目標分析物、配體或分子的存在的傳感器芯片，包括由透光性材4牛制成并限定與用于接收測試流體的流體入口和流體出口相連接的流體腔室的外殼；和對應于所述多種目標物的不同官能化的表面等離子體激元諧振(SPR)元件的陣列，所述陣列安裝在設置在所述流體腔室內的共用基體上，用于接觸所述腔室內的測試流體。
31. 權利要求30的傳感器芯片，進一步包括安裝在所述外殼內用于將流體泵送通過所述腔室的微流體泵。
32. 權利要求31的傳感器芯片，其中所述流體入口包括微流體閥門。
33. 權利要求30的傳感器芯片，其中所述外殼進一步限定了至少一個與所述腔室相連接的其它流體入口。
34. 權利要求30的傳感器芯片，其中多個所述不同官能化的SPR元件設置成多個列；和所述外殼限定了在所述多個列的每一個上的流動通道，用于流過能夠對該列中的SPR元件官能化的化學物質，從而與該多種目標物的一種相結合。
35. 用于檢測測試流體中目標分析物、配體或分子的存在的傳感器，包括透光性基體；至少一個安裝在所述基體上的珠子，所述珠子由透光性材料形成，并具有適于維持用于使表面等離子體激元駐波越過所述珠子的暴露表面運行的周期性邊界條件的形狀；和涂布所述珠子和所述基體的暴露表面的表面等離子體激元諧振 (SPR)支持材料，所述基體和所述珠子之間的界面限定了不含該SPR 支持材料的針孔。
36. 權利要求35的傳感器，其中所述珠子在暴露表面處具有約等于該SPR支持材料的諧振波長的最大尺寸。
37. 權利要求35的傳感器，其中所述珠子具有小于lpm的最大尺寸。
38. 權利要求35的傳感器，其中所述珠子由介電材料制成。
39. 權利要求35的傳感器，其中該SPR支持材料選自金、銀或銅。
40. 權利要求39的傳感器，其中該SPR支持材料是金，所述涂層約150nm厚。
41. 權利要求35的傳感器，其中所迷針孔具有小于該SPR支持材料的諧振波長的直徑。
42. 用于安裝在光源和檢測器之間的用于才全測測試流體中目標分析物、配體或分子的存在的傳感器芯片，包括透光性基體；安裝在所述基體上的官能化表面等離子體激元諧振(SPR)元件，所述SPR元件經官能化以與目標物相結合；由透光性材料制成且限定用于測試流體在所述SPR元件上流動的流體腔室的外殼，所述外殼進一步限定與所述腔室相連接的流體入口和流體出口；和至少一個與所述外殼相關聯且可操作以控制通過所述腔室的流體流動的微流體部件。
43. 權利要求42的傳感器芯片，其中所述微流體部件是微流體泵。
44. 權利要求43的傳感器芯片，其中所述流體入口包括微流體閥門。
45. 權利要求42的傳感器芯片，其中所述外殼進一步限定至少一個與所述腔室相連接的其它流體入口。
46. 權利要求45的傳感器芯片，其中所述其它流體入口包括微流體閥門。
47. 權利要求42的傳感器芯片，其中所述微流體部件包括過濾器。
48. 權利要求42的傳感器芯片，其中所述微流體部件包括預濃縮模塊。
49. 提供用于才全測測試流體中兩種或更多種不同目標分析物、配體或分子的存在的官能化微傳感器的方法，包括以和每一目標物對應的兩個或更多個帶的形式提供安裝在共用透光性基體上的表面等離子體激元諧振(SPR)元件；限定與所述SPR元件的兩個或更多個帶中的每一個對應的流體流動通道；使能夠將相應帶中的SPR元件官能化以與相應目標物相結合的官能化化學物質流動通過每個流體流動通道。
50. 提供用于檢測測試流體中兩種或更多種不同目標分析物、配體或分子的存在的官能化微傳感器的方法，包括提供安裝在共用透光性基體上的多個表面等離子體激元諧振(SPR) 元件；和將每個SPR元件單獨地暴露于能夠使該SPR元件官能化以與相應的目標物相結合的化學物質。
51. 權利要求50的方法，其中暴露每個SPR元件的步驟包括使用微測位儀來向其施加該官能化化學物質。
52. 權利要求50的方法，其中暴露每個SPR元件的步驟包括在所述多個SPR元件上提供掩膜。
53. 權利要求50的方法，其中暴露每個SPR元件的步驟包括形成包括多個相鄰SPR元件的位點，其中在該位點中的所有SPR元件;陂共同官能化。
54. 檢測患者中敗血癥的方法，包括以下步驟提供微傳感器，所述微傳感器具有安裝在透光性基體上的表面等離子體激元諧振(SPR)元件的陣列，至少一組一個或更多個SPR元件經官能化以檢測至少一種指示敗血癥的相應分子，并具有光源和經設置以感應通過該SPR元件陣列的光的檢測器，還具有限定在SPR元件陣列之上的流體腔室的外殼；使患者的血液流動通過在官能化SPR元件的陣列之上的流體腔室；和使用該SPR元件的陣列和4企測器，^r測該至少一種相應分子在血液中的存在。
55. 權利要求54的方法，其中該流體腔室與患者體內設置的導管相連接。
56. 權利要求54的方法，其中兩組或多組SPR元件經官能化用于檢測兩種或更多種指示敗血癥的相應的不同分子；和該檢測步驟包括檢測所述不同分子中一種或更多種的存在。
57. 權利要求54的方法，其中該檢測步驟包括定量檢測相應的分子。
58. 用于檢測測試流體中多種目標分析物、配體或分子的存在的傳感器，包括透光性基體；多個無規(guī)則分布在所述基體的表面上的表面等離子體激元諧振 (SPR)元件；每個所述SPR元件的暴露表面，具有能夠與待檢測的相應一種目標物相結合的材料的表面涂層；經設置用于將光導入所述SPR元件中的光源；和相對于所述SPR元件設置以檢測透過其的光的檢測器。
59. 權利要求58的傳感器，其中所述檢測器包括像素陣列，每個像素可操作以產生響應于所述像素處光檢測的輸出。
60. 權利要求58的傳感器，其中所述多個SPR元件中的兩組或多組限定兩個或更多個位點，組內的每一 SPR元件用能夠與共同的一種目標物相結合的共同表面涂層進行共同地官能化。
61. 權利要求60的傳感器，其中所述檢測器包括像素陣列，每個像素可操作以響應于所述像素處的光4企測產生輸出；和所述檢測器相對于所述基體設置以使得至少一個像素對準所述兩個或更多個位點中的每一個。
62. 提供用于^r測測試流體中兩種或更多種不同目標分析物、配體或分子的存在的官能化微傳感器的方法，包括在共用透光性基體上無規(guī)則分散多個表面等離子體激元諧振(SPR) 元件；在該基體上限定兩個或更多個位點，其對應于所述兩種或更多種目標物中的每一種并將該兩個或更多個位點的每一個內的每個SPR元件官能化以4企測相應的目標物；提供具有與該基體上的多個SPR元件對準的像素陣列的檢測器；和選擇對準該兩個或更多個位點中的每一個的一個或更多個像素，其輸出表示相應目標物的檢測。
全文摘要
用于檢測測試流體中目標分析物、配體或分子的存在的傳感器，包括透光性基體、安裝在其上的一系列表面等離子體激元諧振(SPR)元件、經設置以將光線導入該SPR元件的光源、和經設置以檢測透射通過該SPR元件的光的檢測器。該SPR元件可以包括具有約150nm厚度的金涂層的約770nm球形直徑的介電聚苯乙烯球。該SPR元件和該基體的界面構成了直徑小于導入該元件的光的波長的針孔，以在該微尺寸的SPR元件中產生近場耦合模式。該SPR元件包含在模制的PDMS芯片中，其可以加入微流體元件，例如泵和閥門，用于控制測試流體越過該SPR元件的流動。
文檔編號G01N21/65GK101360986SQ200680051423
公開日2009年2月4日申請日期2006年12月15日優(yōu)先權日2005年12月16日
發(fā)明者B·德拉尼, D·阿馬里, J·A·格拉奇爾申請人:印第安納大學研究及科技有限公司

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