專利名稱：在體內(nèi)分泌莫納甜的產(chǎn)品和方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明一般涉及在體內(nèi)生產(chǎn)莫納甜(monatin)甜味劑的產(chǎn)品和方法。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及在體內(nèi)分泌莫納甜甜味劑的產(chǎn)品和方法。
相關(guān)領(lǐng)域 莫納甜是一種具有以下化學(xué)結(jié)構(gòu)的高強(qiáng)度甜味劑
莫納甜包含兩個(gè)手性中心從而導(dǎo)致四種可能的立體異構(gòu)構(gòu)型R，R構(gòu)型(“R，R立體異構(gòu)體”或“R，R莫納甜”)；S，S構(gòu)型(“S，S立體異構(gòu)體”或“S，S莫納甜”)；R，S構(gòu)型(“R，S立體異構(gòu)體”或“R，S莫納甜”)；以及S，R構(gòu)型(“S，R立體異構(gòu)體”或“S，R莫納甜”)。本文中，除非另有說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)“莫納甜”是指包含莫納甜所有四種立體異構(gòu)體的組合物、包含莫納甜立體異構(gòu)體任何組合的組合物(例如，僅包含莫納甜的R，R和S，S立體異構(gòu)體的組合物)以及單個(gè)同分異構(gòu)形式。
出于本公開的目的，莫納甜的碳主鏈將如按上圖所示編號(hào)，與醇基相連的碳被定義為2-位碳，而與氨基直接共價(jià)結(jié)合的碳被定義為4-位碳。因此，除非另有說(shuō)明，文中提及R，R莫納甜、S，S莫納甜、R，S莫納甜和S，R莫納甜時(shí)分別表示2R，4R莫納甜、2S，4S莫納甜、2R，4S莫納甜和2S，4R莫納甜。
注意，在文獻(xiàn)中，莫納甜的碳主鏈也可能已經(jīng)用另一種約定來(lái)編號(hào)，其中與醇基相連的碳被定義為4-位碳，而與氨基相連的碳被定義為4-位碳。因此，例如，本公開中提到的2S，4R莫納甜與采用另一種編號(hào)約定的文獻(xiàn)中的2R，4S莫納甜是相同的。
此外，由于存在各種命名約定，已知莫納甜有許多可替換使用的化學(xué)名，其中包括2-羥基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-氨基戊二酸；4-氨基-2-羥基-2-(1H-吲哚-3-基甲基)-戊二酸；4-羥基-4-(3-吲哚基甲基)谷氨酸；和3-(1-氨基-1，3-二羧基-3-羥基-丁-4-基)吲哚。
至少部分由于其甜味特征，具有莫納甜的經(jīng)濟(jì)來(lái)源是理想的。在生長(zhǎng)在南非德蘭士瓦省地區(qū)的植物Schlerochiton ilicifolius的根樹皮中可發(fā)現(xiàn)莫納甜的某些同分異構(gòu)形式。然而，干燥樹皮中存在的莫納甜的濃度以吲哚的酸性形式表示約為0.007質(zhì)量％。見美國(guó)專利No.4,975,298。此外，在植物中生產(chǎn)莫納甜的方法目前還是未知的。另一方面，美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0/422,366(“’366申請(qǐng)”)中公開了在體內(nèi)和體外生產(chǎn)莫納甜的多肽、途徑和微生物，該申請(qǐng)通過引用納入本文。
發(fā)明概述 莫納甜的產(chǎn)生被認(rèn)為是一種平衡的過程。為使莫納甜的產(chǎn)量超過平衡量，并且有可能使莫納甜的生產(chǎn)更經(jīng)濟(jì)，從制備莫納甜的反應(yīng)中去除產(chǎn)物或者增加反應(yīng)中所添加的底物的量是理想的。因此對(duì)于體內(nèi)生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，以去除產(chǎn)物和促使平衡前進(jìn)的方式從細(xì)胞中分泌莫納甜是理想的。為本說(shuō)明書之目的，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞”、“生物”和“微生物”可互換，除非特別指明，其中包括而不限于細(xì)菌、真菌如酵母和霉菌、藻類、原生動(dòng)物、微生物和病毒。
發(fā)明者已開發(fā)出一種利用轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白從細(xì)胞中去除莫納甜使之進(jìn)入周圍環(huán)境中的新方法，此前還不知道該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可與莫納甜相互作用。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是細(xì)胞膜蛋白，它可促使某些溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)通過一層或多層細(xì)胞膜。例如，已對(duì)抗生素產(chǎn)生臨床耐藥性的某些種類的細(xì)菌可利用轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將藥物或其他毒性物質(zhì)泵出細(xì)胞膜而進(jìn)入到介質(zhì)中。這些流出(efflux)泵利用來(lái)自于ATP水解的能量或者利用質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)能來(lái)促使毒性物質(zhì)外流。目前還未報(bào)道有野生型的微生物可以天然生產(chǎn)莫納甜，同樣此前也未報(bào)道可利用轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來(lái)分泌莫納甜。
根據(jù)一些實(shí)施方式，本發(fā)明提供了一種體內(nèi)生產(chǎn)莫納甜(即，莫納甜的所有四種立體異構(gòu)體(stereoismer)或其亞型，其中包括單個(gè)同分異構(gòu)形式)的方法，該方法包括利用一種或多種類型的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)將定位在細(xì)胞內(nèi)的莫納甜分泌出細(xì)胞使之進(jìn)入到介質(zhì)如培養(yǎng)基中。合適的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的非限制性例子包括AcrAB系統(tǒng)、EmrAB系統(tǒng)和包含AcrAB或EmrAB同源物的系統(tǒng)。在一種情況中，莫納甜是在一種微生物中產(chǎn)生的，并且其中至少有一部分可被微生物分泌出來(lái)，該微生物經(jīng)基因修飾以使其能夠生產(chǎn)莫納甜，其相應(yīng)的野生型形式包含一種或多種能夠分泌莫納甜但是其自身不能生產(chǎn)莫納甜的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。在一種情況中，莫納甜是在一種微生物中產(chǎn)生的，并且其中至少有一部分可被微生物分泌出來(lái)，該微生物在天然狀態(tài)下能夠生產(chǎn)莫納甜，但是經(jīng)過基因修飾以使其表達(dá)或過表達(dá)能夠分泌莫納甜的一種或多種轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)或者轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的一種或多種組分。在一種情況中，莫納甜是在一種微生物中產(chǎn)生的，并且其中至少有一部分可被微生物分泌出來(lái)，該微生物經(jīng)過基因修飾以使其表達(dá)參與分泌莫納甜的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的組分。在一種情況中，莫納甜是在一種微生物中產(chǎn)生的，并且其中至少有一部分可被微生物分泌出來(lái)，該微生物經(jīng)過基因修飾以使其表達(dá)能夠分泌莫納甜的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白組分。例如，微生物可經(jīng)過基因修飾以使其過表達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的通道形成蛋白組分，如AcrAB和/或EmrAB。另外一個(gè)例子是，微生物可經(jīng)過基因修飾以使其表達(dá)對(duì)于微生物來(lái)說(shuō)是異源的或者是天然的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的組分，或者是二者的組合。
根據(jù)一些實(shí)施方式，本發(fā)明提供了經(jīng)過基因修飾以使其表達(dá)或過表達(dá)一種或多種能夠使溶質(zhì)在微生物和其環(huán)境之間直接交換的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的微生物。在一些實(shí)施方式中，微生物經(jīng)過基因改造可表達(dá)或過表達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的微生物，其中的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可選擇性地轉(zhuǎn)運(yùn)莫納甜，例如使其越過莫納甜通路上的中間體。
根據(jù)一些實(shí)施方式，莫納甜是在與合適的對(duì)照相比轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性升高的細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)的，例如本文實(shí)施例中所描述的。在一種情況下，莫納甜是在經(jīng)過基因修飾可表達(dá)一種或多種類型的能夠分泌莫納甜的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的微生物中生產(chǎn)的。在一種情況下，莫納甜是在經(jīng)過基因修飾可過表達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)組分的微生物中生產(chǎn)的。例如，莫納甜可在經(jīng)過基因修飾可過表達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的通道蛋白形成組分(如AcrAB或EmrAB)的微生物中生產(chǎn)。另一個(gè)例子是，莫納甜可以在還過表達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的外膜因子組分(如TolC)的微生物中生產(chǎn)。在一種情況中，莫納甜可在暴露于誘導(dǎo)化合物(即，可激發(fā)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)或其組分表達(dá)或者刺激分泌活性的化合物)的微生物中生產(chǎn)。例如，在生產(chǎn)莫納甜的微生物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中可加入癸酸鈉、羰基氰3-氯苯腙(“CCCP”)或水楊酸?！吧L(zhǎng)培養(yǎng)基”、“培養(yǎng)基”和“發(fā)酵培養(yǎng)基”可替換使用。在一種情況下，誘導(dǎo)化合物的存在可使在沒有誘導(dǎo)化合物的情況下不分泌莫納甜的微生物發(fā)生莫納甜的轉(zhuǎn)運(yùn)。在一種情況下，誘導(dǎo)化合物的存在可導(dǎo)致微生物所分泌的莫納甜相對(duì)于合適對(duì)照所分泌的量來(lái)說(shuō)增加。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，本發(fā)明提供了證明轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分泌莫納甜的效率的方法。在一種情況下，該方法包括將含有莫納甜操作子基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到靶轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白已被刪除的宿主微生物內(nèi)，然后根據(jù)莫納甜轉(zhuǎn)運(yùn)/分泌相對(duì)于野生型對(duì)照的丟失情況進(jìn)行篩選。在一種情況中，通過如下過程使轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因過表達(dá)將轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因克隆到多拷貝質(zhì)粒內(nèi)，按照上述方法轉(zhuǎn)化經(jīng)遺傳改造的宿主使其產(chǎn)生莫納甜，以及根據(jù)與不過表達(dá)各種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的野生型對(duì)照相比莫納甜轉(zhuǎn)運(yùn)增加的情況進(jìn)行篩選。在一種情況中，莫納甜分泌可通過使用誘導(dǎo)子以增強(qiáng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性并與合適的未誘導(dǎo)對(duì)照比較莫納甜的生產(chǎn)和/或分泌來(lái)評(píng)價(jià)。
根據(jù)一些實(shí)施方式，莫納甜可在缺乏一種或多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的微生物內(nèi)生產(chǎn)，例如缺乏四種被命名為YhcP(AaeB)、YccS、YjcQ和YhfK的特殊的推測(cè)的流出轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
根據(jù)一些實(shí)施方式，莫納甜可在谷氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型中生產(chǎn)。在一種情況中，莫納甜是在經(jīng)基因工程修飾而能夠產(chǎn)生莫納甜的谷氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型中生產(chǎn)的。在一種情況中，莫納甜可在經(jīng)基因工程改造而過表達(dá)一種或多種類型的能夠分泌莫納甜的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)或這種轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的一種或多種組分的谷氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型中生產(chǎn)。在一種情況中，莫納甜可在增強(qiáng)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)的發(fā)酵條件下培養(yǎng)的微生物內(nèi)生產(chǎn)。
根據(jù)一些實(shí)施方式，莫納甜可在包含在交換蘋果酸時(shí)能夠轉(zhuǎn)移谷氨酸或其結(jié)構(gòu)相似分子的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)或系統(tǒng)的微生物內(nèi)生產(chǎn)。在一種情況下，莫納甜可在包含在交換蘋果酸時(shí)能夠轉(zhuǎn)移谷氨酸或其結(jié)構(gòu)相似分子的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)或系統(tǒng)并且經(jīng)過基因修飾能夠產(chǎn)生莫納甜的微生物內(nèi)生產(chǎn)。在一種情況下，莫納甜可在包含在交換蘋果酸時(shí)能夠轉(zhuǎn)移谷氨酸或其結(jié)構(gòu)相似分子的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)或系統(tǒng)并經(jīng)基因工程改造成為谷氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的微生物內(nèi)生產(chǎn)。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通過閱讀本公開后應(yīng)當(dāng)清楚，本發(fā)明的特殊實(shí)施方式可包含所提及的一個(gè)、一些或所有情況和實(shí)施方式，或者另外包含或還包含雖未明確說(shuō)明但是從本公開中能夠清楚的情況或?qū)嵤┓绞健＠?，利用在公開中清楚描述的化合物(如癸酸鈉和/或CCCP和/或水楊酸)以及本公開中可能未描述的化合物誘導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)也被認(rèn)為包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
同樣，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式可包含未清楚描述的情況/實(shí)施方式的組合。例如，同時(shí)進(jìn)行多種用于獨(dú)立增強(qiáng)莫納甜分泌的處理被認(rèn)為包含在被發(fā)明范圍之內(nèi)。例如，氨芐青霉素和/或吐溫20的提供可與癸酸鈉的提供組合使用。實(shí)施例7提供了包含根據(jù)本發(fā)明的情況/實(shí)施方式組合的合適實(shí)施方式的另一種說(shuō)明。在實(shí)施例7中，莫納甜在通過給生長(zhǎng)培養(yǎng)基提供癸酸鈉以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)同時(shí)又經(jīng)基因工程改造而能過表達(dá)TolC的微生物內(nèi)生產(chǎn)。
因此，應(yīng)當(dāng)從本文的描述中認(rèn)識(shí)到，可在各個(gè)方面對(duì)本發(fā)明作出修改，只要不偏離本發(fā)明的精神和范圍。因此，描述在性質(zhì)上應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是說(shuō)明性的，而不是限制性的，雖然公開了多個(gè)實(shí)施方式/情況，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本文的描述還可以理解其他實(shí)施方式/情況，它顯示和描述了本發(fā)明的說(shuō)明性實(shí)施方式/情況。相應(yīng)的，除非特別說(shuō)明，所有實(shí)施例都是非限制性的，無(wú)論是否作了這樣的清楚描述。
附圖簡(jiǎn)述

圖1(A-D)是一個(gè)序列比對(duì)圖，顯示了生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AtPGP1和7種不同蛋白質(zhì)之間的同源性，這是對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST分析所得到的一組結(jié)果。這些蛋白質(zhì)被命名為Br ABB97035、St AAD10836、Sb AAR10387、Os XP483819、OsCAD59580、ZMPGP1和AAR00316。
發(fā)明詳述 本公開涉及微生物分泌出莫納甜并進(jìn)入介質(zhì)如培養(yǎng)基中的方法和產(chǎn)品。更具體地說(shuō)，本公開涉及莫納甜分泌出宿主微生物并進(jìn)入到所期望的環(huán)境中，如介質(zhì)中，其中包括培養(yǎng)基，所需要的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的開發(fā)和應(yīng)用。從微生物中分泌出的莫納甜的這種轉(zhuǎn)運(yùn)還可以使莫納甜生產(chǎn)的數(shù)量和/或速度都較合適的對(duì)照增加，例如本文實(shí)施例所描述的。
在本文中，“包括”是指“包含”。另外，單數(shù)形式的“一個(gè)”或“一種”或“該”也包括復(fù)數(shù)，除非在上下文中特別指明。例如，提及“包含一個(gè)蛋白質(zhì)”時(shí)包含一個(gè)或多個(gè)這種蛋白質(zhì)，提及“包含該細(xì)胞”時(shí)包含一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞以及本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的其等價(jià)物等等。
在本文中，術(shù)語(yǔ)“約”包括任何檢測(cè)中所發(fā)生的試驗(yàn)誤差范圍。除非特別說(shuō)明，所有的測(cè)量數(shù)據(jù)都被認(rèn)為在其前面有單詞“約”，即使單詞“約”未明確寫出。
在本文中，術(shù)語(yǔ)“增強(qiáng)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性”包括莫納甜生產(chǎn)或分泌的數(shù)量和/或速率高于莫納甜從合適對(duì)照中所生產(chǎn)的數(shù)量和/或速率。
在本文中，術(shù)語(yǔ)“分泌的”和“排出的”可替換使用，包括通過將物質(zhì)從細(xì)胞內(nèi)移去使之進(jìn)入到胞質(zhì)周圍空間或進(jìn)入到細(xì)胞外的環(huán)境如周圍介質(zhì)中而從那些細(xì)胞中制備和分離物質(zhì)。
在本文中，術(shù)語(yǔ)“部分分泌的”和“部分排出的”可替換使用，包括從細(xì)胞中制備和分離特殊物質(zhì)的一部分而不是全部。在一些方面，在細(xì)胞內(nèi)還保留一些物質(zhì)。
在本文中，術(shù)語(yǔ)“莫納甜操縱子基因”和“莫納甜操縱子基因”包括合成莫納甜時(shí)所使用的一個(gè)或多個(gè)酶的編碼基因。
在本文中，術(shù)語(yǔ)“泵”、“多個(gè)泵”、“泵系統(tǒng)”、“多個(gè)泵系統(tǒng)”、“流出系統(tǒng)”和“多個(gè)流出系統(tǒng)”可替換使用，包括能夠?qū)⑽镔|(zhì)從細(xì)胞內(nèi)移送到理想環(huán)境如細(xì)胞周圍環(huán)境中和/或能夠?qū)⑽镔|(zhì)從細(xì)胞周圍區(qū)域移送到細(xì)胞內(nèi)的一種或多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
在本文中，術(shù)語(yǔ)“異源的”包括對(duì)于所列舉元件來(lái)說(shuō)是外源的或是非天然的元件。例如，轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的異源組分包括為該系統(tǒng)的非天然組分的組分。
在本文中，術(shù)語(yǔ)“與...協(xié)作”包括以一種方式與另一種分子相互作用、共價(jià)結(jié)合和/或調(diào)節(jié)另一種分子以完成或增強(qiáng)該分子的功能的分子。另外，該術(shù)語(yǔ)包括能夠啟動(dòng)調(diào)節(jié)途徑從而導(dǎo)致下游另一種分子活化或抑制的分子。
在本文中，術(shù)語(yǔ)“分離”包括將物質(zhì)從其環(huán)境或宿主中去除的過程、除非特別說(shuō)明不會(huì)生產(chǎn)出具有一定純度的物質(zhì)的過程。
在本文中，術(shù)語(yǔ)“游離的”包括已被從其環(huán)境或宿主中去除但還不是純化的物質(zhì)。
在本文中，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)組分”包括完整的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)本身。
在微生物中生產(chǎn)莫納甜 如WO 03/091396 A2所描述(見例如圖1-3和11-13)，莫納甜可通過多步驟途徑從色氨酸制備，其中包括生物轉(zhuǎn)換(即，利用多肽促使底物向產(chǎn)物轉(zhuǎn)換的反應(yīng))。所描述的途徑包括將色氨酸生物轉(zhuǎn)換為吲哚-3-丙酮酸、將吲哚-3-丙酮酸生物轉(zhuǎn)換為2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸(“MP”)以及將MP生物轉(zhuǎn)換為莫納甜。
用于將色氨酸轉(zhuǎn)換為吲哚-3-丙酮酸的酶包括能夠?qū)被鶑墓w分子上轉(zhuǎn)移到受體分子上或者產(chǎn)生氨或氨離子的酶家族的成員?？捎糜谶@種反應(yīng)的典型酶包括酶分類(“EC”)2.6.1.27、1.4.1.19、1.4.99.1、2.6.1.28、1.4.3.2、1.4.3.3、2.6.1.5、2.6.1.-、2.6.1.1、2.6.1.21和3.5.1.-的成員。這些分類包括多肽如色氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，可將L-色氨酸和α-KG(即，α-酮戊二酸，也叫2-氧代戊二酸)轉(zhuǎn)化成吲哚-3-丙酮酸和L-谷氨酸；D-色氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，可將D-色氨酸和2-含氧酸轉(zhuǎn)化成吲哚-3-丙酮酸和氨基酸；色氨酸脫氫酶，可將L-色氨酸和NAD(P)轉(zhuǎn)化成吲哚-3-丙酮酸和NH3及NAD(P)H；D-氨基酸脫氫酶，可將D-氨基酸和FAD轉(zhuǎn)化成吲哚-3-丙酮酸和NH3及FADH2；色氨酸-苯丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶，可將L-色氨酸和苯丙酮酸轉(zhuǎn)化成吲哚-3-丙酮酸和L-苯丙氨酸；L-氨基酸氧化酶，可將L-氨基酸和H2O和O2轉(zhuǎn)化成2-含氧酸和NH3和H2O2；D-氨基酸氧化酶，可將D-氨基酸和H2O和O2轉(zhuǎn)化成2-含氧酸和NH3和H2O2；以及色氨酸氧化酶，可將L-色氨酸和H2O和O2轉(zhuǎn)化成吲哚-3-丙酮酸和NH3和H2O2。這些類的酶還包括酪氨酸(芳香族)氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、D-氨基酸(或D-丙氨酸)氨基轉(zhuǎn)移酶，以及具有多種氨基轉(zhuǎn)移酶活性的廣譜(多底物)氨基轉(zhuǎn)移酶，這類酶中的一些酶可將色氨酸和2-含氧酸轉(zhuǎn)化成吲哚-3-丙酮酸和氨基酸。另外，這些類的酶還包括苯丙氨酸脫氨酶，在水存在的情況下可將色氨酸轉(zhuǎn)化成吲哚-3-丙酮酸和銨。
可用于將吲哚-3-丙酮酸轉(zhuǎn)化成MP的酶包括可催化醛醇縮合反應(yīng)的酶家族的成員?？捎糜谶@種反應(yīng)的典型酶包括酶分類4.1.3.-、4.1.3.16、4.1.3.17和4.1.2.-的成員。這些類的酶包括碳-碳合成酶/裂解酶，如能催化兩個(gè)羧酸底物縮合的醛縮酶。肽類EC 4.1.3.-是能夠利用酮酸底物(如吲哚-3-丙酮酸)作為親電子體形成碳-碳鍵的合成酶/裂解酶，而EC 4.1.2.-是能夠利用醛底物(如苯甲醛)作為親電子體形成碳-碳鍵的合成酶/裂解酶。例如，已知KHG醛縮酶(EC 4.1.3.16)和ProA醛縮酶(EC4.1.3.17)可將吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸轉(zhuǎn)化成MP。MP也可以利用化學(xué)反應(yīng)制備，如醛醇縮合。
可用于將MP轉(zhuǎn)化成莫納甜的酶包括能將氨基從供體分子上轉(zhuǎn)移到受體分子上或者能產(chǎn)生氨/銨離子的酶家族的成員。可用于這種反應(yīng)的典型酶包括下列酶分類的成員色氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(2.6.1.27)、色氨酸脫氫酶(1.4.1.19)、D-氨基酸脫氫酶(1.4.99.1)、谷氨酸脫氫酶(1.4.1.2-4)、苯丙氨酸脫氫酶(EC 1.4.1.20)、色氨酸-苯丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(2.6.1.28)，或者氨基轉(zhuǎn)移酶家族(2.6.1.-)如天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(EC2.6.1.1)、酪氨酸(芳香族)氨基轉(zhuǎn)移酶(2.6.1.5)、D-色氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶或D-丙氨酸(2.6.1.21)氨基轉(zhuǎn)移酶的多個(gè)普通成員(見WO 03/091396 A2的圖2)。這個(gè)反應(yīng)也可以利用化學(xué)反應(yīng)完成。酮酸(MP)的氨基化可利用氨和硼氫化氰通過還原氨基化來(lái)完成。WO 03/091396A2的圖11-13顯示的是可用于將MP轉(zhuǎn)化成莫納甜的其他多肽，以及從吲哚-3-丙酮酸或色氨酸生產(chǎn)莫納甜的產(chǎn)量得以提高。
在本文中，可利用經(jīng)基因修飾從而能夠生產(chǎn)莫納甜的生物在體內(nèi)生產(chǎn)莫納甜，例如，利用上述途徑或者在合適的條件下通過給能表達(dá)上述酶的生物提供合適的底物。例如，可利用生物生產(chǎn)莫納甜，該生物的野生型形式可產(chǎn)生色氨酸、表達(dá)至少一種WO 03/091396所描述的途徑中所公開的酶，該生物經(jīng)過基因修飾后可表達(dá)野生型形式內(nèi)所不存在但是卻能用于莫納甜生產(chǎn)途徑中的其他酶。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，可在表達(dá)一種或多種能夠表達(dá)分泌莫納甜的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的生物(如宿主細(xì)胞)內(nèi)生產(chǎn)莫納甜。根據(jù)一些實(shí)施方式，莫納甜可在表達(dá)野生型形式的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的生物內(nèi)生產(chǎn)。根據(jù)一些實(shí)施方式，莫納甜可在經(jīng)過基因修飾從而能夠表達(dá)對(duì)于微生物來(lái)說(shuō)是異源的一種或多種轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的生物內(nèi)生產(chǎn)。根據(jù)一些實(shí)施方式，莫納甜可在經(jīng)過基因修飾從而能夠表達(dá)用于將莫納甜轉(zhuǎn)運(yùn)到外部介質(zhì)內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)組分的生物內(nèi)生產(chǎn)。
編碼具有轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的多肽的所有核酸都可以從任何生物中分離并克隆到所選擇的宿主生物內(nèi)。編碼具有轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的多肽的基因的例子包括而不限于(1)來(lái)自根瘤菌(Rhizobium)的Aap和Bra基因，(2)阿布屬(Arabidopsis)的AUX1基因或PIN1多肽(通透酶，生長(zhǎng)素分泌)，(3)深紅丙二酸單胞菌(Malonomonas rubra)的MadN(一種醋酸流出泵)，(4)乳酸菌(L.lactis)的有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，類似于哺乳動(dòng)物多藥耐藥多肽和酵母Pdr12，對(duì)陰離子而不是陽(yáng)離子或疏水分子具有特異性，(5)多藥耐藥多肽Mrp2，可從肝臟內(nèi)分泌非膽汁有機(jī)陰離子，以及(6)天冬氨酸/谷氨酸載體(AGC)多肽。根瘤菌的Aap和Bra基因是主要參與類菌體內(nèi)谷氨酸和天冬氨酸攝取的通用氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。但是，當(dāng)介質(zhì)內(nèi)存在高水平的異源氨基酸時(shí)它們也可流出其他氨基酸。實(shí)施例25顯示阿布屬生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的過表達(dá)可導(dǎo)致莫納甜的產(chǎn)量增加。
另外，生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同源物的表達(dá)或過表達(dá)預(yù)計(jì)也可以增加莫納甜的產(chǎn)量。這種同源物的例子包括那些含有如圖1所示的生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白保守區(qū)的同源物。例如，生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的同源物可包含選自以下的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列PXGKTXAXVGXSGSGKSTVVSLXERFYXPXXGXXXLDG、LXLXXLRXQIGLVXQEPXLFATXIXENXLG和QVGERGXQLSGGQKQRIAIARAMLXXPXILLLDEATSALD，其中X是在與同源物的氨基酸序列一起比對(duì)時(shí)位于AtPGP1、BrABB97035、StAAD10836、ZmPGP1_AAR00316、SbAAR10387、OsXP_483819、OS_CAD59580和AtPGP19中任意一個(gè)的指定位置上的氨基酸，如圖1B所示。生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的其他合適同源物可包含選自LPXGYXTXVGERGVQLSGGQXQRIAIARA和LLDEATSALDAESEXXXQEAL的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列，其中X是在與同源物的氨基酸序列一起比對(duì)時(shí)位于AtPGP1、BrABB97035、StAAD10836、ZmPGP1_AAR00316、SbAAR10387、OsXP_483819、OS_CAD59580和AtPGP19中任意一個(gè)的指定位置上的氨基酸，如圖1D所示。
能夠分泌莫納甜的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的非限制性例子包括AcrAB流出系統(tǒng)和EmrAB流出系統(tǒng)。實(shí)施例1證明AcrAB泵能夠分泌莫納甜。實(shí)施例2證明EmrAB泵能夠分泌莫納甜。實(shí)施例3還說(shuō)明AcrAB和EmrAB流出系統(tǒng)都可用于分泌莫納甜。
基于AcrAB和EmrAB的陽(yáng)性試驗(yàn)結(jié)果，可以預(yù)計(jì)某些其他轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也能夠分泌莫納甜。一般來(lái)說(shuō)，AcrAB和EmrAB系統(tǒng)屬于已知為多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族。多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被認(rèn)為是能夠通過將毒性分子主動(dòng)排出以保護(hù)細(xì)胞抵抗各種毒性分子的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白?；诙嗨庌D(zhuǎn)運(yùn)蛋白所排出的分子類型有很寬廣的重疊以及AcrAB和EmrAB轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的類型為多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可以預(yù)見其他多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白應(yīng)該能夠分泌莫納甜。特別是RND家族(包括AcrAB的多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的一個(gè)亞類)的其他轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及MF家族(多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的另一個(gè)亞類，但是該亞類包括EmrAB)的其他轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白預(yù)計(jì)能夠分泌莫納甜。預(yù)計(jì)所檢測(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的同源物也可以分泌莫納甜。以AcrA、AcrB、EmrA、EmrB或TolC多肽為餌對(duì)微生物數(shù)據(jù)庫(kù)ERGO進(jìn)行BLAST檢索可分別鑒定出154、213、231、236和115個(gè)同源物。
更具體的是，AcrEF是與AcrAB高度同源的流出泵，因此AcrEF系統(tǒng)預(yù)計(jì)也能夠分泌莫納甜。實(shí)施例24提供了一個(gè)大腸桿菌(E.coli)突變株，其中編碼轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的基因已被敲除。
轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的其他非限制性例子預(yù)計(jì)也可用于分泌莫納甜，因?yàn)樗鼈兣cAcrAB是同源的，其中包括 ·綠膿假單孢菌Pseudomonas aeruginosa)來(lái)源的AcrA同源物MexA。Fernandez-Recio，J.等，“來(lái)源于革蘭氏陰性菌的跨膜藥物流出泵模型(A modelof a transmembrane drug-efflux pump from Gram-negative bacteria)”，F(xiàn)EBS Lett.5785-9，(2004)； ·淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)來(lái)源的多藥轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，該細(xì)菌含有基因mtrRCD，其產(chǎn)物是與AcrRAB相關(guān)的。Pan，W.，和Spratt，B.G.，“mtr系統(tǒng)對(duì)淋球菌包膜通透性的調(diào)節(jié)(Regulation of the permeability of the gonococcalenvelope by the mtr system)”，Mol.Microbiol.11769-775，(1994)； ·基因ameB的產(chǎn)物，該產(chǎn)物與RND-型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的成員同源。其中包括大腸桿菌的AcrB、綠膿假單孢菌的MexD和mexF、惡臭假單孢菌(Pseudomonasputida)的TtgB、TtgE和SrpB； ·AcrEF流出泵參與多藥耐藥，其底物范圍與AcrAB相似(也轉(zhuǎn)運(yùn)新生霉素)。AcrEF系統(tǒng)在吲哚流出中發(fā)揮重要作用。AcrEF流出泵參與大腸桿菌內(nèi)的溶劑耐受，可利用TolC提高溶劑耐受性。
·被重新命名為mdtABCD的yegMNOB操縱子的產(chǎn)物，其中mdt代表多藥耐藥蛋白。Baranova N.和Nikaido H.，“baeSR二組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)可活化大腸桿菌內(nèi)yegMNOB(mdtABCD)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因簇的轉(zhuǎn)錄并增強(qiáng)其對(duì)新生霉素和脫氧膽酸的耐受性(The baeSR two-component regulatory system activates transcription ofthe yegMNOB(mdtABCD)transporter gene cluster in Escherichia coli andincreases its resistance to novobiocin and deoxycholate)”，J Bacteriol.1844168-4176(2002)。由于AcrAB也是多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白并且也能夠流出新生霉素，因此mdtABCD操縱子也可能是莫納甜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的候選者。
·yhiU/V基因產(chǎn)物。Ma，D.等，“基因acrA和acrB編碼大腸桿菌的應(yīng)激誘導(dǎo)流出(Genes acrA and acrB encode a stress-induced efflux of Escherichia coli)”，Mol.Microbiol.1645-55，(1995)；Ma，D.等，“革蘭氏陰性菌內(nèi)的流出泵和藥物耐受性(Efflux pumps and drug resistance in gram negative bacteria)”，TrendsMicrobiol.2489-493，(1994)。
·AcrB和AcrD屬于耐藥結(jié)節(jié)分化(“RND”)超家族，它們具有相似的拓樸學(xué)結(jié)構(gòu)，包括一對(duì)大的胞質(zhì)環(huán)，每個(gè)環(huán)所含有的氨基酸殘基在300以上。環(huán)區(qū)域的交換伴隨著底物范圍的改變說(shuō)明底物識(shí)別(以及可能的結(jié)合)主要是由兩個(gè)胞質(zhì)環(huán)所決定的。Elkins，C.A.和Nikaido，H.，“大腸桿菌RND型多藥流出泵AcrB和AcrD的底物特異性主要是由兩個(gè)大的胞質(zhì)環(huán)決定的(Substratespecificity of the RND-type multidrug efflux pumps AcrB and AcrD of Escherichiacoli is determined predominantly by two large periplasmic loops)”，J Bacteriol.1846490-6498，(2002)。在兩個(gè)胞質(zhì)環(huán)上進(jìn)行突變可能會(huì)對(duì)AcrAB轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白所運(yùn)輸?shù)牡孜锏奶禺愋援a(chǎn)生影響，增加對(duì)莫納甜的選擇性同時(shí)減少對(duì)莫納甜中間體的運(yùn)輸。
由于和EmrAB同源而被預(yù)計(jì)能夠分泌莫納甜的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的非限制性例子包括 ·MdeA(多藥流出A)是在金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)內(nèi)鑒定出的染色體編碼的多藥耐受流出蛋白。MdeA屬于主要易化超家族，在已知的流出蛋白中與大腸桿菌的LmrB和枯草芽孢桿菌的LmrB關(guān)系最密切。MdeA與蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)比較發(fā)現(xiàn)它與推測(cè)的和已知的MDR蛋白具有明顯的殘基一致性。在標(biāo)準(zhǔn)BLASTP檢索(2002年6月)的頭100次采樣中，只有5個(gè)經(jīng)試驗(yàn)證明是流出蛋白或MDR蛋白 ·枯草芽孢桿菌(B.subtilis)(O35018)的LmrB，與MdeA有37％的一致性(Kumano M.等，“來(lái)自于枯草芽孢桿菌染色體的林可霉素耐藥基因區(qū)(22度-25度)的一個(gè)32kb核苷酸序列及l(fā)in-2突變位點(diǎn)的鑒定(A 32 kb nucleotidesequence from the region of the lincomycin-resistance gene(22 degrees-25 degrees)of the Bacillus subtilis chromosome and identification of the site of the lin-2mutation)”，Microbiology 1432775-2782，(1997))； ·淋病奈瑟球菌的FarB(AAD54074)，與MdeA有24％的一致性(Lee E.H.和Shafer W.M.，“farAB編碼的流出泵介導(dǎo)淋球菌對(duì)長(zhǎng)鏈抗菌脂肪酸的耐藥性(The farAB-encoded efflux pump mediates resistance of gonococci to long-chainedantibacterial fatty acids)”，Mol Microbiol.33839-845(1999))； ·淡青鏈霉菌(Streptomyces glaucescens)的TcmA(P39886)，與MdeA有24％的一致性(Guilfoile P.G.和Hutchinson C.R.，“淡青鏈霉菌的TcmR蛋白通過與基因見操縱區(qū)的結(jié)合來(lái)抑制不同方向的tcmR和tcmA基因的轉(zhuǎn)錄(TheStreptomyces glaucescens TcmR protein represses transcription of the divergentlyoriented tcmR and tcmA genes by binding to an intergenic operator region)”，JBacteriol.1743659-3666(1992))； ·環(huán)圈鏈霉菌(Streptomyces anulatus)的Pur8(P42670)，與MdeA有25％的一致性(Tercero J.A.等，“來(lái)自于白黑鏈霉菌的pur簇的pur8基因編碼賦予嘌呤霉素耐藥性的高度疏水多肽(The pur8 gene from the pur cluster of Streptomycesalboniger encodes a highly hydrophobic polypeptide which confers resistance topuromycin)”，Eur J Biochem.218963-971(1993))。上面所提到的LmrB、TcmA、Pur8和EmrB蛋白賦予對(duì)疏水化合物或抗生素的耐藥性，而FarB蛋白孵育對(duì)抗菌脂肪酸的耐藥性。
·金黃色葡萄球菌(S.aureus)的QacA，與MdeA有23％的一致性，在功能上與葡萄球菌流出蛋白最相關(guān)。Mitchell B.A.等，“來(lái)自于金黃色葡萄球菌的QacA多藥流出泵對(duì)二脒、雙胍和丙咪腙的耐藥性比較分析(QacA multidrug effluxpump from Staphylococcus aureuscomparative analysis of resistance todiamidines，biguanidines，and guanylhydrazones)”，Antimicrob Agents Chemother.42475-477，(1998)。MdeA與其6個(gè)已知MDR的多重比對(duì)證明了在細(xì)菌MDR蛋白上鑒定出的許多基序的保守性。Putman M.等，“細(xì)菌多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的分子特性(Molecular properties of bacterial multidrug transporters)”，Microbiol MolBiol Rev.64672-693(2000)。預(yù)測(cè)MdeA有14個(gè)TMS，MdeA和QacA序列的比對(duì)顯示預(yù)測(cè)的和試驗(yàn)證明的TMS區(qū)各自吻合。(Huang J.等，“金黃色葡萄球菌內(nèi)的染色體編碼的新型多藥流出轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MdeA(Novel chromosomallyencoded multidrug efflux transporter MdeA in Staphylococcus aureus)”，Antimicrob Agents Chemother.48909-917(2004)。
實(shí)施例4中的方法可用于證明給定轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白如上面所鑒定的那些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分泌莫納甜的能力。另外，實(shí)施例4中的方法可用于篩選能用于分泌莫納甜的其他轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。鑒定能夠轉(zhuǎn)運(yùn)莫納甜的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的策略可將實(shí)施例4的篩選方法運(yùn)用到能轉(zhuǎn)運(yùn)谷氨酸、色氨酸、吲哚化合物的任何生物上，或者運(yùn)用到具有與分泌莫納甜的能力相一致的其他特征的任何生物上。這種生物包括而不限于(1)據(jù)推測(cè)具有大量次級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的生物如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、泛菌屬(Pantoea)和立克次氏體，(次級(jí)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可利用電化學(xué)梯度，一般含有多個(gè)(＞7)跨膜區(qū)以及位于胞漿和細(xì)胞外間隙的區(qū)域)，(2)分泌谷氨酸的生物如棒狀菌(Corynebacteria)和短桿菌(Brevibacteria)，(3)植物和含有種子如大豆、豌豆、花生和黃豆的豆莢，(4)根瘤菌屬細(xì)菌，(5)對(duì)酸高度耐受的生物如乳酸菌、醋酸桿菌屬(Acetobacter)菌株、科普屬(Kluyveromyces)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和黑曲霉(Aspergillusniger)，(6)分泌吲哚-丙酮酸的生物如灰黃鏈霉菌(Streptomyces griseoflavus)和斯氏泛菌(P.stewartii)，(7)GRAS生物(公認(rèn)為無(wú)毒的)，其中包括而不限于納塔爾鏈霉菌(Streptomyces natalensis)、恰塔努加鏈霉菌(Streptomyces chattanoogensis)、釀酒酵母、脆弱鏈霉菌(Saccharomyces fragilis)、產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)、Gigartinaceae和Soliericeae家族的成員、Furcellaria fastigiata、高里假絲酵母(Candida guilliermondii)、解脂假絲酵母(Candidalipolytica)，以及(8)能夠合成氨基酸的生物，其中包括而不限于大腸桿菌和其他腸桿菌科的細(xì)菌(如克雷白桿菌屬(Klebsiella)、泛菌屬和i菌株)、谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)、短桿菌屬(Brevibacterium)菌株、桿菌屬(Bacillus)菌株和酵母菌屬(Saccharomyces)菌株。還可以根據(jù)生物利用富含谷氨酸的合成多肽或天然多肽(如，GLURP，來(lái)自于惡性瘧原蟲的富含谷氨酸的多肽)作為唯一氮源的能力來(lái)篩選生物。這種生物能夠分泌谷氨酸，使其能夠在含有高水平胞內(nèi)谷氨酸生物的情況下存活，胞內(nèi)谷氨酸是有毒性的，或者會(huì)對(duì)細(xì)胞滲透勢(shì)造成不利影響。實(shí)施例15顯示泛菌，特別是斯氏泛菌(Pantoea stewartii)能夠生產(chǎn)和排出莫納甜。
幾種類型的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白多肽可識(shí)別莫納甜作為底物，如通用氨基酸/多胺輸出蛋白多肽、二羧酸輸出蛋白多肽、生長(zhǎng)素分泌多肽和多藥耐藥多肽。另外，幾個(gè)超家族包含能完成莫納甜流出的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白多肽。這些超家族包括2.A.1(MFS)、2.A.6(RND)、2.A.7(SMR)、2.A.67(MATE)、CAAT(TC 2.A.78和2.A.69(AEC)。這些超家族包含能識(shí)別植物生長(zhǎng)激素(結(jié)構(gòu)與莫納甜衍生物相似)、藥物、抗菌素和各種有機(jī)分子相關(guān)的底物的流出轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白多肽。例如，大腸桿菌的AcrEF多肽(以及其他RND成員如AcrAB和MexAB)是能夠排出吲哚及其他多種含疏水區(qū)的化合物的多重流出泵。另外，5個(gè)ABC輸出蛋白家族包含能夠行使分泌分子如多肽功能的多肽。這些ABC家族多肽可用于轉(zhuǎn)運(yùn)莫納甜。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，莫納甜可在與合適對(duì)照相比轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性升高的微生物內(nèi)生產(chǎn)，如本文實(shí)施例所描述的?！稗D(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性升高”可通過莫納甜生產(chǎn)和分泌的數(shù)量和/或速度的增加來(lái)測(cè)定。如果不受現(xiàn)有理論的束縛，可以認(rèn)為過表達(dá)泵組分可增加組分的利用度、轉(zhuǎn)化成功能性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)形成的可能性和/或利用度升高，因此可以提高合成增多的莫納甜相應(yīng)的分泌。
根據(jù)一些實(shí)施方式，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性升高可通過基因修飾微生物使其過表達(dá)一種或多種類型的能夠分泌莫納甜的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)如AcrAB和/或EmrAB系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
根據(jù)一些實(shí)施方式，活性升高可通過基因修飾微生物使其過表達(dá)能夠分泌莫納甜的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)組分來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如，莫納甜可在經(jīng)基因修飾從而能夠過表達(dá)RND家族多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的通道形成蛋白組分的微生物內(nèi)生產(chǎn)，例如過表達(dá)通道形成蛋白(如AcrAB和/或EmrAB)，或者例如過表達(dá)該系統(tǒng)的不同組分，如AcrA和AcrB。
轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的表達(dá)或過表達(dá)可通過各種方法實(shí)現(xiàn)。一種通用的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的，用于提高參與莫納甜轉(zhuǎn)運(yùn)的基因的表達(dá)來(lái)增加該基因的拷貝數(shù)。增加基因的拷貝數(shù)可通過用攜帶所需轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的載體/質(zhì)粒轉(zhuǎn)化合適的宿主微生物來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中所需基因連接到載體的調(diào)節(jié)元件上。這種含轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白/轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白組分基因的載體可使宿主微生物過表達(dá)各自的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或組分。增加生物內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的另一種方法是利用調(diào)節(jié)分子如誘導(dǎo)子或抑制子。
AcrAB轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)或其組分的表達(dá)或過表達(dá)可通過如下方法實(shí)現(xiàn) ·RamA是一種含有113個(gè)氨基酸的調(diào)節(jié)蛋白，屬于AraC-XylS轉(zhuǎn)錄活化因子家族，位于產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)ATCC 13048型菌株內(nèi)。RamA的過表達(dá)可增加AcrA的產(chǎn)生，而AcrA是AcrAB-TolC藥物流出泵的一個(gè)組分。實(shí)施例17說(shuō)明RamA的過表達(dá)可導(dǎo)致莫納甜排出增多。
·另外有報(bào)道顯示RamA是marRAB操縱子的轉(zhuǎn)錄活化因子，MarA是由marRAB操縱子編碼的活化蛋白。Chollet，R.等，“RamA是產(chǎn)氣腸桿菌內(nèi)多藥耐藥級(jí)聯(lián)的另一種活化因子(RamA is an alternate activator of the multidrugresistance cascade in Enterobacter aerogenes)”，Antimicrob Agents Chemother.482518-2523，(2004)。據(jù)報(bào)道m(xù)arRAB操縱子主要通過AcrAB-TolC流出泵上調(diào)毒性化合物的流出來(lái)介導(dǎo)耐藥性。
·據(jù)報(bào)道，兩個(gè)組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的某些反應(yīng)調(diào)節(jié)因子過表達(dá)可上調(diào)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的數(shù)目，其中包括acrD、emrKY、mdtABC和mdtEF。Hirakawa，H.等，“吲哚在大腸桿菌內(nèi)誘導(dǎo)多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)(Indole induces theexpression of multidrug transporter genes in Escherichia coli)”，MolecularMicrobiology，55113-1126，(2005)。這些都是莫納甜的候選轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。
·baeSR兩組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)可活化大腸桿菌內(nèi)yegMNOB(mdtABCD)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因簇的轉(zhuǎn)錄，該基因與AcrAB轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)同源。Baranova，N.和Nikaido，H.，“baeSR兩組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)活化大腸桿菌內(nèi)yegMNOB(mdtABCD)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因簇的轉(zhuǎn)錄并且提高其對(duì)新生霉素和脫氧膽酸的耐藥性(The baeSR two-componentregulatory system activates transcription of the yegMNOB(mdtABCD)transportergene cluster in Escherichia coli and increases its resistance to novobiocin anddeoxycholate)”，J.Bacteriol.1844168-4176，(2002)。
·BaeSR兩組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)還控制大腸桿菌內(nèi)賦予藥物耐受性的輸出蛋白基因的表達(dá)。Nagakubo，S.等，J.Bacteriol.1844161-4167，(2002)；Baranova，N.和Nikaido，H.，J.Bacteriol.1844168-4176，(2002)。BaeR在缺乏大腸桿菌多藥輸出蛋白AcrB的情況下過表達(dá)可賦予細(xì)菌對(duì)多種毒性底物的耐受性，其中包括抗生素新生霉素。由于AcrAB可轉(zhuǎn)運(yùn)新生霉素和莫納甜，因此這說(shuō)明有能夠轉(zhuǎn)運(yùn)新生霉素也可能能夠轉(zhuǎn)運(yùn)莫納甜的其他轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被BaeR活化。Nishino K.等，“在基因組范圍分析響應(yīng)于BaeSR兩組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)的大腸桿菌基因的表達(dá)(Genome-wide analyses of Escherichia coli gene expression responsiveto the BaeSR two-component regulatory system)”，J.Bacteriol.1871763-1772，(2005年3月)。實(shí)施例19說(shuō)明BaeR的過表達(dá)可導(dǎo)致莫納甜排出增多。
·marR發(fā)生突變可導(dǎo)致acrAB基因表達(dá)升高。(Ma，D.等，“基因acrA和acrB編碼大腸桿菌的應(yīng)激誘導(dǎo)流出系統(tǒng)(Genes acrA and acrB encode a stress-inducedefflux system of E.coli)”，Mol.Microbiol.1645-55，(1995))和在攜帶多拷貝質(zhì)粒表達(dá)marA的菌株內(nèi)。Miller，P.F.和Sulavik，M.C，“大腸桿菌內(nèi)在的多抗生素耐藥性調(diào)節(jié)的重疊與平行(Overlaps and parallels in the regulation ofintrinsic multiple-antibiotic resistance in Escherichia coli)”，Mol.Microbiol.21441-448(1996)。因此，marA基因的過表達(dá)或marR基因的滅活可導(dǎo)致AcrAB轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)表達(dá)升高。
·MarA、SoxS和SidA(轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子XylS/AraC家族的成員)是通用調(diào)節(jié)因子，可活化AcrAB轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的表達(dá)。AcrAB和其他三個(gè)參與多藥耐藥的大腸桿菌基因(和莫納甜轉(zhuǎn)運(yùn)的候選者)tolC、acrEF和acrD還可被SdiA活化。Baranova，N.和Nikaido，H.，“baeSR兩組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)活化大腸桿菌內(nèi)yegMNOB(mdtABCD)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因簇的轉(zhuǎn)錄并且提高其對(duì)新生霉素和脫氧膽酸的耐藥性(The baeSR two-component regulatory system activates transcriptionof the yegMNOB(mdtABCD)transporter gene cluster in Escherichia coli andincreases its resistance to novobiocin and deoxycholate)”，J.Bacteriol.1844168-4176，(2002)。實(shí)施例18說(shuō)明MarA的過表達(dá)可導(dǎo)致莫納甜排出增多。
根據(jù)一些實(shí)施方式，與AcrAB高度同源因而預(yù)計(jì)可分泌莫納甜的泵AcrEF的活性升高可通過如下修飾來(lái)實(shí)現(xiàn) ·含有推測(cè)啟動(dòng)子序列的插入元件IS1和IS10的存在可導(dǎo)致這些插入突變體內(nèi)acrF的表達(dá)升高8到10倍，因此可增強(qiáng)AcrEF的活性并且可能提高能產(chǎn)生莫納甜的宿主內(nèi)的莫納甜的轉(zhuǎn)運(yùn)。Olliver A.等，“在腸沙門氏菌血清型typhimurium DT204 acrB突變株內(nèi)通過IS1或IS10元件的插入活化使多藥流出操縱子acrEF過表達(dá)并用氟奎諾酮篩選(Overexpression of the multidrug effiuxoperon acrEF by insertional activation with IS1 or IS10 elements in Salmonellaenterica serovar typhimurium DT204 acrB mutants selected withfluoroquinolones)”，AntimicrobAgents Chemother.49289-301(2005年1月)。在不同情況下，acrEF操縱子上游有IS1或IS2插入的大腸桿菌菌株可產(chǎn)生高水平的AcrE和AcrF蛋白。Kobayashi K.等，“大腸桿菌acrB突變體對(duì)有機(jī)溶劑的超敏反應(yīng)可被IS1或IS2元件對(duì)acrEF操縱子的插入活化所抑制(Suppressionof hypersensitivity of Escherichia coli acrB mutant to organic solvents byintegrational activation of the acrEF operon with the IS1 or IS2 element)”，JBacteriol.1832646-2653(2001)。上述實(shí)施例描述了過表達(dá)AcrEF轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的某些方式，該轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)因?yàn)榕cAcrAB轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)高度同源因此能夠轉(zhuǎn)運(yùn)莫納甜； ·EnvR(以前被稱為envCD)是acrEF操縱子的轉(zhuǎn)錄抑制因子。因而，非功能性的EnvR調(diào)節(jié)因子可增強(qiáng)acrEF的轉(zhuǎn)錄。AcrEF的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)可導(dǎo)致AcrEF轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的過表達(dá)，該轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)因?yàn)榕cAcrAB轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)高度同源因此能夠轉(zhuǎn)運(yùn)莫納甜； 根據(jù)一些實(shí)施方式，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性升高可通過如下方法實(shí)現(xiàn)過表達(dá)RND家族多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的外膜因子組分，如TolC；在野生型形式表達(dá)TolC的生物體內(nèi)過表達(dá)能與TolC協(xié)作因而能形成功能性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的其他轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)組分；或者其組合。能與TolcC協(xié)作的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)組分可以是未經(jīng)過基因修飾的。本領(lǐng)域所熟知的用于篩選微生物是否存在功能性TolC的任何方法都可以使用。見，例如，Werner，J.等，“大腸桿菌K-12的一個(gè)結(jié)構(gòu)獨(dú)特且具有多種功能的外膜蛋白TolC的裝配(Assembly of TolC，a structurally unique and multifunctional outer membrane proteinof Escherichia coliK-12)”，J.Bact.1856540-6547(2003)。另外，實(shí)施例5描述了能用于克隆和過表達(dá)TolC的方法，但是本領(lǐng)域所熟知的任何方法都可以使用。實(shí)施例6證明TolC的過表達(dá)可增加莫納甜的分泌。由于TolC可與幾種不同的流出泵協(xié)調(diào)發(fā)揮功能，因此TolC的過表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性升高，其水平大于通過過表達(dá)差異水平更大的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的其他組分而產(chǎn)生的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性升高的水平。
TolC依賴性機(jī)制普遍存在病毒蛋白和抗菌藥物的排出途徑。Koronakis，V.，“TolC-細(xì)菌排出蛋白和藥物的通道(TolC--the bacterial exit duct for proteins anddrugs)”，F(xiàn)EBSLett.55566-71，(2003)。根據(jù)實(shí)施例6的結(jié)果，能夠產(chǎn)生莫納甜并且含有能與TolC協(xié)同工作的流出泵/轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(例如AcrAB和EmrAB)的任何宿主菌株都可能表現(xiàn)出因TolC通道的存在量增加而發(fā)生莫納甜的轉(zhuǎn)運(yùn)增多。這種其他轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的非限制性例子包括 ·霍亂弧菌(Vibrio cholerae)內(nèi)由rtxB、rtxD、rtxE和tolC編碼的四組分I型分泌系統(tǒng)(TISS)。Boardman，B.K.和Satchell，K.J.，“非典型性的I型分泌系統(tǒng)發(fā)生突變的霍亂弧菌菌株可在細(xì)胞內(nèi)積聚RTX毒素(Vibrio cholerae strainswith mutations in an atypical type I secretion system accumulate RTX toxinintracellularly)”，J Bacteriol.1868137-8143，(2004)。
·EmrKY和YhiUV是活性需要TolC的三組分流出泵。Fralick，J.A.，“大腸桿菌Mar/AcrAB流出泵發(fā)揮功能需要TolC的現(xiàn)象(Evidence that TolC isrequired for functioning of the Mar/AcrAB efflux pump of E.coli.)”，J.Bact.1785803-5805，(1996)；Nishino，K.和Yamaguchi，A.，“二組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的EvgA可調(diào)節(jié)大腸桿菌內(nèi)YhiUV多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的合成(EvgA of thetwo-component signal transduction system modulates production of the YhiUVmultidrug transport in Escherichia coli)”，J.Bact.1842319-2323，(2002)。
同樣，TolC同源物還可以和AcrAB系統(tǒng)協(xié)作以改善莫納甜的生產(chǎn)速度或產(chǎn)量。TolC家族成員之間的全面比較證明其特征性的結(jié)構(gòu)元件是保守的。這強(qiáng)烈暗示所有同源物都具有相似的折疊和特性。TolC同源物之間關(guān)鍵結(jié)構(gòu)氨基酸的保守性確立了包含TolC家族蛋白的輸出和流出系統(tǒng)的通用機(jī)制。據(jù)報(bào)道，人們可以肯定運(yùn)輸通道的核心功能在所有革蘭氏陰性細(xì)菌中都是一樣的。Andersen，C.等，“通道景象。通過細(xì)菌運(yùn)輸通道輸出和外排(Chunnel vision.Export and effiux throughbacterial channel-tunnels)”，EMBO Rep.1313-8，(2000)?？捎糜谀{甜分泌的同源物的非限制性例子還包括 ·在超過30種細(xì)菌內(nèi)有將近100個(gè)同源物符合TolC家族成員在革蘭氏陰性細(xì)菌中間是廣泛存在的這一報(bào)道。Dinh，T.等，“允許大分子通過革蘭氏陰性細(xì)菌外膜的細(xì)胞質(zhì)外蛋白家族(A family of extracytoplasmic proteins that allowtransport of large molecules across the outer membranes of gram-negativebacteria)”，J Bacteriol.1763825-3831，(1994)；Andersen，C.等，“通道景象。
通過細(xì)菌運(yùn)輸通道輸出和外排(Chunnel vision.Export and effiux throughbacterial channel-tunnels)”，EMBO Rep.1313-8，(2000)。
·大腸桿菌基因組編碼三個(gè)tolC同源物和ABC、MFS(EmrAB)和RND(AcrAB)家族的約30個(gè)內(nèi)膜移位酶。
·綠膿假單孢菌具有4個(gè)主要的流出(Mex)系統(tǒng)和RNA質(zhì)子反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及三種TolC同源物OprM、OprJ和OprN中的一種。這些現(xiàn)象與報(bào)道過的細(xì)菌有幾種TolC同源物的實(shí)時(shí)相符合，其中TolC同源物與多種流出泵平行發(fā)揮功能，這些流出泵具有較廣的并且有時(shí)是重疊的特性。Koronakis V.等，“TolC的結(jié)構(gòu)和功能細(xì)菌排出蛋白和藥物的通道(Structure and function of TolCthebacterial exit duct for proteins and drugs)”，Annu Rev Biochem.73467-489，(2004)。
·參與藥物流出(以及可能參與莫納甜流出)的某些TolC同源物是FusA、OprA、OpcM、NodT3、NodT2、NodT1、SmeC、SrpC、TtgC、MtrE。Andersen，C.等，“通道景象。通過細(xì)菌運(yùn)輸通道輸出和外排(Chunnel vision.Export andefflux through bacterial channel-tunnels)”，EMBO Rep.1313-8，(2000)。
TolC的活性還可以被提高以增強(qiáng)莫納甜的分泌。增強(qiáng)TolC活性的可能方法的非限制性例子包括 ·利用MarA上調(diào)TolC。大腸桿菌和沙門氏菌的多抗生素耐藥(mar)基因座可能是描述最詳細(xì)的參與MarA誘導(dǎo)的這類耐藥的例子，MarA是由marRAB基因座編碼的活化蛋白。據(jù)報(bào)道，mar基因座主要通過AcrAB-TolC流出泵上調(diào)某些抗生素、消毒劑和有機(jī)溶劑的流出來(lái)介導(dǎo)耐藥性。Randall，L.P.和Woodward，M.J.，“多抗生素耐藥(mar)基因座及其意義(The multiple antibioticresistance(mar)locus and its significance)”，Res Vet Sci.7287-93，(2002)。
·除了MarA之外，Rob或SoxS也可上調(diào)TolC水平。在The tolC基因上游可能存在一個(gè)mar-rob-sox盒序列。有機(jī)溶劑耐藥水平升高的大腸桿菌突變株具有高水平的外膜蛋白ToLC和內(nèi)膜蛋白AcrA。Aono，R.等，“mar-sox調(diào)節(jié)子的一個(gè)可能成員-外膜蛋白TolC參與大腸桿菌K-12對(duì)有機(jī)溶劑耐受的維持和上升(Involvement of outer membrane protein TolC，a possible member of themar-sox regulon，in maintenance and improvement of organic solvent tolerance ofEscherichia coli K-12)”，J Bacteriol.180938-944(1998)。
·RamA是一種能夠增強(qiáng)marA轉(zhuǎn)錄然后導(dǎo)致tolC過表達(dá)的調(diào)節(jié)蛋白。Chollet，R.等，“RamA是產(chǎn)氣腸桿菌內(nèi)多藥耐藥級(jí)聯(lián)的另一個(gè)活化因子(RamA is analternate activator of the multidrug resistance cascade in Enterobacteraerogenes)”，Antimicrob Agents Chemother.482518-2523，(2004)。實(shí)施例17說(shuō)明RamA的過表達(dá)可導(dǎo)致莫納甜分泌的增加。
根據(jù)一些實(shí)施方式，增加轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性可通過將表達(dá)能夠分泌莫納甜的泵的微生物暴露于誘導(dǎo)化合物(即，可激發(fā)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)或其組分表達(dá)的化合物)來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如，可使表達(dá)AcrAB系統(tǒng)的微生物暴露于癸酸鈉或水楊酸。實(shí)施例1證明癸酸鈉可用于誘導(dǎo)AcrAB泵分泌莫納甜。另一個(gè)例子是，可使表達(dá)EmrAB系統(tǒng)的微生物在其生長(zhǎng)培養(yǎng)基中暴露于羰基氰3-氯苯腙(“CCCP”)。實(shí)施例2證明CCCP可誘導(dǎo)莫納甜轉(zhuǎn)運(yùn)增加。實(shí)施例14證明水楊酸可誘導(dǎo)莫納甜轉(zhuǎn)運(yùn)增加。
AcrAB的其他潛在誘導(dǎo)子包括而不限于 ·植物抗毒素是AcrAB轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的誘導(dǎo)子。Burse，A.等，“植物抗毒素可誘導(dǎo)的多藥流出泵AcrAB對(duì)火疫病原體解淀粉歐文氏菌的毒力有貢獻(xiàn)(Thephytoalexin-inducible multidrug efflux pump AcrAB contributes to virulence in thefire blight pathogen，Erwinia amylovora)”，Mol Plant Microbe Interact.1743-54，(2004)。
·限制作為AcrAB轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)過表達(dá)誘導(dǎo)條件的營(yíng)養(yǎng)素如葡萄糖、鐵或氮。據(jù)報(bào)道，acrAB是作為大腸桿菌在分批培養(yǎng)和恒化培養(yǎng)期間的生長(zhǎng)速率功能來(lái)調(diào)節(jié)的。在恒化培養(yǎng)中，無(wú)論是否限制營(yíng)養(yǎng)素，acrAB都與生長(zhǎng)速率負(fù)相關(guān)。與限制鐵或氮相比，在限制葡萄糖的條件下acrAB的表達(dá)都要高。acrAB轉(zhuǎn)錄的慢生長(zhǎng)速率調(diào)節(jié)不需要靜止期σ因子的存在。在acrAB啟動(dòng)子的-10區(qū)有一個(gè)推測(cè)的變速箱共有序列。Rand，J.D.等，“多藥流出基因acrAB的表達(dá)升高發(fā)生在大腸桿菌的緩慢生長(zhǎng)期/靜止期(Increased expression of the multidrug effluxgenes acrAB occurs during slow growth/stationary phase of Escherichia coli)”，F(xiàn)EMS Microbiol Lett.20791-95(2002)。
·RobA是DNA結(jié)合蛋白XylS/AraC亞科的成員，可活化AcrAB轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。當(dāng)robA過表達(dá)時(shí)，可以誘導(dǎo)大腸桿菌產(chǎn)生多抗生素耐藥。據(jù)報(bào)道，RobA過表達(dá)所誘導(dǎo)的多抗生素耐藥主要依賴于AcrAB流出的活化以及micF的活化。Tanaka，T.等，“RobA誘導(dǎo)的多抗生素耐藥主要依賴于AcrAB流出的活化(RobA-induced multiple antibiotic resistance largely depends on the activation ofthe AcrAB efflux)”，Microbiol Immunol.41697-702，(1997)。實(shí)施例6說(shuō)明RobA的過表達(dá)可導(dǎo)致莫納甜的排出。
·cysH、icdA(異檸檬酸脫氫酶)、metE或purB(腺苷酸琥珀酸裂解酶)突變可導(dǎo)致AcrAB轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的活化。據(jù)報(bào)道，當(dāng)用低水平的萘啶酸在營(yíng)養(yǎng)素平板上篩選大腸桿菌和其他細(xì)菌的突變株時(shí)，不同基因位點(diǎn)上的突變可導(dǎo)致耐藥。在轉(zhuǎn)座誘導(dǎo)文庫(kù)中約有10％的萘啶酸耐藥(Nalr)突變株表現(xiàn)出需要生長(zhǎng)因子，這是cysH、icdA(異檸檬酸脫氫酶)、metE或purB(腺苷酸琥珀酸裂解酶)突變的結(jié)果。所有這些突變株的耐藥性都需要功能性的AcrAB-TolC流出泵。AcrAB的轉(zhuǎn)錄在每一種類型的Nal(r)突變株中都有升高。在icdA和purB突變株中，每一個(gè)已知的信號(hào)途徑都可用于活化AcrAB-TolC泵。由突變引起的代謝物在上游積聚而造成的阻塞可提高AcrAB-TolC泵的水平，從而能夠從生物中去除萘啶酸。Helling等，“大腸桿菌內(nèi)的毒性廢物處理(Toxic waste disposal inEscherichia coli)”，J Bacteriol.1843699-3703，(2002)。上述每個(gè)突變株都能夠在產(chǎn)生莫納甜的宿主菌株內(nèi)制備以便于通過AcrAB轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白增加莫納甜的轉(zhuǎn)運(yùn)。實(shí)施例23說(shuō)明刪除cysH基因可導(dǎo)致莫納甜產(chǎn)量增加。
·水楊酸至少通過兩種機(jī)制誘導(dǎo)AcrAB-TolC流出泵，其中一個(gè)包括Mar。Cohen，S.P.等，“水楊酸在大腸桿菌中誘導(dǎo)抗生素耐藥mar操縱子的活化和mar無(wú)關(guān)途徑(Salicylate induction of the antibiotic resistance in Escherichia coliactivation of the mar operon and mar-independent pathway)”，J.Bacteriol.1757856-7862，(1993)。
·幾種通用應(yīng)激信號(hào)如4％乙醇、脂肪酸樣癸酸或高滲介質(zhì)(0.4M NaCl)可增強(qiáng)AcrAB轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的表達(dá)。因此人們可以利用環(huán)境條件間接影響AcrAB轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的表達(dá)。Ma D等，“革蘭氏陰性菌中的流出泵和藥物耐受(Efflux pumps anddrug resistance in gram-negative bacteria)”，Trends Microbiol.2489-493(1994)。
·本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的一種增加參與莫納甜轉(zhuǎn)運(yùn)的基因表達(dá)水平的通用方法可增加基因的拷貝數(shù)。這可通過用用攜帶所需轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的載體/質(zhì)粒轉(zhuǎn)化合適的能夠轉(zhuǎn)運(yùn)莫納甜的宿主微生物來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中所需基因連接到載體的調(diào)節(jié)元件上。這種含轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白/轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白組分基因的載體可使宿主微生物過表達(dá)各自的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或組分。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式包含在谷氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型生產(chǎn)莫納甜，谷氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型是一種因發(fā)生突變而失去合成谷氨酸的能力的生物。不被現(xiàn)有理論所束縛，發(fā)明者假設(shè)用于分泌谷氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也可以分泌莫納甜。谷氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型可能還含有谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，但是因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)有過多的碳源可以用來(lái)制備莫納甜(因?yàn)樗皇潜幌挠糜诤铣晒劝彼?和/或因?yàn)闆]有谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白競(jìng)爭(zhēng)谷氨酸，因此谷氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型適用于生產(chǎn)和分泌莫納甜。
Eikmanns，B.J.等“編碼異檸檬酸脫氫酶的棒狀桿菌谷氨酸基因的克隆、序列分析和滅活以及該酶的生化特征(Cloning，sequence analysis，and inactivation of theCorynebacterium glutamicum icd gene encoding isocitrate dehydrogenase andbiochemical characterization of the enzyme)”，J Bacteriol.，177774-782，(1995)提供了一種制備谷氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的方法。然而，本領(lǐng)域所熟知的任何方法都可以使用。
實(shí)施例8提供了一個(gè)宿主菌株的例子-已被突變成谷氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的谷氨酸棒狀桿菌ATCC菌株13032，該實(shí)施例證明該菌株中莫納甜的排出增多。實(shí)施例9提供了一個(gè)菌株的例子，大腸桿菌谷氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型(icdA缺陷型)，預(yù)計(jì)該菌株具有莫納甜排出增加的潛能。
需要注意的是適于生產(chǎn)莫納甜的谷氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型可與一種或多種其他方法組合以提供莫納甜的分泌從而進(jìn)一步提高莫納甜的轉(zhuǎn)運(yùn)。用生產(chǎn)莫納甜所需的基因轉(zhuǎn)化谷氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型(用滅活的icd基因)，結(jié)合其他預(yù)計(jì)或顯示可增加莫納甜產(chǎn)量和/或轉(zhuǎn)運(yùn)的處理和細(xì)胞修飾可進(jìn)一步增加莫納甜的產(chǎn)量/轉(zhuǎn)運(yùn)。例如，將谷氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型暴露于AcrAB和/或EmrAB轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白誘導(dǎo)子；或者將谷氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型進(jìn)行改造以使其過表達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白組分如TolC；或者改變發(fā)酵培養(yǎng)基組分使其包含去污劑如吐溫20/40/60和/或氨芐青霉素(10μg/mL)；或其組合。
根據(jù)本發(fā)明，用于分泌莫納甜的另一個(gè)實(shí)施方式包括基因修飾能夠轉(zhuǎn)位谷氨酸或氧代戊二酸以交換蘋果酸的微生物使其能夠生產(chǎn)莫納甜。一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方式包括在這種微生物內(nèi)生產(chǎn)莫納甜，其中的生物還可以經(jīng)過基因修飾以使其稱為谷氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型。實(shí)施例10說(shuō)明使用微生物能夠在生產(chǎn)莫納甜時(shí)用谷氨酸(gluatamate)交換蘋果酸。
不受現(xiàn)有理論的束縛，莫納甜具有谷氨酸主鏈，或者被認(rèn)為是4-取代谷氨酸衍生物。因此莫納甜可被轉(zhuǎn)位谷氨酸以交換底物如蘋果酸的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)菌細(xì)胞。阿布屬質(zhì)粒中的谷氨酸/蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是由DiT2基因編碼的，可以反向轉(zhuǎn)運(yùn)的方式轉(zhuǎn)位谷氨酸和蘋果酸。Renne，P.等，“阿布屬突變株dct是質(zhì)粒谷氨酸/蘋果酸轉(zhuǎn)位子DiT2缺陷的(The Arabidopsis mutant dct is deficient in the plastidicglutamate/malate translocator DiT2)”，Plant J.35316-331，(2003)；Taniguchi，M.等，“擬南芥內(nèi)質(zhì)粒2-氧代戊二酸/蘋果酸和二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的鑒定和特征(Identifying and Characterizing Plastidic 2-Oxoglutarate/Malate and DicarboxylateTransporters in Arabidopsis thaliana)”，Plant and Cell Physiology 43706-717，(2002)。谷氨酸/蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族與菠菜光合小體中的2-氧代戊二酸/蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同源的，與大腸桿菌內(nèi)的CitT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)，被認(rèn)為是檸檬酸和琥珀酸的反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。Pos，K.M.等，“大腸桿菌檸檬酸載體CitT與菠菜光合小體來(lái)源的2-氧代戊二酸/蘋果酸轉(zhuǎn)位分子相關(guān)的新型真細(xì)菌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的一個(gè)成員(TheEscherichia coli Citrate Carrier CitTa Member of a Novel Eubacterial TransporterFamily Related to the 2-Oxoglutarate/Malate Translocator from SpinachChloroplasts)”，Journal of Bacteriology 1804160-4165，(1998)。有一種可能是這個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可允許宿主攝取蘋果酸，同時(shí)排出谷氨酸或莫納甜進(jìn)入上清。蘋果酸發(fā)揮增強(qiáng)莫納甜轉(zhuǎn)運(yùn)的功能的另一種可能是由于蘋果酸可作為替代碳源來(lái)影響生長(zhǎng)速度和碳在代謝途徑中的分布，這種代謝途徑與葡萄糖明顯不同。蘋果酸還可以被兩個(gè)基因編碼的蘋果酸酶內(nèi)在轉(zhuǎn)化成丙酮酸(Fischer，E.和Sauer，U.，“利用GC-MS研究大腸桿菌突變株在中央碳代謝中的代謝流通特征(Metabolic fluxprofiling of Escherichia coli mutants in central carbon metabolism using GC-MS)”，Eur.J.Biochem.270880-891，(2003))，以及由于丙酮酸是莫納甜的一個(gè)前體，因此更高的丙酮酸利用度可使莫納甜的產(chǎn)量增加，進(jìn)而莫納甜的分泌增多(見在微生物中誘導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以去除積聚的代謝物的其他參考文獻(xiàn))。以蘋果酸作為主要碳源的大腸桿菌的生長(zhǎng)可使分泌到介質(zhì)如培養(yǎng)基中的莫納甜增多。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，莫納甜的產(chǎn)量可被溫度和/或一種或多種其他化合物的處理所影響，如那些干擾細(xì)胞膜的化合物(氨芐青霉素和吐溫)。另外，通過選擇最佳溫度和/或用一種或多種其他化合物處理來(lái)增加莫納甜從微生物的流出，如那些干擾細(xì)胞膜的化合物(氨芐青霉素和吐溫)?？僧a(chǎn)生這些效應(yīng)的合適化合物的例子包括乙胺丁醇、氨芐青霉素、吐溫和/或生物素。例如，實(shí)施例20說(shuō)明溫度升高以及提供給谷氨酸棒狀桿菌細(xì)胞的丙酮酸鈉的量增加可導(dǎo)致莫納甜流出增多。另外，實(shí)施例21說(shuō)明單獨(dú)用氨芐青霉素處理或者和生物素組合在一起處理可導(dǎo)致莫納甜的流出增多。另外，實(shí)施例22證明用乙胺丁醇單獨(dú)處理或者用乙胺丁醇組合吐溫和氨芐青霉素處理可對(duì)棒狀桿菌科的莫納甜流出產(chǎn)生正面影響。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式包括在微生物中生產(chǎn)莫納甜，其中微生物因不表達(dá)某些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白而被篩選出來(lái)，或者經(jīng)過改造使其不表達(dá)某些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。實(shí)施例11證明缺乏某些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-被鑒定為YhcP(AaeB)、YccS、YjcQ和YhfK的四種推測(cè)的流出轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-會(huì)導(dǎo)致莫納甜的產(chǎn)量增加。如果不被現(xiàn)有理論所束縛，可以認(rèn)為某些泵還可以利用生產(chǎn)莫納甜的通路轉(zhuǎn)運(yùn)形成的中間體，這些中間體的排出可導(dǎo)致莫納甜合成速度變慢或下降。因此，缺少這些泵可導(dǎo)致莫納甜的合成速度變快或升高。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式包括在微生物中生產(chǎn)莫納甜，其中微生物經(jīng)過改造后具有經(jīng)修飾的細(xì)胞被膜，例如，經(jīng)過改造缺乏或抑制分支菌酸(mycoloic acid)的微生物。如果不被現(xiàn)有理論所束縛，可以認(rèn)為這種方法可使莫納甜流出增多，因?yàn)橥饽ねㄍ感云琳媳蝗趸８唧w的是，發(fā)現(xiàn)棒狀桿菌屬(Corynebacterineae)的細(xì)胞被膜的主要脂質(zhì)成分分枝菌酸被發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞壁的阿拉伯半乳糖或酯化的海藻糖和甘油共價(jià)相連。含分支菌酸的組分被認(rèn)為在這種細(xì)胞包被的結(jié)構(gòu)和功能中扮演關(guān)鍵角色，主要因?yàn)樗鼈儽黄渌|(zhì)有機(jī)化而形成了流動(dòng)性極低的外膜通透性屏障，該屏障使這些細(xì)菌的通透性極低；這可以解釋分枝桿菌對(duì)許多抗生素內(nèi)在的耐藥性。Kacem，R.等，“分支菌酸轉(zhuǎn)移酶在谷氨酸棒狀桿菌生理中的重要性(Importance of mycoloyltransferases on the physiology of Corynebacteriumglutamicum)”，Microbiology 15073-84，(2004)。
微生物所產(chǎn)生的莫納甜在其被分泌后可從介質(zhì)中收集。另外，微生物所產(chǎn)生的莫納甜在其被分泌后可從介質(zhì)中分離。分離方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，用于從發(fā)酵介質(zhì)中分離有機(jī)酸，該方法通常依賴于色譜方法和/或提取。莫納甜與谷氨酸類似。用于從發(fā)酵培養(yǎng)基中純化谷氨酸的許多方法都是本領(lǐng)域所熟知的。以前已經(jīng)公開了從復(fù)雜生物介質(zhì)中分離莫納甜的描述(見WO03091396實(shí)施例6)?？捎糜趶慕橘|(zhì)中收集和/或分離莫納甜的方法的一個(gè)例子是在低pH條件下利用強(qiáng)陽(yáng)離子交換層析，如Bio-Rad的AG50WX-8樹脂(H型)。在這種方法中，化合物莫納甜的氨基是帶電荷的，可與樹脂結(jié)合。任何被污染的有機(jī)酸都不能與樹脂結(jié)合，在低pH條件下會(huì)流過樹脂。然后在中性pH條件下利用陰離子交換層析如DEAE樹脂將氨基酸彼此分開(如從丙氨酸和莫納甜中分離色氨酸)。
下面的實(shí)施例有意幫助普通技術(shù)人員實(shí)施、利用和/或理解本發(fā)明。這些實(shí)施例并不意味著以任何方式限制本公開的范圍。例如，用于實(shí)施例中的莫納甜主要是S，S莫納甜。然而，實(shí)施例中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的特異性預(yù)計(jì)不是基于轉(zhuǎn)運(yùn)分子的手性確定的。因此，被證明可轉(zhuǎn)運(yùn)S，S莫納甜的系統(tǒng)應(yīng)該能夠有效轉(zhuǎn)運(yùn)莫納甜的所有四種立體異構(gòu)體(stereoismer)。
實(shí)施例 實(shí)施例1 誘導(dǎo)AcrAB流出泵以增加莫納甜的轉(zhuǎn)運(yùn) 大腸桿菌的AcrAB TolC系統(tǒng)是一種由胞漿膜組分/質(zhì)子反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AcrB和胞質(zhì)輔助蛋白AcrA所組成的多藥流出泵。AcrA和AcrB的登錄號(hào)是AcrA(蛋白質(zhì)，NP_414996，DNA，NC_000913)和AcrB(蛋白質(zhì)，NP_414995，DNA，NC_000913)。細(xì)胞利用這個(gè)系統(tǒng)泵出各種抗微生物化合物，其中包括抗生素、去污劑、染料和有機(jī)溶劑，使其通過外膜通道TolC直接進(jìn)入介質(zhì)。通過加入癸酸鈉可誘導(dǎo)AcrAB基因。Zgurskaya，H.I.和Nikaido，H.，Proc Natl Acad Sci USA 967190-7195，(1999)。
已進(jìn)行的一項(xiàng)有關(guān)大腸桿菌BL21 DE3的初步研究證明2.5mM癸酸鈉加入到介質(zhì)內(nèi)可導(dǎo)致對(duì)80-160μg/ml的新生霉素耐受。這是因?yàn)閍crAB基因被加入的癸酸鈉誘導(dǎo)，并賦予對(duì)新生霉素的耐藥性。Rosenberg，E.Y.等，Molecular Microbiol.481609-1619，(2003)。
用于本試驗(yàn)的微生物菌株是大腸桿菌BL21(DE3)::aspC/proA/pET32(WO030913961。符號(hào)::代表“轉(zhuǎn)化的”，這是本領(lǐng)域所熟知的。實(shí)施例12提供了一個(gè)用于轉(zhuǎn)化微生物的非限制性的典型方法。為了進(jìn)行接種，大腸桿菌菌株在含100μg/mL氨芐青霉素的Luria-Bertani(″LB″)培養(yǎng)基內(nèi)、37℃、250rpm振蕩培養(yǎng)過夜。為了進(jìn)行試驗(yàn)處理，按照如下方法制備用于提高色氨酸在大腸桿菌內(nèi)的產(chǎn)量的基本培養(yǎng)基Trp-1+葡萄糖培養(yǎng)基(Zeman等，F(xiàn)olia Microbiol.35200-204，(1990))。向800mL納米純的水中加入下列試劑2g(NH4)2SO4和13.6g KH2PO4。PH調(diào)至7.0，體積增加到948mL，并對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行高壓滅菌。滅菌后在1.8mL體積的培養(yǎng)基中加入0.2g MgSO4*7H2O、0.01g CaCl2*2H2O和0.5mg FeSO4*7H2O，然后加入0.2mL Neidhardt微量營(yíng)養(yǎng)素溶液。Neidhardt，F(xiàn).C.等，“腸道細(xì)菌培養(yǎng)基(Culturemedium for Enterobacteria)”，J.Bacteriol.119736-746(1974)。Neidhardt培養(yǎng)基包含(每升)0.18g(NH4)6(MO7)24-4H2O、1.24g H3BO3、0.36g CoCl2-6H2O、0.12gCuSO4(無(wú)水的)、0.8g MnCl2-4H2O和0.14g ZnSO4-7H2O。單獨(dú)制備50％的葡萄糖溶液并通過過濾除菌。將40mL葡萄糖溶液和10mL 1M 3-嗎啉代丙磺酸(“MOPS”)緩沖液加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基(950mL)中，最后體積為1L。將2-5v/v％大腸桿菌接種物加入到含100μg/mL氨芐青霉素的在500mL帶擋板搖瓶?jī)?nèi)的100mL培養(yǎng)基中。搖瓶在37℃孵育，以250rpm振蕩直到進(jìn)行誘導(dǎo)。在0.6OD600nm時(shí)，開始利用0.5mM IPTG誘導(dǎo)pET32載體上的莫納甜操縱子基因(aspC和proA)。在誘導(dǎo)時(shí)加入0.5mM維生素B6和0.2mL Balch維生素(Balch，W.E.等，“產(chǎn)甲烷菌對(duì)獨(dú)特生物群的重新評(píng)價(jià)(Methanogensreevaluation of a unique biological group)”，Microbiol.Rev.43260-296，(1979))，在誘導(dǎo)后孵育溫度要低于30℃。在開始誘導(dǎo)后3.5小時(shí)加入1gL-色氨酸、5g/L丙酮酸鈉、0.04mM吡哆醛-5’-磷酸(“PLP”)和0.2％吐溫20(聚氧乙烯20-失水山梨糖醇單月桂酸酯)。一些處理包括在誘導(dǎo)開始后3.5小時(shí)加入2.5mM癸酸鈉。在24和30小時(shí)采集用于莫納甜分析和確定細(xì)胞干重的樣品。按照實(shí)施例13所描述的進(jìn)行莫納甜分析。
表1.1 大腸桿菌所流出的莫納甜/細(xì)胞干重 莫納甜/dcw＝莫納甜(mg)/dcw(g) 表1.2 大腸桿菌所流出的平均莫納甜/細(xì)胞干重 莫納甜/dcw＝莫納甜(mg)/dcw(g) n＝3 通過用2.5mM能誘導(dǎo)AcrAB流出系統(tǒng)的癸酸鈉處理大腸桿菌BL21(DE3)::aspC/proA/pET32可以觀察到分泌的莫納甜/細(xì)胞干重(“dcm”)增加了9倍多(莫納甜(mg)/dcw(g)為14.6-1.58或15.2-1.57)。因此通過開啟或上調(diào)AcrAB流出系統(tǒng)的表達(dá)可以增加莫納甜的排出。當(dāng)暴露于合適的誘導(dǎo)物時(shí)，AcrAB轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)同源物也可以增加莫納甜的轉(zhuǎn)運(yùn)。
實(shí)施例2 誘導(dǎo)EmrAB流出泵可增加莫納甜的轉(zhuǎn)運(yùn)-大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌多藥流出泵EmrB流出泵是由emrB基因編碼的(GenBank登錄號(hào)NP_417171，DNA NC_000913)。Lomovskaya，O.和Lewis，K，“emr，負(fù)責(zé)多藥耐藥的大腸桿菌基因座(emr，an E.coli locus for multidrug resistance)”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA898938-8942，(1992)。通過向生長(zhǎng)/發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)加入誘導(dǎo)子羰基氰3-氯(″CCCP″)可上調(diào)emrB基因。Lomovskaya O.等，“大腸桿菌mcb和emr操縱子的差異調(diào)節(jié)mcb在多藥耐藥中的作用(Differential regulation of the mcb and emr operons of E.coliRole of mcb in multidrug resistance)”，Antimicrob Agents Chemother.401050-1052，(1996)。這個(gè)實(shí)施例說(shuō)明莫納甜流出增多是CCCP出來(lái)的結(jié)果。
用于本試驗(yàn)的菌株是大腸桿菌MG1655::aspC/proA/pProNde和大腸桿菌BL21(DE3)::aspC/proA/pET30。為了進(jìn)行接種，大腸桿菌菌株在含50μg/mL卡那霉素的Luria-Bertani(″LB″)培養(yǎng)基內(nèi)、37℃、250rpm振蕩培養(yǎng)過夜。
為了進(jìn)行試驗(yàn)處理，按照如下方法制備用于提高色氨酸在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的產(chǎn)量的基本培養(yǎng)基Trp-1+葡萄糖培養(yǎng)基(Zeman等，F(xiàn)olia Microbiol.35200-204，(1990))。向800mL納米純的水中加入下列試劑2g(NH4)2SO4和13.6g KH2PO4。PH調(diào)至7.0，體積增加到948mL，并對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行高壓滅菌。滅菌后在1.8mL體積的培養(yǎng)基中加入0.2g MgSO4*7H2O、0.01g CaCl2*2H2O和0.5mg FeSO4*7H2O，然后加入0.2mL Neidhardt微量營(yíng)養(yǎng)素溶液。Neidhardt，F(xiàn).C.等，“腸道細(xì)菌培養(yǎng)基”，J.Bacteriol.119736-746(1974)。Neidhardt培養(yǎng)基包含(每升)0.18g(NH4)6(MO7)24-4H2O、1.24g H3BO3、0.36g CoCl2-6H2O、0.12g CuSO4(無(wú)水的)、0.8g MnCl2-4H2O和0.14g ZnSO4-7H2O。單獨(dú)制備50％的葡萄糖溶液并通過過濾除菌。將40mL葡萄糖溶液和10mL 1M 3-嗎啉代丙磺酸(“MOPS”)緩沖液加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基(950mL)中，最后體積為1L。
為了處理，將2-5v/v％接種物加入到含50μg/mL卡那霉素的在500mL帶擋板搖瓶?jī)?nèi)的100mL培養(yǎng)基中。處理?xiàng)l件包括以250rpm振蕩，在37℃孵育直到進(jìn)行誘導(dǎo)，然后30℃孵育，隨后進(jìn)行誘導(dǎo)。在0.5-0.6OD600nm時(shí)，開始質(zhì)?；虻恼T導(dǎo)。在誘導(dǎo)時(shí)，加入0.5mM IPTG、0.5mM維生素B6和0.2mL Balch維生素。在開始誘導(dǎo)后3.5小時(shí)加入1gL-色氨酸、5g/L丙酮酸鈉、0.04mM吡哆醛-5’-磷酸(“PLP”)和0.2％吐溫20(聚氧乙烯20-失水山梨糖醇單月桂酸酯)。一種處理包括在誘導(dǎo)開始后3.5小時(shí)再加入10μM CCCP。CCCP可誘導(dǎo)EmrB流出系統(tǒng)。在10、15.5、25.6和31小時(shí)采集用于莫納甜分析和確定細(xì)胞干重的樣品。按照實(shí)施例13所描述的進(jìn)行莫納甜分析。
表2.1 大腸桿菌MG1655和BL21(DE3)所流出的莫納甜/細(xì)胞干重 *莫納甜/dcw(mg/g) **CCCP是羰基氰3-氯苯腙 對(duì)于大腸桿菌BL21(DE3)::aspCproA pET30菌株來(lái)說(shuō)，在用一次(10μM)或兩次(20μM)CCCP處理?yè)u瓶后31小時(shí)，莫納甜/dcw上升超過1.8或3.5倍(33.0/18.1或64.2/18.1)。對(duì)于大腸桿菌MG1655::aspCproA pProNde菌株來(lái)說(shuō)，在31小時(shí)時(shí)莫納甜/dcw上升2倍。因此通過啟動(dòng)或上調(diào)EmrAB流出泵的表達(dá)可以使莫納甜的流出至少升高2倍。通過與增加莫納甜轉(zhuǎn)運(yùn)的其他處理組合使用可進(jìn)一步增加莫納甜的流出。
實(shí)施例3 敲除大腸桿菌emrB和acrAB基因?qū)mrAB和AcrAB轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分別介導(dǎo)的莫納甜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響 所設(shè)計(jì)的引物用于通過從模板pKD3 PCR擴(kuò)增來(lái)產(chǎn)生所期望的敲除產(chǎn)物，如Datsenko K.A.和Wanner，B.L.，“利用PCR產(chǎn)物一步滅活大腸桿菌K-12的染色體基因(One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCRproducts)”，Proceed.Natl.Acad.Sci.USA，976640-6645，(2000)。
emrB敲除引物序列 大腸桿菌EmrBF (5’AAGCTAACGCTGGCTAATCCAGAGGTGCGTGTGATGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’)； 大腸桿菌EmrBR (5’-AAAGCCAGTTCAAATGAACTGGCTTAGTTGTACTTACATATGAATATCCTCCTTA-3’)； acrAB敲除引物序列 大腸桿菌AcrAF (5’-GACCAATTTGAAATCGGACACTCGAGGTTTACATATGAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’)； 大腸桿菌AcrBR (5’-CTTACGCGGCCTTAGTGATTACACGTTGTATCAATGATGCATATGAATATCCTCCTTA-3’) 通過如下PCR過程擴(kuò)增刪除了emrB和acrAB基因的PCR產(chǎn)物。在100μL反應(yīng)體系中，加入100ng模板(pKD3)(Datsenko，K.A.和Wanner，B.L.，“利用PCR產(chǎn)物一步滅活大腸桿菌K-12的染色體基因(One-step inactivation of chromosomalgenes in Escherichia coliK-12 using PCR products)”，Proceed.Natl.Acad.Sci.USA，976640-6645，(2000))、0.4μM各引物、0.4mM各dNTP、5.6 U Expand HighFidelityTM聚合酶(羅氏(Roche)，Indianapolis，IN)、1.0 U Pfu聚合酶(斯加特基因公司(Stratagene)，La Jolla，CA)和含Mg的1×ExpandTM緩沖液。所使用的熱循環(huán)程序包括94℃熱啟動(dòng)3分鐘，如下步驟重復(fù)8次94℃30秒，50℃30秒和72℃1分30秒，然后如下步驟重復(fù)22次94℃30秒，58℃30秒和72℃1分30秒。完成22個(gè)循環(huán)以后使樣品在72℃保持7分鐘，然后儲(chǔ)存于4℃。這個(gè)PCR過程可制備出emrB和acrAB敲除引物對(duì)的1.1-Kb產(chǎn)物。
利用Qiagen凝膠提取試劑盒(Valencia，CA)從0.8％TAE-瓊脂糖凝膠中凝膠純化PCR產(chǎn)物。利用SmartSpec 3000TM分光光度計(jì)定量PCR產(chǎn)物。
凝膠純化的PCR產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株BW25113/pKD46。Datsenko K.A.和Wanner，B.L.，“利用PCR產(chǎn)物一步滅活大腸桿菌K-12的染色體基因(One-stepinactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products)”，Proceed.Natl.Acad.Sci.USA，976640-6645，(2000)。1μL各產(chǎn)物加到40μl細(xì)胞中，利用BioRad Gene Pulsar II在下列條件下通過電穿孔轉(zhuǎn)化細(xì)胞在0.2cm槽內(nèi)2.5kV，25μF，200ohm。細(xì)胞在1mL SOC中37℃、225rpm振蕩4小時(shí)使其恢復(fù)，然后置于室溫下過夜(不振蕩)。細(xì)胞接種到含氯霉素(10μg/mL)LB平板上，37℃孵育過夜。在非選擇性的LB培養(yǎng)基(在42℃生長(zhǎng))上單集落純化氯霉素耐藥轉(zhuǎn)化子，檢測(cè)單個(gè)集落是否保留了氯霉素耐藥性并且丟失了氨芐青霉素耐藥性(說(shuō)明pKD46得以恢復(fù))。利用位于缺失位點(diǎn)上游和下游的引物通過集落PCR來(lái)確定emrB或acrAB基因是否被正確刪除 EmrB上游正向引物5’-GTATCGGTCAGCCGGTCACT-3’ EmrB下游反向引物5’-TGTTCGATCTGCGCTTCTGC-3’ AcrA上游正向引物5’-TAATCGACGCCGTTCTTCTG-3’ AcrB下游反向引物5’-GCGGTTGAACTAACGGACAC-3’ 為了刪除emrB，利用EmrB上游正向引物和EmrB下游反向引物引物可以得到一個(gè)比野生型2.4 kb產(chǎn)物短的截短的1.9 kb PCR產(chǎn)物。為了刪除acrAB，利用AcrA上游正向引物和AcrB下游反向引物引物可以得到一個(gè)比野生型5.679 kb產(chǎn)物短的截短的1.9kb PCR產(chǎn)物。
裂解物制備為了生產(chǎn)BW25113ΔEmrB和BW25113ΔAcrAB菌株，制備p1噬菌體裂解物以使敲除分別轉(zhuǎn)移到大腸桿菌BL21DE3或MG1655生產(chǎn)宿主內(nèi)。供體菌株在含10μg/mL氯霉素的LB培養(yǎng)基內(nèi)孵育過夜。培養(yǎng)物用于接種含5mMCaCl2的新鮮LB培養(yǎng)基，稀釋度為1∶10，在37℃孵育70分鐘。1mL每種培養(yǎng)物用3μL或5μL噬菌體儲(chǔ)存液(ATCC 25404-B1)接種，37℃20分鐘。然后噬菌體/培養(yǎng)物與4mL含5mM CaCl2的軟瓊脂混合，覆蓋在LB培養(yǎng)基上。對(duì)照試驗(yàn)用無(wú)噬菌體的溶液進(jìn)行。平板右側(cè)向上在37℃孵育5小時(shí)，然后所有含噬菌體的平板上都可以看到有融合裂解；對(duì)照平板如預(yù)期一樣有細(xì)胞菌苔。平板在37℃孵育過夜，然后如預(yù)期一樣在試驗(yàn)平板上看到有噬菌體耐受集落。用無(wú)菌的可處理接種環(huán)從每個(gè)平板上刮下軟瓊脂放到離心管內(nèi)。用2mL LB沖洗平板，沖洗液與離心管中的軟瓊脂混合。在管中加入5滴氯仿，溫和振蕩，在室溫下孵育20分鐘?；旌衔?0000g離心10分鐘，用0.2μm注射器式濾器過濾上清，得到噬菌體裂解物。所有噬菌體裂解物都儲(chǔ)存于4℃。
轉(zhuǎn)導(dǎo)入生產(chǎn)宿主通過P1轉(zhuǎn)導(dǎo)分別制備菌株BL21DE3ΔemrB和MG1655ΔacrAB，從而使emrB敲除子轉(zhuǎn)移到菌株大腸桿菌BL21DE3內(nèi)，使acrAB敲除子轉(zhuǎn)移到菌株大腸桿菌MG1655內(nèi)。BL21DE3ΔemrB和MG1655ΔacrAB在含10μg/mL氯霉素的LB培養(yǎng)基內(nèi)孵育過夜。培養(yǎng)物用于接種5mL含5mM CaCl2的新鮮LB培養(yǎng)基，稀釋度為1∶10。亞培養(yǎng)物在37℃孵育60分鐘。培養(yǎng)物離心，重懸于500μLMC緩沖液(0.1M MgSO4，5mM CaCl2)中，室溫下孵育20分鐘。各種稀釋度的供體裂解物(1∶100到1×，用MC緩沖液稀釋)以相等體積加入到100μL培養(yǎng)物中。混合物37℃孵育20分鐘，然后每管加入200μL檸檬酸鹽緩沖液(0.1M檸檬酸和220mM NaOH，pH5.5)和1mL LB。培養(yǎng)物在37℃孵育1小時(shí)，以200rpm振蕩，然后離心得到細(xì)胞團(tuán)。細(xì)胞團(tuán)重懸于100μL檸檬酸鹽緩沖液中，接種到含10μg/mL氯霉素的LB平板上。
通過在合適的選擇培養(yǎng)基上重新接種來(lái)純化單個(gè)的氯霉素耐藥集落，按照以前所描述的用于BW25113敲除株的方法通過PCR檢測(cè)單集落以證明是否存在emrB和acrAB敲除子。emrB和acrAB敲除對(duì)EmrAB和AcrAB轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的影響分別利用合適的抗生素并與野生型對(duì)照微生物比較通過評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)運(yùn)突變株的表型來(lái)確定，如表3.1和表3.2所示。
表3.1 *羰基氰3-氯苯腙 因此，根據(jù)表3.1所示的數(shù)據(jù)可以確認(rèn)EmrAB轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)負(fù)責(zé)CCCP的流出。在缺少CCCP(0μM)的情況下，在24小時(shí)時(shí)野生型菌株和用pET30載體上的莫納甜操縱子(aspC，proA)轉(zhuǎn)化的ΔemrB大腸桿菌菌株的生長(zhǎng)是相似的。但是，當(dāng)加入20μM CCCP時(shí)，缺失菌株大腸桿菌BL21DE3ΔemrB::aspCproApET30的生長(zhǎng)下降了80倍/99％，估計(jì)這可能是因?yàn)闊o(wú)法流出毒性分析CCCP所導(dǎo)致的。這些數(shù)據(jù)證明了EmrAB系統(tǒng)在轉(zhuǎn)運(yùn)CCCP中的主要作用。
表3.2 因此，根據(jù)表3.2所示的數(shù)據(jù)可以確認(rèn)EmrAB轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)負(fù)責(zé)新生霉素的流出，該系統(tǒng)可被癸酸鈉誘導(dǎo)。在缺少新生霉素(0μM)的情況下，在24小時(shí)時(shí)野生型菌株和用pProNde載體上的莫納甜操縱子(aspC，proA)轉(zhuǎn)化的ΔacrAB大腸桿菌菌株的生長(zhǎng)是相似的。但是，在存在40或80 ppm新生霉素的情況下，ΔacrAB大腸桿菌菌株的生長(zhǎng)被完全抑制，而相應(yīng)的對(duì)照卻只有輕微的生長(zhǎng)抑制。在存在AcrAB誘導(dǎo)物癸酸鈉的情況下，相應(yīng)的對(duì)照菌株生長(zhǎng)所達(dá)到的光密度與0ppm、40ppm或80ppm新生霉素相似，而ΔacrAB大腸桿菌菌株的生長(zhǎng)被完全抑制。
實(shí)施例4 鑒定大腸桿菌、棒狀桿菌屬或其他微生物來(lái)源的莫納甜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的策略來(lái)自本申請(qǐng)其他實(shí)施例的數(shù)據(jù)顯示AcrAB和EmrAB多藥流出泵能夠轉(zhuǎn)運(yùn)莫納甜。用癸酸誘導(dǎo)AcrAB轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)可導(dǎo)致莫納甜流出進(jìn)一步增多。除了acrAB和emrAB轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)基因以為，利用膜拓樸學(xué)推測(cè)理論和生物信息學(xué)方法還可以鑒定出許多轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因。據(jù)報(bào)道，大腸桿菌基因組至少編碼20種在過表達(dá)時(shí)能賦予藥物耐受性的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。
一種可能的情況是這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中的一些可能無(wú)法從其天然啟動(dòng)子表達(dá)，或者在天然宿主內(nèi)其表達(dá)被通用的或特殊的抑制分子所抑制。Nishino，K.和Yamaguchi，A.，“大腸桿菌內(nèi)推測(cè)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的完全文庫(kù)的分析(Analysis of acomplete library of putative drug transporter genes in Escherichia coli)”，J.Bacteriol.1835803-5812，(2001)。還有報(bào)道顯示，除acrAB外，這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中的一些在正常發(fā)酵/培養(yǎng)條件下未達(dá)到最佳表達(dá)(Sulavik，M.C.等，“缺乏多藥流出泵的大腸桿菌菌株的抗生素敏感性概況(Antibiotic susceptibility profiles of Escherichia colistrains lacking multidrug efflux pump genes)”，Antimicrob.Agents Chemother.451126-1136，(2001))，因此需要用特殊的方法來(lái)檢測(cè)這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性。根據(jù)上述信息，大腸桿菌及其他微生物內(nèi)的其他轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可能能夠轉(zhuǎn)運(yùn)莫納甜，只是其效率和選擇性不同而已。
生物信息學(xué)方法(搜索特殊的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白特征、跨膜區(qū)等)、公用文獻(xiàn)檢索等可用于鑒定轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因候選者的來(lái)源，還可以提供轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白誘導(dǎo)子有關(guān)的信息。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可被分組到上升類別中(被專家所承認(rèn))?？梢澡b定每個(gè)分類中的一個(gè)或兩個(gè)成員以確定它們?cè)谀{甜轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用。這個(gè)策略可能能夠允許從已檢測(cè)的代表來(lái)源的數(shù)據(jù)外推到整個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白類別。
例如，莫納甜操縱子(aspC，proA)可被克隆到載體內(nèi)，并轉(zhuǎn)化到特定轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)或者不同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白組分缺失的宿主微生物內(nèi)?？梢愿鶕?jù)與合適的野生型對(duì)照相比莫納甜轉(zhuǎn)運(yùn)功能喪失的情況來(lái)篩選具有制備莫納甜能力的特殊轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白突變體。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺失導(dǎo)致莫納甜轉(zhuǎn)運(yùn)減少或喪失說(shuō)明各個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在莫納甜流出中可能扮演角色。
例如，莫納甜操縱子(aspC，proA)可被克隆到載體內(nèi)，并轉(zhuǎn)化到經(jīng)過基因修飾可過表達(dá)特定轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)或不同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白組分的宿主微生物內(nèi)。與未過表達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的野生型對(duì)照相比莫納甜轉(zhuǎn)運(yùn)增多的微生物菌株可證明各個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在莫納甜流出中可能扮演角色。
特殊的生長(zhǎng)條件或通用誘導(dǎo)子可增強(qiáng)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的莫納甜流出活性。誘導(dǎo)子可以是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白特異性的，也可以是通用的，誘導(dǎo)子是有益的，因?yàn)檫@些誘導(dǎo)子可增強(qiáng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性，使之更容易根據(jù)莫納甜的轉(zhuǎn)運(yùn)活性來(lái)篩選。例如，吲哚可促進(jìn)許多轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)，其中包括acrD、acrE、cusB、emrK、mdtA、mdtE和yceL。Hirakawa，H.等，“吲哚誘導(dǎo)大腸桿菌內(nèi)多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)(Indoleinduces the expression of multidrug transporter genes in Escherichia coli)”，MolecularMicrobiology 55113-1126，(2005)。比較被誘導(dǎo)系統(tǒng)內(nèi)的與相應(yīng)的非誘導(dǎo)對(duì)照內(nèi)的莫納甜流出可用于評(píng)價(jià)能夠轉(zhuǎn)運(yùn)莫納甜的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和誘導(dǎo)子。參見，例如，實(shí)施例1、2和14。
例如，莫納甜操縱子(aspC，proA)可被克隆到載體內(nèi)，并轉(zhuǎn)化到合適的宿主微生物內(nèi)。莫納甜生產(chǎn)菌株用合適的誘導(dǎo)子處理，檢測(cè)莫納甜流出的增加。微矩陣分析可用于鑒定在可導(dǎo)致莫納甜流出增多的誘導(dǎo)條件下過表達(dá)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因。這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因候選者可以被過表達(dá)以確定其在莫納甜流出中的作用，如上所述。
例如，莫納甜操縱子(aspC，proA)可被克隆到載體內(nèi)，并轉(zhuǎn)化到一個(gè)或多個(gè)已知的莫納甜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白如AcrAB或EmrAB系統(tǒng)缺失的宿主微生物內(nèi)。在缺乏某些主要的已知轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的宿主背景中誘導(dǎo)莫納甜轉(zhuǎn)運(yùn)可用于檢測(cè)野生型微生物內(nèi)的或經(jīng)過基因修飾過表達(dá)特定轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)或不同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白組分的菌株內(nèi)的其他莫納甜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。在同樣的誘導(dǎo)條件下，與合適的對(duì)照菌株相比莫納甜轉(zhuǎn)運(yùn)增加的微生物菌株可說(shuō)明各個(gè)誘導(dǎo)子/轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在莫納甜流出中扮演角色。
除了本申請(qǐng)實(shí)施例中所觀察到的莫納甜流出以外，我們還觀察到在培養(yǎng)基上有紅色形成物，我們推測(cè)這可能是由于培養(yǎng)基上發(fā)生了有莫納甜中間體如吲哚-3-丙酮酸(″I3P″)參與的反應(yīng)，說(shuō)明莫納甜中間體也可以被轉(zhuǎn)運(yùn)。
吲哚-3-丙酮酸流出并生成有色形成物(由于I3P復(fù)合物形成)可作為I3P轉(zhuǎn)運(yùn)的篩選標(biāo)記。假設(shè)莫納甜與莫納甜中間體如吲哚-3-丙酮酸結(jié)構(gòu)類似，那么能夠轉(zhuǎn)運(yùn)I3P的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)可能會(huì)是莫納甜轉(zhuǎn)運(yùn)的候選者(假定轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白不能區(qū)分I3P和莫納甜)。例如，灰黃鏈霉菌(Streptomyces griseoglavus)是細(xì)胞和細(xì)胞外吲哚-3-丙酮酸的主動(dòng)制造者，是用于篩選I3P和莫納甜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的極佳候選生物。El-Abyad，M.S.和Farid，M.，“灰黃鏈霉菌生產(chǎn)吲哚-3-丙酮酸所需培養(yǎng)條件的優(yōu)化(Optimization ofculture conditions for indole-3-pyruvic acid production byStreptomyces griseoflavus)”，Can.J.Microbio.40754-760，(1994)。增加莫納甜流出的效率需要修飾候選轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以便于通過降低莫納甜中間體/前體如吲哚-3-丙酮酸和莫納甜以及初始底物如色氨酸或丙酮酸的轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)增加其對(duì)莫納甜轉(zhuǎn)運(yùn)的特異性。
實(shí)施例5 TolC的克隆和過表達(dá) 本實(shí)施例描述了可用于克隆和過表達(dá)大腸桿菌tolC基因的方法。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過程根據(jù)5’限制性酶切位點(diǎn)涉及引物，其突出部分用于克隆到pProNco載體(克隆科技公司(Clontech)，Palo Alto，CA)內(nèi)。引物N端5′-GGCCTTGGCCATGGAAATGAAGAAATTGCTCCCC-3′和C端5′-CCGGCCAAGCTTTCAGTTACGGAAAGGGTTAT-3′。通過如下PCR過程擴(kuò)增tolC基因。在50μL反應(yīng)體系中加入0.150μg模板(大腸桿菌MG1655)、1.6μM各引物、0.4mM各dNTP、2.8U Expand High FidelityTM聚合酶(羅氏(Roche)，Indianapolis，IN)、0.5U Pfu聚合酶(斯加特基因公司(Stratagene)，La Jolla，CA)、含Mg的1×ExpandTM緩沖液和2.5μLDMSO。所使用的熱循環(huán)程序包括94℃熱啟動(dòng)3分鐘，如下步驟重復(fù)8次94℃30秒，52℃45秒和72℃2分30秒，然后如下步驟重復(fù)18次94℃30秒，59℃45秒和72℃2分30秒。完成22個(gè)循環(huán)以后使樣品在72℃保持7分鐘，然后儲(chǔ)存于4℃。這個(gè)PCR過程可制備出1475bp的產(chǎn)物。
tolC基因的克隆利用Qiagen凝膠提取試劑盒(Valencia，CA)從0.8％TAE-瓊脂糖凝膠中凝膠純化PCR產(chǎn)物。利用SmartSpec 3000TM分光光度計(jì)定量PCR產(chǎn)物。根據(jù)廠商推薦的方法(因維曲根公司(Invitrogen)，Carlsbad，CA)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行TOPOBlunt處理。利用上述方法PCR篩選轉(zhuǎn)化子以確定TolC是否插入。按廠商(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室公司(New England Biolabs)，Beverly，MA)推薦的方法用限制性內(nèi)切酶Ncol和HindIII消化經(jīng)驗(yàn)證的TOPO克隆。利用Qiagen凝膠提取試劑盒從0.8％TAE-瓊脂糖凝膠中凝膠純化1.475kb條帶。通過用限制性內(nèi)切酶Ncol和HindIII消化、然后再用蝦堿性磷酸酶處理來(lái)制備載體pProNco，利用Qiagen凝膠提取試劑盒從0.8％TAE-瓊脂糖凝膠中純化載體。
被消化的載體和插入片段用RapidTM DNA連接試劑盒(羅氏(Roche)，Indianapolis，IN)連接。約50ng被處理插入片段、100ng被處理載體(插入片段與載體的摩爾比為3∶1)、5U T4 DNA連接酶和1×連接緩沖液在室溫下共孵育5分鐘。利用高純度PCR產(chǎn)物純化試劑盒(羅氏(Roche))清理連接反應(yīng)液，用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B電感受態(tài)細(xì)胞(因維曲根公司(Invitrogen)，Carlsbad，CA)。在40μLDH10B細(xì)胞中加入10μL各連接反應(yīng)液，利用BioRad Gene Pulsar II在下列條件下通過電穿孔轉(zhuǎn)化細(xì)胞在0.2cm槽內(nèi)，2.5kV，25μF，200ohm。細(xì)胞在1mL室溫SOC中37℃、225rpm振蕩4小時(shí)使其恢復(fù)。細(xì)胞接種到含卡那霉素(50μg/mL)LB平板上，37℃孵育過夜。
利用Qiagen自旋小量制備試劑盒從得到的轉(zhuǎn)化子中純化質(zhì)粒DNA，通過用限制性內(nèi)切酶Ncol和HindIII消化來(lái)篩選正確的插入。通過雙脫氧鏈終止DNA測(cè)序反應(yīng)驗(yàn)證具有正確插入的質(zhì)粒序列。
tolC基因表達(dá)經(jīng)序列分析驗(yàn)證的質(zhì)粒DNA亞克隆到大腸桿菌表達(dá)宿主BL21(DE3)(諾佛根公司(Novagen)，Madison，WI)內(nèi)。擴(kuò)增培養(yǎng)物，用Qiagen小量制備試劑盒分離質(zhì)粒，通過限制性酶切分析以確定其一致性。培養(yǎng)物在含卡那霉素(50mg/mL)的50mL LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，30℃、225rpm直到OD600達(dá)到0.5-0.6，與100mM IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)和0.5％阿拉伯糖共孵育使其過表達(dá)tolC基因。TolC過表達(dá)對(duì)莫納甜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響見下面實(shí)施例6和7的描述。
實(shí)施例6 大腸桿菌內(nèi)tolC的過表達(dá)使莫納甜排出增多 在革蘭氏陰性細(xì)菌中，藥物耐受的部分原因是跨膜流出泵的活性，跨膜流出泵由三種類型的蛋白質(zhì)組成。大腸桿菌來(lái)源的典型泵是由三聚體的外膜蛋白TolC、三聚體的內(nèi)膜質(zhì)子反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AcrB和胞質(zhì)蛋白AcrA裝配而成的，其中TolC組成一個(gè)別構(gòu)通道。泵可利用質(zhì)子電化學(xué)勢(shì)能將底物從細(xì)菌內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)出去。Fernandez-Recio，J.等，“一個(gè)來(lái)源于革蘭氏陰性菌的跨膜藥物流出泵模型(Amodelof a transmembrane drug-efflux pump from Gram-negative bacteria)”，F(xiàn)EBS Lett.5785-9，(2004)。
大腸桿菌內(nèi)的tolC基因編碼外膜蛋白，它可以和幾種不同的外流泵協(xié)同發(fā)揮功能。TolC在革蘭氏陰性細(xì)菌如大腸桿菌和綠膿假單孢菌的各種底物的轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮重要作用。TolC的同源物在革蘭氏陰性細(xì)菌中間普遍存在，現(xiàn)已鑒定出大約100各TolC同源物。Dinh，T.等，J.Bacteriol.1763825-3831，(1994)；Johnson，J.和Church，M.J.Mol.Biol.287695-715，(1999)；Anderson，C.等，EMBO Rep.1313-318，(2000)。tolC基因在大腸桿菌內(nèi)過表達(dá)可用于確定TolC通道的利用度上升是否能夠增加莫納甜的轉(zhuǎn)運(yùn)。
含有莫納甜操縱子(aspC，天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和proA，醛縮酶基因)的大腸桿菌菌株BL21(DE3)和帶有或不帶有tolC基因的pProNde質(zhì)粒(pProLAR，來(lái)自克隆科技公司(Clontech)，按照US20040235123所描述的進(jìn)行修飾)用于檢測(cè)莫納甜的轉(zhuǎn)運(yùn)。
用于試驗(yàn)的菌株包括大腸桿菌BL21(DE3)::aspCproApET32和tolC pProNde或不帶tolC的pProNde。為了進(jìn)行接種，大腸桿菌菌株在含100μg/mL氨芐青霉素和50μg/mL卡那霉素的Luria-Bertani(″LB″)培養(yǎng)基內(nèi)、37℃、250rpm振蕩培養(yǎng)過夜。
為了進(jìn)行試驗(yàn)處理，按照如下方法制備用于提高色氨酸在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的產(chǎn)量的基本培養(yǎng)基Trp-1+葡萄糖培養(yǎng)基(Zeman等，F(xiàn)olia Microbiol.35200-204，(1990))。向800mL納米純的水中加入下列試劑2g(NH4)2SO4和13.6g KH2PO4。PH調(diào)至7.0，體積增加到948mL，并對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行高壓滅菌。滅菌后在1.8mL體積的培養(yǎng)基中加入0.2g MgSO4*7H2O、0.01g CaCl2*2H2O和0.5mg FeSO4*7H2O，然后加入0.2mL Neidhardt微量營(yíng)養(yǎng)素溶液。Neidhardt，F(xiàn).C.等，“腸道細(xì)菌培養(yǎng)基”，J.Bacteriol.119736-746(1974)。Neidhardt培養(yǎng)基包含(每升)0.18g(NH4)6(MO7)24-4H2O、1.24g H3BO3、0.36g CoCl2-6H2O、0.12g CuSO4(無(wú)水的)、0.8g MnCl2-4H2O和0.14g ZnSO4-7H2O。單獨(dú)制備50％的葡萄糖溶液并通過過濾除菌。將40mL葡萄糖溶液和10mL 1M 3-嗎啉代丙磺酸(“MOPS”)緩沖液加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基(950mL)中，最后體積為1L。
為了處理，將3-4v/v％接種物加入到含100μg/mL氨芐青霉素的在500mL帶擋板搖瓶?jī)?nèi)的100mL培養(yǎng)基中。處理?xiàng)l件包括整個(gè)試驗(yàn)溫度為30℃、以250rpm振蕩。在0.4 OD600nm時(shí)，開始質(zhì)粒基因的誘導(dǎo)。在誘導(dǎo)時(shí)，加入0.5mM IPTG、0.5％阿拉伯糖、0.5mM維生素B6和0.2mL Balch維生素(Balch，W.E.等，“產(chǎn)甲烷菌對(duì)獨(dú)特生物群的重新評(píng)價(jià)”，Microbiol.Rev.43260-296，(1979))。在開始誘導(dǎo)后3小時(shí)加入1gL-色氨酸、5g/L丙酮酸鈉、0.04mM吡哆醛-5’-磷酸(“PLP”)和0.2％吐溫20(聚氧乙烯20-失水山梨糖醇單月桂酸酯)。某些處理包括在誘導(dǎo)開始后3小時(shí)加入2.5mM癸酸鈉。在6.5、25和50小時(shí)采集用于莫納甜分析和確定細(xì)胞干重的樣品。
利用實(shí)施例13所描述的方法確定莫納甜流出的量。
表6.1 大腸桿菌排出的莫納甜/細(xì)胞干重 nd未檢測(cè)到 表6.2 大腸桿菌排出的平均莫納甜/細(xì)胞干重 如上所述，在25小時(shí)采樣點(diǎn)上，過表達(dá)TolC的菌株排出0.939莫納甜(mg)/g細(xì)胞干重，而沒有TolC過表達(dá)的菌株是0.056mg/g。TolC通道利用度上升的菌株內(nèi)莫納甜的轉(zhuǎn)運(yùn)升高了16.8倍。在50小時(shí)采樣點(diǎn)上觀察到了同樣的趨勢(shì)，轉(zhuǎn)運(yùn)的莫納甜升高了15.8倍。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明有tolC基因過表達(dá)的大腸桿菌菌株內(nèi)被轉(zhuǎn)運(yùn)的莫納甜更多。
實(shí)施例7 在大腸桿菌內(nèi)tolC過表達(dá)結(jié)合誘導(dǎo)AcrAB流出泵可增加莫納甜的排出試驗(yàn)證明，在大腸桿菌內(nèi)通過加入2.5mM癸酸鈉可誘導(dǎo)AcrAB多藥流出泵。在本實(shí)施例中，評(píng)價(jià)了誘導(dǎo)AcrAB流出泵與增加TolC通道利用度的組合。另外還用2.5mM癸酸鈉處理過表達(dá)tolC基因的大腸桿菌菌株以同時(shí)誘導(dǎo)AcrAB泵。
利用實(shí)施例13所描述的方法確定莫納甜流出的量。
表7.1 2.5mM癸酸鈉處理大腸桿菌排出的莫納甜/細(xì)胞干重 表7.2 2.5mM癸酸鈉處理大腸桿菌排出的平均莫納甜/細(xì)胞干重 n＝2處理的平均值 如上表所述，在通過癸酸鈉處理來(lái)誘導(dǎo)AcrAB轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的條件下，與未有與tolC基因過表達(dá)的處理相比，25和50小時(shí)時(shí)間點(diǎn)上，與tolC基因過表達(dá)組合的癸酸鈉處理可使大腸桿菌內(nèi)莫納甜的轉(zhuǎn)運(yùn)分別升高58.5和91.1倍。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明tolC基因過表達(dá)與誘導(dǎo)AcrAB轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的組合對(duì)增加莫納甜流出更有利。
實(shí)施例8 谷氨酸棒狀桿菌谷氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型(缺陷的)菌株內(nèi)莫納甜的排出和/或生產(chǎn)增多 谷氨酸棒狀桿菌ATCC株13032是谷氨酸生產(chǎn)菌株。NADP+-依賴性的異檸檬酸脫氫酶基因(ICD；EC 1.1.1.42，Gen bank登錄號(hào)X71489)是三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶之一，可將D-異檸檬酸轉(zhuǎn)化成2-氧代戊二酸、CO2和NADPH。2-氧代戊二酸可進(jìn)一步還原胺化形成谷氨酸。Icd基因的滅活可導(dǎo)致谷氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型。Eikmanns，B.J.等“編碼異檸檬酸脫氫酶的谷氨酸棒狀桿菌icd基因的克隆、序列分析和滅活以及該酶的生化特征(Cloning，sequence analysis，and inactivation of theCorynebacterium glutamicum icd gene encoding isocitrate dehydrogenase andbiochemical characterization of the enzyme)”，J Bacteriol.，177774-782，(1995)。從Hermann Sahm教授處(Institut fur Biotechnologie des Forschungszentrums Julich，德國(guó))獲得了兩個(gè)icd突變株。根據(jù)icd突變株無(wú)法在未添加谷氨酸的基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的特性可以確認(rèn)谷氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型。用位于pEKEX-2載體(Eikmanns等，Gene10293-98，(1991))上的莫納甜操縱子(aspC/proA)轉(zhuǎn)化icd突變株。誘導(dǎo)莫納甜操縱子可導(dǎo)致莫納甜合成并排出細(xì)胞。
用APpEKEX-2轉(zhuǎn)化的谷氨酸棒狀桿菌13032菌株(帶或不帶滅活的icd基因)在添加5μg/mL氯霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，培養(yǎng)條件為30℃、250rpm振蕩。對(duì)于試驗(yàn)處理?yè)u瓶來(lái)說(shuō)，每個(gè)搖瓶加入100mL Kraemer A培養(yǎng)基。Hoisted C.和Kraemer，R.，“流出載體系統(tǒng)參與谷氨酸棒狀桿菌內(nèi)谷氨酸排出的證據(jù)(Evidencefor an efflux carrier system involved in the secretion of glutamate by Corynebacteriumglutamicum)”，Arch.Microbiol 151342-347，(1989)。KraemerA培養(yǎng)基包含(每升)5g(NH4)2SO4、5g尿素、2g KH2PO4、1.53 K2HPO4、0.249g MgSO4*7H2O、50g葡萄糖、0.01g FeSO4-7H2O、0.01g MnSO4-H2O、0.01g CaCl2-2H2O、0.03mgZnSO4-7H2O、0.1mg H3BO3、0.07mg CaCl2-6H2O、0.01mg NiCl2-2H2O、0.03mgCuCl2-2H2O、0.1mg來(lái)自(NH4)6Mo7O24-4H2O的Mo+6和1μg生物素。PH調(diào)至7.0。所有搖瓶(盛有谷氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株(icd2)以及野生型對(duì)照)都添加5mM谷氨酸。
為了處理，將4-7 v/v％接種物加入到500mL帶擋板搖瓶?jī)?nèi)的100mL培養(yǎng)基中。處理?xiàng)l件包括整個(gè)試驗(yàn)溫度為30℃、以250rpm振蕩。在0.4-0.7 OD600nm時(shí)，開始莫納甜操縱子的誘導(dǎo)。0.5mM IPTG用于誘導(dǎo)，在誘導(dǎo)時(shí)，加入0.5mM維生素B6和0.04mM吡哆醛-5’-磷酸(“PLP”)。在開始誘導(dǎo)后3小時(shí)加入1gL-色氨酸、5g/L丙酮酸鈉和10μg/mL氨芐青霉素。在接種后約24和48小時(shí)(運(yùn)行時(shí)間)采集用于莫納甜分析和確定細(xì)胞干重的樣品。
表8.1 谷氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型和對(duì)照的莫納甜/單位生物量 結(jié)果表示為莫納甜/細(xì)胞干重(莫納甜(mg)/dcw(g)) 在所有采樣時(shí)間點(diǎn)上兩種處理都是n＝3 由于莫納甜具有谷氨酸主鏈，將莫納甜轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞的一個(gè)可能候選者是谷氨酸流出轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。然而，到目前為止，在棒狀桿菌內(nèi)還未鑒定出谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。在谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠轉(zhuǎn)運(yùn)莫納甜的事件中，如果不被現(xiàn)有理論所束縛，那么預(yù)計(jì)在谷氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型中如果沒有對(duì)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)的競(jìng)爭(zhēng)，就會(huì)有更多的莫納甜被轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白流出。另外，在谷氨酸棒狀桿菌中，丙酮酸是谷氨酸和莫納甜合成的中間體。由于在谷氨酸產(chǎn)生細(xì)菌內(nèi)有較高的碳流向谷氨酸，因此使用谷氨酸合成缺陷的棒狀桿菌菌株可導(dǎo)致丙酮酸向莫納甜的轉(zhuǎn)化增加。ICD酶在能量產(chǎn)生和中間代謝中都發(fā)揮作用(Eikmanns，B.J.等“編碼異檸檬酸脫氫酶的谷氨酸棒狀桿菌icd基因的克隆、序列分析和滅活以及該酶的生化特征(Cloning，sequence analysis，andinactivation of the Corynebacterium glutamicum icd gene encoding isocitratedehydrogenase and biochemical characterization of the enzyme)”，J Bacteriol.，177774-782，(1995))，因此在含有滅活icd基因的菌株內(nèi)生產(chǎn)莫納甜將更有優(yōu)勢(shì)。另外一種可能是ICD上游反應(yīng)所積聚的中間體可活化流出泵的形成，這樣就會(huì)阻止這些中間體的積聚，這個(gè)流出泵能夠轉(zhuǎn)運(yùn)莫納甜。
用莫納甜操縱子(aspCproApEKEX-2)轉(zhuǎn)化的谷氨酸棒狀桿菌13032 icd2谷氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型生產(chǎn)的莫納甜平均達(dá)到每克細(xì)胞干重15.97毫克，而含有莫納甜操縱子的野生型對(duì)照所生產(chǎn)的莫納甜只有每克細(xì)胞干重0.28毫克。這些結(jié)果說(shuō)明含有滅活icd基因并用莫納甜操縱子轉(zhuǎn)化的谷氨酸棒狀桿菌13032谷氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型所排出的莫納甜比含有功能性icd基因的野生型菌株高57倍。
實(shí)施例9 大腸桿菌谷氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型(icdA缺陷)菌株應(yīng)該具有莫納甜排出升高的潛能 在用低水平的萘啶酸在營(yíng)養(yǎng)平板上篩選大腸桿菌和其他細(xì)菌的突變株時(shí)，據(jù)報(bào)道，耐藥的發(fā)生是因?yàn)樵诓煌z傳位點(diǎn)上發(fā)生的突變。一個(gè)這種位點(diǎn)是編碼異檸檬酸脫氫酶的icdA基因。在icdA基因上的一個(gè)突變可導(dǎo)致谷氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型和大量檸檬酸和異檸檬酸積聚，二者都是IcdA所催化反應(yīng)之前的中間體。根據(jù)如下現(xiàn)象可以預(yù)測(cè)中間體的積聚與萘啶酸耐受之間的關(guān)系代謝產(chǎn)物/中間體活化流出泵的形成，其中流出泵可將萘啶酸從細(xì)胞去除從而防止其毒性。據(jù)報(bào)道，icdA突變株內(nèi)的acrAB轉(zhuǎn)錄升高，證明在大腸桿菌icdA突變株內(nèi)，萘啶酸耐受的表達(dá)需要AcrAB-TolC流出泵。Helling，R.B.等，“大腸桿菌內(nèi)的毒性廢物處理(Toxic wastedisposal in Escherichia coli)”，J Bacteriol.1843699-3703，(2002)。因此，在含有icdA突變并且被莫納甜生產(chǎn)所需基因轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株內(nèi)，預(yù)計(jì)會(huì)因?yàn)锳crAB-TolC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的誘導(dǎo)而使莫納甜轉(zhuǎn)運(yùn)增多。
實(shí)施例10 在大腸桿菌內(nèi)以蘋果酸為碳底物可增加莫納甜排出/流出莫納甜含有谷氨酸的主鏈，或者被認(rèn)為是4-取代谷氨酸衍生物。因此莫納甜可被轉(zhuǎn)位谷氨酸以交換底物如蘋果酸的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞如細(xì)菌細(xì)胞。阿布屬質(zhì)粒內(nèi)的谷氨酸/蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由DiT2基因編碼，可以反向轉(zhuǎn)運(yùn)的方式轉(zhuǎn)位谷氨酸和蘋果酸。Renne，P.等，“阿布屬突變株dct在質(zhì)粒谷氨酸/蘋果酸轉(zhuǎn)位分子DiT2中是缺失的(The Arabidopsis mutant dct is deficient in the plastidic glutamate/malatetranslocator DiT2)”，Plant J.35316-331，(2003)；Taniguchi，M.等，“擬南芥內(nèi)質(zhì)粒2-氧代戊二酸/蘋果酸和二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的鑒定和特征(Identifying andCharacterizing Plastidic 2-Oxoglutarate/Malate and Dicarboxylate Transporters inArabidopsis thaliana)”，Plant and Cell Physiology 43706-717，(2002)。谷氨酸/蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族與菠菜光合小體中的2-氧代戊二酸/蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同源的，與大腸桿菌內(nèi)的CitT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)，被認(rèn)為是檸檬酸和琥珀酸的反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。Pos，K.M.等，“大腸桿菌檸檬酸載體CitT與菠菜光合小體來(lái)源的2-氧代戊二酸/蘋果酸轉(zhuǎn)位分子相關(guān)的新型真細(xì)菌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的一個(gè)成員(The Escherichia colicitrate carrier CitTa member of a novel eubacterial transporter family related to the2-oxoglutarate/malate translocator from spinach chloroplasts)”，Journal of Bacteriology1804160-4165，(1998)。據(jù)報(bào)道，大腸桿菌CitT蛋白是參與二羧酸和三羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)的真細(xì)菌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白新型家族的一個(gè)成員。有一種可能是這個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可允許宿主攝取蘋果酸，同時(shí)排出谷氨酸或莫納甜進(jìn)入上清。蘋果酸發(fā)揮增強(qiáng)莫納甜轉(zhuǎn)運(yùn)的功能的另一種可能是由于蘋果酸可作為替代碳源來(lái)影響生長(zhǎng)速度和碳在代謝途徑中的分布，這種代謝途徑與葡萄糖明顯不同。蘋果酸還可以被兩個(gè)基因編碼的蘋果酸酶內(nèi)在轉(zhuǎn)化成丙酮酸(Fischer，E.和Sauer，U.，“利用GC-MS研究大腸桿菌突變株在中央碳代謝中的代謝流通特征(Metabolic flux profiling of Escherichia colimutants in central carbon metabolism using GC-MS)”，Eur.J.Biochem.270880-891，(2003))，以及由于丙酮酸是莫納甜的一個(gè)前體，因此更高的丙酮酸利用度可使莫納甜的產(chǎn)量增加，進(jìn)而莫納甜的分泌增多。以蘋果酸作為主要碳源的大腸桿菌的生長(zhǎng)可使分泌到培養(yǎng)基中的莫納甜增多。
為了進(jìn)行接種，大腸桿菌BL21 DE3 aspC/proA/pET30菌株在含50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基內(nèi)、37℃、250rpm振蕩培養(yǎng)過夜。為了進(jìn)行試驗(yàn)處理，使用如實(shí)施例6所描述的Trp-1培養(yǎng)基(Zeman等，F(xiàn)olia Microbiol.35200-204，(1990))和50μg/mL卡那霉素。蘋果酸和葡萄糖在各自的處理中起始濃度都是4g/L。為了處理?yè)u瓶，將2.2 v/v％接種物加入到250mL帶擋板搖瓶?jī)?nèi)的50mL培養(yǎng)基中。為了進(jìn)行葡萄糖處理，在0.8 OD600nm開始誘導(dǎo)莫納甜操縱子。為了進(jìn)行蘋果酸處理，在0.25 OD時(shí)開始誘導(dǎo)。在誘導(dǎo)時(shí)，加入0.5mM IPTG、0.5mM維生素B6和0.2mL Balch維生素(Balch，W.E.等，“產(chǎn)甲烷菌對(duì)獨(dú)特生物群的重新評(píng)價(jià)(Methanogensreevaluation of a unique biological group)”，Microbiol.Rev.43260-296，(1979))。在誘導(dǎo)時(shí)溫度降低到30℃。在開始誘導(dǎo)后3小時(shí)加入1gL-色氨酸、5g/L丙酮酸鈉、0.04mM吡哆醛-5’-磷酸(“PLP”)、10μg/mL氨芐青霉素和0.2％吐溫20(聚氧乙烯20-失水山梨糖醇單月桂酸酯)。在誘導(dǎo)后24小時(shí)采集用于莫納甜分析和確定細(xì)胞干重的樣品。
表10.1 以葡萄糖或蘋果酸作為碳源的大腸桿菌總結(jié)表 從上述結(jié)果可以看出，與葡萄糖處理相比，用蘋果酸處理可使轉(zhuǎn)運(yùn)的莫納甜/單位生物量上升(7.72到6.28)。蘋果酸作為主要碳源可使轉(zhuǎn)運(yùn)的莫納甜/單位生物量升高23％。利用蘋果酸作為主要碳源或補(bǔ)充碳源結(jié)合所描述的已證明或預(yù)計(jì)能增加莫納甜流出的其他條件可導(dǎo)致莫納甜的合成和排出進(jìn)一步增加。
實(shí)施例11 通過在大腸桿菌內(nèi)刪除推測(cè)的流出轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(″PET″)Aae轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 可增加莫納甜的排出 已有報(bào)道證實(shí)在細(xì)菌、酵母和植物內(nèi)存在一個(gè)推測(cè)的流出轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族(″PET″)。已在大腸桿菌中鑒定出的帶登錄號(hào)的PET家族成員包括YjcQ(P32715)、YccS(P75870)、YhfK(P45537)和YhcP(P46481)。到目前為止，PET家族成員中只有一個(gè)AaeAB/YhcP的功能被確定。Van Dyk，T.K.等，“大腸桿菌AaeAB流出泵的特征代謝減壓閥？(Characterization of the Escherichia coli AaeAB efflux pumpametabolic reliefvalve？)”，J Bacteriol.2004 Nov；1867196-7204，(2004)。細(xì)菌和酵母蛋白含有一個(gè)重復(fù)的內(nèi)部重復(fù)元件，該元件含有一個(gè)約含170個(gè)殘基的N端疏水序列、6個(gè)推測(cè)的α螺旋跨膜扳手(TMS)，隨后是一個(gè)大的C端疏水胞漿區(qū)。植物蛋白只有一個(gè)這樣的單位，但是它們有較大的C端胞漿區(qū)。擬南芥(Arabidopsisthaliana)至少編碼7個(gè)PET家族的類似物。革蘭氏陰性細(xì)菌的蛋白有時(shí)由也包含編碼膜融合蛋白的基因的操縱子中發(fā)現(xiàn)的基因編碼。這個(gè)事實(shí)強(qiáng)烈暗示PET家族的蛋白是流出泵。Harley，K.T.和Saier，M.H.Jr.，“一個(gè)新的普遍存在的推測(cè)流出轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族(A novel ubiquitous family of putative efflux transporters)”，J MolMicrobiol Biotechnol.2195-198，(2000)。
用于本試驗(yàn)的PET突變株得自位于圣地亞哥的哥倫比亞大學(xué)的Milton Saier教授，包括大腸桿菌BW 25113野生型和4個(gè)單敲除突變株大腸桿菌BW 25113ΔyhcP、大腸桿菌BW 25113ΔyccS、大腸桿菌BW 25113 ΔyjcQ、大腸桿菌BW 25113ΔyhfK和四突變株大腸桿菌BW 25113 ΔyhcP ΔyccS ΔyjcQ ΔyhfK。所有菌株都用pProNde載體上的莫納甜操縱子基因轉(zhuǎn)化，如本申請(qǐng)的其他實(shí)施例所描述。菌株在含50μg/mL卡那霉素的Luria-Bertani(″LB″)培養(yǎng)基內(nèi)、37℃、250rpm振蕩培養(yǎng)過夜。
為了進(jìn)行試驗(yàn)處理，按照如下方法制備用于提高色氨酸在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的產(chǎn)量的基本培養(yǎng)基Trp-1+葡萄糖培養(yǎng)基(Zeman等，F(xiàn)olia Microbiol.35200-204，(1990))。向800mL納米純的水中加入下列試劑2g(NH4)2SO4和13.6g KH2PO4。PH調(diào)至7.0，體積增加到948mL，并對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行高壓滅菌。滅菌后在1.8mL體積的培養(yǎng)基中加入0.2g MgSO4*7H2O、0.01g CaCl2*2H2O和0.5mg FeSO4*7H2O，然后加入0.2mL Neidhardt微量營(yíng)養(yǎng)素溶液(Neidhardt，F(xiàn).C.等，“腸道細(xì)菌培養(yǎng)基(Culture medium for Enterobacteria)”，J.Bacteriol.119736-746(1974))。Neidhardt培養(yǎng)基包含(每升)0.18g(NH4)6(MO7)24-4H2O、1.24g H3BO3、0.36g CoCl2-6H2O、0.12g CuSO4(無(wú)水的)、0.8g MnCl2-4H2O和0.14g ZnSO4-7H2O。單獨(dú)制備50％的葡萄糖溶液并通過過濾除菌。將40mL葡萄糖溶液和10mL 1M 3-嗎啉代丙磺酸(“MOPS”)緩沖液加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基(950mL)中，最后體積為1L。
對(duì)于莫納甜生產(chǎn)搖瓶，將3-4 v/v％接種物加入到含50μg/mL卡那霉素的在500mL帶擋板搖瓶?jī)?nèi)的100mL培養(yǎng)基中。處理?xiàng)l件包括整個(gè)試驗(yàn)以250rpm振蕩、溫度為37℃直到開始誘導(dǎo)，然后溫度降到30℃，隨后開始誘導(dǎo)。在0.6 OD600nm時(shí)，開始質(zhì)粒基因的誘導(dǎo)。在誘導(dǎo)時(shí)，加入0.5mM IPTG、0.5％阿拉伯糖、0.5mM維生素B6和0.2mL Balch維生素。在開始誘導(dǎo)后3.5小時(shí)加入1gL-色氨酸、5g/L丙酮酸鈉、0.04mM吡哆醛-5’-磷酸(“PLP”)、10μg/mL氨芐青霉素和0.2％吐溫20(聚氧乙烯20-失水山梨糖醇單月桂酸酯)。在24和30或31小時(shí)采集用于莫納甜分析和確定細(xì)胞干重的樣品。按照實(shí)施例13的描述通過LC/MS/MS檢測(cè)莫納甜。結(jié)果顯示如下。
表11.1 30小時(shí)樣品的莫納甜平均值/細(xì)胞干重 所有6個(gè)菌株都是n＝2 四PET突變株大腸桿菌BW 25113 ΔyhcP(aaeB)ΔyccS ΔyjcQ ΔyhfK排出的莫納甜/細(xì)胞干重為6.16，明顯高于野生型或四個(gè)單突變株，其中莫納甜/g細(xì)胞干重的范圍平均為1.6-2.02mg。
據(jù)報(bào)道，YhcP流出系統(tǒng)對(duì)某些羧基化的芳香族羧酸具有較高的特異性。AaeAB(YhcP)流出系統(tǒng)的狹窄特異性與多藥流出系統(tǒng)如AcrAB-TolC明顯不同。Van Dyk，T.K.等，“大腸桿菌AaeAB流出泵的特征代謝減壓閥？”，J.Bacteriol.1867196-7204，(2004)。已有研究表明AaeAB流出系統(tǒng)是“代謝減壓閥”，估計(jì)代謝紊亂/內(nèi)部應(yīng)激如果發(fā)生(如莫納甜或莫納甜中間體積聚)，則流出系統(tǒng)的表達(dá)將被激活。
在四PET(Aae)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺失的背景下可以觀察到莫納甜流出這一事實(shí)說(shuō)明一個(gè)或多個(gè)PET轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在一個(gè)或多個(gè)莫納甜中間體的流出中可能發(fā)揮作用。因此，在經(jīng)改造后可產(chǎn)生莫納甜但是卻含有這四個(gè)PET/Aae轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白聯(lián)合滅活的菌株中，可能會(huì)有莫納甜產(chǎn)物丟失的減少，從而有更多的莫納甜被細(xì)胞生產(chǎn)出來(lái)并被轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)AcrAB TolC/EmrAB TolC等轉(zhuǎn)運(yùn)。另外一個(gè)可能是在四PET突變的背景下，會(huì)有更多的可能與莫納甜生物合成相關(guān)或不相關(guān)的代謝物積聚，這又會(huì)誘導(dǎo)莫納甜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，導(dǎo)致莫納甜的流出增多。
不同PET轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的各種缺失組合可能和四PET轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺失菌株一樣有效或者更有效。四PET突變背景與增加莫納甜轉(zhuǎn)運(yùn)的其他任何轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或條件組合可產(chǎn)生出莫納甜轉(zhuǎn)運(yùn)潛能更高的菌株。
上述結(jié)果證明，與相應(yīng)的野生型對(duì)照菌株相比，含有YhcP(AaeB)、YccS、YjcQ和YhfK推測(cè)流出轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(PET)缺失組合的大腸桿菌菌株可通過直接或間接機(jī)制排出更高的莫納甜/細(xì)胞干重。
實(shí)施例12 谷氨酸棒狀桿菌的轉(zhuǎn)化 在說(shuō)明書提到轉(zhuǎn)化谷氨酸棒狀桿菌的地方，使用的是下列方法。
谷氨酸棒狀桿菌的電感受態(tài)細(xì)胞通過將起始培養(yǎng)物(培養(yǎng)過夜)接種到200mlMB培養(yǎng)基(5g/L酵母提取物，15g/L胰蛋白胨，5g/L大豆胨(soytone)，5g/L氯化鈉)中使初始OD600nm達(dá)到0.1來(lái)制備。培養(yǎng)物在200 rpm振蕩條件下孵育，直到OD600nm達(dá)到0.7，4℃離心收集細(xì)胞。細(xì)胞團(tuán)用40m1用冰預(yù)冷的緩沖液(20mMHEPES，pH 7.2，含5％甘油)洗滌三次。然后用20ml用冰預(yù)冷的10％v/v甘油洗滌2次，細(xì)胞團(tuán)重懸于1ml 10％v/v甘油中。經(jīng)洗滌的電感受態(tài)細(xì)胞按每150μL/管冷凍儲(chǔ)存于-80℃。
在轉(zhuǎn)化電感受態(tài)谷氨酸棒狀桿菌細(xì)胞之前，在冰上凍溶150μL電感受態(tài)細(xì)胞。將1μg所需質(zhì)粒加入到細(xì)胞內(nèi)，在冰上孵育5分鐘，然后轉(zhuǎn)移到冷凍的0.2cm槽內(nèi)。在細(xì)胞懸液上覆蓋0.8mL用冰預(yù)冷的10％甘油，小心避免各層混合，在200ohm、25 uFd、12.5 kV/cm條件下電穿孔。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到4 mL 46℃預(yù)熱的MB培養(yǎng)基內(nèi)，46℃孵育6分鐘，不振蕩。細(xì)胞懸液在20℃、200rpm條件下孵育50分鐘，然后接種到含合適篩選抗生素的MB平板上，30℃孵育使轉(zhuǎn)化的谷氨酸棒狀桿菌菌株生長(zhǎng)。
實(shí)施例13 檢測(cè)莫納甜和莫納甜立體異構(gòu)體的方法 本實(shí)施例描述了用于檢測(cè)莫納甜、色氨酸和谷氨酸是否存在的方法。本實(shí)施例還描述了分離和檢測(cè)莫納甜的四種立體異構(gòu)體的方法。
用LC/MS/MS多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(″MRM″)分析莫納甜和色氨酸 利用Waters/Micromass液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(“LC/MS/MS”)儀對(duì)體外或體內(nèi)生化反應(yīng)所生產(chǎn)的莫納甜和色氨酸的混合物進(jìn)行分析，該設(shè)備包括一個(gè)Waters 2795液相色譜儀和一個(gè)Waters 996光電二極管陣列(PDA)吸光度檢測(cè)儀，后者位于色譜儀和Micromass Quattro Ultima三聯(lián)四極質(zhì)譜儀之間起串聯(lián)作用。利用2.1mm×250mm的Xterra MS C8反向色譜柱在40℃進(jìn)行LC分離。LC流動(dòng)相包含A)含0.05％(v/v)三氟乙酸的水和B)含0.05％(v/v)三氟乙酸的甲醇。
梯度洗脫為0-4分鐘5％B到35％B線性梯度，4-6.5分鐘35％B到60％B線性梯度，6.5-7分鐘60％B到90％B線性梯度，7-11分鐘在90％B等度，11-12分鐘90％B到95％B線性梯度，12-13分鐘95％B到5％B線性梯度，各輪之間有5分鐘的重平衡期。流速為0.25毫升/分鐘，監(jiān)測(cè)200nm到400nm之間的PDA吸光度。ESI-MS的所有參數(shù)都根據(jù)目的分析物的質(zhì)子化分子離子([M+H]+)的生成情況和特征性碎片離子的生成情況進(jìn)行了優(yōu)化和篩選。下面的設(shè)備參數(shù)用于莫納甜和色氨酸的LC/MS/MS多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(“MRM”)分析毛細(xì)管3.5kV；圓錐(Cone)40V；六角形(Hex)120V；孔徑0V；六角形(Hex)20V；來(lái)源溫度100℃；去溶劑化溫度350℃；去溶劑化氣體500L/h；圓錐氣體50L/h；低質(zhì)量分辨率(Q1)12.0；高質(zhì)量分辨率(Q1)12.0；離子能量0.2；入口-5V；碰撞能量8；出口1V；低質(zhì)量分辨(Q2)15；高質(zhì)量分辨(Q2)15；離子能量(Q2)3.5；倍增器650。5個(gè)莫納甜特異性親本到女兒(parent-to daughter)MRM躍遷用于體外和體內(nèi)反應(yīng)中莫納甜的特異性監(jiān)測(cè)。所監(jiān)測(cè)到的躍遷是293.1到158.3、293.1到168.2、293.1到211.2、293.1到230.2以及293.1到257.2。監(jiān)測(cè)到的色氨酸的MRM躍遷為204.7到146.4。為了內(nèi)標(biāo)定量莫納甜和色氨酸，分析了四個(gè)校正標(biāo)準(zhǔn)，其中包含四個(gè)不同比例的分析物與d5-色氨酸和d5-莫納甜的混合物。這些數(shù)據(jù)進(jìn)行線性最小二乘法分析形成莫納甜和色氨酸的校正曲線。每個(gè)樣品中加入固定量的d5-色氨酸和d5-莫納甜，反應(yīng)比例(莫納甜/d5-莫納甜；色氨酸/d5-色氨酸)與上述校正曲線結(jié)合用于計(jì)算混合物中每種分析物的量。
莫納甜的手性LC/MS/MS(MRM)檢測(cè) 體外和體內(nèi)反應(yīng)中莫納甜立體異構(gòu)體分布的確定通過1-氟-2-4-二硝基苯基-5-L-丙氨酸酰胺(“FDAA”)的衍生化再用反相LC/MS/MS MRM檢測(cè)來(lái)完成。
用FDAA衍生化莫納甜 在50μtL樣品或標(biāo)準(zhǔn)物中加入200μL1％的FDAA丙酮溶液。加入40μL 1.0M的碳酸氫鈉，混合物在40℃孵育1小時(shí)，偶爾加以攪拌。取出樣品并冷卻，用20μL2.0M HCl中和(要影響緩沖的生物混合物的中和可能需要更多的鹽酸)。除氣完成后，樣品可用于LC/MS/MS分析。
LC/MS/MS多反應(yīng)監(jiān)測(cè)用于確定體外和體內(nèi)反應(yīng)中莫納甜立體異構(gòu)體的分布 利用上面章節(jié)中所描述的LC/MS/MS設(shè)備完成分析。能夠分離莫納甜所有四種立體異構(gòu)體(特別是FDAA-莫納甜)的LC分離在40℃的Phenomenex Luna2.0×250mm(3μm)C18反相色譜柱上完成。LC流動(dòng)相包含A)含0.05％(質(zhì)量/體積)醋酸銨的水和B)乙睛。洗脫條件為0-2分鐘13％B等度，2-15分鐘13％B到30％B線性梯度，15-16分鐘30％B到80％B線性梯度，16-21分鐘80％B等度，和21-22分鐘80％B到13％B線性梯度，各輪之間有8分鐘的重平衡期。流速為0.23毫升/分鐘，監(jiān)測(cè)200nm到400nm之間的PDA吸光度。ESI-MS的所有參數(shù)都根據(jù)FDAA-莫納甜的質(zhì)子化分子離子([M-H]-)的生成情況和特征性碎片離子的生成情況進(jìn)行了優(yōu)化和篩選。
下列設(shè)備參數(shù)用于以陰離子ESI/MS模式進(jìn)行的莫納甜LC/MS分析毛細(xì)管2.0kV；圓錐25V；六角形110V；孔徑0V；六角形20V；來(lái)源溫度100℃；去溶劑化溫度350℃；去溶劑化氣體500L/h；圓錐氣體50L/h；低質(zhì)量分辨率(Q1)12.0；高質(zhì)量分辨率(Q1)12.0；離子能量0.2；入口-5V；碰撞能量20；出口1V；低質(zhì)量分辨(Q2)12；高質(zhì)量分辨(Q2)12；離子能量(Q2)3.0；倍增器650。3個(gè)FDAA-莫納甜特異性親本到女兒MRM躍遷用于體外和體內(nèi)反應(yīng)中FDAA-莫納甜的特異性監(jiān)測(cè)。躍遷為543.6到268.2、543.6到499.2以及543.6到525.2。根據(jù)與純化的莫納甜立體異構(gòu)體比較的色譜保留時(shí)間和質(zhì)譜數(shù)據(jù)鑒定FDAA-莫納甜立體異構(gòu)體。
實(shí)施例14 用水楊酸誘導(dǎo)可增加莫納甜的轉(zhuǎn)運(yùn) 用aspCProApEKEX-2谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032菌株在添加25μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，培養(yǎng)條件為37℃、250rpm振蕩。對(duì)于試驗(yàn)處理?yè)u瓶來(lái)說(shuō)，每個(gè)搖瓶加入100mL KraemerA培養(yǎng)基。Hoisted C.和Kraemer，R.，“流出載體系統(tǒng)參與谷氨酸棒狀桿菌內(nèi)谷氨酸排出的證據(jù)(Evidence for an efflux carriersystem involved in the secretion of glutamate by Corynebacterium glutamicum)”，Arch.Microbiol 151342-347，(1989)。Kraemer A培養(yǎng)基包含(每升)5g(NH4)2SO4、5g尿素、2g KH2PO4、1.53 K2HPO4、0.249g MgSO4*7H2O、50g葡萄糖、0.01gFeSO4-7H2O、0.01g MnSO4-H2O、0.01g CaCl2-2H2O、0.03mg ZnSO4-7H2O、0.1mgH3BO3、0.07mg CaCl2-6H2O、0.01mg NiCl2-2H2O、0.03mg CuCl2-2H2O、0.1mg來(lái)自(NH4)6Mo7O24-4H2O的Mo+6和1μg生物素。PH調(diào)至7.0。
為了處理，將4.2v/v％接種物加入到在500mL帶擋板搖瓶?jī)?nèi)的100mL培養(yǎng)基中。處理?xiàng)l件包括全程37℃孵育并以250rpm振蕩。在接種后1小時(shí)加入水楊酸鈉(0、1或2mM)。在0.45-0.6 OD600nm時(shí)，開始莫納甜操縱子的誘導(dǎo)。0.5mM IPTG用于誘導(dǎo)，在誘導(dǎo)時(shí)加入0.5mM維生素B6和0.04mM吡哆醛-5’-磷酸(“PLP”)。在開始誘導(dǎo)后3小時(shí)加入1gL-色氨酸、5g/L丙酮酸鈉和10μg/mL氨芐青霉素。在23.5和48小時(shí)采集用于莫納甜分析和確定細(xì)胞干重的樣品。
表14.1 水楊酸的誘導(dǎo)可提高莫納甜/細(xì)胞干重 MarA可活化mar調(diào)節(jié)子的表達(dá)，其中包括acrAB、tolC和marRAB，而MarR可通過抑制MarA的合成來(lái)下調(diào)這個(gè)反應(yīng)。試驗(yàn)證實(shí)，加入某些抗生素、弱的芳香酸如水楊酸以及結(jié)構(gòu)各不相同的其他化合物如解偶聯(lián)劑羰基氰氯苯腙(″CCCP″)可引起mar調(diào)節(jié)子的誘導(dǎo)，進(jìn)而導(dǎo)致AcrAB和TolC的表達(dá)。Grkovic，S.等，“細(xì)菌藥物外排系統(tǒng)的調(diào)節(jié)(Regulation of Bacterial Drug Export Systems)”，Microbiologyand Molecular Biology Reviews 66671-701，(2002)。
另外，在存在CCCP、弱酸水楊酸和許多結(jié)構(gòu)不相關(guān)的其他藥物時(shí)大腸桿菌的EmrAB多藥泵可被誘導(dǎo)。去阻遏是由MarR型的抑制蛋白EmrR控制的。Cohen，S.P.等，“水楊酸誘導(dǎo)大腸桿菌內(nèi)的抗生素耐藥性mar操縱子和非mar-依賴型途徑的活化(Salicylate induction of antibiotic resistance in Escherichia coliactivation ofthe mar operon and a mar-independent pathway)”，J.Bacteriol.1757856-7862，(1993)；Lomovskaya，O.等，“EmrR是大腸桿菌多藥耐藥泵EmrAB的負(fù)調(diào)節(jié)因子(EmrR is a negative regulator of the Escherichia coli multidrug resistance pumpEmrAB)”，J.Bacteriol.1772328-2334，(1995)。因此，加入水楊酸可提高大腸桿菌內(nèi)AcrAB和emrAB轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的活性。給棒狀桿菌添加水楊酸可誘導(dǎo)AcrAB/EmrAB的同源物或其他轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，導(dǎo)致莫納甜的轉(zhuǎn)運(yùn)增多。
因此用1mM或2mM水楊酸鈉處理谷氨酸棒狀桿菌可導(dǎo)致莫納甜的轉(zhuǎn)運(yùn)增多。按照實(shí)施例13的描述進(jìn)行莫納甜分析。在48小時(shí)時(shí)可以看到莫納甜的流出增加7％，而23.5小時(shí)時(shí)被轉(zhuǎn)運(yùn)莫納甜的增加70％。
實(shí)施例15 斯氏泛菌內(nèi)莫納甜產(chǎn)生和排出的證明 通過將1％斯氏泛菌細(xì)胞接種物在營(yíng)養(yǎng)肉湯內(nèi)培養(yǎng)過夜來(lái)制備點(diǎn)感受態(tài)的斯氏泛菌(ATCC 8200)。細(xì)胞在26℃孵育，250rpm振蕩，直到OD 600達(dá)到約0.6。離心(10分鐘，10,000×g)使細(xì)胞成團(tuán)，用50ml 10mM HEPES(pH 7.0)洗滌。用25ml 10mM HEPES緩沖液(pH 7.0)重復(fù)洗滌一次，然后進(jìn)行和上面一樣的離心。細(xì)胞再用25ml 10％甘油洗滌一次。離心以后，細(xì)胞重懸于500μL10％甘油中。每管40μL冷凍，儲(chǔ)存于-80℃直到使用。
按照Stratagene QuikChange位點(diǎn)特異性突變?cè)噭┖?斯加特基因公司(Stratagene)，Inc.)所描述的方法，利用誘變寡核苷酸(下劃線是Nde I基因座)，可以通過位點(diǎn)特異性的突變改變pPROLarA.122(克隆科技實(shí)驗(yàn)室有限公司(ClonTechLaboratories，Inc.))，在bp 132(克隆科技實(shí)驗(yàn)室有限公司所描述的核苷酸編號(hào))處引入Nde I限制性酶切位點(diǎn)，形成載體pPRONde 5’-GAGGAGAAAGGTACATATGGGTGAACAGAAAC-3’ 5’-CAGTTTCTGTTCACCCATATGTACCTTTCTCC-3’ 熱循環(huán)條件 1)96℃5分鐘 2)96℃30秒 3)55℃45秒 4)72℃3分鐘 5)重復(fù)步驟2-4；24次 6)72℃10分鐘 配方 10×擴(kuò)展聚合酶緩沖液5μL dNTP(各10mM)1μL pPRONde(約50ng/uL) 0.1μL PCR引物(各) 0.5μL 擴(kuò)展聚合酶 0.5μL 水 42.4μL 共計(jì)50μL 得到的PCR產(chǎn)物用PCR提純?cè)噭┖?恰根公司(Qiagen))純化，并用Nde I限制性內(nèi)切酶消化。然后在0.8％瓊脂糖凝膠上凝膠純化被消化的DNA并連接起來(lái)。通過乙醇沉淀法沉淀連接混合物，再用KpnI限制性內(nèi)切酶消化以使所有親本質(zhì)粒都線性化。反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌電感受態(tài)細(xì)胞DH10B內(nèi)。通過用KpnI限制性內(nèi)切酶消化根據(jù)KpnI基因座的去除來(lái)篩選轉(zhuǎn)化子。
利用Quikchange定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?斯加特基因公司(Strategene)，La Jolla，CA)刪除pPRONde載體上一個(gè)29bp的片段，已有報(bào)道表明載體內(nèi)該片段的重復(fù)性可使載體在應(yīng)激條件下不穩(wěn)定。誘變所用引物為 5’-ACGTCTGTGTGGAATTCTCGGACACCGAGGAG-3’和 5’-CTCCTCGGTGTCCGAGAATTCCACACAGACGT-3’。
按照廠商的說(shuō)明書進(jìn)行誘變。通過用EcoRI限制性內(nèi)切酶消化來(lái)篩選克隆，因?yàn)閯h除預(yù)期的DNA片段會(huì)產(chǎn)生一個(gè)新的EcoRI限制性酶切位點(diǎn)，突變體通過測(cè)序來(lái)確認(rèn)。得到的載體命名為pPRONdeDel。利用限制性酶切位點(diǎn)NdeI和BamHI將aspC基因插入載體pPRONdeDel。隨后利用限制性酶切位點(diǎn)BamHI和NotI將proA基因插入載體pPRONdeDel，得到載體aspC/proA/pPRONdeDel(APpPRONdeDel)。
按照Bio-Rad電穿孔操作手冊(cè)所描述的利用0.2cm槽和Bio-Rad Gene Pulser II系統(tǒng)將載體APpPRONdeDel轉(zhuǎn)化到斯氏泛菌內(nèi)。細(xì)胞在900μL SOC培養(yǎng)基中26℃孵育1小時(shí)，250rpm振蕩，使細(xì)胞恢復(fù)。細(xì)胞接種到含卡那霉素(25μg/mL)的LB-瓊脂平板上。
為了進(jìn)行接種，斯氏泛菌在含25μg/mL卡那霉素的Luria-Bertani(″LB″)培養(yǎng)基內(nèi)、30℃、250rpm振蕩培養(yǎng)過夜。為了進(jìn)行試驗(yàn)處理，按照如下方法制備trp-1+葡萄糖培養(yǎng)基(Zeman等，F(xiàn)olia Microbiol.35200-204，(1990))。向800mL納米純的水中加入下列試劑2g(NH4)2SO4和13.6g KH2PO4。PH調(diào)至7.0，體積增加到948mL，并對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行高壓滅菌。滅菌后在1.8mL體積的培養(yǎng)基中加入0.2gMgSO4*7H2O、0.01g CaCl2*2H2O和0.5mg FeSO4*7H2O，然后加入0.2mLNeidhardt微量營(yíng)養(yǎng)素溶液。Neidhardt，F(xiàn).C.等，“腸道細(xì)菌培養(yǎng)基”，J.Bacteriol.119736-746(1974)。Neidhardt培養(yǎng)基包含(每升)0.18g(NH4)6(MO7)24-4H2O、1.24gH3BO3、0.36g CoCl2-6H2O、0.12g CuSO4(無(wú)水的)、0.8g MnCl2-4H2O和0.14gZnSO4-7H2O。單獨(dú)制備50％的葡萄糖溶液并通過過濾除菌。將40mL葡萄糖溶液和10mL 1M 3-嗎啉代丙磺酸(“MOPS”)緩沖液加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基(950mL)中，最后體積為1L。
為了處理，將3.5-5.0 v/v％接種物加入到含25μg/mL卡那霉素的在500mL帶擋板搖瓶?jī)?nèi)的100mL培養(yǎng)基中。處理?xiàng)l件包括整個(gè)試驗(yàn)以250rpm振蕩，溫度為37℃直到接種，然后降到30℃，隨后誘導(dǎo)。在0.35-0.50 OD600nm時(shí)，開始質(zhì)粒基因的誘導(dǎo)。在誘導(dǎo)時(shí)，加入0.5mM IPTG、0.5％阿拉伯糖、0.5mM維生素B6和0.2mL Balch維生素。在開始誘導(dǎo)后3.0小時(shí)加入10g L-色氨酸、10g/L丙酮酸鈉、0.04mM吡哆醛-5’-磷酸(“PLP”)和0.2％吐溫20(聚氧乙烯20-失水山梨糖醇單月桂酸酯)。某些處理包括在誘導(dǎo)開始后3.0小時(shí)加入2.5mM癸酸鈉和/或10μg/ml氨芐青霉素。在24、30和48小時(shí)采集用于莫納甜分析和確定細(xì)胞干重的樣品。
表15.1 斯氏泛菌排出的莫納甜/細(xì)胞干重 斯氏泛菌內(nèi)莫納甜操縱子、aspC-氨基轉(zhuǎn)移酶和proA-醛縮酶的過表達(dá)可導(dǎo)致莫納甜的流出(莫納甜/細(xì)胞干重)升高。當(dāng)培養(yǎng)基中加入吐溫20和氨芐青霉素時(shí)，48小時(shí)的莫納甜排出增加4到5倍。據(jù)報(bào)道，吐溫和氨芐青霉素可通過影響細(xì)胞被膜從而輔助代謝物轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞而使細(xì)胞應(yīng)激。
這是首次報(bào)道泛菌屬和斯氏泛菌種內(nèi)有莫納甜的產(chǎn)生和排出。
實(shí)施例16 RobA蛋白的過表達(dá)可增加莫納甜的排出 RobA是DNA結(jié)合蛋白XylS/AraC亞科的成員，試驗(yàn)表明當(dāng)其過表達(dá)時(shí)可誘導(dǎo)大腸桿菌對(duì)多種抗生素的耐藥。據(jù)報(bào)道，RobA的過表達(dá)所誘導(dǎo)的多重抗生素耐藥主要依賴于AcrAB流出泵的活化以及micF的活化。Tanaka T.等，“RobA誘導(dǎo)的多重抗生素耐藥主要依賴于AcrAB流出泵的活化(RobA-induced multipleantibiotic resistance largely depends on the activation of the AcrAB efflux)”，MicrobiolImmunol.41697-702，(1997)。MicF小RNA是由編碼OmpC外膜孔道蛋白的基因分散編碼的，可抑制另一種外面孔道蛋白OmpF的表達(dá)。MicF在莫納甜流出中所扮演的確切角色還有待于證實(shí)。
用于本試驗(yàn)的菌株包括大腸桿菌MG1655::aspC/proA/pProNdeDel，該菌株帶有pUC19載體，大腸桿菌的robA基因被克隆到該載體內(nèi)。對(duì)照菌株是帶pUC19載體的大腸桿菌MG1655::aspC/proA/pProNde。robA基因擴(kuò)增自大腸桿菌W3110，所用引物為5’TTAAGGCCGTCGACATGGATCAGGCCGGCATTAT3’和5’TTCCAAGGTTGGA TCCCTAAACGATGCGGCAGGC3’，該引物可將SalI和BamHI基因座引入到擴(kuò)增片段的末端。PCR片段克隆在載體pUC19(GenBank/EMBL登錄號(hào)L09137)的SalI和BamHI基因座之間。為了進(jìn)行接種，大腸桿菌菌株在含100μg/mL氨芐青霉素和50μg/mL卡那霉素的Luria-Bertani(″LB″)培養(yǎng)基內(nèi)、37℃、250rpm振蕩培養(yǎng)過夜。
為了進(jìn)行試驗(yàn)處理，按照如下方法制備用于提高色氨酸在大腸桿菌內(nèi)產(chǎn)量的基本培養(yǎng)基Trp-1+葡萄糖培養(yǎng)基(Zeman等，F(xiàn)olia Microbiol.35200-204，(1990))。向800mL納米純的水中加入下列試劑2g(NH4)2SO4和13.6g KH2PO4。PH調(diào)至7.0，體積增加到948mL，并對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行高壓滅菌。滅菌后在1.8mL體積的培養(yǎng)基中加入0.2g MgSO4*7H2O、0.01g CaCl2*2H2O和0.5mg FeSO4*7H2O，然后加入0.2mL Neidhardt微量營(yíng)養(yǎng)素溶液。Neidhardt，F(xiàn).C.等，“腸道細(xì)菌培養(yǎng)基”，J.Bacteriol.119736-746(1974)。Neidhardt培養(yǎng)基包含(每升)0.18g(NH4)6(MO7)24-4H2O、1.24g H3BO3、0.36g CoCl2-6H2O、0.12g CuSO4(無(wú)水的)、0.8g MnCl2-4H2O和0.14g ZnSO4-7H2O。單獨(dú)制備50％的葡萄糖溶液并通過過濾除菌。將40mL葡萄糖溶液和10mL 1M 3-嗎啉代丙磺酸(“MOPS”)緩沖液加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基(950mL)中，最后體積為1L。
為了處理，將3.5-5.0 v/v％接種物加入到含100μg/mL氨芐青霉素的在500mL帶擋板搖瓶?jī)?nèi)的100mL培養(yǎng)基中。處理?xiàng)l件包括整個(gè)試驗(yàn)以250rpm振蕩，溫度為37℃直到接種，然后降到30℃，隨后誘導(dǎo)。在0.35-0.50 OD600nm時(shí)，開始質(zhì)?；虻恼T導(dǎo)。在誘導(dǎo)時(shí)，加入1.0mM IPTG、0.5％阿拉伯糖、0.5mM維生素B6和0.2mL Balch維生素。在開始誘導(dǎo)后3小時(shí)加入10g L-色氨酸、10g/L丙酮酸鈉、0.04mM吡哆醛-5’-磷酸(“PLP”)和0.2％吐溫20(聚氧乙烯20-失水山梨糖醇單月桂酸酯)。某些處理包括在誘導(dǎo)開始后3小時(shí)加入2.5mM癸酸鈉。在24、30和48小時(shí)采集用于莫納甜分析和確定細(xì)胞干重的樣品。
表16.1 大腸桿菌排出的莫納甜/細(xì)胞干重 所有處理都是n＝2 在48小時(shí)時(shí)，未用癸酸鈉處理的RobA過表達(dá)可導(dǎo)致莫納甜流出增多。當(dāng)RobA過表達(dá)時(shí)，48小時(shí)的莫納甜/細(xì)胞干重平均為10.41mg/g，而無(wú)RobA過表達(dá)時(shí)僅為2.94mg/g。RobA的過表達(dá)可使莫納甜的流出升高3.5倍。這說(shuō)明RobA的過表達(dá)對(duì)AcrAB的表達(dá)或micF有正面影響，導(dǎo)致莫納甜的流出增多。MicF在莫納甜流出中所扮演的確切角色還有待于證實(shí)。
表16.2 大腸桿菌排出的莫納甜/細(xì)胞干重 所有處理都是n＝2 在48小時(shí)時(shí)，用2.5mM癸酸鈉處理的RobA過表達(dá)可導(dǎo)致莫納甜流出增多。當(dāng)RobA過表達(dá)時(shí)，48小時(shí)的莫納甜/細(xì)胞干重平均為25.62mg/g，而無(wú)RobA過表達(dá)時(shí)僅為4.31mg/g。在有癸酸鈉存在的條件下RobA的過表達(dá)可使莫納甜的流出升高超過5倍。這說(shuō)明RobA的過表達(dá)和癸酸鹽的加入對(duì)AcrAB的表達(dá)或micF有正面的并且可能是協(xié)同的影響，導(dǎo)致莫納甜的流出增多。MicF在莫納甜流出中所扮演的確切角色還有待于證實(shí)。
表16.3 大腸桿菌ΔacrAB排出的莫納甜/細(xì)胞干重 所有處理都是n＝2 所有處理中加入2.5mM癸酸鈉 在24、30和48小時(shí)時(shí)，添加2.5mM癸酸鈉和RobA過表達(dá)可導(dǎo)致大腸桿菌MG1655 ΔAcrAB菌株的莫納甜流出增多。當(dāng)RobA過表達(dá)時(shí)，48小時(shí)ΔAcrAB菌株的莫納甜/細(xì)胞干重平均為81.7mg/g，而無(wú)RobA過表達(dá)時(shí)僅為39.3mg/g。在有癸酸鈉存在的條件下RobA在ΔAcrAB菌株內(nèi)的過表達(dá)可使莫納甜的流出升高超過2倍。這說(shuō)明ΔAcrAB菌株內(nèi)RobA的過表達(dá)和癸酸鹽的加入可導(dǎo)致莫納甜的流出增多，這可能是由對(duì)micF或AcrAB轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)之外的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的作用造成的。
根據(jù)上述結(jié)果可以得出結(jié)論，RobA對(duì)莫納甜流出有正面影響，這可能是通過AcrAB或其他轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的活化實(shí)現(xiàn)的。
實(shí)施例17 RamA蛋白的過表達(dá)可增加莫納甜的排出 RamA是產(chǎn)氣腸桿菌內(nèi)的一個(gè)含113個(gè)氨基酸的調(diào)節(jié)蛋白，屬于AraC-Xy1S轉(zhuǎn)錄活化因子家族。據(jù)報(bào)道，RamA在藥物敏感的大腸桿菌JM109和產(chǎn)氣腸桿菌ATCC 13048內(nèi)誘導(dǎo)出MDR表型，導(dǎo)致AcrA的合成增多，AcrA是AcrAB-TolC藥物流出泵的一個(gè)組分。研究表明RamA步進(jìn)可以增強(qiáng)marRAB操縱子的轉(zhuǎn)錄，而且能夠在mar-缺陷的菌株內(nèi)誘導(dǎo)多藥耐藥(“MDR”)表型。因此，RamA除了是一個(gè)MDR級(jí)聯(lián)的自治活化因子之外，還是Mar操縱子的轉(zhuǎn)錄活化因子。CholletR.等，“RamA是產(chǎn)氣腸桿菌內(nèi)的多藥耐藥級(jí)聯(lián)的另一個(gè)活化因子(RamA is analternate activator of the multidrug resistance cascade in Enterobacter aerogenes)”，Antimicrob Agents Chemother.482518-2523，(2004)。
用于本試驗(yàn)的菌株包括大腸桿菌MG1655::aspC/proA/pProNdeDel，該菌株帶有pUC19載體(GenBank/EMBL登錄號(hào)L09137)，產(chǎn)氣腸桿菌的ramA基因被克隆到該載體內(nèi)。對(duì)照菌株是帶pUC19載體的大腸桿菌MG1655::aspC/proA/pProNde。ramA基因擴(kuò)增自產(chǎn)氣腸桿菌ATCC13048，所用引物為5’GGCCGGTTAAGTCGACATGAATATATCCGCTCAGG3’和5’TTAACCTTGGATCC TCAGTGCGCGCGGCTGT3’，該引物可將SalI和BamHI基因座引入到擴(kuò)增片段的末端。PCR片段克隆在載體pUC19(GenBank/EMBL登錄號(hào)L09137)的SalI和BamHI基因座之間。為了進(jìn)行接種，大腸桿菌菌株在含100μg/mL氨芐青霉素和50μg/mL卡那霉素的Luria-Bertani(″LB″)培養(yǎng)基內(nèi)、37℃、250rpm振蕩培養(yǎng)過夜。
為了進(jìn)行試驗(yàn)處理，按照如下方法制備用于提高色氨酸在大腸桿菌內(nèi)產(chǎn)量的基本培養(yǎng)基Trp-1+葡萄糖培養(yǎng)基(Zeman等，F(xiàn)olia Microbiol.35200-204，(1990))。向800mL納米純的水中加入下列試劑2g(NH4)2SO4和13.6g KH2PO4。PH調(diào)至7.0，體積增加到948mL，并對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行高壓滅菌。滅菌后在1.8mL體積的培養(yǎng)基中加入0.2g MgSO4*7H2O、0.01g CaCl2*2H2O和0.5mg FeSO4*7H2O，然后加入0.2mL Neidhardt微量營(yíng)養(yǎng)素溶液。Neidhardt，F(xiàn).C.等，“腸道細(xì)菌培養(yǎng)基”，J.Bacteriol.119736-746(1974)。Neidhardt培養(yǎng)基包含(每升)0.18g(NH4)6(MO7)24-4H2O、1.24g H3BO3、0.36g CoCl2-6H2O、0.12g CuSO4(無(wú)水的)、0.8g MnCl2-4H2O和0.14g ZnSO4-7H2O。單獨(dú)制備50％的葡萄糖溶液并通過過濾除菌。將40mL葡萄糖溶液和10mL 1M 3-嗎啉代丙磺酸(“MOPS”)緩沖液加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基(950mL)中，最后體積為1L。
為了處理，將3.5-5.0 v/v％接種物加入到含100μg/mL氨芐青霉素的在500mL帶擋板搖瓶?jī)?nèi)的100mL培養(yǎng)基中。處理?xiàng)l件包括整個(gè)試驗(yàn)以250rpm振蕩，溫度為37℃直到接種，然后降到30℃，隨后誘導(dǎo)。在0.30-0.50 OD600nm時(shí)，開始質(zhì)?；虻恼T導(dǎo)。在誘導(dǎo)時(shí)，加入1.0mM IPTG、0.5％阿拉伯糖、0.5mM維生素B6和0.2mL Balch維生素。在開始誘導(dǎo)后3小時(shí)加入10gL-色氨酸、10g/L丙酮酸鈉、0.04mM吡哆醛-5’-磷酸(“PLP”)和0.2％吐溫20(聚氧乙烯20-失水山梨糖醇單月桂酸酯)。某些處理包括在誘導(dǎo)開始后3小時(shí)加入2.5mM癸酸鈉。在24、30和48小時(shí)采集用于莫納甜分析和確定細(xì)胞干重的樣品。
表17.1 大腸桿菌排出的莫納甜/細(xì)胞干重 所有處理都是n＝2 在30和48小時(shí)時(shí)，未用癸酸鈉處理的RamA過表達(dá)都可導(dǎo)致莫納甜流出增多。當(dāng)RamA過表達(dá)時(shí)，48小時(shí)的莫納甜/細(xì)胞干重平均為5.92mg/g，而無(wú)RobA過表達(dá)時(shí)僅為2.94mg/g。RamA的過表達(dá)可使莫納甜的流出升高2倍。這說(shuō)明RamA的過表達(dá)對(duì)mar操縱子或多藥耐藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因或二者有正面影響，導(dǎo)致莫納甜的流出增多。
表17.2 大腸桿菌排出的莫納甜/細(xì)胞干重 所有處理都是n＝2 在30和48小時(shí)時(shí)，用2.5mM癸酸鈉處理的RamA過表達(dá)都可導(dǎo)致莫納甜流出增多。當(dāng)RamA過表達(dá)時(shí)，48小時(shí)的莫納甜/細(xì)胞干重平均為13.90mg/g，而無(wú)RamA過表達(dá)時(shí)僅為4.31mg/g。在有癸酸鈉存在的條件下RamA的過表達(dá)可使莫納甜的流出升高超過3.2倍。這說(shuō)明在有癸酸鈉存在的條件下，RamA可作用于mar操縱子或多藥耐藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因或二者，導(dǎo)致莫納甜的流出增多。
表17.3 大腸桿菌ΔacrAB排出的莫納甜/細(xì)胞干重 所有處理都是n＝2 所有處理中加入2.5mM癸酸鈉 RamA在帶有莫納甜操縱子的大腸桿菌ΔAcrAB內(nèi)的過表達(dá)可使莫納甜的排出高于無(wú)RamA過表達(dá)的同一菌株。在48小時(shí)時(shí)，RamA過表達(dá)可導(dǎo)致莫納甜/細(xì)胞干重達(dá)到61.1mg/g，而無(wú)RamA過表達(dá)時(shí)僅為39.3 mg/g。這代表RamA的過表達(dá)可使莫納甜的流出升高1.5倍。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明在沒有AcrAB轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與時(shí)RamA的過表達(dá)可使莫納甜的排出增多。這種對(duì)莫納甜流出的正面影響可能是由于mar操縱子或AcrAB之外的其他轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因/系統(tǒng)的活化引起的。
因此，我們已經(jīng)證明ramA基因在大腸桿菌內(nèi)的過表達(dá)可導(dǎo)致莫納甜的流出增多。在AcrAB系統(tǒng)缺失的宿主背景中也觀察到了莫納甜流出的增多。這說(shuō)明對(duì)莫納甜流出的正面影響也可能是由于其對(duì)AcrAB轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)之外的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的影響造成的。
實(shí)施例18 MarA蛋白的過表達(dá)可增加莫納甜的排出 acrAB表達(dá)的轉(zhuǎn)錄活化是導(dǎo)致過表達(dá)MarA的菌株產(chǎn)生多藥耐藥的主要原因，MarA是轉(zhuǎn)錄活化因子AraC家族的成員。MarA通過結(jié)合到被稱為mar盒的位于各種靶基因啟動(dòng)子附近的DNA區(qū)活化其自身的轉(zhuǎn)錄和許多mar調(diào)節(jié)子基因的轉(zhuǎn)錄。AcrAB也與mar盒相鄰，試驗(yàn)證明MarA可與mar盒結(jié)合并活化轉(zhuǎn)錄。Alekshun，M.N.和Levy，S.B.，“染色體介導(dǎo)的多藥抗生素耐藥性的調(diào)節(jié)mar調(diào)節(jié)子(Regulation of chromosomally mediated multiple antibiotic resistancethe marregulon)”，Antimicrob.Agents Chemother.412067-2075，(1997)。
另外，試驗(yàn)還證明MarA的過表達(dá)可導(dǎo)致AcrAB-TolC泵復(fù)合體的TolC組分的合成增加，結(jié)合鑒定出的位于tolC基因上游的推測(cè)的mar/rob/sox盒，強(qiáng)烈暗示tolC也屬于mar調(diào)節(jié)子。Aono，R.等，“mar-sox調(diào)節(jié)子的一個(gè)可能成員-外膜蛋白TolC參與大腸桿菌K-12對(duì)有機(jī)溶劑耐受的維持和上升(Involvement of outer membraneprotein TolC，a possible member of the mar-sox regulon，in maintenance andimprovement of organic solvent tolerance of Escherichia coli K-12)”，J Bacteriol.180938-944(1998)。
據(jù)報(bào)道，MarA的轉(zhuǎn)錄活化功能在自然界中是普遍存在的，因?yàn)镸arA在體內(nèi)和體外都能啟動(dòng)具有不同功能的蛋白的編碼基因的轉(zhuǎn)錄。對(duì)組成性表達(dá)MarA的菌株進(jìn)行的基因芯片分析表明超過60個(gè)大腸桿菌基因可被此蛋白調(diào)節(jié)，但調(diào)節(jié)效應(yīng)不同(Barbosa，T.M.和Levy，S.B.，“MarA的組成性表達(dá)可導(dǎo)致大腸桿菌內(nèi)60個(gè)以上的基因發(fā)生差異表達(dá)(Differential expression of over 60 chromosomal genes inEscherichia coli by constitutive expression of MarA)”，J.Bacteriol.1823467-3474，(2000))，而利用可誘導(dǎo)的MarA表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行的第二項(xiàng)研究鑒定出了另外67個(gè)MarA調(diào)節(jié)的基因。Pomposiello，P.J.等.，“超氧化物和水楊酸鈉對(duì)大腸桿菌基因組范圍的轉(zhuǎn)錄情況的影響(Genome-wide transcriptional profiling of the Escherichia coliresponses to superoxide stress and sodium salicylate)”，J.Bacteriol.1833890-3902，(2001)。據(jù)報(bào)道，MarA還能夠活化帶有mar盒的基因，該盒與共有序列具有實(shí)質(zhì)的差異。Barbosa，T.M.和S.B.Levy，“MarA通過II類啟動(dòng)子上高度差異的mar盒活化大腸桿菌的nfnB基因(Activation of the Escherichia coli nfnB gene by MarAthrough a highly divergent marbox in a class II promoter)”，Mol.Microbiol.45191-202，(2002)。
總之，MarA可活化mar調(diào)節(jié)子的表達(dá)，其中包括acrAB、tolC和marRAB，而MarR的作用是通過抑制MarA的合成來(lái)下調(diào)這個(gè)反應(yīng)。雖然質(zhì)粒來(lái)源的MarA的過表達(dá)足以活化mar調(diào)節(jié)子基因，但是試驗(yàn)證實(shí)，加入抗生素四環(huán)素和氯霉素、弱芳香酸如水楊酸以及具有不同結(jié)構(gòu)的其他化合物如解偶聯(lián)劑羰基氰氯苯腙和氧化還原循環(huán)化合物維生素K3和藍(lán)雪醌都可以引起mar調(diào)節(jié)子表達(dá)的誘導(dǎo)。GrkovicS等，“細(xì)菌藥物外排系統(tǒng)的調(diào)節(jié)(Regulation of bacterial drug export systems)”，Microbiol Mol Biol Rev.66671-701，(2002)。
用于本試驗(yàn)的菌株包括大腸桿菌MG1655::aspC/proA/pProNdeDel，該菌株帶有pUC19載體(GenBank/EMBL登錄號(hào)L09137)，大腸桿菌的marA基因被克隆到該載體內(nèi)。對(duì)照菌株是帶pUC19載體的大腸桿菌MG1655::aspC/proA/pProNde。利用PCR技術(shù)(本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的)從大腸桿菌W3110擴(kuò)增marA基因，所用引物為E.coliMarASalIF-5’TTAAGGCCGTCGACATGACGATGTCCAGACGCAATA3’和E.coliMarABamHIR-5’GCAGTGCCGGATCCCTAGCTGTTGTAATGATTTA3’。為了進(jìn)行接種，大腸桿菌菌株在含100μg/mL氨芐青霉素和50μg/mL卡那霉素的Luria-Bertani(″LB″)培養(yǎng)基內(nèi)、37℃、250rpm振蕩培養(yǎng)過夜。
為了進(jìn)行試驗(yàn)處理，按照如下方法制備用于提高色氨酸在大腸桿菌內(nèi)產(chǎn)量的基本培養(yǎng)基Trp-1+葡萄糖培養(yǎng)基(Zeman等，F(xiàn)olia Microbiol.35200-204，(1990))。向800mL納米純的水中加入下列試劑2g(NH4)2SO4和13.6g KH2PO4。PH調(diào)至7.0，體積增加到948mL，并對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行高壓滅菌。滅菌后在1.8mL體積的培養(yǎng)基中加入0.2g MgSO4*7H2O、0.01g CaCl2*2H2O和0.5mg FeSO4*7H2O，然后加入0.2mL Neidhardt微量營(yíng)養(yǎng)素溶液。Neidhardt，F(xiàn).C.等，“腸道細(xì)菌培養(yǎng)基”，J.Bacteriol.119736-746(1974)。Neidhardt培養(yǎng)基包含(每升)0.18g(NH4)6(MO7)24-4H2O、1.24g H3BO3、0.36g CoCl2-6H2O、0.12g CuSO4(無(wú)水的)、0.8g MnCl2-4H2O和0.14g ZnSO4-7H2O。單獨(dú)制備50％的葡萄糖溶液并通過過濾除菌。將40mL葡萄糖溶液和10mL 1M 3-嗎啉代丙磺酸(“MOPS”)緩沖液加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基(950mL)中，最后體積為1L。
為了處理，將3.2-3.6 v/v％接種物加入到含100μg/mL氨芐青霉素的在500mL帶擋板搖瓶?jī)?nèi)的100mL培養(yǎng)基中。處理?xiàng)l件包括整個(gè)試驗(yàn)以250rpm振蕩，溫度為37℃直到接種，然后降到30℃，隨后誘導(dǎo)。在0.35-0.50 OD600nm時(shí)，開始質(zhì)?；虻恼T導(dǎo)。在誘導(dǎo)時(shí)，加入1.0mM IPTG、0.5％阿拉伯糖、0.5mM維生素B6和0.2mL Balch維生素。在開始誘導(dǎo)后3.0小時(shí)加入10gL-色氨酸、10g/L丙酮酸鈉、0.04mM吡哆醛-5’-磷酸(“PLP”)和0.2％吐溫20(聚氧乙烯20-失水山梨糖醇單月桂酸酯)。在接種后24小時(shí)，每個(gè)搖瓶?jī)?nèi)再加入10g/L丙酮酸鈉。某些處理包括在誘導(dǎo)開始后3.0小時(shí)加入2.5mM癸酸鈉。在24、30和72小時(shí)采集用于莫納甜分析和確定細(xì)胞干重的樣品。
表18.1 大腸桿菌排出的莫納甜/細(xì)胞干重 所有處理都是n＝2 在未添加上述的癸酸鈉時(shí)，marA的過表達(dá)可導(dǎo)致莫納甜的流出增多(莫納甜/細(xì)胞干重)。因MarA基因的過表達(dá)，莫納甜(mg)/g細(xì)胞干重增加了10倍。MarA對(duì)AcrAB轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的影響、與多重轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相互作用的tolC基因的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)和/或在莫納甜流出中發(fā)揮作用的其他轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的可能上調(diào)都可以解釋這種明顯增加。
表18.2 大腸桿菌排出的莫納甜/細(xì)胞干重 所有處理都是n＝2 在如上述添加癸酸鈉的情況下，marA的過表達(dá)可導(dǎo)致莫納甜的流出進(jìn)一步增多(莫納甜/細(xì)胞干重)。加入2.5mM癸酸鈉后，在72小時(shí)時(shí)，marA菌株所排出的莫納甜/細(xì)胞干重平均值達(dá)到51.9mg/g，而對(duì)照菌株只有2.7mg/g，這表示莫納甜的流出升高了19倍。這說(shuō)明marA的過表達(dá)對(duì)流出莫納甜的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有實(shí)質(zhì)影響。癸酸鈉與marA的過表達(dá)顯示有協(xié)同作用。
表18.4 帶莫納甜操縱子的大腸桿菌ΔacrAB排出的莫納甜/細(xì)胞干重 所有處理都是n＝2 所有處理中加入2.5mM癸酸鈉 marA的過表達(dá)與acrAB敲除突變的組合可導(dǎo)致72小時(shí)時(shí)的莫納甜/細(xì)胞干重達(dá)到209mg/g，而不含marA質(zhì)粒的acrAB敲除突變株只有62.6mg/g。甚至到24小時(shí)時(shí)，acrAB敲除/marA過表達(dá)菌株超過對(duì)照2倍以上(54.6到22.2莫納甜(mg)/dcw(g))。這是一個(gè)AcrAB轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺失和調(diào)節(jié)基因如marA過表達(dá)的組合對(duì)莫納甜流出有協(xié)同效應(yīng)的例子。
已知MarA可活化acrAB的表達(dá)，但是在acrAB敲除株中，莫納甜的排出比正常株甚至更高。據(jù)報(bào)道，除了acrA如mtr(色氨酸-特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)、ompX(外膜蛋白X)和yadG(推測(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的ATP結(jié)合組分)之外，MarA的表達(dá)還可提高參與轉(zhuǎn)運(yùn)的多個(gè)基因的表達(dá)。因此，這個(gè)效應(yīng)可能是由參與莫納甜排出的除AcrAB之外的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的誘導(dǎo)所引起的。已知MarA還可活化tolC的轉(zhuǎn)錄，這是多重轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的一個(gè)組分。因此，莫納甜轉(zhuǎn)運(yùn)的增加可能是由需要TolC的多重轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用引起的。
這些結(jié)果證明MarA對(duì)大腸桿菌內(nèi)的莫納甜流出有很強(qiáng)的正面影響。
實(shí)施例19 BaeR蛋白的過表達(dá)可增加莫納甜的排出 BaeSR二組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)控制輸出基因的表達(dá)，賦予大腸桿菌耐藥性。Nagakubo，S.等，J.Bacteriol.1844161-4167，(2002)；Baranova，N.和Nikaido，H.，“baeSR二組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)可活化大腸桿菌內(nèi)yegMNOB(mdtABCD)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因簇的轉(zhuǎn)錄并增強(qiáng)其對(duì)新生霉素和脫氧膽酸的耐受性(The baeSR two-component regulatorysystem activates transcription of the yegMNOB(mdtABCD)transporter gene cluster inEscherichia coli and increases its resistance to novobiocin and deoxycholate)”，JBacteriol.1844168-4176(2002)。據(jù)報(bào)道，BaeSR二組分系統(tǒng)通過調(diào)節(jié)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)調(diào)節(jié)大腸桿菌的藥物耐藥性。Baranova，N.和Nikaido，H.，“baeSR二組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)可活化大腸桿菌內(nèi)yegMNOB(mdtABCD)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因簇的轉(zhuǎn)錄并增強(qiáng)其對(duì)新生霉素和脫氧膽酸的耐受性”，J Bacteriol.1844168-4176(2002)。Nagakubo，S.K.等，“推測(cè)的反應(yīng)調(diào)節(jié)因子BaeR通過新型多藥輸出蛋白系統(tǒng)MdtABC刺激大腸桿菌的多藥耐藥性(The putative response regulator BaeRstimulates multidrug resistance of Escherichia coli via a novel multidrug exportersystem，MdtABC)”，J.Bacteriol.1844161-4167，(2002)。反應(yīng)調(diào)節(jié)因子BaeR調(diào)節(jié)編碼多藥輸出蛋白系統(tǒng)的mdtABC和acrD的表達(dá)。Hirakawa，H.K.等，“大腸桿菌內(nèi)二組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的反應(yīng)調(diào)節(jié)因子的過表達(dá)所介導(dǎo)的藥物耐藥性的綜合研究”，J.Bacteriol.1851851-1856，(2003)；Hirakawa，H.K.等，“大腸桿菌內(nèi)二組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的反應(yīng)調(diào)節(jié)因子的過表達(dá)所調(diào)節(jié)的β-內(nèi)酰胺耐藥性(Comprehensivestudies on the drug resistance mediated by the overexpression of response regulators oftwo-component signal transduction systems in Escherichia coli)”，J.Antimicrob.Chemother.52576-582，(2003)。據(jù)報(bào)道，在大腸桿菌的主要耐藥輸出蛋白AcrB缺失的背景下，BaeR的過表達(dá)可賦予抗β-內(nèi)酰胺、新生霉素、十二烷基硫酸鈉和牛膽酸鈉的耐藥性。還有報(bào)道顯示，BaeR可提高外膜通道tolC基因的表達(dá)，tolC基因是MdtABC、AcrD和其他轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)發(fā)揮功能所必需的。Nishino，K.等，“TolC依賴性的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在大腸桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺的耐藥性中的作用(Roles ofTolC-dependent multidrug transporters of Escherichia coli in resistance to β-lactams)”，Antimicrob.Agents Chemother.473030-3033，(2003)；Nishino，K.和Yamaguchi，A.，“大腸桿菌內(nèi)推測(cè)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的完全文庫(kù)的分析(Analysis of acomplete library of putative drug transporter genes in Escherichia coli)”，J.Bacteriol.1835803-5812，(2001)。
用于本試驗(yàn)的菌株是大腸桿菌MG1655::aspC/proA/pProNdeDel，該菌株帶有pUC19載體，pUC19載體內(nèi)插入或未插入baeR基因。baeR基因擴(kuò)增自大腸桿菌W3110，所用引物為E.colibaeRSalIF5’GGCCTTCCGTCGACATGACCGAGTTACCAATC3’和E.colibaeRBamHIR5’TTCCAAGGTTGGATCCCTAAACGATGCGGCAGGC3’， 該引物可將SalI和BamHI基因座引入到擴(kuò)增片段的末端。PCR片段克隆在載體pUC19(GenBank/EMBL登錄號(hào)L09137)的SalI和BamHI基因座之間。為了進(jìn)行接種，大腸桿菌菌株在含100μg/mL氨芐青霉素和50μg/mL卡那霉素的Luria-Bertani(″LB″)培養(yǎng)基內(nèi)、37℃、250rpm振蕩培養(yǎng)過夜。
為了進(jìn)行試驗(yàn)處理，按照如下方法制備用于提高色氨酸在大腸桿菌內(nèi)產(chǎn)量的基本培養(yǎng)基trp-1+葡萄糖培養(yǎng)基(Zeman等，F(xiàn)olia Microbiol.35200-204，(1990))。向800mL納米純的水中加入下列試劑2g(NH4)2SO4和13.6g KH2PO4。PH調(diào)至7.0，體積增加到948mL，并對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行高壓滅菌。滅菌后在1.8mL體積的培養(yǎng)基中加入0.2g MgSO4*7H2O、0.01g CaCl2*2H2O和0.5mg FeSO4*7H2O，然后加入0.2mLNeidhardt微量營(yíng)養(yǎng)素溶液。Neidhardt，F(xiàn).C.等，“腸道細(xì)菌培養(yǎng)基”，J.Bacteriol.119736-746(1974)。Neidhardt培養(yǎng)基包含(每升)0.18g(NH4)6(MO7)24-4H2O、1.24gH3BO3、0.36g CoCl2-6H2O、0.12g CuSO4(無(wú)水的)、0.8g MnCl2-4H2O和0.14gZnSO4-7H2O。單獨(dú)制備50％的葡萄糖溶液并通過過濾除菌。將40mL葡萄糖溶液和10mL 1M 3-嗎啉代丙磺酸(“MOPS”)緩沖液加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基(950mL)中，最后體積為1L。
為了處理，將3.5-5.0 v/v％接種物加入到含100μg/mL氨芐青霉素的在500mL帶擋板搖瓶?jī)?nèi)的100mL培養(yǎng)基中。處理?xiàng)l件包括整個(gè)試驗(yàn)以250rpm振蕩，溫度為37℃直到接種，然后降到30℃，隨后誘導(dǎo)。在0.35-0.38 OD600nm時(shí)，開始質(zhì)?；虻恼T導(dǎo)。在誘導(dǎo)時(shí)，加入1.0mM IPTG、0.5％阿拉伯糖、0.5mM維生素B6和0.2mL Balch維生素。在開始誘導(dǎo)后3.5小時(shí)加入10gL-色氨酸、10g/L丙酮酸鈉、0.04mM吡哆醛-5’-磷酸(“PLP”)和0.2％吐溫20(聚氧乙烯20-失水山梨糖醇單月桂酸酯)。在接種后24小時(shí)，每個(gè)搖瓶?jī)?nèi)再加入10g/L丙酮酸鈉。某些處理包括在誘導(dǎo)開始后3.5小時(shí)加入2.5mM癸酸鈉。在24、30和72小時(shí)采集用于莫納甜分析和確定細(xì)胞干重的樣品。
表19.1 大腸桿菌排出的莫納甜/細(xì)胞干重 所有處理都是n＝2 在不加入癸酸鈉時(shí)，baeR的過表達(dá)使莫納甜的流出比無(wú)baeR過表達(dá)的對(duì)照菌株明顯增多。在72小時(shí)時(shí)，baeR過表達(dá)的菌株所積聚的莫納甜/細(xì)胞干重平均值達(dá)到24.9mg/g，而無(wú)baeR的對(duì)照菌株在相同條件下只有2.3mg/g。這說(shuō)明無(wú)癸酸鹽處理的baeR過表達(dá)可使莫納甜的流出升高約11倍。這個(gè)效應(yīng)可能是由mdtABCD或acrD或這兩個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的活化造成的。天然的AcrAB系統(tǒng)在莫納甜轉(zhuǎn)運(yùn)中可能也發(fā)揮作用。另外，已知BaeR可促進(jìn)tolC基因的表達(dá)，該基因是好幾種排出系統(tǒng)發(fā)揮功能所必須的。
表19.2 大腸桿菌排出的莫納甜/細(xì)胞干重 所有處理都是n＝2 在加入2.5mM癸酸鈉時(shí)，baeR的過表達(dá)使莫納甜的流出比無(wú)baeR過表達(dá)的對(duì)照菌株明顯增多。在72小時(shí)時(shí)，baeR過表達(dá)的菌株所積聚的莫納甜/細(xì)胞干重平均值達(dá)到66.8mg/g，而無(wú)baeR的對(duì)照菌株在相同條件下只有2.7mg/g。這說(shuō)明baeR的過表達(dá)加上癸酸鹽的處理可使莫納甜的流出比無(wú)癸酸鹽處理的對(duì)照升高約25倍。已知癸酸鈉可活化AcrAB轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。另外，已知BaeR可促進(jìn)tolC基因的表達(dá)，該基因是好幾種排出系統(tǒng)發(fā)揮功能所必須的。莫納甜流出的這種升高可能是由于mdtABCD和/或acrD的活化以及癸酸鈉加入導(dǎo)致的AcrAB轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)活化引起的。
表19.3 大腸桿菌排出的莫納甜/細(xì)胞干重 所有處理都是n＝2 所有處理中加入2.5mM癸酸鈉 據(jù)報(bào)道，天然的多藥輸出蛋白AcrB的表達(dá)可屏蔽baeR過表達(dá)的效應(yīng)。為了確定baeR過表達(dá)在無(wú)AcrAB轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的情況下的作用，使用了acrAB基因缺失的宿主菌株。在ΔacrAB宿主菌株中，baeR基因的過表達(dá)可導(dǎo)致莫納甜的排出比對(duì)照的ΔacrAB菌株增加3.5倍(137.3到39.3莫納甜(mg)/dcw(g))。這清楚地說(shuō)明除了AcrAB之外還有其他轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與莫納甜的轉(zhuǎn)運(yùn)。另外，已知BaeR可促進(jìn)tolC基因的表達(dá)，除了MdtABCD或AcrD多藥轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)之外，該基因還是另外幾種排出系統(tǒng)發(fā)揮功能所必須的。Nishino K.等，“在基因組范圍分析響應(yīng)于BaeSR兩組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)的大腸桿菌基因的表達(dá)(Genome-wide analysis of Escherichia coli geneexpression responsive to the BaeSR two-component regulatory system)”，J.Bacteriol.1871763-1772，(2005年3月)。因此，MdtABCD或AcrD或者這兩個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)都參與acrAB敲除株中的莫納甜轉(zhuǎn)運(yùn)。
因此，我們可以得出結(jié)論，BaeR對(duì)莫納甜的流出有正面影響。據(jù)報(bào)道，吲哚可通過BaeSR兩組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)誘導(dǎo)mdtABCD和acrD基因的表達(dá)。Nishino K.等，“在基因組范圍分析響應(yīng)于BaeSR兩組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)的大腸桿菌基因的表達(dá)”，J.Bacteriol.1871763-1772，(2005年3月)。有理由預(yù)計(jì)吲哚的處理也應(yīng)該對(duì)莫納甜的流出有正面影響。據(jù)報(bào)道，調(diào)節(jié)物SdiA可控制acrAB和acrD的表達(dá)。Wei，Y.等，“大腸桿菌完整基因表達(dá)譜所揭示的sdiA擴(kuò)增的全面效應(yīng)(Global impact ofsdiA amplification revealed by comprehensive gene expression profiling of Escherichiacoli)”，J.Bacteriol.1832265-2272，(2001)。因此也有理由預(yù)計(jì)SdiA對(duì)莫納甜的流出有正面影響。
實(shí)施例20 提高溫度和用丙酮酸鈉處理可使谷氨酸棒狀桿菌內(nèi)的莫納甜流出增加用aspCProA pEKEX-2轉(zhuǎn)化的谷氨酸棒狀桿菌13032菌株在添加25μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基內(nèi)30℃、250rpm振蕩孵育過夜。對(duì)于試驗(yàn)處理?yè)u瓶來(lái)說(shuō)，每個(gè)搖瓶加入100mL KraemerA培養(yǎng)基。Hoisted C.和Kraemer，R.，“流出載體系統(tǒng)參與谷氨酸棒狀桿菌內(nèi)谷氨酸排出的證據(jù)(Evidence for an efflux carrier systeminvolved in the secretion of glutamate by Corynebacterium glutamicum)”，Arch.Microbiol 151342-347，(1989)。Kraemer A培養(yǎng)基包含(每升)5g(NH4)2SO4、5g尿素、2g KH2PO4、1.53 K2HPO4、0.249g MgSO4*7H2O、50g葡萄糖、0.01gFeSO4-7H2O、0.01g MnSO4-H2O、0.01g CaCl2-2H2O、0.03mg ZnSO4-7H2O、0.1mgH3BO3、0.07mg CaCl2-6H2O、0.01mg NiCl2-2H2O、0.03mg CuCl2-2H2O、0.1mg來(lái)自(NH4)6Mo7O24-4H2O的Mo+6和1μg生物素。PH調(diào)至7.0。
為了處理，將3.5-5.0 v/v％接種物加入到在500mL帶擋板搖瓶?jī)?nèi)的100mL培養(yǎng)基中。處理?xiàng)l件包括整個(gè)試驗(yàn)以250rpm振蕩、溫度為30或35℃。在0.45-0.51OD600nm時(shí)，開始莫納甜操縱子的誘導(dǎo)。1.0mM IPTG用于誘導(dǎo)，在誘導(dǎo)時(shí)，加入0.2mL Balch維生素1000×儲(chǔ)存液和0.5mM維生素B6。在開始誘導(dǎo)后的3小時(shí)和24小時(shí)加入10gL-色氨酸、10或15g/L丙酮酸鈉、0.04mM吡哆醛-5’-磷酸(“PLP”)。在兩個(gè)添加點(diǎn)上添加10或15g/L丙酮酸鈉到每個(gè)搖瓶中，使丙酮酸鈉的總量達(dá)到20或30g/L。在24、30和48小時(shí)采集用于莫納甜分析和確定細(xì)胞干重的樣品。
表20.1 溫度升高和丙酮酸可導(dǎo)致流出的莫納甜/細(xì)胞干重升高 在30℃時(shí)，提高丙酮酸鈉的水平可導(dǎo)致莫納甜/細(xì)胞干重升高(在54小時(shí)時(shí)為4.7mg/g和2.7mg/g)。在35℃時(shí)，加入丙酮酸可使莫納甜/細(xì)胞干重從23.8mg/g進(jìn)一步升高到35.2mg/g。溫度提高5℃導(dǎo)致莫納甜/細(xì)胞干重升高7到9倍。穩(wěn)定從30℃升高到35℃還可以使細(xì)胞干重從7.48g/L降到2.50g/L。穩(wěn)定和丙酮酸鈉在包含16組處理的因子設(shè)計(jì)試驗(yàn)中都是莫納甜/細(xì)胞干重的具有較高統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因子。莫納甜產(chǎn)量的升高與生物量的下降說(shuō)明碳流分布發(fā)生了改變。Ohnishi，J.等，Appl Microbiol Biotechnol 6269-75，(2003)。
因此，我們的試驗(yàn)證明了通過改變加入的丙酮酸鈉的量以及改變生物的孵育溫度可使莫納甜的流出增加。雖然從理論上推測(cè)莫納甜流出的這種增加伴隨著莫納甜合成的增多，但是莫納甜流出本身的影響因素的作用也不能排除。繼續(xù)利用本領(lǐng)域熟知的統(tǒng)計(jì)學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)改變生長(zhǎng)介質(zhì)組合物和生長(zhǎng)條件可用于提高莫納甜的產(chǎn)量和流出出細(xì)胞的量。通過使用乙胺丁醇結(jié)合，但不限于，一種或多種已知能夠影響棒狀桿菌分枝菌酸層的下列試劑，其中包括吐溫、生物素和/或氨芐青霉素，可能能夠使莫納甜的流出進(jìn)一步升高。
實(shí)施例21 生物素和氨芐青霉素處理可增加谷氨酸棒狀桿菌中莫納甜的流出用aspCProA pEKEX-2轉(zhuǎn)化的谷氨酸棒狀桿菌13032菌株在添加50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基內(nèi)30℃、250rpm振蕩孵育過夜。對(duì)于試驗(yàn)處理?yè)u瓶來(lái)說(shuō)，每個(gè)搖瓶加入100mL KraemerA培養(yǎng)基。Hoisted C.和Kraemer，R.，“流出載體系統(tǒng)參與谷氨酸棒狀桿菌內(nèi)谷氨酸排出的證據(jù)(Evidence for an efflux carrier systeminvolved in the secretion of glutamate by Corynebacterium glutamicum)”，Arch.Microbiol 151342-347，(1989)。Kraemer A培養(yǎng)基包含(每升)5g(NH4)2SO4、5g尿素、2g KH2PO4、1.53 K2HPO4、0.249g MgSO4*7H2O、50g葡萄糖、0.01gFeSO4-7H2O、0.01g MnSO4-H2O、0.01g CaCl2-2H2O、0.03mg ZnSO4-7H2O、0.1mgH3BO3、0.07mg CaCl2-6H2O、0.01mg NiCl2-2H2O、0.03mg CuCl2-2H2O、0.1mg來(lái)自(NH4)6Mo7O24-4H2O的Mo+6和1μg生物素。PH調(diào)至7.0。
為了處理，將接種物加入到在500mL帶擋板搖瓶?jī)?nèi)的100mL培養(yǎng)基中，吸光度為0.100(600nm)。處理?xiàng)l件包括整個(gè)試驗(yàn)以250rpm振蕩、溫度為37℃。在0.26-0.33 OD600nm時(shí)，開始莫納甜操縱子的誘導(dǎo)。0.5mM IPTG用于誘導(dǎo)，在誘導(dǎo)時(shí)，再加入1.0mM維生素B 6和0.04mM吡哆醛-5’-磷酸(“PLP”)。在開始誘導(dǎo)后的3小時(shí)加入10gL-色氨酸和5g/L丙酮酸鈉以及氨芐青霉素(0或10μg/ml)。在24和48小時(shí)采集用于莫納甜分析和確定細(xì)胞干重的樣品。
表21.1 添加氨芐青霉素和減少生物素可使流出的莫納甜/細(xì)胞干重升高 根據(jù)處理組合不同n＝2或3 *n＝1 在誘導(dǎo)后的3小時(shí)加入氨芐青霉素可使莫納甜/細(xì)胞干重升高3到12倍。初始培養(yǎng)基中的生物素從200μg/L降到1μg/L可使莫納甜/細(xì)胞干重從1.0mg/g升高到4.2mg/g。氨芐青霉素和生物素(分別為10μg/mL和1μg/L)的處理組合可使莫納甜/細(xì)胞干重升高7.9到18倍(13.5/1.7和16.2/0.9)。
因此，我們的試驗(yàn)證明了通過改變宿主生物所接觸的生物素和氨芐青霉素的量可使莫納甜的流出增加。雖然從理論上推測(cè)莫納甜流出的這種增加伴隨著莫納甜合成的增多，但是生物素和/或氨芐青霉素對(duì)莫納甜流出本身的直接影響也不能排除。
繼續(xù)利用本領(lǐng)域熟知的統(tǒng)計(jì)學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)改變生長(zhǎng)介質(zhì)組合物和生長(zhǎng)條件可用于提高莫納甜的產(chǎn)量和流出出細(xì)胞的量。通過使用乙胺丁醇結(jié)合，但不限于，一種或多種已知能夠影響棒狀桿菌分枝菌酸層的下列試劑，其中包括吐溫、生物素和/或氨芐青霉素，可能能夠使莫納甜的流出進(jìn)一步升高。Eggeling，L.和Sahm，H.，“谷氨酸棒狀桿菌和氨基酸流出的細(xì)胞壁屏障(The Cell Wall Barrier ofCorynebacterium glutamicum and Amino Acid Efflux)”，J.BioSci.and BioEng.92201-213，(2001)。
實(shí)施例22 使用乙胺丁醇可增加棒狀桿菌內(nèi)莫納甜的流出 據(jù)報(bào)道，向谷氨酸棒狀桿菌的生長(zhǎng)培養(yǎng)物中加入乙胺丁醇(“EMB”)可導(dǎo)致L-谷氨酸的流出，但是在沒有EMB時(shí)，沒有流出發(fā)生。Radmacher，E.等，“結(jié)核分支桿菌的細(xì)胞壁抑制劑乙胺丁醇可刺激谷氨酸棒狀桿菌的L-谷氨酸流出(Ethambutol，a cell wall inhibitor of Mycobacterium tuberculosis，elicits L-glutamateefflux of Corynebacterium glutamicum)”，Microbiology 1511359-1368，(2005-5)。據(jù)報(bào)道，EMB在分子水平上的靶位是一系列阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶(EmbCAB)。編碼單個(gè)阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶的谷氨酸棒狀桿菌的emb基因位于Tet抑制子(“TetR”)的控制之下。利用這個(gè)菌株以及emb-過表達(dá)的菌株所進(jìn)行的試驗(yàn)結(jié)合生化分析表明，emb的表達(dá)與L-谷氨酸的流出及EMB耐藥性相關(guān)。另外，EMB可導(dǎo)致沉淀于細(xì)胞壁阿拉伯糖半乳糖中的阿拉伯糖減少，使細(xì)胞壁結(jié)合的分枝菌酸的含量下降。因此，添加EMB可導(dǎo)致細(xì)胞被膜出現(xiàn)明顯紊亂，通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查也可以觀察到這一點(diǎn)。
由于已知改變谷氨酸棒狀桿菌胞漿膜的脂質(zhì)組成可導(dǎo)致L-谷氨酸流出，因此可以推斷細(xì)胞被膜的主要結(jié)構(gòu)改變可傳遞到細(xì)胞膜上，這反過來(lái)又可能會(huì)通過升高細(xì)胞膜的電壓來(lái)活化排出系統(tǒng)。Radmacher，E.等，“結(jié)核分支桿菌的細(xì)胞壁抑制劑乙胺丁醇可刺激谷氨酸棒狀桿菌的L-谷氨酸流出”，Microbiology1511359-1368，(2005-5)。
用aspCProA pEKEX-2轉(zhuǎn)化的谷氨酸棒狀桿菌13032菌株在添加25μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基內(nèi)30℃、250rpm振蕩孵育過夜。對(duì)于試驗(yàn)處理?yè)u瓶來(lái)說(shuō)，每個(gè)搖瓶加入100mL KraemerA培養(yǎng)基。Hoisted C.和Kraemer，R.，“流出載體系統(tǒng)參與谷氨酸棒狀桿菌內(nèi)谷氨酸排出的證據(jù)(Evidence for an efflux carrier systeminvolved in the secretion of glutamate by Corynebacterium glutamicum)”，Arch.Microbiol 151342-347，(1989)。Kraemer A培養(yǎng)基包含(每升)5g(NH4)2SO4、5g尿素、2g KH2PO4、1.53 K2HPO4、0.249g MgSO4*7H2O、50g葡萄糖、0.01gFeSO4-7H2O、0.01g MnSO4-H2O、0.01g CaCl2-2H2O、0.03mg ZnSO4-7H2O、0.1mgH3BO3、0.07mg CaCl2-6H2O、0.01mg NiCl2-2H2O、0.03mg CuCl2-2H2O、0.1mg來(lái)自(NH4)6Mo7O24-4H2O的Mo+6和1μg生物素。PH調(diào)至7.0。
為了處理，將3.5-5.0 v/v％接種物加入到在500mL帶擋板搖瓶?jī)?nèi)的100mL培養(yǎng)基中。處理?xiàng)l件包括整個(gè)試驗(yàn)以250rpm振蕩、溫度為30℃。在搖瓶接種前或者在首次加入色氨酸和丙酮酸時(shí)加入乙胺丁醇(10mg/L)。在0.40-0.51 OD600nm時(shí)，開始莫納甜操縱子的誘導(dǎo)。1.0mM IPTG用于誘導(dǎo)，在誘導(dǎo)時(shí)，加入0.2mL Balch維生素和0.5mM維生素B6。在開始誘導(dǎo)后的3小時(shí)加入1gL-色氨酸、10g/L丙酮酸鈉、0.04mM吡哆醛-5’-磷酸(“PLP”)。在24、30/31和48小時(shí)采集用于莫納甜分析和確定細(xì)胞干重的樣品。
表22.1 添加乙胺丁醇可使莫納甜/細(xì)胞干重升高 所有處理都是n＝2 添加乙胺丁醇可使莫納甜流出(mg/g細(xì)胞干重)升高。在48小時(shí)時(shí)，10mg/l乙胺丁醇處理可使莫納甜/細(xì)胞干重平均值達(dá)到1.06mg/g，而無(wú)乙胺丁醇的對(duì)照平均只有每克細(xì)胞干重0.51毫克莫納甜。
表22.2 添加乙胺丁醇和丙酮酸鈉可使莫納甜/細(xì)胞干重升高 所有處理都是n＝2 在接種后24小時(shí)再加入10g/L丙酮酸鈉可使莫納甜的產(chǎn)生/排出進(jìn)一步增多。在48小時(shí)時(shí)，10mg/L乙胺丁醇處理加上再添加的丙酮酸鈉可使莫納甜/細(xì)胞干重平均達(dá)到2.19mg/g，而在24小時(shí)時(shí)間點(diǎn)上，加入相同的乙胺丁醇但是未額外添加丙酮酸時(shí)莫納甜/細(xì)胞干重只有1.06mg/g。
表22.3 添加乙胺丁醇結(jié)合吐溫/氨芐青霉素處理可使莫納甜/細(xì)胞干重進(jìn)一步升高 所有處理都是n＝2 在添加試劑的時(shí)間(誘導(dǎo)后3小時(shí))加入0.2％吐溫20(聚氧乙烯20-失水山梨糖醇單月桂酸酯)和10μg/ml氨芐青霉素再加上乙胺丁醇處理，可以看到莫納甜的排出上升的更高。吐溫、氨芐青霉素和乙胺丁醇處理之間具有協(xié)同效應(yīng)，對(duì)莫納甜的流出有利。吐溫/氨芐青霉素處理結(jié)合10mg/l乙胺丁醇可導(dǎo)致流出的莫納甜/細(xì)胞干重比進(jìn)行了相同處理但未添加乙胺丁醇的對(duì)照升高12倍(分別為每克細(xì)胞干重9.14毫克莫納甜/和每克細(xì)胞干重0.74毫克莫納甜)。
因此，我們可以得出結(jié)論，添加乙胺丁醇對(duì)棒狀桿菌內(nèi)的莫納甜流出有正面影響。這些數(shù)據(jù)還說(shuō)明莫納甜可通過與谷氨酸相同的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白流出，因?yàn)橛袌?bào)道證明乙胺丁醇只影響谷氨酸的流出而不會(huì)影響其他氨基酸的流出。Radmacher，E.等，“結(jié)核分支桿菌的細(xì)胞壁抑制劑乙胺丁醇可刺激谷氨酸棒狀桿菌的L-谷氨酸流出(Ethambutol，a cell wall inhibitor of Mycobacterium tuberculosis，elicits L-glutamateefflux ofCorynebacterium glutamicum)”，Microbiology 1511359-68，(2005-5)。另外，我們還證明乙胺丁醇處理的正效應(yīng)與吐溫和氨芐青霉素組合可導(dǎo)致棒狀桿菌內(nèi)的莫納甜流出反應(yīng)放大，明顯高于單獨(dú)用乙胺丁醇處理所看到的。
實(shí)施例23 缺失cysH的宿主菌株內(nèi)莫納甜的流出升高。
據(jù)報(bào)道，CysH(磷酸腺苷硫酸(″PAPS″)脫氫酶)、icdA(異檸檬酸脫氫酶)、metE或purB(腺苷酸琥珀酸裂解酶)突變可導(dǎo)致AcrAB轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的活化。突變導(dǎo)致代謝物積聚在上游，可使AcrAB-TolC泵的表達(dá)水平升高。Helling R.B.等，“大腸桿菌內(nèi)的毒性廢物處理(Toxic waste disposal in Escherichia coli)”，J Bacteriol.1843699-3703，(2002)。我們檢測(cè)了cysH缺失對(duì)莫納甜流出的影響。
所設(shè)計(jì)的引物用于通過PCR從所述的pKD4制備所希望的大腸桿菌基因敲除。Datsenko，K.A.和Wanner，B.L.，“利用PCR產(chǎn)物一步滅活大腸桿菌K-12的染色體基因(One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 usingPCR products)”，Proceed.Natl.Acad.Sci.USA976640-6645，(2000)。
CysH敲除引物序列 大腸桿菌cysHKO-正向引物 5′CGCGTGAGCGTCGCATCAGGCAAGGCAAACAGTGAGGAATCTATGTCCAAAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC 3′ 大腸桿菌cysHKO-反向引物 5′CGCCCCCATCATTTCTGACAGAGGCGTTTAATTTGTCCGGCAATATTTACCCTTCCATATGAATATCCTCCTTAG3′ 通過如下PCR過程擴(kuò)增PCR產(chǎn)物以刪除了cysH。在100μL反應(yīng)體系中，加入1μL模板(pKD4)(Datsenko，K.A.和Wanner，B.L.，“利用PCR產(chǎn)物一步滅活大腸桿菌K-12的染色體基因(One-step inactivation of chromosomal genes inEscherichia coli K-12 using PCR products)”，Proceed.Natl.Acad.Sci.USA，976640-6645，(2000))、0.4μM各引物、0.4mM各dNTP、1×PCR緩沖液和2μL PfuTurbo聚合酶(斯加特基因公司(Stratagene)，La Jolla，CA)。所使用的熱循環(huán)程序包括94℃熱啟動(dòng)30秒，如下步驟重復(fù)30次94℃1分鐘，55℃1分鐘和72℃4分鐘。完成30個(gè)循環(huán)以后使樣品在72℃保持10分鐘，然后儲(chǔ)存于4℃。這個(gè)PCR過程可制備出1.6Kb的產(chǎn)物。
利用Qiagen PCR提純?cè)噭┖?Valencia，CA)純化PCR產(chǎn)物。利用SmartSpec3000TM分光光度計(jì)定量PCR產(chǎn)物。
純化的PCR產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株BW25113/pKD46。Datsenko K.A.和Wanner，B.L.，“利用PCR產(chǎn)物一步滅活大腸桿菌K-12的染色體基因(One-stepinactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products)”，Proceed.Natl.Acad.Sci.USA，976640-6645，(2000)。1μLPCR產(chǎn)物加到40μl細(xì)胞中，利用BioRad Gene Pulsar II在下列條件下通過電穿孔轉(zhuǎn)化細(xì)胞在0.2cm槽內(nèi)2.5kV，25μF，200ohm。細(xì)胞在500μL SOC中37℃、225rpm振蕩3小時(shí)使其恢復(fù)。細(xì)胞接種到含卡那霉素(50μg/mL)LB平板上，37℃孵育過夜。挑出5個(gè)卡那霉素耐藥轉(zhuǎn)化子進(jìn)行集落PCR篩選以確定產(chǎn)物。
裂解物制備為了生產(chǎn)BW25113ΔcysH菌株，制備P1噬菌體裂解物以使敲除轉(zhuǎn)移到大腸桿菌BL21DE3生產(chǎn)宿主內(nèi)。供體菌株在含25μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基內(nèi)孵育過夜。培養(yǎng)物用于接種含5mM CaCl2的新鮮LB培養(yǎng)基，稀釋度為1∶10，在37℃孵育70分鐘。1mL每種培養(yǎng)物用3μL或5μL噬菌體儲(chǔ)存液(ATCC25404-B1)接種，37℃20分鐘。然后噬菌體/培養(yǎng)物與4mL含5mM CaCl2的軟瓊脂混合，覆蓋在LB培養(yǎng)基上。對(duì)照試驗(yàn)用無(wú)噬菌體的溶液進(jìn)行。平板右側(cè)向上在37℃孵育5小時(shí)，然后所有含噬菌體的平板上都可以看到有融合裂解；對(duì)照平板如預(yù)期一樣有細(xì)胞菌苔。平板在37℃孵育過夜，然后如預(yù)期一樣在試驗(yàn)平板上看到有噬菌體耐受集落。用無(wú)菌的可處理接種環(huán)從每個(gè)平板上刮下軟瓊脂放到離心管內(nèi)。用2mL LB沖洗平板，沖洗液與離心管中的軟瓊脂混合。在管中加入5滴氯仿，溫和振蕩，在室溫下孵育20分鐘?；旌衔?0000×g離心10分鐘，用0.2μm注射器式濾器過濾上清，得到噬菌體裂解物。所有噬菌體裂解物都儲(chǔ)存于4℃。
轉(zhuǎn)導(dǎo)入生產(chǎn)宿主通過P1轉(zhuǎn)導(dǎo)制備菌株BL21DE3ΔcysH，從而使cysH敲除子轉(zhuǎn)移到菌株大腸桿菌BL21DE3內(nèi)。大腸桿菌BL21DE3ΔcysH在含25μg/mL氯霉素的LB培養(yǎng)基內(nèi)孵育過夜。培養(yǎng)物用于接種5mL含5 mM CaCl2的新鮮LB培養(yǎng)基，稀釋度為1∶10。亞培養(yǎng)物在37℃孵育60分鐘。培養(yǎng)物離心，重懸于500μLMC緩沖液(0.1M MgSO4，5mM CaCl2)中，室溫下孵育20分鐘。各種稀釋度的供體裂解物(1∶100到1×，用MC緩沖液稀釋)以相等體積加入到100μL培養(yǎng)物中?；旌衔?7℃孵育20分鐘，然后每管加入200μL檸檬酸鹽緩沖液(0.1M檸檬酸和220mM NaOH，pH5.5)和1mL LB。培養(yǎng)物在37℃孵育1小時(shí)，以200rpm振蕩，然后離心得到細(xì)胞團(tuán)。細(xì)胞團(tuán)重懸于100μL檸檬酸鹽緩沖液中，接種到含25μg/mL卡那霉素的LB平板上。通過在合適的選擇培養(yǎng)基上重新接種來(lái)純化單個(gè)的卡那霉素耐藥集落。
通過在添加L半胱氨酸和/或L蛋氨酸的M9培養(yǎng)基上培養(yǎng)來(lái)檢測(cè)單個(gè)卡那霉素耐藥集落是否是半胱氨酸和蛋氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型(有該表型則證明cysH已缺失)。
為了進(jìn)行接種，大腸桿菌菌株BL21 DE3 aspC proA pET32和BL21 DE3ΔcysH::aspCproA pET32在含100μg/mL氨芐青霉素的Luria-Bertani(″LB″)培養(yǎng)基內(nèi)、37℃、250rpm振蕩培養(yǎng)過夜。
為了進(jìn)行試驗(yàn)處理，按照如下方法制備用于提高色氨酸在大腸桿菌內(nèi)產(chǎn)量的基本培養(yǎng)基Trp-1+葡萄糖培養(yǎng)基(Zeman等，F(xiàn)olia Microbiol.35200-204，(1990))。向800mL納米純的水中加入下列試劑2g(NH4)2SO4和13.6g KH2PO4。PH調(diào)至7.0，體積增加到948mL，并對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行高壓滅菌。滅菌后在1.8mL體積的培養(yǎng)基中加入0.2g MgSO4*7H2O、0.01g CaCl2*2H2O和0.5mg FeSO4*7H2O，然后加入0.2mL Neidhardt微量營(yíng)養(yǎng)素溶液。Neidhardt，F(xiàn).C.等，“腸道細(xì)菌培養(yǎng)基”，J.Bacteriol.119736-746(1974)。Neidhardt培養(yǎng)基包含(每升)0.18g(NH4)6(MO7)24-4H2O、1.24g H3BO3、0.36g CoCl2-6H2O、0.12g CuSO4(無(wú)水的)、0.8g MnCl2-4H2O和0.14g ZnSO4-7H2O。單獨(dú)制備50％的葡萄糖溶液并通過過濾除菌。將40mL葡萄糖溶液和10mL 1M 3-嗎啉代丙磺酸(“MOPS”)緩沖液加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基(950mL)中，最后體積為1L。
為了處理，將3.0-5.0 v/v％接種物加入到含100μg/mL氨芐青霉素的在500mL帶擋板搖瓶?jī)?nèi)的100mL培養(yǎng)基中。處理?xiàng)l件包括整個(gè)試驗(yàn)以250rpm振蕩，溫度為37℃直到接種，然后降到30℃，隨后誘導(dǎo)。在0.44-0.52 OD600nm時(shí)，開始質(zhì)?；虻恼T導(dǎo)。在誘導(dǎo)時(shí)，加入1.0mM IPTG、0.5mM維生素B6和0.2mL Balch維生素。在開始誘導(dǎo)后3.0小時(shí)加入10gL-色氨酸、10g/L丙酮酸鈉、0.04mM吡哆醛-5’-磷酸(“PLP”)和0.2％吐溫20(聚氧乙烯20-失水山梨糖醇單月桂酸酯)。在初次加入丙酮酸喉小時(shí)向每個(gè)搖瓶?jī)?nèi)再加入10g/L丙酮酸鈉。某些處理包括在誘導(dǎo)開始后3.0小時(shí)加入2.5mM癸酸鈉(或無(wú)菌蒸餾水，作為0mM癸酸鹽處理)。在24、30和48小時(shí)采集用于莫納甜分析和確定細(xì)胞干重的樣品。
表23.1 未添加癸酸鹽時(shí)大腸桿菌排出的莫納甜/細(xì)胞干重 n＝2 在未添加癸酸鈉時(shí)，ΔcysH突變株48小時(shí)所排出的莫納甜/細(xì)胞干重超過對(duì)照菌株5倍以上(21.4對(duì)4.2mg/g)。這些結(jié)果證明ΔcysH突變株可排出更多的莫納甜。這個(gè)效應(yīng)很可能是由于AcrAB和/或其他轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的誘導(dǎo)引起的。
表23.2 添加癸酸鹽時(shí)大腸桿菌排出的莫納甜/細(xì)胞干重 n＝2 加入AcrAB轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的誘導(dǎo)劑癸酸鈉，ΔcysH突變株排出的莫納甜的量更高。24小時(shí)時(shí)突變株排出的莫納甜/細(xì)胞干重超過100mg/g。這比對(duì)照菌株高出60％(115.0對(duì)70.9莫納甜(mg)/g細(xì)胞干重)。這些結(jié)果說(shuō)明ΔcysH突變株可排出更大的莫納甜。這個(gè)效應(yīng)很可能是由于AcrAB和/或其他轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的誘導(dǎo)引起的。ΔcysH突變與添加癸酸鈉組合時(shí)所觀察到的莫納甜流出達(dá)到最大這一事實(shí)說(shuō)明有AcrAB轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和/或其他轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的參與。
由于已有報(bào)道證明cysH、icdA(異檸檬酸脫氫酶)、metE或purB(腺苷酸琥珀酸裂解酶)突變可導(dǎo)致AcrAB轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的活化(Helling，R.B.等，“大腸桿菌內(nèi)的毒性廢物處理”，J.Bacteriol.1843699-3703，(2002))，因此我們預(yù)計(jì)刪除下列基因中的一個(gè)或多個(gè)可以增加莫納甜的流出cysH、icdA、metE或purB。
實(shí)施例24 AcrEF轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)可影響莫納甜的流出 大腸桿菌在某些生理?xiàng)l件下可產(chǎn)生色氨酸代謝物吲哚。AcrEF基因的產(chǎn)物是能量依賴型的多藥流出泵，研究表明該基因的滅活可使吲哚的流出減少。從新導(dǎo)入acrEF基因可恢復(fù)吲哚的排出。據(jù)報(bào)道，ΔacrEF突變株比其親本菌株能夠積聚更多的胞內(nèi)吲哚。這個(gè)突變株比其親本菌株對(duì)吲哚的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)更敏感。這些結(jié)果說(shuō)明AcrEF系統(tǒng)在吲哚流出中發(fā)揮重要作用。Kawamura-Sato，K等，“大腸桿菌內(nèi)的多重流出泵在吲哚排出中的作用(Role of multiple efflux pumps inEscherichia coli in indole expulsion)”，F(xiàn)EMS Microbiol Lett.179345-352，(1999)。EnvR基因的滅活可導(dǎo)致AcrEF轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的過表達(dá)。
所設(shè)計(jì)的引物用于通過PCR從模板pKD3制備ΔenvR基因敲除。Datsenko，K.A.和Wanner，B.L.，“利用PCR產(chǎn)物一步滅活大腸桿菌K-12的染色體基因(One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCRproducts)”，Proceed.Natl.Acad.Sci.USA 976640-6645，(2000)。
以pKD3(Datsenko K.A.和Wanner，B.L.，“利用PCR產(chǎn)物一步滅活大腸桿菌K-12的染色體基因(One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coliK-12 using PCR products)”，Proceed.Natl.Acad.Sci.USA，976640-6645，(2000))為模板，利用Pfu Turbo DNA聚合酶(斯加特基因公司(Stratagene)，La Jolla，CA)以及引物ENVR1(5’-CACTCTGTGTCGAATATATTTATTTCCTGAATAATTAATCTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’)和ENVR2(5’-ACTGTGACGAACTGAATTTTCAGGACAGAATGTGAATTTACATATGAATATCCTCCTTA-3’)構(gòu)建和擴(kuò)增ΔenvR敲除產(chǎn)物。所使用的熱循環(huán)程序包括95℃熱啟動(dòng)2分鐘，10個(gè)循環(huán)的95℃30秒，50℃30秒和72℃2分鐘，然后是25個(gè)循環(huán)的95℃30秒，58℃30秒和72℃2分鐘。最后一步是在70℃孵育7分鐘。按照廠商的說(shuō)明書利用QIAquick凝膠提取試劑盒(恰根公司(Qiagen Hilden)，德國(guó))從兩個(gè)PCR反應(yīng)液(共200μL)中純化PCR產(chǎn)物。ΔenvR敲除PCR產(chǎn)物用10μL雙蒸水洗脫。
按照廠商推薦的方法，利用Gene Pulsar II電穿孔系統(tǒng)(Bio-Rad，Hercules，CA)通過電穿孔用1μL PCR產(chǎn)物(250 ng)轉(zhuǎn)化菌株BW25113/pKD46(Datsenko K.A.和Wanner，B.L.，“利用PCR產(chǎn)物一步滅活大腸桿菌K-12的染色體基因(One-stepinactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products)”，Proceed.Natl.Acad.Sci.USA，976640-6645，(2000))，細(xì)胞在SOC培養(yǎng)基(《分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，第三版，2001，Sambrook和Russell，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，NY USA)中自然生長(zhǎng)150分鐘，然后接種到含10μg/mL氯霉素的LB固體培養(yǎng)基上。平板37℃孵育過夜。
通過PCR篩選氯霉素耐藥集落以確定envR基因座的情況。如果envR被氯霉素耐藥基因打斷，那么利用引物ENVR3(5’CCTCTCGTATAAATACACATTAGGTGATAGATTAACCTTCG 3’)和ENVR4(5’GCAACAGAAACAGACAAATGCCGCAATATG 3’)進(jìn)行集落PCR可產(chǎn)生一個(gè)1.2Kb的條帶，否則就會(huì)產(chǎn)生一個(gè)0.8kb的條帶。鑒定ΔenvR缺失的菌株，命名為BW25113 ΔEnvR。
為了制備裂解物，按照實(shí)施例13的描述從BW25113 ΔenvR制備P1噬菌體裂解物以使敲除轉(zhuǎn)移到大腸桿菌MG1655莫納甜生產(chǎn)菌株內(nèi)。
為了將envR缺失導(dǎo)入到生產(chǎn)宿主內(nèi)，按照實(shí)施例3關(guān)于emrB和acrAB敲除的描述將envR缺失轉(zhuǎn)移到含質(zhì)粒paspCproA ProNdede的1菌株大腸桿菌MG1655內(nèi)。刪除了envR基因的菌株通過接種到含25μg/mL氯霉素和50μg/mL卡那霉素的LB平板上進(jìn)行篩選。鑒定ΔenvR缺失菌株并命名為MG1165 ΔEnvRpApProNdedel。
為了打斷MG1165 ΔEnvRpApProNdedel背景上的其他基因，從envR基因座上切下氯霉素耐藥標(biāo)記。按照廠商推薦的轉(zhuǎn)化和儲(chǔ)存溶液方法(TSS，震源生物技術(shù)公司(Epicentre Biotechnologies)，Madison，WI)用15ng pCP20轉(zhuǎn)化MG1165 ΔEnvRpApProNdede(Datsenko K.A.和Wanner，B.L.，“利用PCR產(chǎn)物一步滅活大腸桿菌K-12的染色體基因(One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coliK-12 using PCR products)”，Proceed.Natl.Acad.Sci.USA，976640-6645，(2000))。在30℃自然生長(zhǎng)30分鐘后，細(xì)胞接種到含50μg/mL氨芐青霉素和25μg/mL卡那霉素的LB平板上，30℃孵育過夜。挑出單集落重新接種到含25μg/mL卡那霉素的LB平板上，42℃孵育過夜以獲得單個(gè)集落。上述步驟所得到的單個(gè)集落復(fù)制接種到含25μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素的LB平板上。利用上述ENV3和ENVR4引物通過集落PCR檢測(cè)氯霉素敏感而卡那霉素耐藥的菌株，以確定envR基因座上氯霉素耐藥標(biāo)記的丟失情況。擴(kuò)增氯霉素耐藥標(biāo)記已丟失的envR基因座可得到一個(gè)0.3Kb的條帶，而擴(kuò)增含有氯霉素耐藥標(biāo)記的envR基因座可產(chǎn)生一個(gè)1.2Kb的條帶。得到的菌株命名為MG1165 ΔEnvRpApProNdedel CanS。EmrB和/或acrAB基因現(xiàn)在可能以實(shí)施例3所描述的相同方式被打斷。
由于AcrAB和emrAB轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)液可以轉(zhuǎn)運(yùn)莫納甜，因此envR缺失及其所導(dǎo)致的AcrEF轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的活化對(duì)莫納甜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響在AcrAB和emrAB轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中的一個(gè)或兩個(gè)缺失的宿主菌株內(nèi)可能是最主要的。
由于吲哚和莫納甜的結(jié)構(gòu)相似，因此可以預(yù)計(jì)AcrEF轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也可以發(fā)揮吲哚-3-丙酮酸流出的功能。因此，刪除編碼AcrEF轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因以防止莫納甜中間體漏出細(xì)胞從而使中間體更多流向莫納甜的生產(chǎn)是可能的。同時(shí)，AcrEF轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可發(fā)揮莫納甜流出的功能。實(shí)施例25說(shuō)明流出吲哚-3-丙酮酸的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也能夠發(fā)揮流出莫納甜的功能。決定滅活還是過表達(dá)AcrEF轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)要根據(jù)莫納甜轉(zhuǎn)運(yùn)與吲哚-3-丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)的相對(duì)比例而定。
實(shí)施例25 阿布屬生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的過表達(dá)可增加莫納甜的排出 生長(zhǎng)素(主要是吲哚-3-丙酮酸，IAA)是植物激素。研究表明生長(zhǎng)素的定向轉(zhuǎn)運(yùn)是維持植物正常生長(zhǎng)所必需的并主要由流出載體復(fù)合物介導(dǎo)，流出載體復(fù)合物具有PIN-FORMED(PIN)蛋白家族的特征。哺乳動(dòng)物多藥耐藥/P-糖蛋白(MDR/PGP)的植物類似物在生長(zhǎng)素流出中也發(fā)揮功能。據(jù)報(bào)道，MDR/PGP可穩(wěn)定胞漿膜上的流出復(fù)合物，發(fā)揮ATP依賴性的生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能。據(jù)報(bào)道，轉(zhuǎn)運(yùn)的特異性和方向是由相互作用的PIN蛋白決定的。Blakeslee J.J.等，“生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)(Auxintransport)”，Curr.Opin.Plant Biol.8494-500，(2005年10月)。其他研究者證明MDR/PGP樣ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與生長(zhǎng)素和AtPGP1(NP_181228)的轉(zhuǎn)運(yùn)與主要的生長(zhǎng)素主動(dòng)流出直接相關(guān)(MDR樣ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AtPGP4參與植物生長(zhǎng)素介導(dǎo)的側(cè)根和根毛發(fā)育。Santelia D.等，F(xiàn)EBSLett.5795399-5406，(200年10月)；Geisler M.等，“細(xì)胞流出生長(zhǎng)素由阿布屬M(fèi)DR/PGP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AtPGP1催化(Cellular efflux ofauxin catalyzed by the Arabidopsis MDR/PGP transporter AtPGP1)”，The PlantJournal 44179(2005))。由于莫納甜的結(jié)構(gòu)在某些方面與植物生長(zhǎng)素有相似性，因此我們研究了利用生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來(lái)流出莫納甜。
擬南芥mRNA(Cat#M1634310)得自生物鏈公司(Biochain)(Hayward，CA)。mRNA用無(wú)RNA酶的水稀釋10倍，終濃度到50ng/μL。利用所述的反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(帕瑪咖公司(Promega)，Madison，WI)和隨機(jī)引物從mRNA制備cDNA，模板為100ngmRNA而不是1μg總RNA。
通過PCR在三個(gè)部分?jǐn)U增AtPGP1基因，使用的聚合酶是Pfu Turbo DNA聚合酶(斯加特基因公司(Stratagene)，La Jolla，CA)，以擬南芥cDNA為模板。利用引物PGP1(5’-CATATGATGGATAATGACGGTGGTGCTCCTCCTCC-3’)和PGP2(5’-CATTTGCGACTCGAGCAGCCTCCTCTATCTC-3’)擴(kuò)增開放閱讀框架的1到1453位堿基。這可將Nde I限制性酶切位點(diǎn)引入開放閱讀框架的5’端。退火溫度為63℃，延伸時(shí)間2分鐘。利用瓊脂糖凝膠電泳純化PCR片段，按照廠商推薦的方法利用QIAquick凝膠提取試劑盒(恰根公司(Qiagen Hilden)，德國(guó))提取。按照廠商推薦的方法將純化的PCR產(chǎn)物克隆到pCR4.0 Blunt-TOPO(因維曲根公司(Invitrogen)Carlsbad，CA)中。通過直接測(cè)序(埃金科特公司(Agencourt)，Beverly MA)驗(yàn)證序列的正確性。得到的質(zhì)粒命名為pAtPGP1-5’。利用引物PGP3(5’-GAGATAGAGGAGGCTGCTCGAGTCGCAAATG-3’)和PGP4(5’-GAGAGCATAAGAT GCATAAAGACAGAACTGAGCTACACC-3’)擴(kuò)增開放閱讀框架的1423到2829位堿基。退火溫度為55℃，延伸時(shí)間2分鐘。按照上述方法將PCR片段純化，克隆到pCR4.0 Blunt-TOPO內(nèi)，并進(jìn)行序列正確性的驗(yàn)證。得到的質(zhì)粒命名為pAtPGP1-C。利用引物PGP5(5’-GCGGCCGCCTAAGCATCATCTTCCTTAACCCTAGAACTTGAACCTGAC-3’)和引物PGP6(5’-GGTGTAGCTCAGTTCTGTCTTTATGCATCTTATGCTCTC-3’)擴(kuò)增開放閱讀框架的2791到3861位堿基。退火溫度為55℃，延伸時(shí)間2分鐘。這可將Not I限制性酶切位點(diǎn)引入開放閱讀框架的末端。按照上述方法將PCR片段純化，克隆到pCR4.0 Blunt-TOPO內(nèi)，并進(jìn)行序列正確性的驗(yàn)證。得到的質(zhì)粒命名為pAt-PGP1-3’。
三個(gè)片段分別克隆以后，將3’片段和中間片段連接起來(lái)。得到的片段與5’片段連接起來(lái)形成完整的開放閱讀框架，插入到最后的質(zhì)粒中。pAtPGP1-C、pAtPGP1-3’和pBluescript SK-(斯加特基因公司(Stratagene)，La Jolla，CA)分別用XhoI和NsiI、NsiI和NotI或者XhoI和NotI消化。按照上面所描述的方法通過瓊脂糖凝膠電泳純化1.4kb(pAtPGP1-C)、1.0Kb(pAtPGP1-3’)和3.0Kb(pBluescriptSK-)片段并提取。按照廠商的說(shuō)明書利用快速連接連接酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室公司(New England Biolabs)，Ipswich，MA)將純化的片段連接起來(lái)。得到的質(zhì)粒命名為pAtPGP1-C3’。pAtPGP1-C3’、pAtPGP1-5’和pProNdedel分別用XhoI和NotI、NdeI和NotI或者NdeI和NotI消化。按照上面所描述的方法通過瓊脂糖凝膠電泳純化2.4kb(pAtPGP1-C3’)、1.4Kb(pAtPGP1-5’)和2.6Kb(pProNdedel-我們有一種方法描述了pProNdedel的構(gòu)建，見實(shí)施例15)的片段并提取。按照上述方法將純化的片段連接起來(lái)。得到的質(zhì)粒命名為pPro-AtPGP1，通過限制性酶切分析進(jìn)行確認(rèn)。
利用轉(zhuǎn)化和儲(chǔ)存溶液(TSS，震源生物技術(shù)公司(Epicentre Biotechnologies))制備感受態(tài)的大腸桿菌B121-DE3::aspCproApET32。按照廠商推薦的方法將pPro-AtPGP1轉(zhuǎn)化到感受態(tài)的大腸桿菌B121-DE3::aspCproApET32內(nèi)，然后接種到含100μg/mL氨芐青霉素和50μg/mL卡那霉素的LB平板上。含第二質(zhì)粒pPro-AtPGP1的大腸桿菌B121-DE3::aspCproApET32轉(zhuǎn)化子通過PCR擴(kuò)增AtPGP1的3’區(qū)和5’區(qū)來(lái)驗(yàn)證，所用引物分別為上述的PGP1和PGP2或PGP5和PGP6。
為了進(jìn)行接種，大腸桿菌菌株在含100μg/mL氨芐青霉素和50μg/mL卡那霉素的Luria-Bertani(″LB″)培養(yǎng)基內(nèi)、37℃、250rpm振蕩培養(yǎng)過夜。為了進(jìn)行試驗(yàn)處理，按照如下方法制備用于提高色氨酸在大腸桿菌內(nèi)產(chǎn)量的基本培養(yǎng)基trp-1+葡萄糖培養(yǎng)基(Zeman等，F(xiàn)olia Microbiol.35200-204，(1990))。向800mL納米純的水中加入下列試劑2g(NH4)2SO4和13.6g KH2PO4。PH調(diào)至7.0，體積增加到948mL，并對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行高壓滅菌。滅菌后在1.8mL體積的培養(yǎng)基中加入0.2gMgSO4*7H2O、0.01g CaCl2*2H2O和0.5mg FeSO4*7H2O，然后加入0.2mL Neidhardt微量營(yíng)養(yǎng)素溶液。Neidhardt，F(xiàn).C.等，“腸道細(xì)菌培養(yǎng)基”，J.Bacteriol.119736-746(1974)。Neidhardt培養(yǎng)基包含(每升)0.18g(NH4)6(MO7)24-4H2O、1.24g H3BO3、0.36g CoCl2-6H2O、0.12g CuSO4(無(wú)水的)、0.8g MnCl2-4H2O和0.14gZnSO4-7H2O。單獨(dú)制備50％的葡萄糖溶液并通過過濾除菌。將40mL葡萄糖溶液和10mL 1M 3-嗎啉代丙磺酸(“MOPS”)緩沖液加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基(950mL)中，最后體積為1L。
為了處理，將3.5 v/v％接種物加入到含100μg/mL氨芐青霉素和50μg/mL卡那霉素的在500mL帶擋板搖瓶?jī)?nèi)的100mL培養(yǎng)基中。處理?xiàng)l件包括整個(gè)試驗(yàn)以250rpm振蕩，溫度為37℃直到接種，然后降到30℃，隨后誘導(dǎo)。在0.54-0.62 OD600nm時(shí)，開始質(zhì)?；虻恼T導(dǎo)。在誘導(dǎo)時(shí)，加入1.0mM IPTG、0.5％L-阿拉伯糖、0.5mM維生素B6和0.2mL Balch維生素。在開始誘導(dǎo)后3小時(shí)加入10gL-色氨酸、10g/L丙酮酸鈉、0.04mM吡哆醛-5’-磷酸(“PLP”)和0或0.2％吐溫20(聚氧乙烯20-失水山梨糖醇單月桂酸酯)。在24、30和48小時(shí)采集用于莫納甜分析和確定細(xì)胞干重的樣品。
表25.1 大腸桿菌流出的莫納甜/細(xì)胞干重增加是由于生長(zhǎng)素基因的表達(dá) 除了*n＝2之外所有處理都是n＝3 與用空白載體(無(wú)生長(zhǎng)素基因)處理的對(duì)照相比，利用質(zhì)粒上的莫納甜操縱子誘導(dǎo)阿布屬生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在菌株內(nèi)表達(dá)可導(dǎo)致莫納甜/細(xì)胞干重升高。24小時(shí)的莫納甜/細(xì)胞干重結(jié)果平均為9.6mg/g，而無(wú)生長(zhǎng)素基因的空白載體對(duì)照只有1.5mg/g。另外，在誘導(dǎo)后3小時(shí)用吐溫20處理可導(dǎo)致莫納甜/細(xì)胞干重平均值在24小時(shí)時(shí)升高到29.4mg/g，而空白載體對(duì)照只有2.2mg/g。這表示表達(dá)AtPGP1生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的菌株所流出的莫納甜/細(xì)胞干重升高了13倍。
據(jù)報(bào)道，生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AtPGP19(Q9LJX0)的功能與AtPGP1類似，預(yù)計(jì)也能夠轉(zhuǎn)運(yùn)莫納甜。另外，文獻(xiàn)還報(bào)道了基于對(duì)阿布屬PGP的種系發(fā)生(phyogenetic)分析所發(fā)現(xiàn)的三個(gè)p-糖蛋白(PGP)簇/進(jìn)化枝。At PGP1是I類分子的原型，可催化生長(zhǎng)素的轉(zhuǎn)運(yùn)。除了AtPGP1和AtPGP19之外，預(yù)計(jì)能在生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮作用的I類PGP的其他成員包括阿布屬的AtPGP13、AtPGP14、AtPGP10、AtPGP2以及稻(Oryza sativa)(水稻)的OsPGP9、OsPGP8、OsPGP7和OsPGP6(Geisler，M.和A.S.Murphy，“生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)的初步知識(shí)p-糖蛋白在植物發(fā)育中的作用(The ABC ofauxin transportThe role of p-glycoproteins in plant development)”，F(xiàn)EBS Letters5801094-1102，(2006))。上面所提到的I類PGP預(yù)計(jì)都具有轉(zhuǎn)運(yùn)莫納甜的某些能力。
另外，利用AtPGP1蛋白序列作為關(guān)鍵詞對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行的BLAST分析表明，有許多同源物，例如而不限于BrABB97035、StAAD10836、SbAAR10387、Os XP483819、Os CAD59580、ZMPGP1 AAR00316，都能在莫納甜轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮作用。所有這些同源物的序列比對(duì)顯示在圖1中。
因此，我們所提供的證據(jù)支持生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在莫納甜流出中的作用。
權(quán)利要求
1.一種方法，所述方法包括用基因工程微生物分泌莫納甜。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物經(jīng)基因工程改造以表達(dá)或過表達(dá)能夠分泌莫納甜的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)組分。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物經(jīng)基因工程改造以表達(dá)能夠分泌莫納甜并與所述微生物異源的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)組分。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物經(jīng)基因工程改造以過表達(dá)能夠分泌莫納甜并且是所述微生物天生的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)組分。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物經(jīng)基因工程改造以合成莫納甜。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物含有一個(gè)或多個(gè)選自以下的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)AcrAB轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、AcrAB轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的同源物、EmrAB轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、以及EmrAB轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的同源物。
7.一種方法，所述方法包括在微生物中生產(chǎn)莫納甜；誘導(dǎo)所述微生物表達(dá)或過表達(dá)能夠分泌所述莫納甜的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)或能夠分泌所述莫納甜的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的組分；以及由所述微生物分泌所述莫納甜。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)是AcrAB轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，且所述誘導(dǎo)步驟包括在培養(yǎng)基中提供癸酸鈉。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)是EmrAB轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，且所述誘導(dǎo)步驟包括在培養(yǎng)基中提供羰基氰3-氯苯腙。
10.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述莫納甜分泌是與適當(dāng)對(duì)照相比增加的莫納甜分泌。
11.一種方法，所述方法包括用經(jīng)基因工程改造以表達(dá)或過表達(dá)一種或多種選自TolC、RobA、RamA、MarA、BaeR及其同源物的蛋白質(zhì)的微生物在體內(nèi)生產(chǎn)莫納甜。
12.一種方法，所述方法包括在谷氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型中生產(chǎn)莫納甜。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述微生物經(jīng)基因工程改造以生產(chǎn)莫納甜，經(jīng)基因工程改造以表達(dá)或過表達(dá)一種或多種類型的能夠分泌莫納甜的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，或這兩者。
14.一種方法，所述方法包括在能夠?qū)⒐劝彼峄蚬劝彼犷愃迫苜|(zhì)與蘋果酸交換的微生物中生產(chǎn)莫納甜。
15.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)步驟包括在培養(yǎng)基中提供水楊酸。
16.一種方法，所述方法包括在生產(chǎn)或者經(jīng)基因工程改造以生產(chǎn)或過度生產(chǎn)生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的同源物或其組合的微生物中生產(chǎn)莫納甜。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，當(dāng)如圖1所示與AtPGP1、BrABB97035、StAAD10836、ZmPGP1_AAR00316、SbAAR10387、OsXP_483819、OS_CAD59580和AtPGP19進(jìn)行比對(duì)時(shí)，所述生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的所述同源物的氨基酸序列包含圖1所示的共有序列。
18.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的所述同源物包含選自PXGKTXAXVGXSGSGKSTVVSLXERFYXPXXGXXXLDG、LXLXXLRXQIGLVXQEPXLFATXIXENXLG和QVGERGXQLSGGQKQRIAIARAMLXXPXILLLDEATSALD的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列，其中X是當(dāng)所述氨基酸序列與AtPGP1、BrABB97035、StAAD10836、ZmPGP1_AAR00316、SbAAR10387、OsXP_483819、OS_CAD59580和AtPGP19中任一序列進(jìn)行比對(duì)時(shí)相應(yīng)位置上的氨基酸，如圖1B所示。
19.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的所述同源物包含選自LPXGYXTXVGERGVQLSGGQXQRIAIARA和LLDEATSALDAESEXXXQEAL的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列，其中X是當(dāng)所述氨基酸序列與AtPGP1、BrABB97035、StAAD10836、ZmPGP1_AAR00316、SbAAR10387、OsXP_483819、OS_CAD59580和AtPGP19中任一序列進(jìn)行比對(duì)時(shí)相應(yīng)位置上的氨基酸，如圖1D所示。
20.一種方法，所述方法包括在缺乏cysH基因的微生物中生產(chǎn)莫納甜。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述微生物經(jīng)基因工程改造而缺乏cysH基因。
22.一種方法，所述方法包括用經(jīng)基因工程改造從而與基因工程改造之前的所述微生物相比在其細(xì)胞被膜中無(wú)分枝菌酸或其水平降低的微生物生產(chǎn)莫納甜。
23.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物是泛菌科的一員。
24.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物是棒狀桿菌科的一員。
25.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，使所述微生物暴露于與合適對(duì)照相比能提高莫納甜產(chǎn)量、莫納甜流出量，或者同時(shí)提高莫納甜產(chǎn)量和莫納甜流出量的化合物。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述化合物選自氨芐青霉素、乙胺丁醇、丙酮酸、吐溫及其組合。
27.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因工程生物缺乏選自YhcP(AaeB)、YccS、YjcQ和YhfK的一種或多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
28.一種方法，所述方法包括通過檢驗(yàn)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分泌莫納甜的效率來(lái)鑒定莫納甜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
29.一種能夠分泌莫納甜的基因工程微生物。
30.如權(quán)利要求29所述的微生物，其特征在于，所述微生物經(jīng)基因工程改造以生產(chǎn)或過度生產(chǎn)莫納甜。
31.如權(quán)利要求29所述的微生物，其特征在于，所述微生物經(jīng)基因工程改造以表達(dá)或過表達(dá)一種或多種能夠分泌莫納甜的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。
全文摘要
提供了在體內(nèi)生產(chǎn)莫納甜甜味劑的產(chǎn)品和方法。該產(chǎn)品包括經(jīng)基因修飾以分泌莫納甜或促進(jìn)莫納甜分泌的微生物；經(jīng)基因修飾以生產(chǎn)莫納甜的微生物；以及經(jīng)基因修飾以同時(shí)分泌莫納甜或促進(jìn)莫納甜分泌的微生物并生產(chǎn)莫納甜的微生物。該方法包括在這種基因工程微生物中生產(chǎn)莫納甜。
文檔編號(hào)G01N33/53GK101223444SQ200680021827
公開日2008年7月16日 申請(qǐng)日期2006年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月20日
發(fā)明者J·C·安德森, M·L·德蘇扎, P·M·西克斯, S·R·科勒曼, J·拉普拉扎 申請(qǐng)人:嘉吉有限公司