專利名稱：血清缺血修飾白蛋白的游離鈷定量測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對人血清中缺血修飾白蛋白進(jìn)行檢測的方法。該方法利用急性冠狀動脈綜合癥(ACS)患者血清中缺血修飾白蛋白與外源性Co2+結(jié)合能力減弱的特性，在血清中加入一定濃度鈷溶液，使其與血清中白蛋白充分結(jié)合，再加入試劑檢測反應(yīng)體系中的游離鈷，通過吸光度變化表示游離鈷含量變化，進(jìn)而間接表示缺血修飾白蛋白的濃度。
背景技術(shù)：
人血清白蛋白(HSA)是一種循環(huán)蛋白，其氨基末端序列為人類所特有，能與金屬鈷、銅和鎳等離子結(jié)合，與其它種屬動物白蛋白相比，HSA的金屬結(jié)合位點更易受生物化學(xué)因素的影響而被降解。人血清白蛋白在氧自由基作用下，其氨基末端結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致其與某些外源性金屬鈷、銅、鎳結(jié)合能力減弱的白蛋白，稱為缺血修飾白蛋白(Ischemia modified albumin IMA)。
研究表明IMA基本具備理想心肌缺血標(biāo)志物基本特征，在以下幾個方面具有重要價值(1)對于因胸痛或不適來就診的急診患者進(jìn)行危險分層，對低?；颊哂兄懦鼳CS診斷。
(2)作為對疑似ACS患者最早升高的短期缺血危險分層標(biāo)志物，有助于臨床醫(yī)師早期恰當(dāng)處理病人。傳統(tǒng)的心肌損傷標(biāo)志物常在心肌細(xì)胞發(fā)生壞死后血中濃度方可升高，IMA在心肌可逆的心肌缺血階段血中濃度即迅速升高，可早期并靈敏地反應(yīng)心肌缺血狀況，將心肌缺血的診斷窗由原來的缺血發(fā)生后4-6小時提前到5-10分鐘。
目前，IMA測定一般利用正常人血清中白蛋白能與Co2+結(jié)合而缺血修飾白蛋白與Co2+結(jié)合能力減弱的特性，采用白蛋白-鈷結(jié)合試驗(ACB)進(jìn)行。正常人白蛋白以活性形式存在，加入鈷試劑后，Co2+與人血清白蛋白N-末端結(jié)合，溶液中游離Co2+濃度下降，心肌缺血病人血清標(biāo)本中含有大量的IMA，加入同等量的鈷試劑后，由于IMA與Co2+的結(jié)合能力下降，溶液中存在較多量的游離Co2+，加入二硫蘇糖醇(DTT)試劑后，游離鈷可與二硫蘇糖醇反應(yīng)，產(chǎn)生棕紅色化合物。游離鈷含量越高，顏色欲深，用分光光度計測定吸光度值大小，從而間接表示血清中IMA含量。
由于DTT做顯色劑存在檢測結(jié)果常隨生產(chǎn)廠家、試劑種類、批號等引起結(jié)果不穩(wěn)定，分辨率明顯不高和測試溶液后價格略高的問題，本發(fā)明人提出了使用二硫赤蘚糖醇(DTE)作為檢測反應(yīng)體系中游離鈷的顯色試劑的優(yōu)選方法。
在上述缺血修飾白蛋白測定方法中，有二種結(jié)果表達(dá)方式一種是吸光度單位；一種是單位定義，即在某一特定條件下吸光度上升或下降某一吸光度為1U/L，此二種結(jié)果表達(dá)方式均為相對單位，無法實現(xiàn)溯源，這對定量檢測試驗而言，屬通常不采用的方式，應(yīng)在無法溯源與無確定標(biāo)準(zhǔn)的情況下迫不得已才采取的一種方式。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于通過檢測反應(yīng)體系中剩余鈷含量的方式，以游離鈷含量表示血清與鈷結(jié)合程度，表述缺血修飾白蛋白與鈷結(jié)合力的下降，從根本上解決了缺血修飾白蛋白定量問題，并將檢測結(jié)果以游離鈷濃度報告。
本發(fā)明的血清缺血修飾白蛋白的游離鈷定量測定方法，利用缺血修飾白蛋白鈷結(jié)合能力減弱的特性，使用化學(xué)試劑檢測反應(yīng)體系中的游離鈷，獲得吸光度變化表示游離鈷含量變化，間接表示缺血修飾白蛋白的濃度，并將所述的對游離鈷檢測的結(jié)果以游離鈷濃度指標(biāo)替代吸光度，避免由于儀器或試劑性能差別和不穩(wěn)定導(dǎo)致缺血修飾白蛋白檢測結(jié)果的不穩(wěn)定。
本發(fā)明的缺血修飾白蛋白測定方法，根據(jù)檢測結(jié)果數(shù)據(jù)，制作游離鈷濃度指標(biāo)與吸光度的關(guān)系曲線，確認(rèn)鈷濃度與吸光度之間的線性關(guān)系為C測定＝A(測定-測定對照管)/A(標(biāo)準(zhǔn)-標(biāo)準(zhǔn)對照管)*C標(biāo)準(zhǔn)其中，C標(biāo)準(zhǔn)為標(biāo)準(zhǔn)液含游離鈷的濃度，C測定為所測血清反應(yīng)體系中含游離鈷的濃度，A(測定-測定對照管)為測定管吸光度與測定對照管吸光度的差值，A(標(biāo)準(zhǔn)-標(biāo)準(zhǔn)對照管)為標(biāo)準(zhǔn)管吸光度與標(biāo)準(zhǔn)對照管吸光度的差值。
本發(fā)明的血清缺血修飾白蛋白的游離鈷定量測定方法，可以根據(jù)鈷溶液的專用國家標(biāo)準(zhǔn)，實現(xiàn)數(shù)據(jù)的溯源。
在檢測測定方法的精密度時，檢測高低二個濃度樣本，確定儀器內(nèi)CV＜5％，批內(nèi)CV＜5％，符合測試要求。
本發(fā)明的的缺血修飾白蛋白測定方法，避免采用吸光度報告時由于儀器或試劑性能差別和不穩(wěn)定導(dǎo)致缺血修飾白蛋白檢測結(jié)果不穩(wěn)定的問題，本檢測方法所使用的鈷標(biāo)準(zhǔn)溶液可以溯源至國家標(biāo)準(zhǔn)。
具體實施例方式
本發(fā)明以二硫赤蘚糖醇(DTE)作為檢測反應(yīng)體系中的游離鈷的顯色試劑為例敘述具體的實施方式。所用的測試管采用血清180μl，加入2.48mmol/L氯化鈷溶液120μl，加pH7.8的Tris-HCl緩沖液1600ul，混勻放37℃水浴箱8分鐘，加入5mmol/L的DTE 200ul，混勻放37℃溫育2分鐘，在UV-2800紫外可見分光光度計下，在波長480nm處比色，測定游離鈷濃度。具體的測試方案見表1表1


用分光光度計，10mm比色杯，在480nm處以蒸餾水調(diào)零，分別讀取上述4個測試管的吸光度。
吸光度和血清反應(yīng)體系中含游離鈷的濃度之間所存在的對應(yīng)關(guān)系，通過DTE法標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作得出。
該曲線的制作方法是將CoCl2分別配置成620μmol/l，1240μmol/l，1860μmol/l，2480μmol/l四種不同濃度，用上述方法檢測其濃度與吸光度的線性關(guān)系。
1.系列標(biāo)準(zhǔn)液按照下表配制①2480μmol/l CoCl2配置稱29.5mgCoCl2，用去離子水30ml將其溶解于燒杯中，待溶解后，移入50ml容量瓶中補(bǔ)足。
②1240μmol/l CoCl2配置取10.0ml①液加入10.0ml去離子水混勻即可。
③1860μmol/l CoCl2配置取5ml②液，加入5ml①液，混勻即可。
④620μmol/l CoCl2配置取5ml②液，加入5ml去離子水混勻即可。
⑤0μmol/l CoCl2配置用生理鹽水替代。
2.標(biāo)準(zhǔn)曲線測定


混勻放37℃ 2min取出，在Uv-2800分光光度計上480nm處比色，以空白管為空白，由低濃度到高濃度比色，記錄各反應(yīng)管吸光度。
3.測量結(jié)果如下表

A0＝-100.61A1＝2917.3R＝0.99924.結(jié)論本法檢測Co2+的線性可達(dá)2480μmol/l。
根據(jù)以上測量結(jié)果，確定吸光度與CoCl2濃度存在線性關(guān)系，其計算方程為C測定＝A(測定-測定對照管)/A(標(biāo)準(zhǔn)-標(biāo)準(zhǔn)對照管)*C標(biāo)準(zhǔn)其中，C標(biāo)準(zhǔn)為標(biāo)準(zhǔn)液含游離鈷的濃度，C測定為所測血清反應(yīng)體系中含游離鈷的濃度，A(測定-測定對照管)為測定管吸光度與測定對照管吸光度的差值，A(標(biāo)準(zhǔn)-標(biāo)準(zhǔn)對照管)為標(biāo)準(zhǔn)管吸光度與標(biāo)準(zhǔn)對照管吸光度的差值。
利用測定的反應(yīng)體系中游離鈷含量，間接表示IMA濃度。以標(biāo)本反應(yīng)體系中含游離鈷濃度(umol/l血清)報告結(jié)果。
計算的結(jié)果以游離鈷含量表達(dá)，游離鈷含量的單位為μmol/L。
檢測的數(shù)據(jù)的可靠性分析根據(jù)分析校準(zhǔn)函數(shù)(測量函數(shù)的反函數(shù))Y＝X/A1-b/A1，分析靈敏度R應(yīng)在2700～3000之間；不確定度CV＜5％，線性0-2480mmol/L。
測量正確度該方法所用鈷標(biāo)準(zhǔn)溶液已溯源至國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。(標(biāo)準(zhǔn)號GBW08613，200604)。
測量精密度按EP5-A2文件要求，對本法進(jìn)行精密度測試高低二個濃度連續(xù)測定5日，每日測定8批，每批測定2個數(shù)據(jù)，共80個數(shù)據(jù)。統(tǒng)計結(jié)果儀器內(nèi)CV均＜5％。表明本試驗精密度良好。
測量的檢測限受分析靈敏度、正確度、精密度和空白值的影響。本法檢測限為0-2480μmol/L。
測量的測定低限與高限已測最低結(jié)果為770μmol/L，已測最高結(jié)果為1925μmol/L。
由于本法檢測的核心物質(zhì)是游離鈷，國家計量院有鈷國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW08613)，故可以將該檢測體系進(jìn)行溯源。
根據(jù)下述實驗，檢測標(biāo)準(zhǔn)溶液的溯源性采用的材料鈷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW08613 200604)，檢測試劑盒。
采用的方法1.鈷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)按1∶8，1∶10，1∶20比例稀釋，配成2121，1697，848umol/l三種不同濃度鈷溶液，分別按本法溯源。
2.按下述測定步驟
生理鹽水180μl，加入鈷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)120μl，加PH7.8 Tris-HCl緩沖液1600ul，混勻放37℃水浴箱8分鐘，加入5mmol/L DTE200ul，混勻放37℃溫育2分鐘，在UV-2800紫外可見分光光度計下480nm處比色，以蒸餾水為空白，測定游離鈷濃度。
鈷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溯源步驟

用UV-2800分光光度計，10mm比色杯，在480nm處以蒸餾水調(diào)零，分別讀取4管吸光度，根據(jù)下式計算反應(yīng)體系中游離鈷含量C測定＝A(溯源-溯源對照管)/A(標(biāo)準(zhǔn)-標(biāo)準(zhǔn)對照管)*C標(biāo)準(zhǔn)，得出游離鈷濃度(umol/l)，報告結(jié)果。
3.若在生化分析儀上進(jìn)行溯源，參數(shù)如下37℃ 波長480nm樣本18μL試劑243μL試劑1172μL

兩點法，吸光度上升反應(yīng)。
實驗結(jié)果

結(jié)論該方法溯源結(jié)果滿足溯源要求。按本法測定鈷國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，鈷國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW08613 200604)測定值為999.3ug/ML(三種濃度測定均值)，與標(biāo)示值(1000ug/ML)相差0.7ug/ML，＜1％，符合溯源要求。表明本法已經(jīng)實現(xiàn)溯源。
用本法檢測高低二個濃度樣本，按EP5-2A文件要求，測定所建IMA測試方法的精密度度所用儀器為日立UV-2800紫外可見分光光度計，501-A超級恒溫水浴箱，亞光溫濕度計，倒計時器，芬蘭雷伯移液器(10-200ul)，金花移液器(10-1000ul)；試劑與方法IMA的游離鈷濃度測定法相同；樣本1號、2號高低二個濃度樣本結(jié)果對比根據(jù)獲得的精密度實驗原始數(shù)據(jù)按傳統(tǒng)方法統(tǒng)計樣本1x＝1684.5SD＝54.99CV＝3.26％樣本2x＝1149.2SD＝43.21CV＝3.76％根據(jù)結(jié)果對比，可以得出結(jié)論高、低二個濃度樣本，按本法測定儀器內(nèi)CV＜5％，批內(nèi)CV＜5％，符合方法學(xué)測試要求。
權(quán)利要求
1.一種血清缺血修飾白蛋白的游離鈷定量測定方法，其利用缺血修飾白蛋白鈷結(jié)合能力減弱的特性，使用化學(xué)試劑檢測反應(yīng)體系中的游離鈷，獲得吸光度變化表示游離鈷含量變化，間接表示缺血修飾白蛋白的濃度，其特征在于對游離鈷檢測的結(jié)果是以游離鈷濃度指標(biāo)替代吸光度，避免由于儀器或試劑性能差別和不穩(wěn)定導(dǎo)致缺血修飾白蛋白檢測結(jié)果的不穩(wěn)定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的血清缺血修飾白蛋白的游離鈷定量測定方法，其特征在于根據(jù)檢測結(jié)果數(shù)據(jù)，制作游離鈷濃度指標(biāo)與吸光度的關(guān)系曲線，確認(rèn)鈷濃度與吸光度之間的線性關(guān)系為C測定＝A(測定-測定對照管)/A(標(biāo)準(zhǔn)-標(biāo)準(zhǔn)對照管)*C標(biāo)準(zhǔn)其中，C標(biāo)準(zhǔn)為標(biāo)準(zhǔn)液含游離鈷的濃度，C測定為所測血清反應(yīng)體系中含游離鈷的濃度，A(測定-測定對照管)為測定管吸光度與測定對照管吸光度的差值，A(標(biāo)準(zhǔn)-標(biāo)準(zhǔn)對照管)為標(biāo)準(zhǔn)管吸光度與標(biāo)準(zhǔn)對照管吸光度的差值。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的血清缺血修飾白蛋白的游離鈷定量測定方法，其特征在于該方法所用鈷溶液已溯源至國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，實現(xiàn)數(shù)據(jù)的溯源。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的血清缺血修飾白蛋白的游離鈷定量測定方法，其特征在于在檢測測定方法的精密度時，檢測高低二個濃度樣本，確定儀器內(nèi)CV＜5％，批內(nèi)CV＜5％，符合測試要求。
全文摘要
本發(fā)明提出一種血清缺血修飾白蛋白的游離鈷定量測定方法，利用缺血修飾白蛋白鈷結(jié)合能力減弱的特性，使用化學(xué)試劑檢測反應(yīng)體系中的游離鈷，獲得吸光度變化表示游離鈷含量變化，間接表示缺血修飾白蛋白的濃度；根據(jù)檢測結(jié)果，制作游離鈷濃度指標(biāo)與吸光度的關(guān)系曲線，確認(rèn)鈷濃度與吸光度之間的線性關(guān)系為C
文檔編號G01N21/31GK1904617SQ20061010435
公開日2007年1月31日 申請日期2006年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月9日
發(fā)明者陳寶榮, 方虹, 楊振華 申請人:北京航天總醫(yī)院