專(zhuān)利名稱(chēng)：競(jìng)爭(zhēng)性示差篩選的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本方明提供用于篩選目標(biāo)化合物的方法。具體而言，本方明提供競(jìng)爭(zhēng)性示差篩選的方法。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，本方明提供了有助于緊密結(jié)合物(binder)的鑒定的競(jìng)爭(zhēng)性示差篩選方法。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法中所使用的試劑包括緊密結(jié)合物和弱結(jié)合物。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了采用識(shí)別和結(jié)合靶標(biāo)的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合物的方法，但所述競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合物具有弱于目標(biāo)結(jié)合物的結(jié)合。
背景技術(shù)：
目前使用的篩選和/或鑒定目標(biāo)化合物(例如結(jié)合物)的程序典型包括步驟溫育多種化合物的庫(kù)與固定于表面的抗靶標(biāo)(anti-targets)(即，預(yù)選擇的不期望靶標(biāo))；洗去不結(jié)合于所述抗-靶標(biāo)的化合物；以及將經(jīng)洗去的化合物重施用于第二或新的靶標(biāo)源。與抗靶標(biāo)的溫育使結(jié)合于不期望靶標(biāo)的化合物的庫(kù)減少。因此，該步驟篩選出結(jié)合抗靶標(biāo)的化合物，從而提供這樣的庫(kù)，其在用于鑒定目標(biāo)化合物的試驗(yàn)中顯示出較低的污染和降低的背景。在一些試驗(yàn)系統(tǒng)中，對(duì)靶標(biāo)和抗靶標(biāo)進(jìn)行若干輪的選擇和去選擇(de-selection)。污染經(jīng)常是一個(gè)顯著的問(wèn)題。因?yàn)樗鰩?kù)并未耗盡常見(jiàn)靶標(biāo)，所以產(chǎn)生背景噪聲(background noise)。降低污染和背景噪聲的方法，尤其是降低針對(duì)常見(jiàn)靶標(biāo)的污染和背景噪聲的方法，已經(jīng)被開(kāi)發(fā)并被并入一些方法中。在一些方法中，并入了設(shè)計(jì)用于有效地篩選出常見(jiàn)靶標(biāo)的結(jié)合物的封閉或預(yù)清除步驟。封閉或預(yù)清除步驟可以包括，例如，與蛋白如脫脂乳蛋白或其它常見(jiàn)蛋白溫育，因?yàn)檫@些蛋白包含許多常見(jiàn)靶標(biāo)。封閉或預(yù)清除溫育有時(shí)也使用溫和去垢劑(例如，TWEEN-20或Triton X-100)進(jìn)行。除了各種免疫試驗(yàn)體系之外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些方法在噬菌體展示方法中有用。例如，針對(duì)污染表位的封閉或預(yù)清除步驟已經(jīng)被用于減少噬菌體的富集。在該方法中，噬菌體與固相預(yù)溫育，但不具有特異目標(biāo)靶標(biāo)。然后，選擇噬菌體，并隨后相對(duì)于目標(biāo)靶標(biāo)溫育。盡管這些方法隨著時(shí)間已經(jīng)被改進(jìn)，它們尚未證明完全成功并且常常不能最小化污染和背景噪聲。在存在污染的情況下，經(jīng)常難以甚至不可能區(qū)別并隨后分離結(jié)合目標(biāo)靶標(biāo)的具體化合物。因此，在現(xiàn)有技術(shù)中存在克服這些污染和背景噪聲問(wèn)題的方法的需求。
發(fā)明概述本發(fā)明提供篩選目標(biāo)化合物的方法。具體而言，本發(fā)明提供競(jìng)爭(zhēng)性示差篩選的方法。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，本方明提供了幫助緊密結(jié)合物的鑒定的競(jìng)爭(zhēng)性示差篩選方法。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法中所使用的試劑包括緊密結(jié)合物和弱結(jié)合物。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了采用識(shí)別和結(jié)合靶標(biāo)的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合物的方法，但所述競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合物具有弱于目標(biāo)結(jié)合物的結(jié)合。本發(fā)明提供了分離至少一種目標(biāo)結(jié)合物的方法，包括步驟使第一靶標(biāo)與試劑的第一收集物溫育，在使得所述第一收集物中的所述試劑的至少一部分結(jié)合于所述第一靶標(biāo)的條件下進(jìn)行，以產(chǎn)生第一結(jié)合的靶標(biāo)；洗滌所述第一結(jié)合的靶標(biāo)；洗脫所述第一結(jié)合的靶標(biāo)中結(jié)合于所述靶標(biāo)的所述試劑，以產(chǎn)生抗靶標(biāo)肽的收集物；擴(kuò)增所述抗靶標(biāo)肽收集物，以產(chǎn)生擴(kuò)增的抗靶標(biāo)肽收集物；使所述擴(kuò)增的抗靶標(biāo)肽收集物和試劑的第一收集物和/或試劑的第二收集物暴露于所述第一靶標(biāo)和/或暴露于第二靶標(biāo)，在使得至少一部分所述試劑結(jié)合于所述第一和/或第二靶標(biāo)的條件下，以產(chǎn)生進(jìn)一步的第一結(jié)合的靶標(biāo)和/或第二結(jié)合的靶標(biāo)；洗滌所述進(jìn)一步的第一結(jié)合的靶標(biāo)和/或所述第二結(jié)合的靶標(biāo)；以及區(qū)別、分離和鑒定至少一種目標(biāo)結(jié)合物。在一些實(shí)施方式中，所述試劑是肽，而在其它實(shí)施方式中，所述試劑是核酸。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，核酸是DNA和/或RNA。在另外的實(shí)施方式中，靶標(biāo)選自癌細(xì)胞、癌細(xì)胞系、癌細(xì)胞培養(yǎng)物、腫瘤提取物、癌組織、癌器官、癌細(xì)胞相關(guān)分子、癌細(xì)胞系相關(guān)分子、癌細(xì)胞培養(yǎng)物相關(guān)分子、腫瘤提取物相關(guān)分子、癌組織相關(guān)分子、以及癌器官相關(guān)分子。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，靶標(biāo)是抗原。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述抗原選自癌抗原muc-1、Tag72、CEA、CD22、ED-B和FAP。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，第一靶標(biāo)群和第二靶標(biāo)群不同。在一些實(shí)施方式中，靶標(biāo)群和第二靶標(biāo)群是細(xì)胞。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述第一靶標(biāo)群包含正常細(xì)胞并且所述第二靶標(biāo)群包含異常細(xì)胞。在一些可選的實(shí)施方式中，第二靶標(biāo)群包括腫瘤細(xì)胞。在另外的實(shí)施方式中，至少其中一個(gè)步驟被重復(fù)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，至少其中兩個(gè)步驟被重復(fù)。仍在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述擴(kuò)增的抗靶標(biāo)試劑收集物的濃度比試劑的第一收集物的濃度至少大1000倍。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，抗靶標(biāo)試劑收集物的每一成員以這樣的水平存在，該水平選自比擴(kuò)增之前的水平的大大約100倍、約500倍、約1000倍、約5000倍、約10,000倍、約100,000倍和約1,000,000倍。仍在另外的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步采用噬菌體展示。在一些噬菌體展示實(shí)施方式中，所述試劑是存在于噬菌體或噬菌體感染的細(xì)胞表面上的肽，以及所述抗靶標(biāo)試劑是存在于噬菌體或噬菌體感染的細(xì)胞表面上不同的肽。在另外的噬菌體展示實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括在使擴(kuò)增的收集物與所述第二靶標(biāo)群以及所述試劑的第一收集物溫育之前，使包含抗靶標(biāo)試劑的噬菌體失活的步驟。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過(guò)將所述噬菌體暴露于導(dǎo)致所述噬菌體不能存活的溫度來(lái)進(jìn)行失活。本發(fā)明還提供了分離至少一種目標(biāo)肽的方法，包括溫育野生型細(xì)胞的至少一種收集物與噬菌體展示肽的第一庫(kù)，在使得所述野生型細(xì)胞的至少一部分將結(jié)合噬菌體展示肽的第一庫(kù)中的至少一些成員以產(chǎn)生結(jié)合的細(xì)胞或未結(jié)合的噬菌體的條件下進(jìn)行；在使得未結(jié)合噬菌體被除去的條件下洗滌所述結(jié)合的細(xì)胞和未結(jié)合的噬菌體；洗脫結(jié)合于結(jié)合的細(xì)胞的噬菌體，產(chǎn)生抗靶標(biāo)肽收集物；擴(kuò)增所述抗靶標(biāo)肽收集物；將擴(kuò)增的抗靶標(biāo)肽收集物和步驟(i)的噬菌體展示肽的第一和/或第二庫(kù)施用于異常細(xì)胞，在使得至少一部分異常細(xì)胞結(jié)合于抗靶標(biāo)肽或噬菌體展示肽的第一和/或第二庫(kù)的條件下進(jìn)行，以產(chǎn)生具有結(jié)合的抗靶標(biāo)肽和至少一種目標(biāo)肽的結(jié)合的異常細(xì)胞；洗滌所述結(jié)合的異常細(xì)胞并除去未結(jié)合在所述異常細(xì)胞表面上的任何噬菌體，以留下由結(jié)合的抗靶標(biāo)肽和至少一種目標(biāo)肽覆蓋的細(xì)胞表面；從攜帶抗靶標(biāo)肽的異常細(xì)胞區(qū)分和/或分離攜帶至少一種目標(biāo)肽的噬菌體；以及鑒定至少一種目標(biāo)肽。在一些實(shí)施方式中，噬菌體的第一和第二收集物包含不同的基因組。仍在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，使用對(duì)噬菌體的第二收集物中的至少一部分核酸序列特異的寡核苷酸進(jìn)行的擴(kuò)增，進(jìn)行鑒定所述肽的步驟。在一些可選的實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括使用抗微生物耐受模式區(qū)分噬菌體的第一和第二收集物的步驟。在一些可選的實(shí)施方案中，第二靶標(biāo)群包括腫瘤細(xì)胞。在另外的實(shí)施方式中，至少一個(gè)步驟被重復(fù)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，至少兩個(gè)步驟被重復(fù)。在一些另外的實(shí)施方式中，所述擴(kuò)增的抗靶標(biāo)噬菌體收集物的濃度比噬菌體的第二收集物的濃度大至少約1000倍。仍在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括在使擴(kuò)增的收集物與所述第二靶標(biāo)群以及所述試劑的第一收集物溫育之前，使包含抗靶標(biāo)試劑的噬菌體失活的步驟。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過(guò)將所述噬菌體暴露于導(dǎo)致所述噬菌體不能存活的溫度來(lái)進(jìn)行失活。本發(fā)明還提供分離至少一種目標(biāo)結(jié)合物的方法，所述方法包括步驟使靶標(biāo)群與試劑收集物接觸，其中所述試劑收集物具有操縱濃度，在使得至少一部分所述靶標(biāo)群結(jié)合于至少一部分試劑以產(chǎn)生具有至少一種結(jié)合物的結(jié)合的靶標(biāo)群的條件下進(jìn)行；洗滌所述結(jié)合的靶標(biāo)群，以除去未結(jié)合于靶標(biāo)群的試劑；以及區(qū)分、分離并鑒定所述至少一種結(jié)合物。在一些實(shí)施方式中，試劑是肽，而在其它的實(shí)施方式中，所述試劑是核酸。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸是DNA和/或RNA。在另外的實(shí)施方式中，靶標(biāo)選自癌細(xì)胞、癌細(xì)胞系、癌細(xì)胞培養(yǎng)物、腫瘤提取物、癌組織、癌器官、癌細(xì)胞相關(guān)分子、癌細(xì)胞系相關(guān)分子、癌細(xì)胞培養(yǎng)物相關(guān)分子、腫瘤提取物相關(guān)分子、癌組織相關(guān)分子、以及癌器官相關(guān)分子。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，靶標(biāo)是抗原。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述抗原選自癌抗原muc-1、Tag72、CEA、CD22、ED-B和FAP。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，操縱濃度為所述靶標(biāo)群濃度的約1×10-3至約1×103倍。在一些可選的優(yōu)選實(shí)施方式中，操縱濃度包含試劑多樣性的下降，使得每一單獨(dú)試劑的濃度增加至所述試劑期望解離常數(shù)的約1×10-4至約1×102倍。在一些另外的實(shí)施方式中，操縱濃度包括至少一種競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合物，所述競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合物包括對(duì)期望的靶標(biāo)具有預(yù)先確定的解離常數(shù)的結(jié)合物。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述靶標(biāo)群具有低濃度，其中所述低濃度在約1微摩爾濃度至約1皮摩爾濃度之間。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步采用噬菌體展示。在一些另外的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述試劑是存在于噬菌體或噬菌體感染的細(xì)胞表面上的肽，以及所述抗靶標(biāo)試劑是存在于噬菌體或噬菌體感染的細(xì)胞表面上的不同的肽。在一些可選的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括在使擴(kuò)增的收集物與所述第二靶標(biāo)群以及所述試劑的第一收集物溫育之前，使包含抗靶標(biāo)試劑的噬菌體失活的步驟。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過(guò)將所述噬菌體暴露于導(dǎo)致所述噬菌體不能存活的溫度來(lái)進(jìn)行噬菌體失活。在一些實(shí)施方式中，所述肽包括至少一種抗體，而在另外的實(shí)施方式中，所述肽包括抗體的至少一部分。仍在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括使用對(duì)噬菌體收集物中的至少一種核酸序列特異的寡核苷酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增。本發(fā)明還提供分離至少一種目標(biāo)結(jié)合物的方法，所述方法包括步驟使靶標(biāo)群與試劑收集物接觸，其中所述靶標(biāo)群具有低濃度，在使得至少一部分所述靶標(biāo)群結(jié)合于試劑收集物的至少一部分成員的條件下進(jìn)行，以產(chǎn)生具有至少一種目標(biāo)結(jié)合物的結(jié)合的靶標(biāo)，和未結(jié)合的試劑；和洗滌所述結(jié)合的靶標(biāo)，以除去未結(jié)合的試劑；區(qū)分、分離并鑒定所述至少一種目標(biāo)結(jié)合物。在一些實(shí)施方式中，試劑收集物包括至少一種肽，而在一些可選的實(shí)施方式中，所述試劑收集物包括至少一種核酸。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述核酸是DNA和/或RNA。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述試劑收集物具有操縱濃度。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述試劑收集物的操縱濃度為所述靶標(biāo)群濃度的約1×10-3至約1×103倍。仍然在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，操縱濃度包含試劑多樣性的下降，這樣，每一單獨(dú)試劑的濃度增加至所述試劑期望解離常數(shù)的約1×10-4至約1×102倍。在一些可選的優(yōu)選實(shí)施方式中，操縱濃度包括至少一種競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合物，所述競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合物包括對(duì)期望靶標(biāo)具有預(yù)先確定的解離常數(shù)的結(jié)合物。在一些另外的實(shí)施方式中，靶標(biāo)選自癌細(xì)胞、癌細(xì)胞系、癌細(xì)胞培養(yǎng)物、腫瘤提取物、癌組織、癌器官、癌細(xì)胞相關(guān)分子、癌細(xì)胞系相關(guān)分子、癌細(xì)胞培養(yǎng)物相關(guān)分子、腫瘤提取物相關(guān)分子、癌組織相關(guān)分子、以及癌器官相關(guān)分子。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，靶標(biāo)是抗原。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述抗原選自癌抗原muc-1、Tag72、CEA、CD22、ED-B和FAP。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述靶標(biāo)群具有低濃度，其中所述低濃度在約1微摩爾濃度至約1皮摩爾濃度之間。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步采用噬菌體展示。在一些實(shí)施方式中，所述試劑是存在于噬菌體或噬菌體感染的細(xì)胞表面上的肽，以及抗靶標(biāo)試劑是存在于噬菌體或噬菌體感染的細(xì)胞表面上的不同的肽。在一些優(yōu)的選實(shí)施方式中，在使擴(kuò)增的收集物與所述第二靶標(biāo)群以及所述試劑的第一收集物溫育之前，所述方法進(jìn)一步包括使包含抗靶標(biāo)試劑的噬菌體失活的步驟。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過(guò)將所述噬菌體暴露于導(dǎo)致所述噬菌體不能存活的溫度和條件來(lái)進(jìn)行噬菌體失活。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述肽包括至少一種抗體，而在可選的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述肽包括抗體的至少一部分。仍在另外的實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括使用對(duì)噬菌體收集物中的至少一種核酸序列特異的寡核苷酸的擴(kuò)增步驟。本發(fā)明還提供了分離至少一種目標(biāo)結(jié)合物的方法，包括使第一靶標(biāo)與試劑的第一收集物接觸；洗滌掉未結(jié)合于所述靶標(biāo)中存在的靶分子的試劑并丟棄被洗出的試劑；洗脫結(jié)合于靶分子的試劑，以產(chǎn)生抗靶標(biāo)肽的收集物；擴(kuò)增所述抗靶標(biāo)肽收集物；將所述擴(kuò)增的抗靶標(biāo)肽收集物和試劑的所述第一收集物和/或第二收集物施用于所述第一靶標(biāo)或施用于第二靶標(biāo)；洗滌掉未結(jié)合于所述第一或第二靶標(biāo)中的靶分子的試劑；以及區(qū)別、分離和鑒定至少一種目標(biāo)結(jié)合物。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述試劑是肽，而在其它可選的實(shí)施方式中，所述試劑是核酸。在一些實(shí)施方式中，核酸是DNA和/或RNA。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，靶標(biāo)選自癌細(xì)胞、癌細(xì)胞系或癌細(xì)胞培養(yǎng)物、腫瘤提取物或癌組織或癌器官；或與癌細(xì)胞、癌細(xì)胞系或癌細(xì)胞培養(yǎng)物、腫瘤提取物或癌組織或癌器官相關(guān)的分子；或與癌細(xì)胞、癌細(xì)胞系、癌細(xì)胞培養(yǎng)物、腫瘤提取物或癌組織或癌器官相關(guān)的細(xì)胞、細(xì)胞系或細(xì)胞培養(yǎng)物、組織或器官。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，靶標(biāo)是抗原。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述抗原選自癌抗原，如muc-1、Tag72、CEA、CD22、ED-B和FAP。在一些可選的優(yōu)選實(shí)施方式中，第一靶標(biāo)群和第二靶標(biāo)群不同。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，第一靶標(biāo)群和第二靶標(biāo)群是細(xì)胞。在一些進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述第一靶標(biāo)群包含正常細(xì)胞并且所述第二靶標(biāo)群包含異常細(xì)胞。仍在一些進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，異常的第二靶標(biāo)群包括腫瘤細(xì)胞。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括重復(fù)步驟在溫育混合物中溫育所述第一靶標(biāo)群和所述試劑第一收集物，隨后洗滌所述溫育混合物，以從所述溫育混合物除去未結(jié)合的試劑。在一些另外的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述擴(kuò)增的抗靶標(biāo)試劑收集物的濃度比試劑的第一收集物的濃度大至少約1000倍。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，抗靶標(biāo)試劑收集物的每一成員以這樣的水平存在，該水平比擴(kuò)增之前它們的水平的大大約100倍、約500倍、約1000倍、約5000倍、約10,000倍、約100,000倍或約1,000,000倍。在一些可選的優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法采用噬菌體展示。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述試劑是存在于噬菌體表面上的肽，以及所述抗靶標(biāo)試劑是存在于噬菌體表面上的不同的肽。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括在使擴(kuò)增的收集物與所述第二靶標(biāo)群以及所述試劑的第一收集物溫育之前，使包含抗靶標(biāo)試劑的噬菌體失活的步驟。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，失活步驟包括將所述噬菌體暴露于導(dǎo)致所述噬菌體不能存活的溫度。本發(fā)明還提供分離至少一種目標(biāo)肽的方法，包括溫育野生型細(xì)胞的至少一種收集物與噬菌體展示肽的第一庫(kù)；洗滌掉未結(jié)合于所述野生型細(xì)胞表面上的靶分子的噬菌體；洗脫結(jié)合于靶分子的噬菌體，產(chǎn)生抗靶標(biāo)肽收集物；擴(kuò)增所述抗靶標(biāo)肽收集物；將擴(kuò)增的抗靶標(biāo)肽收集物和噬菌體展示肽的第一和/或第二庫(kù)施用于異常細(xì)胞；洗滌掉未結(jié)合于異常細(xì)胞表面上的靶分子的噬菌體，以留下由結(jié)合的抗靶標(biāo)肽以及至少一種目標(biāo)肽覆蓋的細(xì)胞表面；從攜帶抗靶標(biāo)肽的噬菌體區(qū)分和/或分離攜帶至少一種目標(biāo)肽的噬菌體；以及鑒定所述至少一種目標(biāo)肽。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，噬菌體的第一收集物和噬菌體的第二收集物包含不同的基因組。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，確定來(lái)自噬菌體第二收集物的肽的身份的步驟包括使用對(duì)噬菌體的第二收集物中的核酸序列特異的寡核苷酸的PCR擴(kuò)增，其中所述肽結(jié)合于在所述第二細(xì)胞群的細(xì)胞表面上表達(dá)的靶。在一些可選的優(yōu)選實(shí)施方式中，使用抗微生物劑耐受性。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過(guò)噬菌體第一收集物給予細(xì)胞的抗微生物劑耐受模式不同于通過(guò)噬菌體第二收集物給予細(xì)胞的抗微生物劑耐受模式。在一些另外的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括重復(fù)步驟在溫育混合物中溫育所述第一靶標(biāo)群和所述試劑第一收集物，并洗滌所述溫育混合物，以從所述溫育混合物除去未結(jié)合的試劑。在一些進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述擴(kuò)增的抗靶標(biāo)噬菌體收集物的濃度比噬菌體的第二收集物的濃度大至少約1000倍。仍在一些進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括在使擴(kuò)增的收集物與所述第二靶標(biāo)群溫育以及與所述試劑的第一收集物溫育之前，使包含抗靶標(biāo)試劑的噬菌體失活的步驟。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，失活步驟包括將所述噬菌體暴露于導(dǎo)致所述噬菌體不能存活的溫度。本發(fā)明還提供分離至少一種目標(biāo)結(jié)合物的方法，包括步驟使靶標(biāo)群與試劑收集物接觸，所述試劑收集物具有操縱濃度；洗滌掉未結(jié)合于所述靶標(biāo)群的試劑；以及區(qū)分、分離并鑒定所述至少一種結(jié)合物。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，試劑收集物包括至少一種類(lèi)型的肽。在一些可選的優(yōu)選實(shí)施方式中，試劑收集物包括至少一種類(lèi)型的核酸。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，核酸的類(lèi)型是DNA和/或RNA分子。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，操縱濃度為所述靶標(biāo)群濃度的約1×10-3至約1×103倍。在一些其它優(yōu)選的實(shí)施方式中，操縱濃度包含試劑多樣性的下降，使得每一單獨(dú)試劑的濃度增加至所述試劑期望解離常數(shù)的約1×10-4至約1×102倍。在一些進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，操縱濃度包括至少一種競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合物。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述至少一種競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合物包括對(duì)期望的靶標(biāo)具有預(yù)先確定的解離常數(shù)的結(jié)合物。在一些進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，靶標(biāo)群選自癌細(xì)胞、癌細(xì)胞系或癌細(xì)胞培養(yǎng)物、腫瘤提取物或癌組織或癌器官。在一些可選的優(yōu)選實(shí)施方式中，靶標(biāo)群是一組抗原。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，存在至少一種抗原，選自癌抗原muc-1、Tag72、CEA、CD22、ED-B和FAP。在一些另外的優(yōu)選實(shí)施方式中，靶標(biāo)群具有低濃度。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述低濃度在約1微摩爾濃度(1e-6M)至約1皮摩爾濃度(1e-12M)之間。在一些更特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述濃度在約1e-7M至約1e-11M。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，采用噬菌體展示進(jìn)行所述方法。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述試劑的收集物包括存在于噬菌體表面上的至少一種類(lèi)型的肽。在一些可選的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述肽包括至少一種抗體。仍在一些另外的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括使噬菌體失活，其中失活發(fā)生在使噬菌體與靶標(biāo)收集物和包含試劑收集物的噬菌體溫育之前。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述失活步驟包括將所述噬菌體暴露于導(dǎo)致所述噬菌體不能存活的溫度。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用對(duì)噬菌體收集物中的核酸序列特異的寡核苷酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增。本發(fā)明還提供分離至少一種目標(biāo)結(jié)合物的方法，所述方法包括步驟使靶標(biāo)群與試劑收集物接觸，所述試劑收集物具有低濃度；洗滌掉未結(jié)合于所述靶標(biāo)群的試劑；以及區(qū)分、分離并鑒定所述至少一種目標(biāo)結(jié)合物。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，試劑收集物包括至少一種類(lèi)型的肽，而在一些可選的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述試劑收集物包括至少一種類(lèi)型的核酸。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述核酸是DNA和/或RNA分子。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，試劑收集物具有操縱濃度。在一些可選的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述操縱濃度為所述靶標(biāo)群濃度的約1×10-3至約1×103倍。在一些另外的優(yōu)選實(shí)施方式中，操縱濃度包含試劑多樣性的下降，使得每一單獨(dú)試劑的濃度增加至所述試劑期望解離常數(shù)的約1×10-4至約1×102倍。在一些進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，操縱濃度包括至少一種競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合物，其中所述至少一種競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合物包括對(duì)期望靶標(biāo)具有預(yù)先確定的解離常數(shù)的結(jié)合物。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，靶標(biāo)群選自癌細(xì)胞、癌細(xì)胞系或癌細(xì)胞培養(yǎng)物，腫瘤提取物或癌組織或癌器官。在一些可選的優(yōu)選實(shí)施方式中，靶標(biāo)群是一組抗原。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，至少一種抗原選自癌抗原muc-1、Tag72、CEA、CD22、ED-B和FAP。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述靶標(biāo)群具有低濃度，所述低濃度在約1微摩爾濃度(1e-6M)至約1皮摩爾濃度(1e-12M)之間。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，該范圍包括在約1e-7至約1e-11之間的任何濃度。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，試劑收集物包括至少一種類(lèi)型的肽，而在一些可選的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述試劑收集物包括至少一種類(lèi)型的核酸。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述核酸是DNA和/或RNA。在一些進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，采用噬菌體展示進(jìn)行所述方法。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述試劑收集物是存在于噬菌體表面上的至少一種類(lèi)型的肽。在一些可選的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述肽包括抗體的至少一個(gè)部分。在一些進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括使噬菌體失活，其中失活發(fā)生在使噬菌體與靶標(biāo)收集物和包含試劑收集物的噬菌體溫育之前。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述失活步驟包括將所述噬菌體暴露于導(dǎo)致所述噬菌體不能存活的溫度。一些可選的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)一步包括使用對(duì)噬菌體收集物中的核酸序列特異的寡核苷酸的PCR擴(kuò)增。


圖1提供了顯示文庫(kù)成員P1和P2之間競(jìng)爭(zhēng)的圖，兩者都以1-10M的濃度存在，其中結(jié)合靶標(biāo)(target-bound)的P1和P2(分別為T(mén)P1和TP2)的濃度被繪制為靶標(biāo)濃度(T0)的函數(shù)。P1和P2的解離常數(shù)分別為Kd1＝1-10M、Kd2＝1-7M。x軸表示靶標(biāo)濃度(摩爾濃度)，而y軸表示結(jié)合靶標(biāo)的成員的濃度(摩爾濃度)。如該圖所示，結(jié)合的文庫(kù)成員的量是解離常數(shù)和靶標(biāo)濃度的函數(shù)。
圖2提供了文庫(kù)(每一成員都以1-10M的濃度存在)的每一結(jié)合的成員(TPi)的作為靶標(biāo)濃度函數(shù)的濃度，其中，1種結(jié)合物(P1)，Kd＝1-12M(with 1 binder(P1)at Kd＝1-12M)；10種結(jié)合物(P2)，Kd＝1-11M；100種結(jié)合物(P3)，Kd＝1-10M；1000種結(jié)合物(P4)，Kd＝1-9M；10,000種結(jié)合物(P5)，Kd＝1-8M。x軸表示靶標(biāo)濃度(摩爾濃度)，而y軸表示結(jié)合靶標(biāo)的成員的濃度(摩爾濃度)。如該圖所示，對(duì)于具有成員P1至P5的文庫(kù)，結(jié)合的文庫(kù)成員的量是解離常數(shù)和靶標(biāo)濃度的函數(shù)。
圖3提供了文庫(kù)(每一成員都以1-10M的濃度存在)的每一結(jié)合的成員TPi的作為靶標(biāo)濃度函數(shù)的濃度，其中，1種結(jié)合物(P1)，Kd＝1-12M；10種結(jié)合物(P2)，Kd＝1-11M；100種結(jié)合物(P3)，Kd＝1-10M；1000種結(jié)合物(P4)，Kd＝1-9M；10,000種結(jié)合物(P5)，Kd＝1-8M。所有的條件與圖2相同，除了以1-4M的濃度加入Kd＝1-8M的1種另外的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合物(P6)。x軸表示靶標(biāo)濃度(摩爾濃度)，而y軸表示結(jié)合靶標(biāo)的成員的濃度(摩爾濃度)。如該圖所示，對(duì)于具有成員P1至P5的文庫(kù)，結(jié)合的文庫(kù)成員的量是解離常數(shù)和靶標(biāo)濃度的函數(shù)。
圖4提供了結(jié)合的噬菌體對(duì)靶標(biāo)濃度的圖。該圖顯示了噬菌體文庫(kù)(每一成員都以1-13M的濃度存在)的每一結(jié)合的成員(TPi)的濃度，其中，1種結(jié)合物(P1)，Kd＝1-10M；5種結(jié)合物(P2)，Kd＝5-10M；25種結(jié)合物(P3)，Kd＝2.5-9M；50種結(jié)合物(P4)，Kd＝5-9M；100種結(jié)合物(P5)，Kd＝1-8M(并且無(wú)其它結(jié)合物)。x軸表示靶標(biāo)濃度(摩爾濃度)，而y軸表示結(jié)合靶標(biāo)的成員的濃度(摩爾濃度)。如該圖所示，對(duì)于具有成員P1至P5的典型噬菌體文庫(kù)，結(jié)合的文庫(kù)成員的量是解離常數(shù)和靶標(biāo)濃度的函數(shù)。
圖5提供了結(jié)合的噬菌體對(duì)靶標(biāo)濃度的圖。該圖顯示了噬菌體文庫(kù)(每一成員都以1-13M的濃度存在)的每一結(jié)合的成員(TPi)的濃度，其中，1種結(jié)合物(P1)，Kd＝1-10M；5種結(jié)合物(P2)，Kd＝5-10M；25種結(jié)合物(P3)，Kd＝2.5-9M；50種結(jié)合物(P4)，Kd＝5-9M；100種結(jié)合物(P5)，Kd＝1-8M(并且無(wú)其它結(jié)合物)。條件與圖4所示相同，除了以1-4M的濃度存在1個(gè)另外的競(jìng)爭(zhēng)性非噬菌體結(jié)合物(P6)(1-8MKd)。x軸表示靶標(biāo)濃度(摩爾濃度)，而y軸表示結(jié)合靶標(biāo)的成員的濃度(摩爾濃度)。該圖顯示，結(jié)合的文庫(kù)成員的量是解離常數(shù)和具有成員P1至P5和一個(gè)添加的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合物的典型噬菌體文庫(kù)的靶標(biāo)濃度的函數(shù)。
圖6提供了顯示洗脫對(duì)滯留的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合圖。圖6A顯示懸浮在溶液中的結(jié)合物，而圖6B顯示了結(jié)合于靶標(biāo)的結(jié)合物，以及圖6C顯示了結(jié)合于靶標(biāo)的一些結(jié)合物。表示了三種不同類(lèi)型的結(jié)合物，并且所有三種類(lèi)型要求相同量的時(shí)間，以結(jié)合于靶標(biāo)(大約10秒)，但三種結(jié)合物的每一種具有不同的解離速率(off-rate)。具有1分鐘解離速率的結(jié)合物由八邊形表示；有30個(gè)這樣的結(jié)合物被描繪。
具有10分鐘解離速率的結(jié)合物由三角形表示；有10個(gè)這樣的結(jié)合物被描繪。具有100分鐘解離速率的結(jié)合物由傾斜45度的正方形表示；存在5個(gè)這樣的結(jié)合物被描繪。靶標(biāo)在圖的底部被顯示為“X”。因此，總而言之，圖6顯示了三類(lèi)結(jié)合物結(jié)合至固定的靶標(biāo)上。
圖7顯示了降低靶標(biāo)濃度的影響。圖7A顯示懸浮在溶液中的結(jié)合物，而圖7B顯示了結(jié)合于靶標(biāo)的結(jié)合物。具有最慢的解離速率的分子(具有最低濃度的兩類(lèi)分子)是結(jié)合的。圖7C顯示了一些結(jié)合物，僅僅具有最慢解離速率(處于最低濃度)的結(jié)合物與靶標(biāo)結(jié)合。表示出三種不同類(lèi)型的結(jié)合物，并且所有三種類(lèi)型要求相同量的時(shí)間，以結(jié)合于靶標(biāo)(大約10秒)，但三種結(jié)合物的每一種具有不同的解離速率。具有1分鐘解離速率的結(jié)合物由八邊形表示；存在30個(gè)這樣的結(jié)合物被描繪。具有10分鐘解離速率的結(jié)合物由三角形表示；存在10個(gè)這樣的結(jié)合物被描繪。具有100分鐘解離速率的結(jié)合物由傾斜45度的正方形表示；存在5個(gè)這樣的結(jié)合物被描繪。靶標(biāo)在圖的底部被顯示為“X”。因此，圖7顯示提供了例子，即當(dāng)靶標(biāo)的量有限或被降低時(shí)，三類(lèi)結(jié)合物結(jié)合至固定的靶標(biāo)。
圖8顯示了向文庫(kù)加入競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合物的影響。圖8A顯示懸浮在溶液中的結(jié)合物，而圖8B顯示了競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，涉及以高濃度和慢解離速率結(jié)合于靶標(biāo)的結(jié)合物。在文庫(kù)中存在四種不同類(lèi)型的結(jié)合物。盡管所有四種類(lèi)型要求相同量的時(shí)間以結(jié)合于靶標(biāo)(大約10秒)，但三種結(jié)合物的每一種具有不同的解離速率。具有1分鐘解離速率的結(jié)合物由八邊形表示；存在30個(gè)這樣的結(jié)合物被描繪。具有10分鐘解離速率的結(jié)合物由等腰三角形和長(zhǎng)三角形表示；其中10個(gè)結(jié)合物由等腰三角形表示，以及50個(gè)結(jié)合物由長(zhǎng)三角形表示。具有100分鐘解離速率的結(jié)合物由傾斜45度的正方形表示；存在5個(gè)這樣的結(jié)合物被描繪。靶標(biāo)在圖的底部被顯示為“X”。因此，該圖顯示，當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合物有限時(shí)，三類(lèi)結(jié)合物結(jié)合至固定的靶標(biāo)。
圖9提供了操縱濃度的計(jì)算結(jié)果或提供操縱濃度的計(jì)算結(jié)果。給定文庫(kù)濃度(摩爾濃度)(以及該文庫(kù)結(jié)合靶標(biāo)的平均結(jié)合能(ΔG千卡/摩爾))，在平均值的每一標(biāo)準(zhǔn)偏差內(nèi)的文庫(kù)成員P1-P8的期望數(shù)從二項(xiàng)(正態(tài))分布計(jì)算。計(jì)算出每一成員的平均結(jié)合能，并且計(jì)算每一成員的解離常數(shù)KD＝eΔG/RT。具有弱于或等于所述平均值的結(jié)合能的所有文庫(kù)成員被集中成一組。
圖10提供了多肽文庫(kù)的樣品計(jì)算的例子以及從這些計(jì)算得到的圖表，所述多肽文庫(kù)具有7個(gè)完全改變的氨基酸位置。圖10A提供了具有7個(gè)氨基酸的多肽的樣品計(jì)算的例子，而圖10B提供了基于上述計(jì)算預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)偏差的曲線，圖10C提供根據(jù)上面的計(jì)算繪制的不含競(jìng)爭(zhēng)物下結(jié)合的文庫(kù)成員對(duì)靶標(biāo)的圖，圖10D提供根據(jù)上面的計(jì)算繪制的含競(jìng)爭(zhēng)物下結(jié)合的文庫(kù)成員對(duì)靶標(biāo)的圖，以及圖10E組合圖10C和10D的圖。
圖11提供來(lái)自蛋白質(zhì)文庫(kù)的hSC胰凝乳蛋白酶抑制劑的質(zhì)譜篩選的層析圖，如實(shí)施例3所描述。
圖12提供hSC胰凝乳蛋白酶結(jié)合物的MS/MS測(cè)序，如實(shí)施例3所描述。圖12A顯示結(jié)合物pj01，而圖12B顯示結(jié)合物pj02。
圖13提供二級(jí)功能性篩選(secondary functional screening)并從抑制劑區(qū)分出結(jié)合物，通過(guò)質(zhì)譜篩選hSC胰凝乳蛋白酶抑制劑，如實(shí)施例3所描述。
發(fā)明描述 本發(fā)明提供篩選目標(biāo)化合物的方法。具體而言，本發(fā)明提供競(jìng)爭(zhēng)性示差篩選的方法。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，本方明提供了幫助緊密結(jié)合物的鑒定的競(jìng)爭(zhēng)性示差篩選方法。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法中所使用的試劑包括緊密結(jié)合物和弱結(jié)合物。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了采用識(shí)別和結(jié)合靶標(biāo)的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合物的方法，但所述競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合物具有弱于目標(biāo)結(jié)合物的結(jié)合。
定義 除非在本文中另外定義，本文中所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所通常理解的相同的含義。例如，Singleton和Sainsbury，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology，2d Ed.，John Wiley和Sons，NY(1994)；以及Hale和Marham，The Harper Collins Dictionary of Biology，Harper Perennial，NY(1991)為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供本發(fā)明中使用的許多術(shù)語(yǔ)的通用詮釋。廣為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的另外的參考資料包括Sambrook等，MolecularCloningA Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork ，以及Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，Greene-Publishing & Wiley Interscience NY(1987；1999年增補(bǔ))。
盡管與本文中描述的那些相似或等同的各種方法和材料在本發(fā)明的實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)有用，但優(yōu)選的方法和材料在本文中被描述。因此，通過(guò)從整體上參考說(shuō)明書(shū)，下面即將定義的術(shù)語(yǔ)被更充分描述。同樣，如本文所使用，單數(shù)“一(a)”、“一(an)”和“該(the)”包括復(fù)數(shù)涵義，除非上下文另外清楚地指出。
一般地，所使用的命名法，以及標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室步驟例如細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、以及核酸化學(xué)和雜交，在本領(lǐng)域中是熟知的并被廣泛使用的。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)被用于重組核酸方法、多核苷酸合成、微生物培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、分析化學(xué)、有機(jī)合成化學(xué)、化學(xué)合成和化學(xué)分析。通常，根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行酶反應(yīng)和純化和/或分離步驟。
術(shù)語(yǔ)“試劑(agent)”指任何結(jié)合物(binder)(例如，肽、多肽、蛋白質(zhì)或核酸)，其結(jié)合靶標(biāo)上或靶標(biāo)內(nèi)的靶分子。核酸可以是DNA和/或RNA。在任一情況下，核酸可以是單鏈或雙鏈的。該術(shù)語(yǔ)包括識(shí)別特定靶分子的配體，以及肽衍生物、肽模擬物、擬肽、有機(jī)小分子、碳水化合物，和從候選混合物中分離的其它分子，所述候選混合物以期望的方式作用于靶分子。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“試劑”不限于特定的分子大小或組成特征。在一些實(shí)施方式中，試劑作為酶催化反應(yīng)的底物，而在其它實(shí)施方式中，試劑是激動(dòng)劑、拮抗劑和/或信號(hào)信使。在一些實(shí)施方式中，試劑刺激或抑制代謝通路。在另選的實(shí)施方式中，試劑是表達(dá)在噬菌體表面上的肽或多肽，作為噬菌體被殼蛋白的一部分，如噬菌體展示篩選法所常規(guī)進(jìn)行的。
在有些實(shí)施方式中，試劑結(jié)合靶分子。在有些實(shí)施方式中，試劑催化性地改變靶分子。類(lèi)似地，在可選的實(shí)施方式中，試劑與靶分子反應(yīng)，導(dǎo)致靶分子的修飾或變化。在又一個(gè)實(shí)施方式中，試劑被修飾，以促進(jìn)試劑或試劑-靶標(biāo)分子復(fù)合物的分離。在另外的實(shí)施方式中，“標(biāo)記(tag)”(例如生物素)被連接在試劑或靶標(biāo)上的至少一個(gè)位置中，以幫助使用鏈霉抗生物素分離新的、結(jié)合的試劑-靶標(biāo)復(fù)合物。在可選的實(shí)施方式中，試劑被連接于螯合化合物或金屬，使得促進(jìn)通過(guò)螯合或磁場(chǎng)進(jìn)行的分離。在還有一個(gè)實(shí)施方式中，試劑被直接或間接鏈接于報(bào)告分子或另一個(gè)標(biāo)記物。在另外的實(shí)施方式中，試劑被修飾或被操縱，從而改變它們的形狀或構(gòu)象。仍在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，試劑對(duì)于靶分子具有這樣的結(jié)合親和力，該親和力在抗體對(duì)于選擇的配體的結(jié)合親和力的典型范圍的某處。
試劑(或抗試劑(反試劑，anti-agent))對(duì)其靶標(biāo)(或抗靶標(biāo)(反靶標(biāo)，anti-target))的結(jié)合親和力經(jīng)常用解離常數(shù)(Kd)，50％有效結(jié)合所需的濃度(EC50)，或?qū)Y(jié)合至所述靶標(biāo)的另一化合物的結(jié)合50％抑制所需的濃度(IC50)描述。Ko由koff/kon定義。koff值定義靶標(biāo)/配體復(fù)合物斷裂開(kāi)或分離的速率；kon值描述試劑和靶標(biāo)分子結(jié)合以形成試劑-靶標(biāo)分子復(fù)合物的速率。結(jié)合親和力術(shù)語(yǔ)在本領(lǐng)域中有時(shí)指試劑-靶標(biāo)分子復(fù)合物的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性或反映親和力比率的任何其它可測(cè)量的量的比率。選擇性或者通過(guò)結(jié)合親和力的比率或者通過(guò)試劑-復(fù)合物的解離速率的比率(例如，靶分子Kd/抗靶分子Kd)來(lái)定義。在一些實(shí)施方式中，期望增加kon，而在其它實(shí)施方式中，期望降低koff，以及在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，期望增加kon并降低koff。
如本文所使用，“抗靶標(biāo)(anti-target)”是指之前已被鑒定為結(jié)合靶標(biāo)并通常被擴(kuò)增，產(chǎn)生結(jié)合物收集物的試劑。在一些實(shí)施方式中，抗靶標(biāo)是核酸(單鏈或雙鏈DNA和/或RNA)。在本文中，為了方便起見(jiàn)，術(shù)語(yǔ)“試劑(agent)”被用在下面的實(shí)施例中，既指“試劑”(即，結(jié)合靶分子的分子)，又指“抗靶標(biāo)劑”(抗靶標(biāo)試劑)。因此，“試劑”包括識(shí)別特定靶標(biāo)的配體或抗靶標(biāo)分子。
如本文所使用，“收集物(collection)”指一組將被觀察、研究、使用和/或保持在一起的對(duì)象。因此，該術(shù)語(yǔ)包括試劑收集物，其中靶標(biāo)群被暴露于此試劑收集物。
如本文所使用，“類(lèi)型(type)”是指可以與其它試劑區(qū)分開(kāi)的試劑。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，類(lèi)型通過(guò)結(jié)合親和力或Kd與另一類(lèi)型的試劑通過(guò)其結(jié)合親和力區(qū)分開(kāi)。作為非限制性例子，在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，三種不同類(lèi)型的結(jié)合物包括三類(lèi)大概具有三種不同結(jié)合親和力的試劑。類(lèi)型的一個(gè)圖示例子提供在圖中(例如，圖7顯示三種類(lèi)型的結(jié)合物，具有1分鐘解離速率的結(jié)合物，具有10分鐘解離速率的結(jié)合物，和具有100分鐘解離速率的結(jié)合物)。
如本文所使用，“目標(biāo)蛋白質(zhì)(protein of interest)”指被分析、鑒定和/或修飾的蛋白質(zhì)。發(fā)現(xiàn)天然發(fā)生的蛋白以及重組蛋白在本發(fā)明中有用。
如本文所使用，“蛋白質(zhì)(protein)”是指由氨基酸組成并被本領(lǐng)域技術(shù)人員承認(rèn)為蛋白質(zhì)的任何成分。術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”、“肽(peptide)”和多肽(polypeptide)在本文中可互換使用。其中肽是蛋白質(zhì)的一部分，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員理解該術(shù)語(yǔ)在上下文中的用途。術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”包括成熟形式的蛋白，以及相關(guān)蛋白的原-(pro-)形式和前原-(prepro-)形式。蛋白質(zhì)的前原形式包括具有可操縱性連接到蛋白質(zhì)的氨基端的原序列(prosequence)的蛋白質(zhì)的成熟形式，以及可操縱性連接到所述原序列的氨基端的“前”或“信號(hào)”序列。該術(shù)語(yǔ)意欲于還包括這樣的序列如抗體的序列。
具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族已經(jīng)在本領(lǐng)域中被定義。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(例如，賴(lài)氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電極性側(cè)鏈(例如，天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、半胱氨酸、甘氨酸)、β-支化側(cè)鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)以及芳族側(cè)鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。如本領(lǐng)域所知，標(biāo)準(zhǔn)三字母或單字母氨基酸縮寫(xiě)在本文中被使用。等價(jià)的取代可以被包括在權(quán)利要求的范圍內(nèi)(例如，氨基酸取代相同組的另一氨基酸)。
在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的肽、多肽和/或蛋白質(zhì)包括一個(gè)或多個(gè)非典型氨基酸?？傮w上說(shuō)，“非典型氨基酸(non-classical amino acid)”通常包括但不限于常見(jiàn)氨基酸的D-異構(gòu)體、α-氨基異丁酸、4-氨基丁酸(4-Abu)、2-氨基丁酸(2-Abu)、6-氨基己酸(Ahx)、2-氨基異丁酸(2-Aib)、3-氨基丙酸、鳥(niǎo)氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、羥脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、半胱磺酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、環(huán)己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代氨基酸、“設(shè)計(jì)師(designer)”氨基酸例如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸和一般的氨基酸類(lèi)似物。
如本文所使用的“抗體(anibody)”(Ab)和“免疫球蛋白(Immunoglobulin)”(IgG)，指被定義為人和其它動(dòng)物的B細(xì)胞和漿細(xì)胞產(chǎn)生的糖蛋白，其高特異性地結(jié)合抗原(通常但并不總是肽)或結(jié)構(gòu)上相似的抗原，所述抗原導(dǎo)致抗體的產(chǎn)生?？贵w可以通過(guò)任何已知的方法產(chǎn)生并且可以是多克隆或單克隆抗體。該術(shù)語(yǔ)還包括結(jié)合抗原的嵌合抗體、人源化抗體、免疫球蛋白或抗體或抗體的功能性片段。此類(lèi)功能性部分的例子包括完整的抗體分子、抗體片段，例如Fv、單鏈Fv、互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)、VL(輕鏈可變區(qū))、VH(重鏈可變區(qū))、以及這些物質(zhì)或能夠結(jié)合靶抗原的免疫球蛋白肽的任何其它功能部分的任意結(jié)合。
本發(fā)明所使用的抗體可以使用各種免疫原制備。本領(lǐng)域已知的各種方法可以被用于多克隆抗體的生產(chǎn)。在一些制備抗體的實(shí)施方式中，通過(guò)注射相應(yīng)于本發(fā)明的感興趣靶標(biāo)的肽，對(duì)不同的宿主動(dòng)物(包括但不限于兔、小鼠、大鼠、綿羊、山羊等)進(jìn)行免疫。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述肽被偶聯(lián)于免疫原載體(例如，白喉毒素、牛血清白蛋白(BSA)、或匙孔血藍(lán)蛋白[MLH])。取決于宿主物種，各種佐劑可以被用于增加免疫應(yīng)答，包括但不限于弗氏(完全和不完全)、礦物膠例如氫氧化鋁、表面活性物質(zhì)例如溶血卵磷脂、多聚醇、聚陰離子、肽、油乳液、匙孔血藍(lán)蛋白、二硝基苯酚、以及潛在有用的人佐劑例如BCG(卡介苗(Bacille Calmette-Guerin))和短小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)。
為制備單克隆抗體，可以使用通過(guò)培養(yǎng)中的連續(xù)細(xì)胞系產(chǎn)生抗體分子的任何技術(shù)(參見(jiàn)，例如Harlow和Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。這些技術(shù)包括但不限于最初由Khler和Milstein開(kāi)發(fā)的雜交瘤技術(shù)(Khler和Milstein，Nature 256495-497 )，以及三體瘤技術(shù)，人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(參見(jiàn)，例如Kozbor等人，Immunol.Today472 )，和用于產(chǎn)生人單克隆抗體的EBV雜交瘤技術(shù)(參見(jiàn)，例如Cole等人，在Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy中，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96 )。在本發(fā)明的一些特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供IgG類(lèi)的單克隆抗體。
在本發(fā)明的另外的實(shí)施方式中，在無(wú)菌動(dòng)物中生產(chǎn)單克隆抗體(參見(jiàn)，例如PCT/US90/02545)。根據(jù)本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)人抗體有用，并可以使用人雜交瘤(參見(jiàn)，例如Cote et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.802026-2030 )或通過(guò)用EBV病毒體外轉(zhuǎn)化人B細(xì)胞(參見(jiàn)，例如Cote et al.，見(jiàn)上)而獲得。
發(fā)現(xiàn)描述單鏈抗體的產(chǎn)生的技術(shù)(美國(guó)專(zhuān)利4,946,778，并入本文作為參考)在產(chǎn)生特異識(shí)別目標(biāo)分子的單鏈抗體中有用。在一些實(shí)施方式中，描述用于構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(kù)的技術(shù)(例如，參見(jiàn)Huse et al，Science 2461275-1281 )被用于允許迅速而容易地鑒定具有期望特異性的單克隆Fab片段。
含有抗體分子的獨(dú)特型(抗原結(jié)合區(qū))的抗體片段可以通過(guò)已知的技術(shù)產(chǎn)生。例如，此類(lèi)片段包括但不限于可以通過(guò)胃蛋白酶消化抗體分子而制備的F(ab′)2片段；可以通過(guò)還原F(ab′)2片段的二硫鍵而產(chǎn)生的Fab′片段，以及可以通過(guò)用木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體分子而得到的Fab片段。
在抗體的產(chǎn)生中，可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)期望抗體的篩選(例如，放射免疫測(cè)定、ELISA[酶聯(lián)免疫試驗(yàn)]、“夾心”免疫試驗(yàn)、免疫放射分析、凝膠擴(kuò)散沉淀反應(yīng)、免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、原位免疫分析[例如使用膠體金、酶或放射性同位素標(biāo)記](méi))、蛋白質(zhì)印跡、沉淀反應(yīng)、凝集試驗(yàn)(例如凝膠凝集試驗(yàn)、血凝集試驗(yàn)等)、補(bǔ)體固定試驗(yàn)、免疫熒光測(cè)定、蛋白質(zhì)A測(cè)定和免疫電泳試驗(yàn)等。
在一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)檢測(cè)一抗上的標(biāo)記來(lái)檢測(cè)抗體結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)檢測(cè)二抗或反應(yīng)物與一抗的結(jié)合來(lái)檢測(cè)一抗。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，二抗被標(biāo)記。許多手段在本領(lǐng)域中已知用于檢測(cè)免疫試驗(yàn)中的結(jié)合，并在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
如本文所使用，“染色(staining)”指本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的任何數(shù)量的過(guò)程，其被用于更好顯現(xiàn)細(xì)胞或多個(gè)細(xì)胞的具體成分(多個(gè)成分)和/或特征(多個(gè)特征)。
如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸(oligonucleotide)”被定義為由兩個(gè)或更多個(gè)脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸組成的分子。確切的大小取決于許多因素，其反過(guò)來(lái)取決于寡核苷酸的最終功能或用途。寡核苷酸可以通過(guò)任何合適的方法制備，包括，例如，適宜的序列的克隆和限制以及通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何合適的方法進(jìn)行直接化學(xué)合成，例如磷酸三酯法(參見(jiàn)Narang et al.，Meth.Enzymol.，6890-99 )；磷酸二酯法(例如參見(jiàn)Brown et al，Meth.EnzymoL，68109-151 )；二乙基亞磷酰胺酯法(diethylphosphoramidite method)(參見(jiàn)Beaucage et al.，Tetrahedron Lett.221859-1862 )，以及固相支持體法(solid support methods)(例如參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第4,458,066號(hào))。有關(guān)合成方法的多個(gè)有用的綜述對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的(例如參見(jiàn)Goodchild，1990，Bioconjugate Chemistry1(3)165-187 )。上述參考文獻(xiàn)被并入本文作為參考。
如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“擬肽(peptoid)”是指抗酶促肽類(lèi)似物(enzymaticallyresistant peptide analog)。
如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“接觸(contact)”和“暴露(expose)”意指使試劑的收集物和靶標(biāo)分子處于極為接近或緊密聯(lián)系中并包括體內(nèi)和體外接觸。該術(shù)語(yǔ)包括接觸(touching)、偶聯(lián)(associating)、結(jié)合(joining)或組合(combining)。該術(shù)語(yǔ)也被用于與抗靶標(biāo)有關(guān)。
術(shù)語(yǔ)“分離(separating)”意指選擇、分開(kāi)(segregate)、分割(partition)、分離(isolation)、收集(collect)、保持分開(kāi)(keep apart)和使分離(disunite)。
術(shù)語(yǔ)“擴(kuò)增(amplifying)”和“擴(kuò)增(amplify)”是指任何方法或方法步驟的組合，其增加分子或一類(lèi)分子的拷貝量或拷貝數(shù)。作為例子，在一些實(shí)施方式中，試劑或抗靶標(biāo)試劑的收集物的每一成員以這樣的水平存在，該水平比擴(kuò)增之前的水平高約100倍、約500倍、約1000倍、約5000倍、約10,000倍、約100,000倍或約1,000,000倍。
術(shù)語(yǔ)“低濃度(low concentration)”指靶標(biāo)的濃度，其比通過(guò)計(jì)算文庫(kù)成員與靶標(biāo)的期望解離常數(shù)而獲得的濃度高約1,000倍至底約10倍。低濃度可以是例如在文庫(kù)成員與靶標(biāo)結(jié)合的期望解離常數(shù)的約10倍或以下時(shí)的濃度。在一些實(shí)施方式中，優(yōu)選的濃度在約1微摩爾濃度(1e-6M)和約1皮摩爾濃度(1e-12M)之間，優(yōu)選約1e-7和1e-11之間的任何濃度。
如本文所使用，“操縱濃度(manipulated concentration)”是指已經(jīng)被操縱以達(dá)到本發(fā)明的期望效應(yīng)的濃度，尤其是靶標(biāo)群的濃度。在一些實(shí)施方式中，操縱包括增加或降低靶標(biāo)群的濃度，例如，使得靶標(biāo)群具有與其它濃度成比例相關(guān)的濃度。在一些實(shí)施方式中，操縱濃度包括增加的文庫(kù)濃度、文庫(kù)多樣性的降低——其增加文庫(kù)的每一成員的濃度、和/或降低的靶標(biāo)濃度。
術(shù)語(yǔ)“正常的(normal)”指實(shí)體處于沒(méi)有可觀察和/或可檢測(cè)的異?；蛉毕莸臓顟B(tài)。因此，正常細(xì)胞是這樣的細(xì)胞，其符合或遵循典型的、標(biāo)準(zhǔn)的表達(dá)模式、表達(dá)水平，與其自身類(lèi)型的未改變細(xì)胞的表型和基因型一致。相反地，“異常的(abnormal)”意指非典型的、不常見(jiàn)的或非正規(guī)的、不正常的。因此，病態(tài)的細(xì)胞是“異常的”細(xì)胞類(lèi)型。
術(shù)語(yǔ)“靶標(biāo)(target)”指目標(biāo)物質(zhì)，而該目標(biāo)物質(zhì)被暴露于根據(jù)本發(fā)明的試劑或試劑群。在一些實(shí)施方式中，靶標(biāo)被溫育一段期望的時(shí)期。
在另外的實(shí)施方式中，生物表面是器官的表面，而在可選的實(shí)施方式中，生物表面是細(xì)胞或組織的表面。在一些進(jìn)一步的實(shí)施方式中，生物表面是患病器官、組織或細(xì)胞的表面，而在一些可選的實(shí)施方式中，生物表面是正?；蚪】灯鞴?、組織或細(xì)胞的表面。
仍在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述表面是組織胞間隙中的大分子。在另外的實(shí)施方式中，生物表面是微生物的表面，微生物包括但不限于細(xì)菌、真菌、病毒、寄生物(蠕蟲(chóng)、原生動(dòng)物等)。在一些實(shí)施方式中，微生物是動(dòng)物病原體，而在其它實(shí)施方式中，微生物對(duì)人和/或其它動(dòng)物是非致病性的。細(xì)胞和/或組織的來(lái)源包括人、非人類(lèi)動(dòng)物、細(xì)菌、真菌和植物。
因此，預(yù)期任何生物表面(例如，細(xì)胞、組織、皮膚、指甲、內(nèi)部器官、外部器官和/或毛發(fā))將發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明中可用作靶標(biāo)。在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞是人細(xì)胞，而在可選的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是非人類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、或真菌細(xì)胞。該術(shù)語(yǔ)也包括含有病毒和/或病毒顆粒的細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞是造血細(xì)胞、癌細(xì)胞、或逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。
在可選的實(shí)施方式中，所述靶標(biāo)是血細(xì)胞，包括造血細(xì)胞(例如，造血干細(xì)胞)，以及在紅細(xì)胞系、血小板系和白細(xì)胞系中的各種未成熟細(xì)胞?！把?xì)胞(bloodcells)”包括但不限于造血細(xì)胞、紅細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、血小板、肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞、漿細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，所述靶標(biāo)是異常的血細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，HSC靶標(biāo)具有CD34+Thy-1+或CD34+Thy-1+Lin-的表面抗原表達(dá)模式(“Lin-”指基于缺乏至少一種譜系特異性標(biāo)記的表達(dá)而選擇的細(xì)胞群)。分離和選擇HSCs的方法在本領(lǐng)域中是熟知的(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利第5,061,620、5,677,136和5,750,397號(hào)，每一個(gè)專(zhuān)利被完整引入本文)。
在其它實(shí)施方式中，所述靶標(biāo)是分子。在一些實(shí)施方式中，所述分子是有機(jī)分子。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述分子是生物分子。在另外的實(shí)施方式中，所述生物分子是細(xì)胞相關(guān)分子。仍在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞相關(guān)分子與細(xì)胞的外表面偶聯(lián)。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞相關(guān)分子是胞外基質(zhì)的一部分。在一些另外的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞相關(guān)分子是蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，所述蛋白質(zhì)是受體。在另外的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞相關(guān)分子對(duì)特定細(xì)胞類(lèi)型具有特異性。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是病態(tài)和/或異常細(xì)胞。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述病態(tài)細(xì)胞是癌細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述病態(tài)細(xì)胞是受感染的細(xì)胞。在本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)作為靶標(biāo)有用的另外的分子包括但不限于蛋白質(zhì)、肽、核酸、碳水化合物、脂類(lèi)、多糖、糖蛋白、激素、受體、抗原、抗體、毒性物質(zhì)、代謝物、抑試劑、藥物、染料、營(yíng)養(yǎng)物和生長(zhǎng)因子。
本發(fā)明所包含的蛋白質(zhì)和化學(xué)靶標(biāo)的非限定性例子包括趨化因子和細(xì)胞因子以及它們的受體。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞因子(cytokine)”是指眾多對(duì)細(xì)胞施加各種效應(yīng)(例如，誘導(dǎo)生長(zhǎng)、分化和/或增殖)的因子中的任何一種。非限制性例子包括白介素(IL)，例如IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14和IL-16；可溶性IL-2受體；可溶性IL-6受體；紅細(xì)胞生成素(EPO)；血小板生成素(TPO)；粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)；干細(xì)胞因子(SCF)；白血病抑制因子(LIF)；干擾素(例如，IFN-α、-β、-γ)；制瘤素M(OM)；免疫球蛋白超家族；腫瘤壞死因子(TNF)家族，尤其是TNF-α；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子，(例如，TGF-α和TGF-β)；和IL-α；和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)家族，尤其是VEGF(在本領(lǐng)域中也稱(chēng)為VEGF-A)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(PLGF)。從多個(gè)銷(xiāo)售商可以商業(yè)獲得細(xì)胞因子，包括Amgen(Thousand Oaks，CA)、Immunex(Seattle，WA)和Genentech(South San Francisco，CA)。
如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“組織(tissue)”指一組或一層相似特化的細(xì)胞，其一起執(zhí)行某些特化的功能。在一些組織中，僅存在一種類(lèi)型的細(xì)胞，而在其它組織中，存在不同類(lèi)型的細(xì)胞。該術(shù)語(yǔ)包括但不限于淋巴組織、淋巴結(jié)樣組織、脂肪組織、骨(bony)組織、蜂窩(aerolar)組織、軟骨組織、結(jié)締組織、彈性組織、內(nèi)皮組織、上皮組織、纖維組織、腺組織、腸相關(guān)淋巴組織(gut-associated lymphoid，GALT)、未分化(indifferent)組織、間質(zhì)組織、網(wǎng)狀組織、間充質(zhì)組織、骨髓組織、肌肉組織、神經(jīng)組織、骨(osseous)組織、骨骼組織、皮下組織和其它組織類(lèi)型。如本文所使用，該術(shù)語(yǔ)還可以包括修飾的組織。
術(shù)語(yǔ)“靶標(biāo)群(target population)”指感興趣的靶標(biāo)的收集物，試劑或試劑群被暴露于該感興趣的靶標(biāo)的收集物。靶標(biāo)群可以包括單靶標(biāo)或靶標(biāo)的集合，如本文所述。生物表面的任何收集物，包括但不限于細(xì)胞、組織、皮膚、指甲和/或毛發(fā)，發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明中作為靶標(biāo)群有用。
在一些實(shí)施方式中，靶標(biāo)群包括一組癌細(xì)胞、癌細(xì)胞系或癌細(xì)胞培養(yǎng)物，腫瘤提取物或癌組織或癌器官；與癌細(xì)胞、癌細(xì)胞系或癌細(xì)胞培養(yǎng)物，腫瘤提取物或癌組織或癌器官相關(guān)的分子；或與癌細(xì)胞、癌細(xì)胞系或癌細(xì)胞培養(yǎng)物，腫瘤提取物或癌組織或癌器官相關(guān)的細(xì)胞、細(xì)胞系或細(xì)胞培養(yǎng)物、組織或器官。在一些實(shí)施方式中，靶標(biāo)群包括抗原或抗原收集物本身。靶標(biāo)群的非限制例子可以在以下找到。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述靶標(biāo)是“癌癥相關(guān)靶標(biāo)”。該術(shù)語(yǔ)包括任何靶標(biāo)，其中，作為有機(jī)體中癌癥或癌癥相關(guān)癥狀的診斷或檢測(cè)的一部分，本發(fā)明的組合物與所述靶標(biāo)結(jié)合。例如，該術(shù)語(yǔ)包括癌細(xì)胞、癌組織和/或癌器官；與癌細(xì)胞、癌組織和/或癌器官相關(guān)的分子；和/或與癌細(xì)胞、癌組織和/或癌器官相關(guān)的分子、細(xì)胞、組織或器官(例如，施用于對(duì)象的結(jié)合腫瘤的診斷分子)以及從對(duì)象取出的活組織檢查樣品，或健康組織(例如，與癌性組織相關(guān)的脈管系統(tǒng))。癌癥相關(guān)靶標(biāo)的例子被提供在美國(guó)專(zhuān)利第6,261,535，號(hào)中，該專(zhuān)利被全部并入本文作為參考。然而，本發(fā)明不意欲限制于任何具體的癌癥相關(guān)靶標(biāo)。所述癌癥相關(guān)靶標(biāo)可以與任何癌癥或癌癥相關(guān)狀態(tài)有關(guān)。癌癥類(lèi)型的例子包括但不限于癌、肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、和混合類(lèi)型的癌癥。
術(shù)語(yǔ)“分子(molecule)”指靶分子(例如，抗原或配體)、試劑和/或抗靶標(biāo)分子。合適的試劑、靶標(biāo)分子和抗靶標(biāo)分子包括但不限于蛋白質(zhì)、肽、核酸、碳水化合物、脂類(lèi)、多糖、糖蛋白、激素、受體、抗原、抗體、病毒、致病原、毒性物質(zhì)、代謝物、抑試劑、藥物、染料、營(yíng)養(yǎng)物、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞或組織。
本發(fā)明提供競(jìng)爭(zhēng)性示差篩選試驗(yàn)。本發(fā)明增加在最后一輪的篩選和洗脫之后獲得的特異性結(jié)合至特定靶標(biāo)的試劑的比例。這增加靶表面上或懸浮液中期望靶分子與非期望分子(例如抗靶標(biāo)分子)的信噪比(signal-to-noise)，使得至少一種試劑(例如結(jié)合物)通過(guò)使用篩選試驗(yàn)而被分離。結(jié)果，所述試驗(yàn)促進(jìn)更高質(zhì)量和更緊密結(jié)合物的分離。
發(fā)明詳述 本發(fā)明提供篩選目標(biāo)化合物的方法。具體而言，本發(fā)明提供競(jìng)爭(zhēng)性示差篩選的方法。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，本方明提供了促進(jìn)緊密結(jié)合物的鑒定的競(jìng)爭(zhēng)性示差篩選方法。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法中所使用的試劑包括緊密結(jié)合物和弱結(jié)合物。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了采用識(shí)別和結(jié)合靶標(biāo)的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合物的方法，但所述競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合物具有不強(qiáng)于目標(biāo)結(jié)合物的結(jié)合。
特別優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明提供手段，該手段增加在最后一輪的篩選和洗脫之后獲得的特異性結(jié)合至特定靶標(biāo)的試劑的比例。這增加靶表面上或懸浮液中期望靶分子與非期望抗靶標(biāo)分子的信噪比，從而幫助至少一種結(jié)合物的分離。
在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供分離至少一種目標(biāo)結(jié)合物的方法，所述方法包括步驟使靶標(biāo)群與試劑收集物接觸，所述試劑收集物具有操縱濃度；洗滌掉未結(jié)合于所述靶標(biāo)群的試劑；以及區(qū)分、分離并鑒定所述至少一種目標(biāo)結(jié)合物。
在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離至少一種目標(biāo)結(jié)合物的方法，包括使第一靶標(biāo)與試劑的第一收集物接觸；洗滌掉未結(jié)合于在所述靶標(biāo)中存在的靶分子的試劑，并丟棄被洗出的試劑；洗脫結(jié)合于靶分子的試劑，以產(chǎn)生抗靶標(biāo)肽的收集物；擴(kuò)增所述抗靶標(biāo)肽收集物；將所述擴(kuò)增的抗靶標(biāo)肽收集物和試劑的第一收集物或第二收集物施用于所述第一靶標(biāo)或施用于第二靶標(biāo)；洗滌掉未結(jié)合于所述第一或第二靶標(biāo)中的靶分子的試劑；以及區(qū)別、分離和鑒定所述至少一種目標(biāo)結(jié)合物。
在可選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供分離至少一種目標(biāo)結(jié)合物的方法，所述方法包括步驟使靶標(biāo)群與試劑收集物接觸，所述試劑收集物具有操縱濃度；洗滌掉未結(jié)合于所述靶標(biāo)群的試劑；以及區(qū)分、分離并鑒定所述至少一種目標(biāo)結(jié)合物。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述試劑收集物包括至少一種類(lèi)型的肽。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述試劑收集物包括至少一種類(lèi)型的核酸。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述核酸類(lèi)型是DNA或RNA分子。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，操縱濃度為所述靶標(biāo)群濃度的約1×10-3至約1×103倍。在一些可選的優(yōu)選實(shí)施方式中，操縱濃度包含試劑多樣性的下降，使得每一單獨(dú)試劑的濃度增加至所述試劑期望解離常數(shù)的約1×10-4至約1×102倍。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，操縱濃度包括至少一種競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合物，所述至少一種競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合物包括對(duì)期望靶標(biāo)具有預(yù)先確定的解離常數(shù)的結(jié)合物。預(yù)期本領(lǐng)域已知的用于操縱所述濃度的任何合適的方法將發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明中有用。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述試劑收集物包括至少一種類(lèi)型的肽。在其它優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述試劑收集物包括至少一種類(lèi)型的核酸。仍在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述核酸類(lèi)型是DNA或RNA分子。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，靶標(biāo)群是一組靶標(biāo)(例如，一組細(xì)胞或核酸)，其每一成員包含至少一種靶標(biāo)或靶分子。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述靶標(biāo)群包括癌細(xì)胞、癌細(xì)胞系、癌細(xì)胞培養(yǎng)物，腫瘤提取物或癌組織或癌器官；與癌細(xì)胞、癌細(xì)胞系或癌細(xì)胞培養(yǎng)物，腫瘤提取物或癌組織或癌器官相關(guān)的分子；或與癌細(xì)胞、癌細(xì)胞系或癌細(xì)胞培養(yǎng)物，腫瘤提取物或癌組織或癌器官相關(guān)的細(xì)胞、細(xì)胞系或細(xì)胞培養(yǎng)物、組織或器官。
在一些實(shí)施方式中，所述靶標(biāo)群包括至少一種表面或一組表面。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述表面是生物表面。在其它實(shí)施方式中，所述生物表面是器官的表面。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述生物表面是組織的表面。在另外的實(shí)施方式中，所述生物表面是細(xì)胞的表面。在還有進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述生物表面是病態(tài)器官、組織或細(xì)胞的表面。在其它實(shí)施方式中，所述生物表面是正常或健康器官、組織或細(xì)胞的表面。在另外的實(shí)施方式中，所述表面是組織胞間隙中的大分子。在其它實(shí)施方式中，所述生物表面是非致病原或致病原的表面。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述表面是非生物表面。在一些實(shí)施方式中，所述非生物表面是醫(yī)療設(shè)備的表面。在另外的實(shí)施方式中，所述醫(yī)療設(shè)備是治療性設(shè)備。還在另外的實(shí)施方式中，所述治療性設(shè)備是植入的治療性設(shè)備。在仍進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述醫(yī)療設(shè)備是診斷性設(shè)備。在其它實(shí)施方式中，所述診斷性設(shè)備是孔或盤(pán)。
在另外的實(shí)施方式中，所述靶標(biāo)群是癌癥相關(guān)的。在一些實(shí)施方式中，所述癌癥相關(guān)靶標(biāo)群包括任何靶標(biāo)群，作為癌癥或癌癥相關(guān)癥狀的診斷或檢測(cè)的一部分，試劑收集物與所述靶標(biāo)群結(jié)合(例如，癌細(xì)胞、組織或器官；與癌細(xì)胞、組織或器官相關(guān)的分子；或與癌細(xì)胞、組織或器官相關(guān)的分子、細(xì)胞、組織或器官；也參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第6,261,535，號(hào)，該專(zhuān)利被全部并入本文作為參考)。在一些實(shí)施方式中，所述癌癥相關(guān)靶標(biāo)群與任何癌癥或癌癥相關(guān)狀態(tài)有關(guān)。癌癥類(lèi)型的例子包括癌、肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤和混合類(lèi)型的癌癥。
在一些實(shí)施方式中，所述癌癥是骨癌。例子包括，但不限于，尤文肉瘤、骨肉瘤、橫紋肌肉瘤和其它軟組織肉瘤。在其它實(shí)施方式中，所述癌癥是神經(jīng)系統(tǒng)癌，包括但不限于腦腫瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、室管膜細(xì)胞瘤、腦膜瘤、淋巴瘤、施旺細(xì)胞瘤和成神經(jīng)管細(xì)胞瘤。在另外的實(shí)施方式中，所述癌癥是乳腺癌(例如，乳腺中的原位導(dǎo)管癌)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述癌癥是前列腺癌。在仍進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述癌癥是內(nèi)分泌系統(tǒng)癌癥(例如，腎上腺、胰腺、甲狀旁腺、垂體和甲狀腺)。在另外的實(shí)施方式中，所述癌癥是消化系統(tǒng)癌(例如，肛門(mén)癌、結(jié)腸直腸癌、直腸癌、口腔癌、舌癌、食道癌、胃癌、膽囊癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、大腸癌和小腸癌)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述癌癥是婦科癌(例如，子宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮癌、輸卵管癌、妊娠期滋養(yǎng)層疾病、絨毛膜癌、卵巢癌、陰道癌和外陰癌)。在仍進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述癌癥是頭部和頸部癌癥(例如，喉癌、口咽癌、甲狀旁腺癌和甲狀腺癌)。在另外的實(shí)施方式中，所述癌癥是白血病(例如，急性成淋巴細(xì)胞白血病、急性髓性白血病、慢性成淋巴細(xì)胞白血病、慢性髓性白血病、毛細(xì)胞白血病和/或骨髓增生障礙)。在仍進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述癌癥是肺癌(例如，間皮瘤、非小細(xì)胞性肺癌以及小細(xì)胞性肺癌)。在另外的實(shí)施方式中，所述癌癥是淋巴瘤(例如，AIDS相關(guān)淋巴瘤、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、B細(xì)胞淋巴瘤、蕈樣肉芽腫、霍奇金病和非霍奇金病)。在其它實(shí)施方式中，所述癌癥是骨髓瘤(例如，多發(fā)性骨髓瘤)。仍在其它實(shí)施方式中，所述癌癥是兒科癌(例如腦瘤、尤文肉瘤、白血病(例如，急性成淋巴細(xì)胞白血病或急性髓性白血病)、肝癌、淋巴瘤(例如，霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、肉瘤(例如，骨肉瘤或橫紋肌肉瘤)以及維耳姆斯瘤。在仍進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述癌癥是雄性生殖癌癥，包括但不限于前列腺癌、睪丸癌、附睪癌和陰莖癌。在另外的實(shí)施方式中，所述癌癥是皮膚癌(例如，皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、蕈樣肉芽腫、卡波西肉瘤、皮下或黑素瘤)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述癌癥是甲狀腺癌(例如，乳頭狀癌、濾泡性癌、髓樣癌或未分化(anaplastic)或未分化(undifferentiated)甲狀腺癌)。在另外的實(shí)施方式中，所述癌癥是泌尿系統(tǒng)癌(例如，膀胱、腎和尿道)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述癌癥或癌癥相關(guān)癥狀是運(yùn)動(dòng)失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥、未知初始起源的癌、Li-Fraumeni綜合癥或胸腺瘤。在仍進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述癌癥是轉(zhuǎn)移癌癥。
在另外的實(shí)施方式中，所述癌癥相關(guān)靶標(biāo)是與癌細(xì)胞或組織相關(guān)的分子。在一些實(shí)施方式中，所述分子是腫瘤或腫瘤脈管系統(tǒng)/基質(zhì)抗原，例如CD20、CD19、CD30、CD3、GD2、Lewis-Y、72kd糖蛋白(gp72、衰變加速因子、CD55、DAF、C3/C5轉(zhuǎn)化酶)、CO17-1A(EpCAM、17-1A、EGP-40)、TAG-72、CSAg-P(CSAp)、45kd糖蛋白、HT-29ag、NG2、A33(43kd gp)、38kd gp、MUC-I、CEA、EGFR(HER1)、HER2、HER3、HER4、HN-1配體、CA125、黏結(jié)蛋白聚糖-1、Lewis X、FAP基質(zhì)抗原(成纖維細(xì)胞活化蛋白)、EDG受體(內(nèi)皮糖蛋白受體)、ED-B、層粘連蛋白-5(γ2)、cox-2(+LN-5)、PgP(P-糖蛋白)，αVβ3整聯(lián)蛋白、αVβ5整聯(lián)蛋白、uPAR(尿激酶型纖溶酶原激活物受體)、內(nèi)皮糖蛋白(CD105)、GD2、氨基肽酶、生腱蛋白-C、NG-2、TEM1、TEM8、膜聯(lián)蛋白、葉酸受體骨橋蛋白(EDG 1，3)、p97(黑素運(yùn)鐵蛋白)、法尼基轉(zhuǎn)移酶或凋亡途徑中的分子(例如，死亡受體、fas、胱天蛋白酶或bcl-2)或凝集素。
在可選的實(shí)施方式中，所述靶標(biāo)是血細(xì)胞，包括造血細(xì)胞(例如，造血干細(xì)胞)，以及在紅細(xì)胞系、血小板系和白細(xì)胞系中的各種未成熟細(xì)胞。“血細(xì)胞”包括但不限于造血細(xì)胞、紅細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、血小板、肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞、漿細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，所述靶標(biāo)是異常血細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，HSC靶標(biāo)具有CD34+Thy-1+或CD34+Thy-1+Lin-的表面抗原表達(dá)模式(“Lin-”指基于缺乏至少一種譜系特異性標(biāo)記的表達(dá)而選擇的細(xì)胞群)。分離和選擇HSCs的方法在本領(lǐng)域中是熟知的(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利第5,061,620、5,677,136和5,750,397號(hào)，每一個(gè)專(zhuān)利被完整引入本文)。
在其它實(shí)施方式中，所述靶標(biāo)是分子。在一些實(shí)施方式中，所述分子是有機(jī)分子。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述分子是生物分子。在另外的實(shí)施方式中，所述生物分子是細(xì)胞偶聯(lián)分子。仍在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞偶聯(lián)分子與細(xì)胞的外表面相連。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞偶聯(lián)分子是胞外基質(zhì)的一部分。在一些另外的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞偶聯(lián)分子是蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，所述蛋白質(zhì)是受體。在另外的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞偶聯(lián)分子對(duì)特定細(xì)胞類(lèi)型特異。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是病態(tài)和/或異常細(xì)胞。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述病態(tài)細(xì)胞是癌細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述病態(tài)細(xì)胞是被感染的細(xì)胞。在本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)作為靶標(biāo)有用的另外的分子包括但不限于蛋白質(zhì)、肽、核酸、碳水化合物、酯類(lèi)、多糖、糖蛋白、激素、受體、抗原、抗體、毒性物質(zhì)、代謝物、抑試劑、藥物、染料、營(yíng)養(yǎng)物和生長(zhǎng)因子。
本發(fā)明包括的蛋白質(zhì)和化學(xué)靶標(biāo)的非限定性例子包括趨化因子和細(xì)胞因子以及它們的受體。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞因子(cytokine)”是指眾多對(duì)細(xì)胞施加各種效應(yīng)(例如，誘導(dǎo)生長(zhǎng)、分化、和/或增殖)的因子中的任何一種。非限制性例子包括白介素(IL)，例如IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14和IL-16；可溶性IL-2受體；可溶性IL-6受體；紅細(xì)胞生成素(EPO)；血小板生成素(TPO)；粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)；干細(xì)胞因子(SCF)；白血病抑制因子(LIF)；干擾素(例如，IFN-α、-β、-γ)；制瘤素M(OM)；免疫球蛋白超家族；腫瘤壞死因子(TNF)家族，尤其是TNF-α；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子，(例如，TGF-α和TGF-β)；和IL-α；和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)家族，尤其是VEGF(在本領(lǐng)域中也稱(chēng)為VEGF-A)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(PLGF)。從多個(gè)銷(xiāo)售商可以商業(yè)獲得細(xì)胞因子，包括Amgen(Thousand Oaks，CA)、Immunex(Seattle，WA)和Genentech(South San Francisco，CA)。在一些實(shí)施方式中，特別優(yōu)選的靶標(biāo)是VEGF和TNF-α。
抗TNF-α的抗體顯示，封閉TNF-α與它的受體的相互作用可用于在許多疾病狀態(tài)例如敗血癥性休克、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和其它炎癥過(guò)程中調(diào)節(jié)TNF-α的過(guò)量表達(dá)。VEGF是生血管誘導(dǎo)劑、血管通透的介質(zhì)和內(nèi)皮細(xì)胞特異性有絲分裂原。VEGF也已涉及腫瘤。預(yù)期VEGF家族的靶向性成員和/或它們的受體將具有重要的治療應(yīng)用。例如，預(yù)期阻斷VEGF將在卵巢過(guò)渡刺激綜合癥(OHSS)中具有治療價(jià)值(例如參見(jiàn)Ferrara et al，Nat.Med.，51359 )；和Gerber et al，Nat.Med.，5623 )。其它優(yōu)選的靶標(biāo)包括細(xì)胞表面受體，例如T細(xì)胞受體。
“趨化因子”是在細(xì)胞運(yùn)輸和炎癥中發(fā)揮重要作用的小蛋白質(zhì)的家族。趨化因子家族的成員包括但不限于IL-8、基質(zhì)衍生因子-1(SDF-1)、血小板因子4、噬中性粒細(xì)胞激活蛋白-2(NAP-2)和單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)。這些蛋白質(zhì)也發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明的方法中可用作靶標(biāo)。
其它蛋白質(zhì)和化學(xué)靶標(biāo)包括但不限于免疫調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)蛋白，例如可溶性人白細(xì)胞抗原(HLA、I類(lèi)和/或II類(lèi)、以及非經(jīng)典I類(lèi)HLA(E、F和G))；表面蛋白，例如可溶性T或B細(xì)胞表面蛋白；人血清白蛋白；花生四烯酸代謝物，例如前列腺素、白三烯、凝血烷和前列環(huán)素；自身免疫或同種異型免疫或異種免疫的IgE、自身抗體或同種抗體；Ig Fc受體或Fc受體結(jié)合因子；G蛋白偶聯(lián)受體；細(xì)胞表面糖類(lèi)；血管生成因子；黏附分子；離子，例如鈣、鉀、鎂、鋁和鐵；原纖維蛋白，例如，朊病毒和微管蛋白；酶，例如蛋白酶、氨基肽酶、激酶、磷酸酯酶、DNA酶、RNA酶、脂肪酶、酯酶、脫氫酶、氧化酶、水解酶、硫酸酯酶、環(huán)化酶、轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)氨酶、羧化酶、脫羧酶、超氧化物歧化酶和它們的天然底物和類(lèi)似物；激素和它們相應(yīng)的受體，例如促卵泡激素(FSH)、促黃體生成激素(LH)、甲狀腺素(T4和T3)、脫脂載脂蛋白、低密度脂蛋白(LDL)、極低密度脂蛋白(VLDL)、氫化可的松、醛固酮、雌三醇、雌二醇、孕酮、睪酮、脫氫表雄酮(DHBA)和其硫酸鹽(DHEA-S)；肽激素，例如腎素、胰島素、降鈣素、甲狀旁腺素(PTH)；人生長(zhǎng)激素(hGH)、血管生壓素和抗利尿激素(AD)、促乳素、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、LHRH、促甲狀腺素釋放激素(THRH)、血管活性腸肽(VIP)、緩激肽和相應(yīng)的激素原；兒茶酚肽例如腎上腺素和代謝物；輔因子包括atrionatriutic因子(AdF)、維生素A、B、C、D、E和K以及5-羥色胺；凝血因子，例如凝血酶原、凝血酶、纖維蛋白、纖維蛋白原、因子VIII、因子IX、因子X(jué)I和馮維勒布蘭德因子；纖溶酶原因子，例如纖溶酶、補(bǔ)體激活因子、LDL和它們的配體以及尿酸；調(diào)節(jié)凝血的化合物，例如蛭素、蛭素類(lèi)似物(hirulog)、裂纖酶(hementin)、肝素和組織纖溶酶原激活劑(TPA)；用于基因治療的核酸；酶拮抗劑；結(jié)合配體的化合物，例如炎癥因子和受體以及其它結(jié)合至前述一種或更多種的分子的蛋白質(zhì)。
另外的化學(xué)靶標(biāo)無(wú)限制性地包括藥物，尤其易遭濫用的藥物，例如大麻、海洛因和其它麻醉劑、苯環(huán)利定(PCP)、巴比妥類(lèi)、可卡因和其衍生物以及苯二氮類(lèi)(benzadiazepine)；毒素，例如重金屬如水銀和鉛、砷和放射性化合物；化療劑，例如4-乙酰氨基酚、地高新和自由基；細(xì)菌毒素，例如脂多糖(LPS)和其它革蘭氏陰性毒素、葡萄球菌(Staphylococcus)毒素、毒素A、破傷風(fēng)毒素、白喉毒素以及百日咳毒素；植物和海洋毒素；蛇和其它毒液，毒力因子，例如aerobactins、毒素、蛋白質(zhì)等；感染性病毒，例如肝炎病毒、巨細(xì)胞病毒(CMV)、單純皰疹病毒(例如，1、2和6型HSV)、EB病毒(EBV)、水痘帶狀皰疹病毒(VZV)、人免疫缺陷病毒(例如，HIV-1、HIV-2)和其它逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、輪狀病毒、流感病毒、鼻病毒、細(xì)小病毒、風(fēng)疹病毒、麻疹病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、副黏病毒、乳多空病毒、痘病毒、蟲(chóng)媒病毒、黃熱病毒、沙粒病毒、狂犬病毒、杯狀病毒、星狀病毒、輪狀病毒和小RNA病毒；朊病毒；原質(zhì)團(tuán)組織因子(plasmodia tissuefactor)，原生動(dòng)物，包括阿米巴(例如，溶組織內(nèi)阿米巴(Entamoeba histolytica))、絲蟲(chóng)(例如，絲蟲(chóng)(Wuchereria))、原形體(Plasmodium)、賈第蟲(chóng)屬(Giardia)、利什曼原蟲(chóng)屬(Leishmania)、隱包子蟲(chóng)屬(Cryptosporidium)、肉孢子蟲(chóng)屬(Sarcocystis)、巴貝蟲(chóng)(Babesia)、錐蟲(chóng)屬(Trypanosoma)、和弓形體屬(Toxoplasma)；蠕蟲(chóng)(例如，吸蟲(chóng)(trematodes)、絳蟲(chóng)(cestodes)和線蟲(chóng)(nematodes)；細(xì)菌，包括造成膿毒癥、醫(yī)院內(nèi)感染和其它感染的需氧、厭氧和兼性細(xì)菌(例如，大腸桿菌(E.coli)、不動(dòng)桿菌(Acinetobacter)、假單胞菌(Pseudomonas)、變形菌(Proteus)、克雷白菌屬(Klebsiella)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、奈瑟菌屬(Neisseria)、分枝桿菌(mycobacteria)、軍團(tuán)桿菌屬(Legionnella)、梭狀芽孢桿菌(Clostridium)、支原體屬(Mycoplasma)、密螺旋體屬(Treponema)、衣原體(Chlamydia)、立克次體屬(Rickettsia)、巴爾通體屬(Bartonella)等)和真菌(例如，假絲酵母屬(Candida)、肺孢子蟲(chóng)(Pneumocystis)、曲霉菌(Aspergillus)、毛孢子菌屬(Trichosporum)、小孢子菌屬(Microsporum)、畢赤酵母屬(Pichnia)、球孢子菌屬(Coccidioides)、芽生菌屬(Blastomyces)、組織胞漿菌屬(Histoplasma)、隱球菌屬(Cryptococcus)等)。事實(shí)上，本發(fā)明并不意欲于被限制于任何具體的靶標(biāo)，因?yàn)榭梢员唤Y(jié)合(即，形成結(jié)合的靶標(biāo))的任何靶標(biāo)在本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)有用。
在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述靶標(biāo)是植物或植物來(lái)源材料。在一些實(shí)施方式中，所述靶標(biāo)是木質(zhì)，而在其它實(shí)施方式中，所述靶標(biāo)是非木本植物。本發(fā)明意欲包括任何植物和/或植物來(lái)源材料。
在一些實(shí)施方式中，所述靶標(biāo)是酶，例如蛋白酶、氨基肽酶、激酶、磷酸酯酶、DNA酶、RNA酶、脂肪酶、酯酶、脫氫酶、氧化酶、水解酶、硫酸酯酶、纖維素酶、環(huán)化酶、轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)氨酶、羧化酶、脫羧酶、超氧化物歧化酶和它們的天然底物和類(lèi)似物。特別優(yōu)選的酶包括水解酶，尤其是α/β水解酶；絲氨酸蛋白酶，例如枯草桿菌蛋白酶，和胰凝乳蛋白酶絲氨酸蛋白酶；纖維素酶和脂肪酶。
仍在另外的實(shí)施方式中，所述表面是非生物表面。在一些實(shí)施方式中，所述非生物表面是醫(yī)療設(shè)備的表面。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述醫(yī)療設(shè)備是治療性設(shè)備。還在其它實(shí)施方式中，所述治療性設(shè)備是植入的治療性設(shè)備。在另外的實(shí)施方式中，所述醫(yī)療設(shè)備是診斷性設(shè)備。在一些實(shí)施方式中，所述診斷性設(shè)備是孔或盤(pán)。
在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述靶標(biāo)是非生物材料。在一些實(shí)施方式中，所述非生物材料是織物。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述織物是天然織物。在另外的實(shí)施方式中，所述織物是棉花、絲織品和/或毛織品。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述織物是非天然織物。在一些實(shí)施方式中，所述織物是尼龍、人造纖維織物和/或聚酯。在一些實(shí)施方式中，所述織物是天然和/或合成纖維的混合。在仍進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述非生物材料是塑料、陶瓷、金屬和/或橡膠。在另外的實(shí)施方式中，所述材料是上述任何材料的復(fù)合材料。
在另外的實(shí)施方式中，所述靶標(biāo)是微電路。該電路可以以其完成的形式或處于電路制造的任何階段。靶化的試劑(targeted agent)可以被用于在所述電路上移除或沉積化合物，例如，n型摻雜劑(例如，砷、磷、銻、鈦或其它供體原子種類(lèi))或p型摻雜劑(例如，硼、鋁、鎵、銦或其它受體原子種類(lèi))(例如參見(jiàn)，van Zant，Microchip Fabrication，McGraw-Hill，New York， )，全部引入于此作為參考。
事實(shí)上，本發(fā)明不意欲于被限制于任何具體的靶標(biāo)，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)可以被結(jié)合(即，形成結(jié)合的靶標(biāo))的任何靶標(biāo)在本發(fā)明中都有用。
在一些實(shí)施方式中，表面上的污跡(stain)被認(rèn)為是靶標(biāo)群。因此，在一些實(shí)施方式中，一片棉植物(cotton)上的污跡包含試劑可以緊密結(jié)合的潛在靶分子，但未染污的棉織物包括抗靶標(biāo)試劑結(jié)合至其上的抗靶標(biāo)分子。因此，在一些實(shí)施方式中，污跡是包含試劑特異結(jié)合至其上的靶分子的化合物。在一些實(shí)施方式中，所述化合物是添加顏色至紡織品、金屬或其它織物或固體材料，或添加至產(chǎn)生污跡的可見(jiàn)外觀的物質(zhì)的著色化合物?？梢宰鳛槲圹E的靶化類(lèi)著色物質(zhì)包括但不限于下列卟啉源結(jié)構(gòu)(例如，血中的血紅素和植物中的葉綠素)；丹寧酸和多酚(參見(jiàn)Ribéreau-Gayon，in Oliver and Boyd(eds.)，Plant Phenolics，Edinburgh ，pp.169-198)，其出現(xiàn)在茶葉污跡(tea stains)、葡萄酒污跡(wine stains)、香蕉污跡(banana stains)和桃污跡(peach stains)中；類(lèi)胡蘿卜素和類(lèi)胡蘿卜素衍生物，在番茄(番茄紅素，紅色)、芒果(胡蘿卜素，橙黃色)和紅辣椒中出現(xiàn)的著色物質(zhì)；氧化類(lèi)胡蘿卜素(oxygenated carotenoids)和葉黃素(例如參見(jiàn)Bartley et al，PlantCell，The，71027-1038 )；花青素(即，在許多果實(shí)和花中出現(xiàn)的高著色分子；參見(jiàn)Ribéreau-Gayon，見(jiàn)上，pp.135-169)；以及美拉反應(yīng)產(chǎn)物(即，在蛋白/肽結(jié)構(gòu)存在下在加熱碳水化合物分子的混合物后產(chǎn)生的黃色/棕色著色物質(zhì)，例如在蒸煮油中發(fā)現(xiàn)的那些)。在可選的實(shí)施方式中，著色化合物是通過(guò)化學(xué)反應(yīng)、吸附或分散整合入纖維的染料(例如，直接藍(lán)染料、酸性藍(lán)染料、活性藍(lán)染料和活性黑染料)。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，尤其優(yōu)選的靶標(biāo)包括類(lèi)胡蘿卜素和葉黃素污跡。
在一些實(shí)施方式中，污跡選自下面的非限制性污跡卟啉源污跡、丹寧酸源污跡、類(lèi)胡蘿卜素色素源污跡、花青素色素源污跡、土壤基污跡、油基污跡和人身體源污跡。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述污跡是血液來(lái)源或葉綠素來(lái)源的污跡。更特別地，在一些實(shí)施方式中，所述污跡是草、紅辣椒、茶來(lái)源的污跡或果實(shí)或蔬菜來(lái)源的污跡(例如，來(lái)自葡萄酒、西紅柿或漿果)。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，優(yōu)選的污跡是人身體污跡以及更特別地是稱(chēng)為“衣領(lǐng)污跡”的污跡。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，存在至少兩種靶標(biāo)群，包括第一靶標(biāo)群和第二靶標(biāo)群。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述第一靶標(biāo)群和所述第二靶標(biāo)群不同。在一些更特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述第一靶標(biāo)群和所述第二靶標(biāo)群是細(xì)胞。仍在另外的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述第一靶標(biāo)群含有正常細(xì)胞而所述第二靶標(biāo)群含有異常細(xì)胞。在仍進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述異常的第二靶標(biāo)群包括腫瘤細(xì)胞。
在一些實(shí)施方式中，其中所述第一靶標(biāo)群是受損細(xì)胞、組織或器官上的分子，所述第二靶標(biāo)群包括健康正常(即，非受損的)細(xì)胞、組織或器官或它們的組合。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞、組織和/或器官選自健康正常的全血、皮膚、毛發(fā)、牙齒和指甲。在一些實(shí)施方式中，在野生型細(xì)胞的表面上正常表達(dá)的蛋白質(zhì)是第二靶標(biāo)群分子，而僅在癌細(xì)胞表面上表達(dá)的蛋白質(zhì)是第一靶標(biāo)群分子。然而，本發(fā)明不意欲受限于野生型細(xì)胞上表達(dá)的分子與在異常或病態(tài)細(xì)胞上表達(dá)的那些分子的比較。在可選的實(shí)施方式中，不同的健康細(xì)胞類(lèi)型被相互比較，以鑒定細(xì)胞特異性蛋白(例如，腎細(xì)胞可以與肝細(xì)胞相比)。
在一些進(jìn)一步的實(shí)施方式中，其中所述靶標(biāo)是在受損的細(xì)胞、組織或器官上存在的分子，抗靶標(biāo)分子存在于健康正常(即，非受損的)細(xì)胞、組織、器官或它們的組合上。在一些實(shí)施方式中，所述抗靶標(biāo)分子存在于選自健康正常全血、皮膚、毛發(fā)、牙齒和指甲的細(xì)胞、組織和/或器官上或所述細(xì)胞、組織和/或器官內(nèi)。在一些實(shí)施方式中，在野生型細(xì)胞的表面上正常表達(dá)的蛋白質(zhì)是抗靶標(biāo)分子，而僅在癌細(xì)胞表面上表達(dá)的蛋白至是靶標(biāo)分子。然而，本發(fā)明不意欲受限于野生型細(xì)胞上表達(dá)的分子與在異?；虿B(tài)細(xì)胞上表達(dá)的那些分子的比較。在可選的實(shí)施方式中，不同的健康細(xì)胞類(lèi)型被相互比較，以鑒定細(xì)胞特異性蛋白(例如，腎細(xì)胞可以與肝細(xì)胞相比)。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括重復(fù)步驟在溫育混合物中溫育所述第一靶標(biāo)群和所述試劑第一收集物，并洗滌所述溫育混合物，以從所述溫育混合物除去未結(jié)合的試劑。
在一些可選的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述擴(kuò)增的抗靶標(biāo)試劑收集物的濃度比試劑的第一收集物的濃度至少高約1000倍。優(yōu)選地，抗靶標(biāo)試劑收集物的每一成員可以以這樣的水平存在，該水平比擴(kuò)增之前它們的水平高約100倍、約500倍、約1000倍、約5000倍、約10,000倍、約100,000倍或約1,000,000倍。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述試劑是存在于噬菌體表面上的肽，以及所述抗靶標(biāo)試劑是存在于噬菌體表面上的不同的肽。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括在使擴(kuò)增的收集物與所述第二靶標(biāo)群以及所述試劑的第一收集物溫育之前，使包含抗靶標(biāo)試劑的噬菌體失活的步驟。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，失活步驟包括將所述噬菌體暴露于導(dǎo)致所述噬菌體不能存活的溫度。
本發(fā)明不要求試劑、抗靶標(biāo)試劑、靶標(biāo)群以及試劑收集物被表征至這樣的程度——即，它們結(jié)合的分子是已知的。因此，例如，在一些實(shí)施方式中，在篩選前了解哪一抗靶標(biāo)試劑結(jié)合靶標(biāo)上或靶標(biāo)內(nèi)的抗靶標(biāo)分子并不重要。類(lèi)似地，在允許對(duì)靶標(biāo)分子或群的純度、穩(wěn)定性和濃度的進(jìn)行一些控制的結(jié)構(gòu)(例如，序列相關(guān)的結(jié)構(gòu))、化學(xué)或遺傳水平上，沒(méi)有必要對(duì)靶標(biāo)分子或群和抗靶標(biāo)分子進(jìn)行有些詳細(xì)的表征。同樣，不必知道分子可能結(jié)合哪一試劑或抗靶標(biāo)試劑。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述靶標(biāo)群具有低濃度。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述低濃度在約1微摩爾濃度(1e-6M)至約1皮摩爾濃度(1e-12M)之間，而在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述濃度在約1e-7M至約1e-11M之間。
因此，如本文所述，本發(fā)明提供鑒定結(jié)合至靶標(biāo)群中的靶分子的試劑的方法。如本文中更詳細(xì)的描述，“靶標(biāo)群”是一組靶標(biāo)(例如，一組細(xì)胞或核酸)，其每一成員含有至少一個(gè)靶分子。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法包括使第一靶標(biāo)群與試劑的第一收集物在溫育混合物中接觸，其中至少一些試劑接觸所述第一靶標(biāo)群中的分子。如本文所描述，“試劑的第一收集物”是一組分子(例如，一組肽)，其結(jié)合野生型或正常靶分子。
在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法要求洗滌所述溫育混合物，以從所述溫育混合物中除去未結(jié)合的試劑，然后洗脫所述結(jié)合的試劑，以產(chǎn)生抗靶標(biāo)試劑的收集物。在有些另外優(yōu)選的實(shí)施方式中，這些抗靶標(biāo)試劑被擴(kuò)增，使得每一成員在溶液中以非常高的濃度存在。
在一些實(shí)施方式中，擴(kuò)增產(chǎn)生核酸序列的額外拷貝，并使用本領(lǐng)域中熟知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)進(jìn)行。在一些可選的實(shí)施方式中，擴(kuò)增通過(guò)宿主細(xì)胞由噬菌體的產(chǎn)生而發(fā)生。
因此，在一些實(shí)施方式中，在擴(kuò)增后，抗靶標(biāo)試劑的收集物的每一成員都以非常高的拷貝數(shù)存在。例如，在一些實(shí)施方式中，抗靶標(biāo)試劑收集物的每一成員都以這樣的水平存在，該水平比擴(kuò)增之前抗靶標(biāo)試劑濃度的水平高約100倍、約500倍、約1000倍、約5000倍、約10,000倍、約100,000倍或約1,000,000倍。
在一些實(shí)施方式中，因?yàn)樗鰯U(kuò)增的抗靶標(biāo)試劑的收集物對(duì)于試劑的第一收集物大量過(guò)量，所以所述抗靶標(biāo)試劑結(jié)合至第二靶標(biāo)群中的基本上全部抗靶標(biāo)。在第一靶標(biāo)群中不存在的第二靶標(biāo)群中的任何靶標(biāo)分子是可檢測(cè)的(即，通過(guò)將試劑結(jié)合至該靶標(biāo)而檢測(cè))。因此，在洗滌后，該試劑的身份就是否是目標(biāo)結(jié)合物被鑒定和分析。在一些實(shí)施方式中，所述第二靶標(biāo)群包含與所述第一靶標(biāo)群相同的靶標(biāo)，而在可選的實(shí)施方式中，所述第二靶標(biāo)群包含不同于所述第一靶標(biāo)群的靶標(biāo)。例如，在一些實(shí)施方式中，所述第一靶標(biāo)群包含健康的肝細(xì)胞，而所述第二靶標(biāo)群包含病態(tài)肝細(xì)胞?？蛇x地，在一些實(shí)施方式中，所述第一靶標(biāo)群包含皮膚，而所述第二靶標(biāo)群包含毛發(fā)。在又進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述第一靶標(biāo)群存在于干凈的衣服上，而所述第二靶標(biāo)群存在于含有污跡的衣服上。
在一些實(shí)施方式中，所述試劑是表達(dá)在噬菌體的表面上的肽，而所述第一和第二靶標(biāo)群分別是野生型細(xì)胞和異常細(xì)胞。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法使用噬菌體展示進(jìn)行。噬菌體展示是體外選擇技術(shù)，其中肽或蛋白質(zhì)與噬菌體的被殼蛋白遺傳性融合，導(dǎo)致融合蛋白在噬菌體表面上的展示，同時(shí)編碼所述融合蛋白的DNA定居在噬菌體內(nèi)(例如，參見(jiàn)Barbas等人，Phage Display，a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press， )。該方法允許篩選蛋白質(zhì)的大量突變體或不同蛋白質(zhì)，它們每一個(gè)連接至其的相應(yīng)的DNA序列。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述試劑收集物是噬菌體表面上的至少一種類(lèi)型的肽。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述肽包括至少一種抗體。在其它優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括使噬菌體失活，其中所述失活作用在將噬菌體與靶標(biāo)收集物和包含試劑收集物的噬菌體溫育之前發(fā)生。在可選的優(yōu)選實(shí)施方式中，失活步驟包括將所述噬菌體暴露于使噬菌體不能存活的溫度。在一些實(shí)施方式中，擴(kuò)增也被使用，以產(chǎn)生額外拷貝的核酸序列。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用PCR進(jìn)行擴(kuò)增，如本領(lǐng)域中所知。在其它實(shí)施方式中，擴(kuò)增通過(guò)感染宿主細(xì)胞由噬菌體的繁殖而發(fā)生。在一些實(shí)施方式中，試劑收集物包括在噬菌體表面上表達(dá)的肽，并且第一和第二靶標(biāo)群分別是野生型細(xì)胞和異常細(xì)胞。
使用本領(lǐng)域中已知的任何合適的方法，進(jìn)行區(qū)分和/或分離噬菌體。例如，在一些實(shí)施方式中，在洗脫的噬菌體上存在的擴(kuò)增的肽收集物通過(guò)在80℃溫育所述噬菌體5分鐘而被失活，使得僅僅噬菌體展示肽的第一庫(kù)的噬菌體是存活的并且可以在培養(yǎng)中復(fù)制和生長(zhǎng)。
在可選的實(shí)施方式中，使用不同的噬菌體的兩種不同的株或培養(yǎng)物。例如，具有不同核苷酸序列和/或抗微生物劑耐受模式的株發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明中有用。因此，在抗微生物劑耐受的情況下，在選擇的抗微生物劑存在下擴(kuò)增的試劑收集物確實(shí)不生長(zhǎng)，但所述帶有結(jié)合物的噬菌體確實(shí)生長(zhǎng)。在一些實(shí)施方式中，設(shè)計(jì)用來(lái)僅與一株噬菌體的基因組中的序列雜交的PCR引物被用于鑒定哪一噬菌體存在。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供分離至少一種目標(biāo)結(jié)合物的方法，所述方法包括步驟使靶標(biāo)群與試劑收集物接觸，所述試劑收集物具有低濃度；洗滌掉未結(jié)合于所述靶標(biāo)群的試劑；以及區(qū)分、分離并鑒定所述至少一種目標(biāo)結(jié)合物。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，試劑收集物包括至少一種類(lèi)型的肽。在一個(gè)可選的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述試劑收集物包括至少一種類(lèi)型的核酸。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述核酸是DNA和/或RNA分子。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，試劑收集物具有操作濃度。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述操縱濃度為所述靶標(biāo)群濃度的約1×10-3至約1×103倍。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，操縱濃度包含試劑多樣性的降低，使得每一單獨(dú)試劑的濃度增加至所述試劑期望解離常數(shù)的約1×10-4至約1×102倍。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，操縱濃度包括至少一種競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合物，其中所述至少一種競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合物包括對(duì)期望靶標(biāo)具有預(yù)先確定的解離常數(shù)的結(jié)合物。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，靶標(biāo)群選自癌細(xì)胞、細(xì)胞系或細(xì)胞培養(yǎng)物，腫瘤提取物或癌組織或器官，或與癌細(xì)胞、細(xì)胞系或細(xì)胞培養(yǎng)物相關(guān)的分子(例如，特異性抗原)。因此，在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，靶標(biāo)群是一組抗原。在一些實(shí)施方式中，所述抗原包含至少一種選自癌抗原muc-1、Tag72、CEA、CD22、ED-B和FAP的抗原。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述靶標(biāo)群具有低濃度，所述低濃度在約1微摩爾濃度(1e-6M)至約1皮摩爾濃度(1e-12M)之間；優(yōu)選的范圍是約1e-7至約1e-11之間的任何濃度。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，試劑收集物包括至少一種類(lèi)型的肽，而在一些可選的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述試劑收集物包括至少一種類(lèi)型的核酸。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述核酸是DNA和/或RNA分子。
在一些可選的優(yōu)選實(shí)施方式中，采用噬菌體展示進(jìn)行所述方法。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述試劑收集物是存在于噬菌體表面上的至少一種類(lèi)型的肽。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述肽包括至少一種抗體。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括使噬菌體失活，其中所述失活作用在將噬菌體與靶標(biāo)收集物和包含試劑收集物的噬菌體溫育之前發(fā)生。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述失活步驟包括將所述噬菌體暴露于導(dǎo)致所述噬菌體不能存活的溫度。在一些優(yōu)選的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括使用對(duì)噬菌體收集物中的核酸序列特異的寡核苷酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
本發(fā)明還提供分離至少一種目標(biāo)肽的方法，包括步驟溫育野生型細(xì)胞的至少一種收集物與噬菌體展示肽的第一庫(kù)；洗滌掉未結(jié)合于所述野生型細(xì)胞表面上的靶分子的噬菌體；洗脫結(jié)合于靶分子的噬菌體，產(chǎn)生抗靶標(biāo)肽收集物；擴(kuò)增所述抗靶標(biāo)肽收集物；將擴(kuò)增的抗靶標(biāo)肽收集物和噬菌體展示肽的第一庫(kù)和/或在溫育野生型細(xì)胞的至少一種收集物與噬菌體展示肽的第一庫(kù)之后獲得的第二庫(kù)施用于異常細(xì)胞；洗滌掉未結(jié)合于異常細(xì)胞表面上的靶分子的噬菌體，以留下由結(jié)合的抗靶標(biāo)肽以及至少一種目標(biāo)肽覆蓋的細(xì)胞表面；從攜帶抗靶標(biāo)肽的噬菌體區(qū)分和/或分離攜帶至少一種目標(biāo)肽的噬菌體；以及鑒定所述至少一種目標(biāo)肽。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，噬菌體的第一收集物和噬菌體的第二收集物包含不同的基因組。在一些其它優(yōu)選的實(shí)施方式中，確定來(lái)自噬菌體第二收集物的肽的身份的步驟包括使用對(duì)噬菌體的第二收集物中的核酸序列特異的寡核苷酸的PCR擴(kuò)增，所述肽結(jié)合于在所述第二細(xì)胞群的表面上表達(dá)的靶標(biāo)。在另外的優(yōu)選實(shí)施方式中，使用抗微生物劑耐受標(biāo)記物，并且噬菌體第一收集物的抗微生物劑耐受模式不同于噬菌體第二收集物的抗微生物劑耐受模式。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括重復(fù)步驟在溫育混合物中溫育所述第一靶標(biāo)群和所述試劑第一收集物，并洗滌所述溫育混合物，以從所述溫育混合物除去未結(jié)合的試劑。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述擴(kuò)增的抗靶標(biāo)噬菌體收集物的濃度比噬菌體的第二收集物的濃度大至少約1000倍。
在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，在使擴(kuò)增的收集物與所述第二靶標(biāo)群溫育以及與所述試劑的第一收集物溫育之前，所述方法進(jìn)一步包括使包含抗靶標(biāo)試劑的噬菌體失活的步驟。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，失活步驟包括將所述噬菌體暴露于導(dǎo)致所述噬菌體不能存活的溫度。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，攜帶抗靶標(biāo)肽的噬菌體被擴(kuò)增約100倍、約500倍、約1000倍、約5000倍、約10,000倍、約100,000倍或約1,000,000倍，然后被施用到上面描述的方法中的異常細(xì)胞。因此，擴(kuò)增的抗靶標(biāo)肽的收集物結(jié)合至對(duì)于野生型和異常細(xì)胞都是常見(jiàn)的細(xì)胞表面蛋白。通過(guò)還應(yīng)用噬菌體展示肽的原始的或不同的文庫(kù)，僅在異常細(xì)胞表面上表達(dá)的蛋白保持未結(jié)合，并且，因此，成為包含在該文庫(kù)中的新肽的靶標(biāo)。
如上所示，使用本領(lǐng)域中已知的任何合適的方法，區(qū)分和/或分離噬菌體。在一些實(shí)施方式中，在洗脫的噬菌體上的擴(kuò)增的抗靶標(biāo)肽收集物通過(guò)在80℃溫育所述噬菌體5分鐘而被失活，這樣，僅噬菌體展示肽的第一文庫(kù)的噬菌體是存活的并且可以在培養(yǎng)中復(fù)制和生長(zhǎng)(例如參見(jiàn)Barbas等人，見(jiàn)上)。
在可選的實(shí)施方式中，使用不同的噬菌體的兩種不同的培養(yǎng)物或株。例如，具有不同核苷酸序列和/或抗微生物劑耐受模式的株發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明中有用。因此，在抗微生物劑耐受的情況下，在選擇的抗微生物劑存在下擴(kuò)增的試劑收集物確實(shí)不生長(zhǎng)，但帶有結(jié)合物的噬菌體生長(zhǎng)。在一些實(shí)施方式中，設(shè)計(jì)用來(lái)僅與一株噬菌體的基因組中的序列雜交的PCR引物被用于鑒定哪一噬菌體存在。
在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法包括將擴(kuò)增和純化的抗靶標(biāo)肽施用至未連接(link)或未連接(join)至噬菌體的第二靶標(biāo)群。在該情況下，收集被洗脫的噬菌體，并用于轉(zhuǎn)染細(xì)菌細(xì)胞，其產(chǎn)生與所述噬菌體結(jié)合的肽或蛋白質(zhì)(例如參見(jiàn)Barbas等人，見(jiàn)上)。然后，從細(xì)菌培養(yǎng)物中純化表達(dá)的肽或蛋白質(zhì)，并與攜帶潛在新試劑的噬菌體一起，用作擴(kuò)增的抗靶標(biāo)試劑收集物。以這種方式，基本上所有非特異性的、抗靶標(biāo)分子被結(jié)合至表達(dá)的和純化的肽，而靶標(biāo)分子結(jié)合至噬菌體。因此，僅結(jié)合至靶標(biāo)分子的存活噬菌體在培養(yǎng)中生長(zhǎng)。
試驗(yàn) 下面的例子用于說(shuō)明本發(fā)明的一些優(yōu)選的實(shí)施方式和方面，并不被解釋成限制本發(fā)明的范圍。
在隨后的試驗(yàn)公開(kāi)中，使用下面的縮寫(xiě)sd和SD(標(biāo)準(zhǔn)偏差)；M(摩爾濃度)；mM(毫摩爾濃度)；μM(微摩爾濃度)；nM(納摩爾濃度)；mol(摩爾)；mmol(毫摩爾)；μmol(微摩爾)；nmol(納摩爾)；gm(克)；mg(毫克)；μg(微克)；pg(皮克)；L(升)；ml(毫升)；μl(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；μm(微米)；nm(納米)；LF(致死因子)；℃(攝氏度)；cDNA(拷貝或互補(bǔ)DNA)；DNA(脫氧核糖核酸)；ssDNA(單鏈DNA)；dsDNA(雙鏈DNA)；dNTP(脫氧核糖核苷三磷酸)；RNA(核糖核酸)；PBS(磷酸緩沖鹽水)；g(重力)；OD(光密度)；CPM和cpm(每分次數(shù))；rpm(每分鐘轉(zhuǎn)數(shù))；Dulbecco磷酸鹽緩沖鹽水(DPBS)；HEPES(N-[2-羥乙基]哌嗪-N-[2-乙磺酸酸])；HBS(HEPES緩沖鹽水)；SDS(十二烷基磺酸鈉)；Tris-HCl(三[羥甲基]氨基甲烷-鹽酸鹽)；2-ME(2-巰基乙醇)；EGTA(乙二醇-雙(β-氨基乙醚)N，N，N′，N′-四乙酸)；EDTA(乙二胺四乙酸)；Abbott(Abbott Laboratories，Abbott Park，IL)；Bio-Synthesis(Bio-Synthesis，Lewisville，TX)；ATCC(American Type CultureCollection，Rockville，MD)；Gibco/BRL(Gibco/BRL，Grand Island，NY)；Sigma(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)；Pharmacia(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)；Pierce(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)；Roche(Roche DiagnosticsCorporation，Indianapolis，IN)；Synpep(Synpep，Pleasanton，CA)；Bachem(BachemBiosciences，King of Prussia，PA)；以及Stratagene(Stratagene，La Jolla，CA)。
實(shí)施例1文庫(kù)和結(jié)合物間的競(jìng)爭(zhēng) 在下面的實(shí)施例中，提供多種計(jì)算。本發(fā)明并不意欲于被限制為任何具體的計(jì)算方法。下面的名稱(chēng)在本文中被使用對(duì)于具有n個(gè)成員的庫(kù)L，使To＝靶標(biāo)總量，T＝未結(jié)合靶標(biāo)，Pi＝未結(jié)合文庫(kù)成員I，Pio＝文庫(kù)成員I的總量，KiD＝Pi與T的解離常數(shù)，TPi＝Pi與T的復(fù)合物，Kion＝二級(jí)締合速率常數(shù)，kioff＝一級(jí)解離速率常數(shù)。圖1-8提供了本文中示例的關(guān)系的圖解說(shuō)明。
在該實(shí)施例中，假設(shè)1)達(dá)到穩(wěn)態(tài)結(jié)合；2)每一靶標(biāo)具有僅結(jié)合一個(gè)成員的一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)；和3)每一成員具有相同的二級(jí)締合速率常數(shù)，然后，下面的方程式描繪文庫(kù)成員間的競(jìng)爭(zhēng)-締合速率(on rate)如下計(jì)算d(TPi)/dt＝kion(T)(Pi)-解離速率如下計(jì)算-d(TPi)/dt＝kioff(TPi)-在穩(wěn)態(tài)下，下式適用d(TPi)/dt＝-d(TPi)/dtkion(T)(Pi)＝kioff(TPi)kioff/kion＝(T))(Pi)/(TPi)＝KiD-在具有n個(gè)結(jié)合靶標(biāo)的成員的文庫(kù)中，游離靶標(biāo)的濃度為T(mén)＝To-TP1-TP2-TP3...-TPn-對(duì)于每一成員PiKiD＝(T)(Pi)/(TPi)
T＝(TPi/Pi)KiD-在文庫(kù)L中，存在結(jié)合最緊密的一個(gè)結(jié)合成分(“P1”)。
結(jié)合的P1與游離的P1的比率作為T(mén)的函數(shù)，是T＝(TP1/P1)K1D-由于T是游離靶標(biāo)的濃度，所以對(duì)于該文庫(kù)的任何其它成員PiT＝(TPi/Pi)KiD-對(duì)于該文庫(kù)的每一成員Pi，相對(duì)于最緊密結(jié)合物的結(jié)合與游離的比率(the boundover free ratio)(TP1/P1)，結(jié)合與游離的比率(TPi/Pi)如下給出(TPi/Pi)KiD＝(TP1/P1)K1D(TPi/Pi)＝(TP1/P1)K1D/KiD-對(duì)于該文庫(kù)的任一成員i，相對(duì)于P1的結(jié)合與游離的比率，結(jié)合與游離的比率(TPi/Pi)與兩個(gè)解離常數(shù)的比率成正比使x＝(TP1/P1)；r1i＝K1D/KiDTP1/P1o＝(TP1/P1)/(1+(TP1/P1))＝x/(1+x)TPi/Pio＝(TPi/Pi)/(1+(TPi/Pi))方程式1 TPi/Pio＝r1i*x/(1+r1i*x)-結(jié)合的成分i(TPi)對(duì)結(jié)合的成分1(TP1)的比率是TPi/TP1＝(1+x)*r1i*x*Pio/x*(1+r1i*x)*P1o＝(1+x)*r1i*Pio/(1+r1i*x)*P1o＝(1+x)*Pio/((1/r1i)+x)*P1o方程式2 TPi/TP1＝(1+x)*Pio/((1/r1i)+x)*P1oT＝(TP1/P1)K1D＝(x)K1D當(dāng)To接近0時(shí)；T接近0和x接近0當(dāng)To接近∞時(shí)；T接近∞和x接近∞TPi/TP1＝(1+x)*Pio/((1/r1i)+x)*P1o當(dāng)To接近0時(shí)；TPi/TP1接近(1)*Pio/(1/r1i)*P1o接近(r1i)*Pio/P1o當(dāng)To接近∞時(shí)；TPi/TP1接近(x)*Pio/(x)*P1o接近Pio/P1o 因此，當(dāng)靶標(biāo)有限時(shí)，每一結(jié)合物相對(duì)于最緊密結(jié)合物的量與解離常數(shù)的比率成比例。當(dāng)靶標(biāo)在最高濃度時(shí)，每一成員以相同的程度結(jié)合。該關(guān)系在圖4中被描述。為僅觀察文庫(kù)中的最緊密結(jié)合物，靶標(biāo)濃度必須有限。為觀察文庫(kù)中的所有結(jié)合物，靶標(biāo)應(yīng)該過(guò)量存在。該關(guān)系在圖5中被描述。為增加被檢測(cè)的緊密結(jié)合物的比例，多個(gè)選擇是可能的1)增加文庫(kù)濃度；2)降低文庫(kù)多樣性(增加成員濃度)；3)降低靶標(biāo)濃度；或4)添加一種過(guò)量的可以與其它結(jié)合物區(qū)分開(kāi)的弱結(jié)合物(可以制成該檢測(cè)系統(tǒng)不能檢測(cè)出)。該關(guān)系在圖6中被描述。
實(shí)施例2用于分離結(jié)合物(多種結(jié)合物)的計(jì)算 在本實(shí)施例中，描述了估算或確定結(jié)合至靶標(biāo)的平均結(jié)合能以及標(biāo)準(zhǔn)偏差的方法。通過(guò)本領(lǐng)域中任何合適的方法進(jìn)行確定，包括但不限于平衡透析、熒光活化細(xì)胞分選，或直接測(cè)量10個(gè)隨機(jī)選擇的文庫(kù)成員的結(jié)合能。在一些涉及小分子靶標(biāo)和蛋白質(zhì)或肽配體的文庫(kù)的實(shí)施方式中，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的數(shù)據(jù)(參見(jiàn)例如Lancet等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，903715-3719 )在平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差的初始估計(jì)值時(shí)有用。在該參考文獻(xiàn)中，對(duì)于結(jié)合香蘭素的抗體文庫(kù)，得出-1.5千卡/摩爾的平均結(jié)合能，具有1.8千卡/摩爾的標(biāo)準(zhǔn)偏差。對(duì)于蛋白質(zhì)文庫(kù)結(jié)合蛋白質(zhì)靶標(biāo)，可選的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)有用(參見(jiàn)，例如Laskowski et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，981410-1415 )。在該參考文獻(xiàn)中，對(duì)于卵類(lèi)黏蛋白蛋白酶抑試劑與灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)蛋白水解酶A結(jié)合，得到-5.5千卡/摩爾的平均結(jié)合能，標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8千卡/摩爾。這些參考文獻(xiàn)都顯示，它們的數(shù)據(jù)遵照二項(xiàng)(正態(tài))分布。
在一些實(shí)施方式中，進(jìn)行多個(gè)計(jì)算。例如，在本文中描述了7個(gè)氨基酸被改變的文庫(kù)(207的多樣性)的計(jì)算。首先，在平均值的每一標(biāo)準(zhǔn)偏差內(nèi)的文庫(kù)成員的期望數(shù)被確定，并且平均結(jié)合能被分配給每一成員，其中每一組成員的總數(shù)通過(guò)二項(xiàng)(正態(tài))分布被確定。所有結(jié)合能弱于或等于平均值的文庫(kù)成員被組成一組。確定文庫(kù)的總濃度。該文庫(kù)對(duì)靶標(biāo)的平均結(jié)合能(或估計(jì)或確定)也被確定。確定添加的競(jìng)爭(zhēng)物的濃度和解離常數(shù)。然后確定文庫(kù)結(jié)合能的標(biāo)準(zhǔn)偏差和/或平均結(jié)合能的平方根(用于估計(jì)值)。確定偏離平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差的數(shù)，所述標(biāo)準(zhǔn)偏差通過(guò)計(jì)算1/文庫(kù)大小由單個(gè)成員表示。由高斯分布確定在每一對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差之間的文庫(kù)的百分比。結(jié)合能優(yōu)于平均結(jié)合能的文庫(kù)成員被分入其中結(jié)合能以1標(biāo)準(zhǔn)偏差變化的組內(nèi)(例如，P1是偏離平均值的6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差，P2是5-6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差，P3是4-5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差等)。通過(guò)使文庫(kù)的％乘以總濃度，確定每一種類(lèi)的濃度。通過(guò)偏離平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差的數(shù)乘以標(biāo)準(zhǔn)偏差并將其加到平均ΔG值，確定在每一標(biāo)準(zhǔn)偏差時(shí)的ΔG值。由ΔG值，計(jì)算每一種類(lèi)的平均ΔG。注意到，由平均值(mean)的＜0個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算得到的平均值(average value)，與平均值-1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差相差2/3，以包括總分布。使用方程式KD＝eΔG/RT確定每一種類(lèi)的平均結(jié)合能。
然后使用上述的方程式1TPi/Pio＝r1i*x/(1+r1i*x)其中，x＝(TP1/P1)；r1i＝K1D/KiD以計(jì)算在每個(gè)TP1/P1值時(shí)的TPi/Pio。TP1/P1值從1×10-4到1×107變化。然后使用上述的方程式2TPi/TP1＝(1+x)*Pio/((1/r1i)+x)*P1o以便為每一TP1計(jì)算每一組(i)中結(jié)合的成員相對(duì)于TP1的濃度。計(jì)算每一TP1/P1比率的TPi/TP1的值。通過(guò)將26行中的計(jì)算出的比率TP1/P1o乘以P1o，計(jì)算TP1。用TP1/P1o乘以TP1，計(jì)算每一結(jié)合種類(lèi)(i)的總濃度。使用方程式T＝(TP1/P1)K1D，通過(guò)TP1/P1乘以K1D，計(jì)算游離(未結(jié)合的)靶標(biāo)濃度。通過(guò)將總的結(jié)合靶標(biāo)加至游離靶標(biāo)，計(jì)算滿足該方程的總靶標(biāo)濃度。通過(guò)將結(jié)合種類(lèi)(i)的總濃度除以在該KiD(Pio/P1o)時(shí)結(jié)合物的數(shù)量，計(jì)算每一單獨(dú)的結(jié)合種類(lèi)的濃度。還進(jìn)行相同的計(jì)算，其中競(jìng)爭(zhēng)物濃度和解離常數(shù)被包括在內(nèi)。
然后，這些結(jié)果被繪制成靶標(biāo)濃度(To)的函數(shù)。發(fā)現(xiàn)這些圖在確定期望靶標(biāo)濃度、文庫(kù)濃度、文庫(kù)多樣性以及競(jìng)爭(zhēng)物濃度以幫助鑒定文庫(kù)的緊密(比平均值高若干個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差的更優(yōu)的結(jié)合能)結(jié)合物成員中有用。
實(shí)施例3從蛋白質(zhì)文庫(kù)中質(zhì)譜篩選hSC胰凝乳蛋白酶的抑制劑 在本實(shí)施例中，描述了質(zhì)譜篩選試驗(yàn)。圖10-13提供了在這些試驗(yàn)期間獲得的數(shù)據(jù)和計(jì)算值。從由BBI-環(huán)-BLA(BBI-loop-BLA)制備的蛋白質(zhì)文庫(kù)中篩選人角質(zhì)層胰凝乳蛋白酶(human stratum cornium chymotrypsin，hSCC)的抑制劑(參見(jiàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列第10/984,270和10/984,410號(hào)；和PCT申請(qǐng)第US04/36976、US04/36979號(hào)；和US04/36980)，其都被引入于此作為參考。蛋白質(zhì)文庫(kù)由其中在蛋白質(zhì)的N端3個(gè)非連續(xù)位置被隨機(jī)化(半胱氨酸約束)的蛋白質(zhì)骨架組成。HSCC(篩選靶標(biāo))(Swissprot，編號(hào)P49862)被生物素化并固定在鏈霉抗生物素珠(MagnaBind Beads；Pierce)上。
在存在以1nM、10nM和100nM濃度加入的競(jìng)爭(zhēng)物(大腸桿菌素(Ecotin)；Sigma)下，溫育HSCC與每文庫(kù)成員10nM的蛋白質(zhì)文庫(kù)。溫育(4小時(shí))之后，用溫育緩沖液洗滌該珠，以除去非特異性結(jié)合物，并用洗脫溶液洗脫特異性結(jié)合物。
回收的結(jié)合物被濃縮(真空濃縮)，重懸于消化緩沖液，還原，烷基化，并用蛋白水解酶(Lys-c；Roche)消化。所得到的蛋白質(zhì)消化液用毛細(xì)管LC-ESI-MS/MS分析。
圖11顯示了結(jié)果。如該圖所示，在所有條件下觀察到PJ02結(jié)合物，而僅在具有100nM競(jìng)爭(zhēng)物(參見(jiàn)圖12C)的條件下觀察到pj01結(jié)合物。在圖12(分別是12A和12B)中，顯示了這些結(jié)合物的串聯(lián)質(zhì)譜。
基于這些質(zhì)譜，確定每一結(jié)合物的全序列。檢測(cè)從本篩選試驗(yàn)得到的結(jié)合物(由Synpep制備的合成肽)對(duì)hSCC的抑制活性。圖13提供了用兩種測(cè)序的結(jié)合物和已知的抑制劑滴定hSCC。每一結(jié)合物的濃度在0.1至10μM間變化，而hSCC被維持在0.1μM的濃度。本抑制試驗(yàn)的生色底物是肽suc-AAPF-pNA(Bachem Biosciences)。這些數(shù)據(jù)顯示，pj02結(jié)合物是hSCC的抑制劑(Ki約500nM)。
在上面的詳述中提到的所有出版物和專(zhuān)利被并入本文作為參考。本發(fā)明描述的方法和系統(tǒng)的各種修改和變化對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員將是明顯的，并不背離本發(fā)明的范圍和精神。盡管本發(fā)明連同具體的優(yōu)選實(shí)施方式被描述，但應(yīng)該理解，本發(fā)明不應(yīng)該被不適當(dāng)?shù)叵拗朴诖祟?lèi)具體的實(shí)施方式。事實(shí)上，為實(shí)施本發(fā)明而對(duì)描述的方式進(jìn)行的各種修改對(duì)于分子生物學(xué)、試驗(yàn)開(kāi)發(fā)、免疫學(xué)、配方和/或相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的，都意欲在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將容易理解，本發(fā)明非常適于進(jìn)行所述目標(biāo)并獲得所提及的目標(biāo)和優(yōu)勢(shì)，以及其中內(nèi)在的那些。本發(fā)明描述的分子復(fù)合物和方法、步驟、處理、分子、具體化合物是目前的優(yōu)選實(shí)施方式的代表，是示例性的，并且不意欲為對(duì)本發(fā)明的范圍的限制。事實(shí)上，可以對(duì)本文所公開(kāi)的發(fā)明進(jìn)行變化性取代和改變而不背離本發(fā)明的范圍和精神，這對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員將是非常明顯的。在此被闡述性地描述的本發(fā)明可以在未具體公開(kāi)于本文中的任何元素或多個(gè)元素、限定或多個(gè)限定不存在的情況下適宜地進(jìn)行。已經(jīng)被使用的術(shù)語(yǔ)和表達(dá)被用作描述性術(shù)語(yǔ)，而非限制性術(shù)語(yǔ)，并且在此類(lèi)術(shù)語(yǔ)和表達(dá)的使用中，不意欲于排除所顯示和描述的特征的任何等價(jià)物或它們的部分，但是應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，各種改變?cè)谒蟊Ｗo(hù)的發(fā)明的范圍內(nèi)是可能的。因此，應(yīng)當(dāng)理解，盡管本發(fā)明已經(jīng)通過(guò)優(yōu)選的實(shí)施方式和任選的特征予以具體公開(kāi)，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以采取本文所公開(kāi)的概念的改變和變化，并且應(yīng)當(dāng)理解此類(lèi)改變和變化被認(rèn)為在如所附權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明已經(jīng)被廣泛和一般地描述。落入本一般性公開(kāi)的每一個(gè)較窄種類(lèi)和亞類(lèi)分組也形成本發(fā)明的一部分。這包括本發(fā)明的一般性描述，其帶有限制性條件或從類(lèi)中去除任何主題的否定限制(negative limitation)是，無(wú)論該去除的物質(zhì)被否在本文中具體敘述。
權(quán)利要求
1.分離至少一種目標(biāo)結(jié)合物的方法，包括步驟i)使第一靶標(biāo)與試劑的第一收集物接觸，在使得在所述第一收集物中的所述試劑的至少一部分結(jié)合于所述第一靶標(biāo)的條件下進(jìn)行，以產(chǎn)生第一結(jié)合的靶標(biāo)；ii)洗滌所述第一結(jié)合的靶標(biāo)；iii)洗脫在所述第一結(jié)合的靶標(biāo)中結(jié)合于所述靶標(biāo)的所述試劑，以產(chǎn)生抗靶標(biāo)肽的收集物；iv)擴(kuò)增所述抗靶標(biāo)肽收集物，以產(chǎn)生擴(kuò)增的抗靶標(biāo)肽收集物；v)使所述擴(kuò)增的抗靶標(biāo)肽收集物和試劑的所述第一收集物和/或試劑的第二收集物暴露于所述第一靶標(biāo)和/或暴露于第二靶標(biāo)，在使得至少一部分所述試劑結(jié)合于所述第一和/或所述第二靶標(biāo)的條件下進(jìn)行，以產(chǎn)生進(jìn)一步的第一結(jié)合的靶標(biāo)和/或第二結(jié)合的靶標(biāo)；vi)洗滌所述進(jìn)一步的第一結(jié)合的靶標(biāo)和/或所述第二結(jié)合的靶標(biāo)；和vii)區(qū)別、分離和鑒定所述至少一種目標(biāo)結(jié)合物。
2.權(quán)利要求1所述方法，其中所述試劑是肽。
3.權(quán)利要求1所述方法，其中所述試劑是核酸。
4.權(quán)利要求3所述方法，其中所述核酸包括DNA或RNA。
5.權(quán)利要求1所述方法，其中所述靶標(biāo)選自癌細(xì)胞、癌細(xì)胞系、癌細(xì)胞培養(yǎng)物、腫瘤提取物、癌組織、癌器官、癌細(xì)胞相關(guān)分子、癌細(xì)胞系相關(guān)分子、癌細(xì)胞培養(yǎng)物相關(guān)分子、腫瘤提取物相關(guān)分子、癌組織相關(guān)分子以及癌器官相關(guān)分子。
6.權(quán)利要求1所述方法，其中所述靶標(biāo)是抗原。
7.權(quán)利要求6所述方法，其中所述抗原選自癌抗原muc-1、Tag72、CEA、CD22、ED-B和FAP。
8.權(quán)利要求1所述方法，其中所述第一靶標(biāo)群和所述第二靶標(biāo)群不同。
9.權(quán)利要求8所述方法，其中所述第一靶標(biāo)群和所述第二靶標(biāo)群是細(xì)胞。
10.權(quán)利要求9所述方法，其中所述第一靶標(biāo)群包含正常細(xì)胞，所述第二靶標(biāo)群包含異常細(xì)胞。
11.權(quán)利要求10所述方法，其中所述第二靶標(biāo)群包含腫瘤細(xì)胞。
12.權(quán)利要求1所述方法，其中所述步驟i)和ii)被重復(fù)。
13.權(quán)利要求1所述方法，其中所述擴(kuò)增的抗靶標(biāo)試劑的收集物的濃度比試劑的所述第一收集物的濃度至少大1000倍。
14.權(quán)利要求13所述方法，其中所述抗靶標(biāo)試劑的收集物的每一成員以這樣的水平存在，該水平選自比擴(kuò)增之前的水平大大約100倍、約500倍、約1000倍、約5000倍、約10,000倍、約100,000倍和約1,000,000倍。
15.權(quán)利要求1所述方法，其中所述方法進(jìn)一步采用噬菌體展示。
16.權(quán)利要求15所述方法，其中所述試劑是存在于噬菌體或噬菌體感染的細(xì)胞表面上的肽，以及所述抗靶標(biāo)試劑是存在于噬菌體或噬菌體感染的細(xì)胞表面上不同的肽。
17.權(quán)利要求15所述方法，進(jìn)一步包括在使所述擴(kuò)增的收集物與所述第二靶標(biāo)群以及試劑的所述第一收集物溫育之前，使包含抗靶標(biāo)試劑的所述噬菌體失活的步驟。
18.權(quán)利要求17所述方法，其中所述失活步驟包括將所述噬菌體暴露于導(dǎo)致所述噬菌體不能存活的溫度。
19.分離至少一種目標(biāo)肽的方法，包括i)溫育野生型細(xì)胞的至少一種收集物與噬菌體展示肽的第一庫(kù)，在使得所述野生型細(xì)胞的至少一部分將結(jié)合所述噬菌體展示肽的第一庫(kù)中的至少一些成員以產(chǎn)生結(jié)合的細(xì)胞和未結(jié)合的噬菌體的條件下進(jìn)行；ii)在使得所述未結(jié)合噬菌體被除去的條件下，洗滌所述結(jié)合的細(xì)胞和未結(jié)合的噬菌體；iii)洗脫結(jié)合于所述結(jié)合的細(xì)胞的噬菌體，產(chǎn)生抗靶標(biāo)肽收集物；iv)擴(kuò)增所述抗靶標(biāo)肽收集物；v)將所述擴(kuò)增的抗靶標(biāo)肽收集物和步驟(i)的噬菌體展示肽的所述第一庫(kù)和/或第二庫(kù)施用于異常細(xì)胞，在使得至少一部分所述異常細(xì)胞結(jié)合于所述抗靶標(biāo)肽或噬菌體展示肽的所述第一和/或所述第二庫(kù)的條件下進(jìn)行，以產(chǎn)生具有結(jié)合的抗靶標(biāo)肽和至少一種目標(biāo)肽的結(jié)合的異常細(xì)胞；vi)洗滌所述結(jié)合的異常細(xì)胞并除去未結(jié)合在所述異常細(xì)胞表面上的任何噬菌體，以留下由結(jié)合的抗靶標(biāo)肽和至少一種目標(biāo)肽覆蓋的細(xì)胞表面；vii)從攜帶所述抗靶標(biāo)肽的所述異常細(xì)胞區(qū)分和/或分離攜帶所述至少一種目標(biāo)肽的所述噬菌體；和viii)鑒定所述至少一種目標(biāo)肽。
20.權(quán)利要求19所述方法，其中噬菌體的所述第一收集物和所述第二收集物包含不同的基因組。
21.權(quán)利要求19所述方法，其中使用對(duì)噬菌體的所述第二收集物中的至少一部分核酸序列特異的寡核苷酸進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)行步驟(viii)中所述的鑒定所述肽。
22.權(quán)利要求19所述方法，進(jìn)一步包括使用抗微生物劑耐受模式來(lái)區(qū)分噬菌體的所述第一收集物和所述第二收集物的步驟。
23.權(quán)利要求19所述方法，進(jìn)一步包括重復(fù)步驟(i)和(ii)的步驟。
24.權(quán)利要求19所述方法，其中所述擴(kuò)增的抗靶標(biāo)噬菌體收集物的濃度比噬菌體的所述第二收集物的濃度大至少約1000倍。
25.權(quán)利要求19所述方法，進(jìn)一步包括在使所述擴(kuò)增的收集物與所述第二靶標(biāo)群以及試劑的所述第一收集物溫育之前，使包含抗靶標(biāo)試劑的所述噬菌體失活的步驟。
26.權(quán)利要求25所述方法，其中所述失活步驟包括將所述噬菌體暴露于導(dǎo)致所述噬菌體不能存活的溫度。
27.分離至少一種目標(biāo)結(jié)合物的方法，所述方法包括步驟i)使靶標(biāo)群與試劑收集物接觸，其中所述試劑收集物具有操縱濃度，在使得至少一部分所述靶標(biāo)群結(jié)合于至少一部分所述試劑以產(chǎn)生具有至少一個(gè)結(jié)合物的結(jié)合的靶標(biāo)群的條件下進(jìn)行；ii)洗滌所述結(jié)合的靶標(biāo)群，以除去未結(jié)合于所述靶標(biāo)群的試劑；和iii)區(qū)分、分離并鑒定所述至少一種結(jié)合物。
28.權(quán)利要求27所述方法，其中所述試劑收集物包括至少一種肽。
29.權(quán)利要求27所述方法，其中所述試劑收集物包括至少一種核酸。
30.權(quán)利要求29所述方法，其中所述核酸是DNA或RNA。
31.權(quán)利要求27所述方法，其中所述操縱濃度為所述靶標(biāo)群濃度的約1×10-3至約1×103倍。
32.權(quán)利要求27所述方法，其中所述操縱濃度包括試劑多樣性的下降，這樣使得每一單獨(dú)所述試劑的濃度增加至所述試劑的期望解離常數(shù)的約1×10-4至約1×102倍。
33.權(quán)利要求27所述方法，其中所述操縱濃度包括至少一種競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合物，所述競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合物包含對(duì)期望靶標(biāo)具有預(yù)先確定的解離常數(shù)的結(jié)合物。
34.權(quán)利要求27所述方法，其中所述靶標(biāo)選自癌細(xì)胞、癌細(xì)胞系、癌細(xì)胞培養(yǎng)物、腫瘤提取物、癌組織、癌器官，癌細(xì)胞相關(guān)分子、癌細(xì)胞系相關(guān)分子、癌細(xì)胞培養(yǎng)物相關(guān)分子、腫瘤提取物相關(guān)分子、癌組織相關(guān)分子以及癌器官相關(guān)分子。
35.權(quán)利要求27所述方法，其中所述靶標(biāo)是抗原。
36.權(quán)利要求35所述方法，其中所述抗原選自癌抗原muc-1、Tag72、CEA、CD22、ED-B和FAP。
37.權(quán)利要求27所述方法，其中所述靶標(biāo)群具有低濃度，其中所述低濃度在約1微摩爾濃度至約1皮摩爾濃度之間。
38.權(quán)利要求27所述方法，其中所述方法進(jìn)一步采用噬菌體展示。
39.權(quán)利要求38所述方法，其中所述試劑是存在于噬菌體或噬菌體感染的細(xì)胞表面上的肽，以及所述抗靶標(biāo)試劑是存在于噬菌體或噬菌體感染的細(xì)胞表面上的不同的肽。
40.權(quán)利要求38所述方法，進(jìn)一步包括在使所述擴(kuò)增的收集物與所述第二靶標(biāo)群以及試劑的所述第一收集物溫育之前，使包含抗靶標(biāo)試劑的所述噬菌體失活的步驟。
41.權(quán)利要求40所述方法，其中所述失活包括將所述噬菌體暴露于導(dǎo)致所述噬菌體不能存活的溫度。
42.權(quán)利要求38所述方法，其中所述肽包括至少一種抗體。
43.權(quán)利要求38所述方法，進(jìn)一步包括使用對(duì)所述噬菌體收集物中的至少一種核酸序列特異的寡核苷酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
44.分離至少一種目標(biāo)結(jié)合物的方法，所述方法包括步驟i)使靶標(biāo)群與試劑收集物接觸，其中所述靶標(biāo)群具有低濃度，在使得至少一部分所述靶標(biāo)群結(jié)合于所述試劑收集物的至少一部分成員的條件下進(jìn)行，以產(chǎn)生具有至少一種目標(biāo)結(jié)合物的結(jié)合的靶標(biāo)，和未結(jié)合的試劑；和ii)洗滌所述結(jié)合的靶標(biāo)，以除去未結(jié)合的試劑；區(qū)分、分離并鑒定所述至少一種目標(biāo)結(jié)合物。
45.權(quán)利要求44所述方法，其中所述試劑收集物包括至少一種肽。
46.權(quán)利要求44所述方法，其中所述試劑收集物包括至少一種核酸。
47.權(quán)利要求46所述方法，其中所述核酸是DNA或RNA。
48.權(quán)利要求44所述方法，其中所述試劑收集物具有操縱濃度。
49.權(quán)利要求48所述方法，其中所述試劑收集物的所述操縱濃度為所述靶標(biāo)群濃度的約1×10-3至約1×103倍。
50.權(quán)利要求48所述方法，其中所述操縱濃度包括試劑多樣性的下降，這樣，使得每一單獨(dú)所述試劑的濃度增加至所述試劑的期望解離常數(shù)的約1×10-4至約1×102倍。
51.權(quán)利要求48所述方法，其中所述操縱濃度包括至少一種競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合物，所述競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合物包含對(duì)期望靶標(biāo)的具有預(yù)先確定的解離常數(shù)的結(jié)合物。
52.權(quán)利要求44所述方法，其中所述靶標(biāo)選自癌細(xì)胞、癌細(xì)胞系、癌細(xì)胞培養(yǎng)物、腫瘤提取物、癌組織、癌器官，癌細(xì)胞相關(guān)分子、癌細(xì)胞系相關(guān)分子、癌細(xì)胞培養(yǎng)物相關(guān)分子、腫瘤提取物相關(guān)分子、癌組織相關(guān)分子以及癌器官相關(guān)分子。
53.權(quán)利要求44所述方法，其中所述靶標(biāo)是抗原。
54.權(quán)利要求53所述方法，其中所述抗原選自癌抗原muc-1、Tag72、CEA、CD22、ED-B和FAP。
55.權(quán)利要求44所述方法，其中所述靶標(biāo)群具有低濃度，其中所述低濃度在約1微摩爾濃度至約1皮摩爾濃度之間。
56.權(quán)利要求44所述方法，其中所述方法進(jìn)一步采用噬菌體展示。
57.權(quán)利要求56所述方法，其中所述試劑是存在于噬菌體或噬菌體感染的細(xì)胞表面上的肽，以及所述抗靶標(biāo)試劑是存在于噬菌體或噬菌體感染的細(xì)胞表面上的不同的肽。
58.權(quán)利要求56所述方法，進(jìn)一步包括在使所述擴(kuò)增的收集物與所述第二靶標(biāo)群以及試劑的所述第一收集物溫育之前，使包含抗靶標(biāo)試劑的所述噬菌體失活的步驟。
59.權(quán)利要求58所述方法，其中所述失活包括將所述噬菌體暴露于導(dǎo)致所述噬菌體不能存活的溫度。
60.權(quán)利要求44所述方法，其中所述肽包括至少一種抗體。
61.權(quán)利要求44所述方法，進(jìn)一步包括使用對(duì)所述噬菌體收集物中的至少一種核酸序列特異的寡核苷酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于篩選的新方法。具體而言，本方明提供競(jìng)爭(zhēng)性示差篩選的方法。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，本方明提供了幫助緊密結(jié)合物的鑒定的競(jìng)爭(zhēng)性示差篩選方法。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法中所使用的試劑包括緊密結(jié)合物和弱結(jié)合物。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了采用識(shí)別和結(jié)合靶標(biāo)的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合物的方法，但所述競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合物具有弱于目標(biāo)結(jié)合物的結(jié)合。
文檔編號(hào)G01N33/68GK101044405SQ200580035118
公開(kāi)日2007年9月26日 申請(qǐng)日期2005年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月15日
發(fā)明者A·G·戴, D·A·埃斯特爾, P·T·耶策朱斯基, C·J·穆拉里 申請(qǐng)人:金克克國(guó)際有限公司