專利名稱：：傳感器構(gòu)建體和檢測方法傳感器構(gòu)建體和檢測方法本申請要求2004年3月17日提交的、名稱為"NovelFluorescentNanosensorProteins"的美國臨時專利申請No.60/554,313的優(yōu)先權(quán)，該申請通過弓I用被整體并入本文。
背景技術(shù)：
：免疫檢驗和基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的檢驗是用于檢測待分析物的最為廣泛使用的技術(shù)。雖然基于PCR的技術(shù)通常能給出好的檢測靈敏度，但是它們并未在很多實驗室中廣泛用于常規(guī)篩選。一個理由是，當(dāng)PCR用于檢測生物材料中的待分析物時，其準(zhǔn)確性不僅受PCR檢驗本身性能的強烈影響，還會被從待測生物材料中提取的核酸品質(zhì)強烈影響。此外，基于PCR的方法的檢測靈敏度會被提取物中干擾擴增過程的抑制劑降低。此外，還需要訓(xùn)練有素的實驗室人員來操作PCR檢驗，以確保其準(zhǔn)確性。免疫檢驗通常不那么昂貴，也僅需要較少的培訓(xùn)即可操作。它們己以多種不同的形式被采用，其中酶聯(lián)免疫吸附檢驗(ELISA)、橫向流動免疫檢驗和Western印記檢驗是最常用的。但是，目前，ELISA和Western印記技術(shù)需要多個孵育步驟，容易出現(xiàn)操作錯誤。橫向流動免疫檢驗通常更快，但是不如傳統(tǒng)ELISA準(zhǔn)確。Tsienetal.提出了另一種檢驗形式，用于檢測待分析物。該技術(shù)被描述于美國專利No.5,998,204中，其中使用了具有待分析物結(jié)合區(qū)域和兩個熒光標(biāo)記的蛋白質(zhì)。當(dāng)待分析物結(jié)合區(qū)域結(jié)合上待分析物時，構(gòu)象變化就會發(fā)生，使得兩個熒光標(biāo)記改變相互間的相對位置。這就改變了標(biāo)記之間的熒光共振能量相互作用，對其進行檢測以測定待分析物的結(jié)合。Frommeretal.在PCT國際申請No.03/025220中已經(jīng)提出了一種類似的檢驗形式。該檢驗使用融合蛋白，其包括周質(zhì)(periplasmic)結(jié)合蛋白部分和兩個熒光蛋白部分。該融合蛋白在結(jié)合待分析物后構(gòu)象會改變，從而改變了兩個熒光蛋白部分的相對位置。由此在熒光蛋白部分之間誘導(dǎo)出了改變的熒光共振能量相互作用。Tsien和Frommer公開的檢驗系統(tǒng)都需要使用在結(jié)合上目標(biāo)待分析物時改變構(gòu)象的傳感器構(gòu)建體。此外，這兩者都僅能檢測小的待分析物，例如簡單的糖和氨基酸。因此，人們?nèi)匀恍枰鼮橥ㄓ玫摹⒗霉舱衲芰哭D(zhuǎn)移相互作用的檢測待分析物的方法，但其不限于必須改變構(gòu)象以檢測待分析物的構(gòu)建體，或僅能檢測小的待分析物的構(gòu)建體。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的檢測樣品中待分析物的方法涉及使用傳感器構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包括(i)與待分析物特異性結(jié)合的分子識別結(jié)構(gòu)域；(ii)包含RET供體的第一標(biāo)記；以及(iii)包含針對RET供體的RET受體的第二標(biāo)記。RET受體與RET供體分開一個距離，該距離允許從供體到受體的Fdrster共振能量轉(zhuǎn)移得以發(fā)生，優(yōu)選是大約1到大約25納米的距離。當(dāng)傳感器構(gòu)建體的分子識別結(jié)構(gòu)域與待分析物結(jié)合之后，待分析物與RET供體和/或RET受體的接近干擾了RET供體和RET受體之間的FRET相互作用，產(chǎn)生可被檢測到的光學(xué)信號。樣品中待分析物的存在與否是通過對該光學(xué)信號的檢測來指示的。本發(fā)明的方法還包括更為具體的步驟在傳感器構(gòu)建體與樣品接觸之前，對傳感器構(gòu)建體的RET供體和RET受體之間的F6rster共振能量轉(zhuǎn)移相互作用所產(chǎn)生的對照光學(xué)信號加以測量，然后對傳感器構(gòu)建體與樣品接觸之后檢測到的光學(xué)信號與對照光學(xué)信號之間的差異加以測定。該信兮和對照光學(xué)信號之間的差異代表了樣品中待分析物的含量，由此使得可對待分析物進行定量檢測。優(yōu)選地，傳感器構(gòu)建體的熒光或發(fā)光的強度和衰減動力學(xué)的變化被作為光學(xué)信號來測量。在本發(fā)明的方法中，RET供體可以是大量熒光或發(fā)光基團中的任何種類，例如，熒光蛋白、發(fā)光蛋白、非蛋白熒光團、非蛋白化學(xué)發(fā)光化合物以及熒光納米晶體。RET受體可以是能猝滅(quench)來自RET供體的信號的分子，在一些實施方式中，其展示出增加的、敏化的受體信號。為增加光學(xué)信號的強度，可在每個傳感器構(gòu)建體上包括多個RET供體和受體。傳感器構(gòu)建體自身可以是多肽，其可包含抗體或抗體片段，例如抗體的Fv部分。在此類實施方式中，分子識別結(jié)構(gòu)域是傳感器構(gòu)建體的Fv部分的CDR區(qū)域。分子識別結(jié)構(gòu)域可以包含金屬，例如螯合的金屬，或者作為替代，包含寡核苷酸。在傳感器構(gòu)建體的一些實施方式中，分子骨架(scaffold)、分子識別結(jié)構(gòu)域和/或標(biāo)記可以作為單獨的分子提供，然后合并起來形成傳感器構(gòu)建體。例如，分子骨架可以包含異二聚巻曲螺旋多肽對，分子識別結(jié)構(gòu)域可以包含抗體(包含Vh和V^片段)Fv片段的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在該實施方式中，分子識別結(jié)構(gòu)域還可以是螯合金屬、寡核苷酸、肽、生物素分子或非肽性的酶底物/抑制劑分子。在此類實施方式中，傳感器構(gòu)建體的不同組分在互相接觸的時候是自組裝的(self-assembling)，并且允許從RET供體到RET受體的F6rster共振能量轉(zhuǎn)移發(fā)生。結(jié)合下文描述、所附的權(quán)利要求以及附圖，將能更好地理解本發(fā)明的上述和其它特征、方面和優(yōu)點，其中圖l描述了根據(jù)本發(fā)明的待分析物與傳感器構(gòu)建體的結(jié)合。圖2描述了本發(fā)明的傳感器構(gòu)建體的替代性實施方式，其中，MRD標(biāo)記相連。圖2A描述了本發(fā)明的傳感器構(gòu)建體的另一種實施方式，其中，MRD與標(biāo)記相連。圖3描述了待分析物與本發(fā)明的傳感器構(gòu)建體的另一種替代性實施方式的結(jié)合。圖3A描述了待分析物與本發(fā)明的傳感器構(gòu)建體的又一種實施方式的結(jié)合。圖4描述了本發(fā)明的傳感器構(gòu)建體的另一種替代性實施方式，其中，MRD是自組裝的。圖4A描述了其中標(biāo)記也是自組裝的圖4示出的傳感器構(gòu)建體的實施方式。圖5A描述了本發(fā)明的傳感器構(gòu)建體的另一種自組裝的實施方式的裝配。圖5B描述了待分析物與圖5A示出的傳感器構(gòu)建體的結(jié)合。圖6描述了其中分子骨架是自組裝的本發(fā)明的傳感器構(gòu)建體的實施方式。圖7A-7G描述了根據(jù)本發(fā)明進行的實驗的結(jié)果。本申請文件中展示的所有尺寸都僅為示例之用，不起任何限制作用。此外，這些附圖中展示的比例也非必要的比例。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員參考本申請文件將能理解，本申請文件中公開的任何設(shè)備或設(shè)備的任何部分的實際尺寸將由其計劃用途來確定。發(fā)明描述本發(fā)明的傳感器構(gòu)建體允許對待分析物進行檢測，這是通過對兩種標(biāo)記之間的F6rster共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)相互作用加以干擾來進行的。當(dāng)傳感器構(gòu)建體與待分析物結(jié)合時，此類干擾導(dǎo)致光學(xué)信號的強度改變，所述改變可被靈敏的比例測量(mtiometric)或熒光壽命測量檢測到。因此本發(fā)明的傳感器構(gòu)建體在結(jié)合待分析物時能產(chǎn)生可被檢測到的信號，因此它們是自身發(fā)出信號的(self-signaling)，相對目前很多必須要包括進額外的信號產(chǎn)生元件以檢測待分析物的檢測檢驗來說，這是優(yōu)點。此外，不必將本發(fā)明的傳感器構(gòu)建體附到固體支持物上，因此，本發(fā)明的方法可在溶液中作為非競爭性的檢驗開展，并且提供了增加的檢驗通量。定義本文中使用的下述術(shù)語具有下文給出的定義，除非在使用此類術(shù)語時明確給出了不同的含義。"待分析物"指樣品中的分子、化合物或其它組分。待分析物可以是肽、蛋白質(zhì)、多核苷酸、有機分子、糖或其它碳水化合物或碳水化合物聚合物、脂類或其它類型的分子，包括維生素、激素和疾病標(biāo)記。待分析物可以與其它分子組合出現(xiàn)和/或作為其它分子的部分出現(xiàn)。優(yōu)選地，待分析物不包括RET供體或RET受體。"抗體"指能與待分析物特異性結(jié)合的免疫球蛋白?？贵w包括多個種類和同種型(isotype)的免疫球蛋白，例如IgA、IgD、IgE、IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM。"抗體片段"指包含完整抗體的一部分的分子，例如Fab、scFv、F(ab')2和Fab'分子。"抗體衍生物"指具有添加或取代的抗體或其片段，例如，嵌合抗體?？贵w、抗體片段和抗體衍生物可通過重組方法或本領(lǐng)域已知的任何其它方法從人或動物來源、從雜交瘤獲得。"表位"指待分析物表面局部定位的區(qū)域(或多個區(qū)域)，其能與分子識別結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合。"熒光"指暴露給外部來源的電磁輻射(通常是可見光范圍的，例如，激光)導(dǎo)致的物質(zhì)發(fā)光。就該定義的目的而言，熒光包括磷光，磷光被定義為激發(fā)輻射終止后物質(zhì)上光的持續(xù)發(fā)射。"F6rster半徑"指，RET供體和RET受體之間的共振能量轉(zhuǎn)移達(dá)到50%效率的距離(即，F(xiàn)RET相互作用使得被激發(fā)的供體的50%的光譜發(fā)射暗淡)。"FRET"、"FRET相互作用"以及類似的術(shù)語指RET供體和RET受體之間的F6rster共振能量轉(zhuǎn)移，以及類似類型的、不嚴(yán)格遵循Fdrster's理論的能量轉(zhuǎn)移，例如，當(dāng)使用不相重疊的受體時，不相重疊的能量轉(zhuǎn)移(見，例如，Anal.Chem.2005，77:1483-1487)。"FRET比例"(在圖7A-7I中由符號R來表示)指當(dāng)傳感器構(gòu)建體在最優(yōu)RET供體激發(fā)波長(\^)下被激發(fā)時，熒光RET供體和熒光RET受體在其各自的發(fā)射峰上的穩(wěn)態(tài)熒光強度之比。"標(biāo)記"指能提供可被檢測到的信號的分子或基團。在本發(fā)明的傳感器構(gòu)建體和方法中，標(biāo)記是RET供體或RET受體，信號是電磁(例如，光學(xué))信號。"發(fā)光"指，光從不熱的來源(即，不是熱的、白熾的物體)產(chǎn)生和發(fā)射出。若干種類型的發(fā)光包括化學(xué)發(fā)光和生物發(fā)光，其分別通過化學(xué)和生物化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生。發(fā)光不包括熒光。"基團(moiety)"指分子的具有特定性質(zhì)的一部分。"分子識別結(jié)構(gòu)域"或"MRD"指能與待分析物特異性結(jié)合的分子或基團。MRD的例子包括抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(即，CDR區(qū)域)、抗原表位(例如，當(dāng)檢測抗體時)、螯合的金屬、寡核苷酸、肽和激素受體。涉及到球形蛋白或肽的"分子大小"指分子的流體動力學(xué)半徑。"寡核苷酸"指5至200個核苷酸的鏈，通常大約20至100個核苷酸，更優(yōu)選地，大約30個核苷酸。"肽"指包含50個或更少的相連的氨基酸的分子。"多核苷酸"指包含兩個或更多個相連的核酸的分子。多核苷酸包括核酸以及具有取代和添加的核酸分子。"多肽"指包含兩個或更多個相連的氨基酸的分子。"蛋白質(zhì)"指包含超過50個相連的氨基酸的分子。"比例測量方法"指對來自RET供體和RET受體的熒光的比例加以測量從而測定樣品中待分析物的含量的方法。比例測量可用熒光計來進行。"RET供體"指能通過F6rster共振能量轉(zhuǎn)移與RET受體發(fā)生相互作用的熒光或發(fā)光基團或分子。"RET受體"指，能通過RET受體的增強熒光和/或猝滅來自RET供體的信號，通過F6rster共振能量轉(zhuǎn)移與RET供體發(fā)生相互作用的基閉或分子。"傳感器構(gòu)建體"指分子或分子集合，其中包含在一起發(fā)生作用的亞單元(subimit)，其能提供可被檢測到的信號，指示樣品中待分析物的存在情況，該信號是待分析物與傳感器構(gòu)建體的結(jié)合所產(chǎn)生的。在關(guān)于待分析物和分子識別結(jié)構(gòu)域相互作用的方面，"特異性結(jié)合"或"特異性地結(jié)合"指在特定檢驗的條件下，分子識別結(jié)構(gòu)域與待分析物結(jié)合，而不與樣品中其它組分結(jié)合。在一些檢驗中，可以忍受相對少量的分子識別結(jié)構(gòu)域的非特異性結(jié)合，但是將需要在解釋檢驗結(jié)果的時候?qū)Υ思右钥紤]，以避免假陽性結(jié)果或不準(zhǔn)確的定量數(shù)據(jù)。在一些情況下，分子識別結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合特定族或特定組的分子，其仍被認(rèn)為能與這些分子特異性結(jié)合，例如，當(dāng)MRD與該組分子的共有表位結(jié)合的時候。待分析物與分子識別結(jié)構(gòu)域的結(jié)合可以是可逆的，目卩，待分析物可從分子識別結(jié)構(gòu)域上分開，而不會對待分析物或特異性結(jié)合伴侶的結(jié)構(gòu)造成改變，或者，該結(jié)合可以是不可逆的，例如生物素或親和素之間的結(jié)合。"特異性表位結(jié)合""特異性地與表位結(jié)合"和類似的術(shù)語指，分子識別結(jié)構(gòu)域與待分析物的特定表位結(jié)合。此類結(jié)合僅發(fā)生于分子識別結(jié)構(gòu)域和特定表位之間，雖然在一些檢驗中，少量的非特異性結(jié)合也是可以忍受的，例如，寡核苷酸與具有若干錯配堿基的另一種寡核苷酸結(jié)合，或者抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域與待分析物的異型體(isoform)結(jié)合。特異性表位結(jié)合不包括待分析物和大量不同分子之間都能發(fā)生的相互作用，例如，螯合劑和大量不同金屬中任何一種的離子結(jié)合。但是，如果其能與特定族或組的分子的同一表位結(jié)合的話，分子識別結(jié)構(gòu)域仍可被描述為展示了特異性的表位結(jié)合。例如，MRD可針對于一族抗體的Fc區(qū)域，由此與該特定族屮大量不同的抗體特異性結(jié)合。本文中使用的術(shù)語"包含"及該術(shù)語的變體，例如"包括"、"含有"等并不用于排斥其它添加物、組分、整數(shù)(intergers)或步驟。本文中使用的術(shù)語"該"和"所述"以及類似的說法將用來包含單數(shù)以及復(fù)數(shù)，除非在上下文中對其用法另有指明。FRETF6rster共振能量轉(zhuǎn)移是本發(fā)明用于檢測待分析物的方法的物理原理。FRET涉及能量從RET供體(通常，是處于激發(fā)態(tài)的熒光基團或發(fā)光基團)轉(zhuǎn)移到另一種可被激發(fā)的基團(即RET受體)上，這是通過非輻射的偶極-偶極相互作用造成的。針對本發(fā)明的傳感器構(gòu)建體來選擇RET供體和受體，以確保在供體和受體之間可能發(fā)生FRET相互作用。供體的發(fā)射光譜通常應(yīng)當(dāng)具有比受體的發(fā)射光譜更短的波長(即，供體的最優(yōu)發(fā)射波長的最大值，、《，應(yīng)較受體的要短)。在經(jīng)典FRET中，供體和發(fā)射光譜和受體的吸收光譜應(yīng)在一定程度上重疊。但是，當(dāng)在基于鑭系金屬螯合供體和不相重疊的受體的抗Stokes'位移FRET的情況下，該規(guī)律也有例外(見，例如，Anal.Chem.2005Mar1;77(5):1483-7)。此外，在傳感器構(gòu)建體上RET供體和RET受體應(yīng)當(dāng)緊密靠近，以發(fā)生FRET相互作用。通常，當(dāng)供體和受體分開的距離小于IO納米時，F(xiàn)RET看起來就會發(fā)生，但是在供體和受體之間分子距離高達(dá)25納米時，也有過檢測到FRET的情況(見，例如，J.Am.Chem.Soc.2005Mar9;127(9):3115-3119)。根據(jù)F6rster原理，能量轉(zhuǎn)移效率還取決于供體和受體之間介質(zhì)的折射系數(shù)、能量供體的熒光/發(fā)光發(fā)射的速度常數(shù)以及在沒有受體的情況下供體的量子產(chǎn)率(quantumyield)。通過本發(fā)明傳感器構(gòu)建體的RET供體和RET受體之間的FRET相互作用產(chǎn)生的光信號強度取決于供體和受體的種類，因為不同的供體和受體對具有不同的F6rster半徑。當(dāng)RET供體處于激發(fā)態(tài)，并且在供體和受體之間發(fā)生FRET相互作用時，供體的熒光或發(fā)光會被猝滅(即，總的光輸出減少)。對一些RET受體而言，光發(fā)射是通過從RET供體轉(zhuǎn)移能量或能量吸收來觸發(fā)的，這導(dǎo)致了受體的光發(fā)射。其它受體，例如猝滅劑，使從RET供體吸收的能量消亡，并且不會發(fā)射出光(或者發(fā)射的光很微弱)。本發(fā)明的方法中，可通過使用本領(lǐng)域己知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(見，例如，Curr.Opin.Chem.Biol.2003oct;7(5):635-40)，對傳感器構(gòu)建體的穩(wěn)態(tài)或時間分辨的(time-resolved)熒光或發(fā)光加以測量，來檢測FRET相丌.作用。例如，可對RET受體的熒光，或RET供體熒光或發(fā)光的猝滅，或這兩者均加以測量。當(dāng)用猝滅劑作為RET受體時，通常對供體發(fā)射的猝滅加以測量。在本發(fā)明的方法中，對RET供體和RET受體之間預(yù)期的FRET相互作用的干擾顯示出樣品中待分析物的存在。傳感器構(gòu)建體組分如圖1所示，本發(fā)明的傳感器構(gòu)建體10包括三個主要的元件，艮IJ，分子骨架20，分子識別結(jié)構(gòu)域30和一對能通過F6rster共振能量轉(zhuǎn)移發(fā)生相互作用的標(biāo)記40、50。標(biāo)記40、50與分子骨架20相連，從而足夠緊密的接近，使得在沒有待分析物60與傳感器構(gòu)建體10的MRD30結(jié)合的情況下能夠通過F6rster共振能量轉(zhuǎn)移發(fā)生相互作用。分子識別結(jié)構(gòu)域30被包括進分子骨架20，或與分子骨架20或標(biāo)記中之一(40或50)相連，使得待分析物60與MRD30的結(jié)合干擾標(biāo)記對40、50之間的F6rster共振相互作用。如圖1所示，當(dāng)MRD30與待分析物60結(jié)合時，一種實施方式中的待分析物60即插入到兩個標(biāo)記40、50之間。分子識別結(jié)構(gòu)域大量不同類型的MRD可被用于本發(fā)明的傳感器構(gòu)建體，這取決于將被檢測的待分析物。在一種實施方式中，MRD是抗體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，即，CDR區(qū)域。在某些情況下，CDR區(qū)域的一部分，例如抗體的CDR3部分可以作為MRD發(fā)揮作用。當(dāng)抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域是MRD的時候，其可以是完整抗體的一部分，在這種情況下，優(yōu)選使用直接針對待分析物的單個表位的抗體。此類抗體可以是通過用雜交瘤技術(shù)制造的單克隆抗體，或其可通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的重組方法來制造?；蛘?，多克隆抗體也可用作為MRD，以對待分析物加以檢測。MRD還可被包括進抗體片段，保持其特異性結(jié)合的特征。此類片段可以是，例如，缺少抗體Fc部分的抗體片段，例如，F(xiàn)ab、Fab'和F(ab')2片段。Fab和F(ab')2片段可以通過本領(lǐng)域己知的方法來制造，例如，通過用蛋白水解酶(例如木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、無花果蛋白酶和/或胃蛋白酶)對單克隆抗體進行切割來制造。Fab'片段可以通過用試劑(例如二硫蘇糖醇或巰基乙醇)對F(ab，)2片段進行還原切割來制造。在單條多肽鏈上包括整個抗體結(jié)合區(qū)域的單鏈Fv(scFv)抗體也可通過對連接完整抗體重鏈組分的二硫鍵進行還原切割來獲得。在一種優(yōu)選的實施方式中，或者可以使用重組技術(shù)來制造抗體片段。包含抗體結(jié)合部分的MRD可通過大量的方法被包括進分子骨架。在一種實施方式中，抗體或包含抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體部分是獨立于分子骨架來制造的，然后再被連接到分子骨架上。例如，具有生物素基團的抗體可被連接到在適當(dāng)位置上連有親和素基團的分子骨架上。在一種優(yōu)選的實施方式中，分子骨架包含通過重組方法制造的蛋白質(zhì)，MRD是被包括進分子骨架的抗體的結(jié)合部分。以這種方式，分子骨架和MRD可以被一起制造，而無需額外步驟將MRD連接到分子骨架上。在一種替代性的實施方式中，MRD可以是螯合的金屬(例如，鎳)，用于捕獲結(jié)合金屬的試劑。在該實施方式中，優(yōu)選地，金屬通過與傳感器構(gòu)建體螯合來結(jié)合分子骨架，螯合是通過金屬-螯合基(例如，次氮基三乙酸)與分子骨架或標(biāo)記通過化學(xué)方法連接來實現(xiàn)的。優(yōu)選地，將被檢測的待分析物是連接有His標(biāo)簽(即，靠近該肽或蛋白質(zhì)的N-或C-末端的多個組氨酸殘基的鏈，通常是五個或六個組氨酸殘基)的肽或蛋白質(zhì)?；蛘?，MRd可以是與其它多肽或甚至非肽類物質(zhì)結(jié)合的肽。目前的組合肽文庫篩選技術(shù)允許選出能結(jié)合多種不同分子的獨特的肽(見，例如，Science.1990Jul27;249(4967):404-6)。肽MRD可被包括進傳感器構(gòu)建體的分子骨架或標(biāo)記。MRD還可包含其它類型的特異性結(jié)合分子。例如，MRD可以是寡核苷酸，用于檢測具有互補序列的多核苷酸。被命名為適配子(aptamer)的某些DNA/RNAMRD可以結(jié)合蛋白質(zhì)，由此可能用于檢測蛋白質(zhì)待分析物。MRD還可包含典型地在免疫檢驗中被視為抗原的部分，以檢測(例如)樣品中抗體的存在情況。在一種實施方式中，樣品可以包含血漿和血液，MRD可以是針對抗HIV抗體的肽表位，以檢測抗HIV抗體的存在與否。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到，特異性結(jié)合對(例如，抗體和抗原)的任何成員可以包含分子識別結(jié)構(gòu)域。特異性結(jié)合對包括碳水化合物和凝集素；生物素和親和素；葉酸和葉酸結(jié)合蛋白；維生素B12和內(nèi)因子(intrinsicfactor)以及蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G和免疫球蛋白。標(biāo)記大量的標(biāo)記可作為RET供體和/或RET受體用于本發(fā)明的傳感器構(gòu)建體。RET供體和RET受體都可以是熒光標(biāo)記，其中包括染料，例如，熒光素、若丹明(rhodamine)、香豆素及其衍生物。在FRET中，還可能用鑭系金屬(稀土元素)原子作為供體，傳統(tǒng)有機染料作為受體(見，例如，Nat.Struct.Biol.2000Sep;7(9):730-4)。其它熒光染料被列于下表1中，它們?nèi)慷伎蓮纳虡I(yè)途徑獲得(例如，從SigmaChemical,St.Louis,MO)。表l:熒光標(biāo)記4-乙酰氨基-4'異硫氰酸芪-2,2'-二磺5-(4，6-二氯三嗪-2-基)氨基熒光素酸(DTAF)7-氨基-4-三氟甲基香豆素N-(4-苯胺-l-萘基)馬來酰亞胺4，6-聯(lián)脒-2-苯基剛哚(DAPI)7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)4，4'-二異硫氰酸芪-2，2'-二磺酸四甲基若丹明異硫氰酸酯(TRITC)喹嗪異硫氰酸熒光素(QFITC)丹磺酰氯異硫氰酸曙紅赤蘚紅B熒光胺熒光素?zé)晒馑匮苌?-甲基傘形酮鄰苯二醛若丹明B及衍生物若丹明6G若丹明123磺酰若丹明B磺酰若丹明101氯化磺酰若丹明101酸(sulforhodamine101acidchloride)熒光標(biāo)記還包括熒光蛋白，例如綠色熒光蛋白(GFP)。GFP是從水母J^WW/Gv/cton'G中分離出來的自發(fā)發(fā)出熒光的蛋白質(zhì)，已經(jīng)發(fā)展出了大量的GFP變體(藍(lán)移和紅移的)。此類變體或衍生物包含對天然GFP序列進行取代、添加和/或缺失的分子。GFP變體包括BFP(藍(lán))、CFP(青)和YFP(黃)，以及這些分子的增強型變體，例如EGFP、ECFP禾卩EYFP。當(dāng)GFP是熒光團之一時，若丹明或Marina藍(lán)(MolecularProbes,Eugene,OR)有利地被用作為FRET對的另一方。此外，來自珊瑚礁物種的紅色熒光蛋白(RFP)以及它們的工程變體也可使用。當(dāng)MRD和/或分子骨架是通過重組制造的情況下，有利地，采用熒光蛋白作為本發(fā)明傳感器構(gòu)建體的RET供體和受體。在該情況下，RET供體和RET受體可隨著分子骨架和/或MRD—起作為單個多肽分子被制造出來，RET供體和受體在分子上的位置可被精確控制。在本發(fā)明的傳感器構(gòu)建體中可用作為標(biāo)記的其它熒光化合物包括納米晶體，其也被稱為量子點。量子點(QD)是半導(dǎo)體納米晶體，其熒光發(fā)射波長與晶體大小成比例。納米點的直徑類似化合物的激子玻爾半徑，其通常為2至10納米寬。典型地，它們包含從兩種元素形成的化合物，各來自周期表的兩個族，即來自周期表2和6族，周期表3和5族，或周期表4和6族。示例性的材料包括CdSe、ZnS和PbSe。量子點的外表面可以容易地與有機分子配對，從而促進與其它基團的結(jié)合，例如與本發(fā)明傳感器構(gòu)建體的分子骨架結(jié)合。在一些實施方式中，傳感器構(gòu)建體的RET供體可以包含發(fā)光基團，以代替熒光基團。例如，RET供體可以包含螢光素酶，當(dāng)其作用于其底物腔腸素上時會產(chǎn)生出光。熒光分子，例如YFP和GFP可以作為螢光素酶的RET受體。用可通過生物獲得的化合物，例如螢光素酶或水母發(fā)光蛋白作為RET供體，有些時候被稱為BRET(生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移)。其它發(fā)光基團，例如，化學(xué)發(fā)光基團也可被用作為RET供體。例如，魯米諾(5-氨基-2，3-二氫-l,4-酞嗪二酮)是一種化學(xué)發(fā)光化合物，當(dāng)其暴露給能氧化魯米諾的堿性溶液，例如過硼酸鹽、高錳酸鹽、過氯酸鹽(hyperchlorite)、碘或過氧化氫時就能發(fā)出藍(lán)綠色的光。其它發(fā)光基團包括過氧草酸化學(xué)發(fā)光團，例如雙(2，4,6-三氯苯基)草酸酯(TCPO)和雙(2-(3,6，9-三氧癸基羰基)-4-硝基苯基)草酸酯(TDPO)。此外，在本發(fā)明的方法的一些實施方式中，猝滅劑也可被用作為RET受體。使用猝滅劑，例如DABCYL、BHQ或QSY染料(例如，QSY7、QSY9、QSY21、QSY35，可從MolecularProbes，Eugene,OR,USA獲得)具有優(yōu)點，其可以消除直接(即，非FRET)受體激發(fā)導(dǎo)致的背景熒光帶來的潛在問題。分子骨架本發(fā)明的分子骨架適用于結(jié)合RET供體、RET受體和MRD，以及保持這些基團互相之間的特定空間關(guān)系。RET供體和RET受體必須在一定距離之內(nèi)，該距離能使得在沒有待分析物與MRD結(jié)合時供體和受體之間的F6rster共振能量相互作用得以發(fā)生。RET供體、RET受體和MRD還應(yīng)被保持為正確的偶極定向，以促進FRET相互作用(見，例如，StryerL.，F(xiàn)luorescenceenergytransferasaspectroscopicruler,Annu.Rev.Biochem.,47:819-46(1978))。MRD還優(yōu)選被分子骨架保留，從而當(dāng)其結(jié)合待分析物時，待分析物結(jié)合MRD或者至少其一部分插入到RET供體和RET受體之間，由此千擾供體和受體之間的F6rster共振能量相互作用。本發(fā)明的傳感器構(gòu)建體中分子骨架不需要構(gòu)象變化即可檢測待分析物。能結(jié)合標(biāo)記和MRD的多種不同分子可被用作為本發(fā)明的傳感器構(gòu)建體中的分子骨架。例如，肽、蛋白質(zhì)、碳水化合物和有機分子，以及包含此類分子的組合的分子例如核酸，可被用作為本發(fā)明傳感器構(gòu)建體的分子骨架基團。在一種實施方式中，分子骨架是包含抗體、抗體片段或抗體衍生物(例如Fv基團)的蛋白質(zhì)。Fv基團包含VH和VL片段，所述片段優(yōu)選被具有柔性的接頭(linker)穩(wěn)定，以形成單鏈Fv(scFv)，或被異二聚巻曲螺旋穩(wěn)定，形成螺旋穩(wěn)定的Fv(hsFv)。在另一種實施方式中，分子骨架包含蛋白質(zhì)，例如周質(zhì)結(jié)合蛋白。一種此類蛋白是麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)。當(dāng)標(biāo)記(例如GFP禾QYFP)分別連接到MBP的N-和C-末端時，它們能通過F6rster共振能量相互作用發(fā)生相互作用。當(dāng)使用周質(zhì)結(jié)合蛋白(例如MBP)，或在結(jié)合到作為分子骨架的小分子上會發(fā)生構(gòu)象改變的其它類似蛋白質(zhì)時，可能利用此類構(gòu)象改變來增強本發(fā)明檢驗的靈敏度，雖然此類構(gòu)象改變對于用本發(fā)明的傳感器構(gòu)建體檢測待分析物來說并非必要。存在麥芽糖的情況下，MBP會經(jīng)歷類似鉸鏈彎曲(hinge-bendinglike)的構(gòu)象改變，其使得RET供體和RET受體更為緊密接近，從而獲得可被檢測到的FRET相互作用。但是，在存在能與MRD結(jié)合的目標(biāo)待分析物的情況下，該FRET效應(yīng)會減弱。其它類型的分子骨架也可被用于形成本發(fā)明的傳感器構(gòu)建體。例如，異二聚巻曲螺旋可被用于MRD和標(biāo)記。或者，包含有機化合物的剛性接頭，例如美國專利No.5,945,526中描述的那些，可被用于保持RET供體、RET受體和MRD。多核苷酸分子也可被用作為分子骨架。標(biāo)記的偶聯(lián)RET供體、RET受體和MRD可以以多種方式連接到分子骨架上，這取決于分子骨架的種類。當(dāng)分子骨架和/或MRD是通過重組方法制造的蛋白質(zhì)時，有利地，熒光或發(fā)光蛋白(例如GFP和螢光素酶)被包括進重組蛋白，并且與分子骨架和MRD—起作為單個分子被制造。例如，六-組氨酸標(biāo)簽可被包括進包含分子骨架或MRD的蛋白質(zhì)。這不僅允許對傳感器構(gòu)建體方便地進行金屬親和性純化，而且還可再用Ni-NTA橋聯(lián)的熒光團對His-標(biāo)簽進行標(biāo)記(見，例如，KapanidisAN，EbrightYW，EbrightRH，Site-specificincorporationoffluorescentprobesintoprotein:hexahistidine-tag-mediatedfluorescentlabelingwith(Ni(2+):nitrilotriaceticAcid(n)-fluorochromeconjugates,J.am.Chem.Soc.2001Dec5;123(48):12123-5)。用于對蛋白質(zhì)進行定點標(biāo)記的另一種方法涉及用具有硫醇反應(yīng)活性的試劑進行半胱氨酸特異性標(biāo)記。定點誘變被用于向蛋白質(zhì)(例如scFv基團)引入N-末端半胱氨酸(見，例如，Gentleetal.，DirectproductionofproteinswithN-terminalcysteineforsite-specificconjugation,Bioconjug.Chem.,15:658-663(2004))。然后可以用化學(xué)連接技術(shù)來引入具有硫醇反應(yīng)活性的熒光或猝滅劑探針，從而獲得對scFv基團氨基末端的定點標(biāo)記(見，例如，Dawson,etal.,Synthesisofproteinsbynativechemicalligation,Science,266:776-779(1994))。大量具有硫醇反應(yīng)活性的熒光團是可通過商業(yè)獲得的?；蛘?，可以用商業(yè)可獲得的試劑盒，向具有硫醇反應(yīng)活性的寡核苷酸中引入熒光團的多個拷貝，制造出具有硫醇反應(yīng)活性的熒光寡核苷酸探針，此類具有硫醇反應(yīng)活性的熒光寡核苷酸探針可用于標(biāo)記半胱氨酸基團，例如，N-末端的半胱氨酸(見，例如，Tung,CHandStain,S，Preparationandapplicationsofpeptideoligonucleotideconjugates,Bioconjug.Chem.，11:605-618(2000))。當(dāng)分子標(biāo)記包含抗體、抗體片段或抗體衍生物時，可通過使用特異性結(jié)合基團，將標(biāo)記特異性連接到免疫球蛋白輕鏈(VL)的構(gòu)架區(qū)(framework)上，所述結(jié)合基團例如蛋白質(zhì)L、蛋白質(zhì)A和/或蛋白質(zhì)G、蛋白質(zhì)L(最辛刀分離自尸e/^cw^e/tococct^mag"ws)。蛋白質(zhì)L(PpL)的單結(jié)構(gòu)域還顯示出與VL構(gòu)架區(qū)的強有力地結(jié)合，其可以在不影響到抗原結(jié)合的情況下與VL結(jié)合。StopA;;/ococca/蛋白質(zhì)A(SPA-E)的E結(jié)構(gòu)域與VH的構(gòu)架區(qū)強有力地結(jié)合，其也不會影響到待分析物的結(jié)合。VL和VH結(jié)構(gòu)域的氨基末端在允許FRET發(fā)生的距離之內(nèi)(大約3至4nm之間)，因此是結(jié)合標(biāo)記以構(gòu)建傳感器構(gòu)建體的合適位置。在該實施方式中，PpL禾nSPA-E可在￡^Aen'c/'aco//中表達(dá)，被純化，以及分別用RET供體和受體標(biāo)記。當(dāng)與抗體、抗體片段或抗體衍生物接觸的時候，經(jīng)過標(biāo)記的PpL和SPA-E分子結(jié)合，由此標(biāo)記此類分子。將標(biāo)記與分子骨架連接的其它方法也可能可行。例如，可以用傳統(tǒng)的化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)，將標(biāo)記連接到分子骨架上，導(dǎo)致標(biāo)記與分子骨架的共價連接。當(dāng)分子骨架是多核苷酸時，可以在合成期間用染料-亞磷酰胺(在合成期間被取代為核苷酸亞磷酰胺)將標(biāo)記直接包括進多核苷酸序列。將熒光染料包括進多核苷酸的其它方法也是本領(lǐng)域已知的。如圖3所示，標(biāo)記(即，圖3中的標(biāo)記40)也可直接連接到MRD30上，而不用與分子骨架直接連接，條件是此類連接不會干擾MRD與待分析物的結(jié)合。此類連接還不應(yīng)干擾在MRD30與待分析物結(jié)合之前RET供體和RET受體之間的FRET相互作用。在一些實施方式中，有利地，將大量供體RET基團和/或大量RET受體基團包括進傳感器構(gòu)建體。如圖4A所示，標(biāo)記40上提供了多個RET供體42、44和46，而RET受體50上提供了多個RET受體52、54和56。在傳感器構(gòu)建體10中使用多個RET供體和受體可以加強本發(fā)明的傳感器構(gòu)建體產(chǎn)生的光學(xué)信號的強度。傳感器構(gòu)建體多種多樣的分子識別結(jié)構(gòu)域、標(biāo)記和分子骨架可被組合，以形成本發(fā)明的傳感器構(gòu)建體。當(dāng)對本文所述的多肽傳感器構(gòu)建體進行設(shè)計時，可以使用分子模型工具，例如DeepView/SwissPDBViewer(可從http:〃www.expasy.org/spdbv/獲得)來進行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)觀察和操作。例如Dock5.0的禾呈序(可從MolecularDesignInstitute,UniversityofCalifornia,SanFrancisco獲得)可被用于分子對接，例如InterPreTS的程序(可從http:〃www.russell.embl.de/interprets獲得)可用于分析蛋白質(zhì)相互作用。用于此類工具的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可從例如RCSBProteinDataBank(可從http:〃pdbbeta.rcsb.org/pdb/獲得)獲得。在一種實施方式中，MRD可與傳感器構(gòu)建體的標(biāo)記之一連接。如圖2所示，MRD30與標(biāo)記40連接。有利地，標(biāo)記和MRD是多肽，并一起作為單個分子被制造。在圖2所示的實施方式中，MRD30連接到標(biāo)記40的N-末端上。在該詳細(xì)的實施例中，標(biāo)記40連接到多肽分子骨架20(可以是MBP)的N-末端上。另一個蛋白質(zhì)標(biāo)記50與分子骨架20的C末端相連。圖2A中展示了一種類似的實施方式，其中，MRD30是肽環(huán)，其插入到多肽標(biāo)記40的序列中。在圖3所示的替代性方法中，用重組DNA技術(shù)，使多肽分子骨架20(其可以是麥芽糖結(jié)合蛋白)的末端與標(biāo)記50(例如，GFP)和包含多肽分子識別結(jié)構(gòu)域30(例如，scFv或其它抗體片段)的分子分別融合。包含MRD30的分子然后再被標(biāo)記40(其可以是熒光團，例如若丹明)所標(biāo)記。包含MRD的肽或甚至是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域也可被插入到MBP核苷酸序列的某些位點，此類融合蛋白然后可以重組表達(dá)，而不會影響到MBP結(jié)合麥芽糖的能力(見，例如Bettonetal.,Locationoftoleratedinsertions/deletionsinthestructureofthemaltosebindingprotein,FEBSLett.325(l-2):34-8(1993)禾卩GuntasOstermeier,Creationofanallostericenzymebydomaininsertion,JMolBiol.336(l):263-73(2004))?；蛘?，MRD30可與MBP的特定位置化學(xué)偶聯(lián)。圖3A中描述了另一種方法。在該實施方式中，MRD30與分子骨架20直接連接。MRD可按照上文所述連接到分子骨架上。圖3A進一步示出了待分析物60與MRD30的結(jié)合。在本發(fā)明傳感器構(gòu)建體10的一些實施方式中，所述構(gòu)建體可由單獨的分子組成，所述單獨的分子互相連接或聯(lián)合，組成傳感器構(gòu)建體10。例如，如圖所示，在一種實施方式中，本發(fā)明的傳感器構(gòu)建體io的分子骨架20和/或MRD30可以包含兩個分子，它們單獨被制造，然后裝配起來。這具有如下優(yōu)點允許RET供體與這些分子之一相連，而RET受體與另一個相連，使得分子骨架的部分和/或MRD與標(biāo)記的結(jié)合可受到更好地控制。從兩個單獨分子制造自組裝的傳感器構(gòu)建體的一種方法是利用異二聚巻曲螺旋多肽基團，例如WinZip-A2Bl(見，例如，JMolBiol.2000Jan21;295(3):627-39)。如圖4所示，當(dāng)異二聚巻曲螺旋基團70(例如WinZip-A2)被連接到分子骨架20的一部分22上，且另一巻曲螺旋基團80(與第一種巻曲螺旋基團70能特異性結(jié)合，例如，WinZip-Bl)被連接到分子骨架20的另一部分24上時，螺旋70和80將會聯(lián)合，由此拉攏分子骨架20的單獨部分22和24相連，形成MRD30。此類螺旋可通過接頭，例如圖4和圖4A示出的肽接頭26、28，加入到分子骨架部分中。包含該實施方式的一種特殊的分子是被螺旋穩(wěn)定的重組Fv，其中，F(xiàn)ab片段的CH1和CL結(jié)構(gòu)域被異二聚巻曲螺旋(例如，WinZip-A2Bl或E/L巻曲螺旋多肽)代替。分子骨架的一部分包含與WinZipA2相連的Fv片段的VH區(qū)域，另一部分包含與WinZipBl相連的VL區(qū)域。這兩部分都可通過本領(lǐng)域已知的基因融合和標(biāo)準(zhǔn)重組方法來制造。當(dāng)VH和VL部分以互相接觸的方式放置時，它們會自組裝，形成傳感器構(gòu)建體。在相關(guān)的實施方式中，如圖5A、5B和6所示，分子骨架20可以包含互相特異性結(jié)合的兩個基團，例如巻曲螺旋多肽對。在圖5A和5B示出的實施方式中，第一巻曲螺旋多肽伴侶70通過接頭26與標(biāo)記40相連。該分子中還包括特異性結(jié)合區(qū)域27。第二巻曲螺旋多肽伴侶80通過接頭28與標(biāo)記50相連，當(dāng)互相接觸時，這兩種巻曲螺旋伴侶會互相特異性結(jié)合。MRD30與針對特異性結(jié)合區(qū)域27的伴侶25相連，當(dāng)接觸到特異性結(jié)合區(qū)域27時，其就會與該區(qū)域聯(lián)合。如圖5B所示，當(dāng)包含表位62(MRD30與其特異性結(jié)合)的待分析物60接觸到包含該實施方式的傳感器構(gòu)建體10的單獨分子時，與MRD30結(jié)合的待分析物60即通過伴侶25、27與所述構(gòu)建體相連，并干擾或改變了標(biāo)記40和50之間的FRET相互作用。在本發(fā)明傳感器構(gòu)建體10的另一種替代性實施方式中，如圖6所示，MRD可以與第一特異性結(jié)合分子25相連，分子25上還連有標(biāo)記40。第二標(biāo)記50(在圖6中示為量子點)與針對特異性結(jié)合分子25的結(jié)合伴侶27相連。當(dāng)特異性結(jié)合伴侶25、27相互接觸時，它們聯(lián)合起來形成分子骨架20。檢驗方法本發(fā)明的傳感器構(gòu)建體適用于檢測大的目標(biāo)待分析物，例如，細(xì)胞、病毒、抗體和蛋白質(zhì)，具體而言，分子大小在大約1nm至大約25nm范圍內(nèi)的待分析物，更優(yōu)選地，在大約3nm至大約6nm范圍內(nèi)的。傳感器構(gòu)建體由此可有利地用于診斷檢驗。例如，可用本發(fā)明的傳感器構(gòu)建體，通過將來自患者的材料樣品(例如，唾液、尿液、血漿、血清、血液或其它組織)與含有本發(fā)明的傳感器構(gòu)建體的溶液接觸，來對懷疑可能具有一種醫(yī)學(xué)病癥的患者加以檢測。傳感器構(gòu)建體適用于與樣品中被懷疑存在的某病癥的指示劑結(jié)合。如果檢測到樣品中指示劑與傳感器構(gòu)建體以適當(dāng)?shù)男盘枏姸人浇Y(jié)合，那么患者可被診斷為患有該病癥。還可對以部分(aliquot)或分批方式純化或生產(chǎn)的實驗材料或制造的材料的樣品加以檢測，以測定在特定的部分或批次中是否存在想要的材料。例如，可對來自色譜分離的洗出液加以檢驗，以檢測出溶液中哪部分含有目標(biāo)待分析物。還可根據(jù)本發(fā)明的方法，對其它樣品(例如環(huán)境樣品)加以檢驗，例如，用于檢測這些樣品中的不想要的污染物。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的方法進行的檢驗是非競爭性的檢驗，傳感器構(gòu)建體應(yīng)答于待分析物的結(jié)合直接產(chǎn)生信號。在將樣品與傳感器構(gòu)建體結(jié)合之后，對來自傳感器構(gòu)建體的光學(xué)信號加以測量。如果檢測到了對所述構(gòu)建體的RET供體和RET受體之間的Raster共振能量轉(zhuǎn)移相互作用的干擾，就表明，樣品中存在目標(biāo)待分析物。優(yōu)選地，在將傳感器構(gòu)建體與樣品接觸之前就從含有傳感器構(gòu)建體的溶液中獲得光學(xué)信號，以測出傳感器構(gòu)建體的RET供體和RET受體之間通過F&ster共振能量轉(zhuǎn)移相互作用產(chǎn)生的對照光學(xué)信號。該對照光學(xué)信號和在樣品溶液中測量出的光學(xué)信號之間的差異可被用于對樣品中存在的待分析物的含量加以定量測定。比例方法可被用于進行這種測定，這是本領(lǐng)域已知的。為此目的，可以測量傳感器構(gòu)建體的發(fā)射強度的變化和/或傳感器構(gòu)建體發(fā)射的光學(xué)信號的衰減動力學(xué)的變化。當(dāng)使用長壽命的RET供體，例如鑭系金屬時，還可應(yīng)用時間分辨方法，如本領(lǐng)域所已知的那樣。本發(fā)明的方法的一個優(yōu)點在于，它們可以在溶液中進行，而無須將傳感器構(gòu)建體連到固體支持物上。這避免了固相檢驗(例如傳統(tǒng)的ELISA)所需的多步結(jié)合和洗滌步驟，因此檢驗通量得以大幅提高，而操作錯誤的幾率則更小。如果需要的話，本發(fā)明的構(gòu)建體也可與固體支持物相連，例如與微滴定板或微陣列相連。當(dāng)本發(fā)明的傳感器構(gòu)建體與固體支持物相連時，對于不同待分析物來說特異性的傳感器構(gòu)建體可被放置于固體支持物(例如，微陣列)上離散的位置上。樣品中特定待分析物的存在可由來自支持物上離散位置的適當(dāng)光學(xué)信號所表示，所述位置上結(jié)合了適于結(jié)合該待分析物的傳感器構(gòu)建體。以這種方式，可針對單種樣品中多種待分析物的存在加以檢測。多種不同的固體支持物可用于本發(fā)明的這種實施方式。合適的圓體支持物包括，平板、？L、膜和纖維，例如，固體支持物可以是顆粒、微陣列、微滴定板、波導(dǎo)管或毛細(xì)管。固體支持物可由能與本發(fā)明的傳感器構(gòu)建體結(jié)合、并且不會干擾MRD與待分析物的結(jié)合或RET供體和RET受體之間的FRET相互作用的任何材料制得。合適的材料包括硝酸纖維素、玻璃和大量合成聚合物，包括尼龍、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸縮水甘油酯、聚丙烯酰胺、聚酰胺和聚氯乙稀。本發(fā)明的傳感器構(gòu)建體可通過已知方法與固體支持物偶聯(lián)。例如，如果固體支持物是具有二氧化硅表面的顆粒，那么可使用腈基硅垸偶聯(lián)劑(見，例如，F(xiàn)alipouetal.,Newuseofcyanosilanecouplingagentfordirectbindingofantibodiestosilicasupports,Bioconjug.Chem.,10:346-353(1999))。對微陣列形式而言，傳感器構(gòu)建體可被點樣到可通過商業(yè)途徑獲得的多孔玻璃微陣列玻片上?？梢杂冕槧罟ぞ哳愋偷奈㈥嚵袃x制造微陣列，用疏水涂層(可從ErieScientific,Portsmouth,NH)來制造孔。本領(lǐng)域已知多種系統(tǒng)可用于激發(fā)熒光團，以及用于檢測和測量本發(fā)明的傳感器構(gòu)建體產(chǎn)生的光學(xué)信號。例如，可以使用廣視野熒光顯微鏡以及激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)。試劑盒在一種實施方式中，本發(fā)明的傳感器構(gòu)建體可被提供于試劑盒中，用于檢測待分析物。例如，此類試劑盒可以包括包含抗體FV部分的多肽；第一標(biāo)記，包含RET供體，其與包含蛋白質(zhì)A的E結(jié)構(gòu)域的多肽結(jié)合；以及第二標(biāo)記，包含RET受體，其與包含蛋白質(zhì)L結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽相結(jié)合。當(dāng)這些單獨的組分在溶液中組合，第一標(biāo)記就通過蛋白質(zhì)A的結(jié)構(gòu)域與Fv基團的VH部分相結(jié)合，第二標(biāo)記就通過蛋白質(zhì)L的結(jié)構(gòu)域與Fv基團的VL部分相結(jié)合?；蛘撸谝粯?biāo)記可以包含RET受體，而第二標(biāo)記包含RET供體。在另一種實施方式中，此類試劑盒可以包括第一標(biāo)記，包含RET供體，其與異二聚巻曲螺旋多肽相連，第二標(biāo)記，包含RET受體以及異二聚巻曲螺旋多肽，其能與第一標(biāo)記的異二聚巻曲螺旋多肽特異性結(jié)合。在該實施方式中，所述試劑盒還包括分子骨架上攜帶的分子識別結(jié)構(gòu)域，其與第一標(biāo)記、第二標(biāo)記或這兩者都能特異性結(jié)合，優(yōu)選地，通過接頭結(jié)合。實施例實施例1檢測抗GFP抗體對麥芽糖結(jié)合蛋白的構(gòu)建體加以檢驗，以確定本發(fā)明方法的實用性。該構(gòu)建體(也稱為熒光指示劑蛋白，或FLP)基于麥芽糖結(jié)合蛋白。連接到MBP基團N末端的是ECFP(增強的青色熒光蛋白)，連接到MBPC末端的是EYFP(增強的黃色熒光蛋白)。將六-組氨酸標(biāo)簽進一步連接到該構(gòu)建體的N-末端上。該構(gòu)建體被描述于PCT國際專利申請No.WO03/025220中，由CarnegieInstitutionofWashington的WolfFrommer教授好心提供。用該構(gòu)建體進行了若干項不同的實驗。結(jié)果被展示于圖7A-7I中，其中使用到了下表2中所示的符號。表2:圖7的圖例說明<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>存在麥芽糖時，該構(gòu)建體展示出增加的FRET比例(R)，這是由于該分子的MBP部分發(fā)生了構(gòu)象改變，導(dǎo)致熒光團相互之間更為緊密接近。在存在及不存在麥芽糖的情況下，對多種不同濃度的該構(gòu)建體與抗GFP多克隆抗體(其結(jié)合ECFP和EYFP)進行孵育。如圖7A和7B所示，在存在抗GFP抗體的情況下，傳感器構(gòu)建體的FRET比例下降，該抗體與GFP的結(jié)合干擾了該構(gòu)建體中RET受體和RET供體之間的FRET效應(yīng)。在存在不特異于GFP的抗體的情況下，對該構(gòu)建體的FRET發(fā)射進行進一步測量，結(jié)果沒有觀察到FRET發(fā)射強度有明顯變化。這些結(jié)果被展示于圖7C中，該圖還包括進了圖7B的結(jié)果以用于比較。用單克隆抗GFP抗體和單克隆抗His標(biāo)簽抗體，也觀察到了類似的來自傳感器的FRET比例下降的趨勢，分別如圖7E和7F所示。將傳感器蛋白結(jié)合到目標(biāo)(本例中，為抗GFP多克隆抗體)上時的FRET比例作為時間的函數(shù)，對其進行了進一步測量。如圖7D所示，F(xiàn)RET比例的變化兒乎立刻發(fā)生，在該系統(tǒng)中于30分鐘之后即測到了降低最大值。將FRET比例的改變作為傳感器濃度的函數(shù)，對其進行檢測，顯示出了本發(fā)明方法的定量性質(zhì)。對該實驗而言，使用固定濃度的多克隆抗-GFP抗體(30tiM)作為目標(biāo)待分析物，在變化的傳感器濃度下來測量傳感器FRET比例的改變。如圖7G所示，在大約30nM處，傳感器信號(FRET比例)開始飽和，這正確地顯示了目標(biāo)待分析物(即，多克隆抗-GFP抗體)的濃度。實施例2用包含MBP作為分子骨架的傳感器構(gòu)建體對溶液中加上了His標(biāo)簽的蛋白質(zhì)進行檢測制造類似于實施例1中的傳感器構(gòu)建體，其中包含重組麥芽糖結(jié)合蛋白，該蛋白具有與其N-末端相連的ECFP基團和與其C-末端相連的EYFP基團。但與實施例1不同的是，該融合蛋白不含六-組氨酸標(biāo)簽。ECFP的N末端或EYFP的C末端被突變，以包括進半胱氨酸殘基，這允許了與具有硫醇反應(yīng)活性的次氮基三乙酸(馬來酰亞胺-C3-NTA，DoJindo,Ga池ersburg，MD)的橋聯(lián)。橋聯(lián)的次氮基三乙酸被用于螯合金屬離子，例如，鎳離子，其隨后與加上了組氨酸標(biāo)簽的蛋白結(jié)合?；蛘?，可用本領(lǐng)域已知的定點誘變和化學(xué)橋聯(lián)技術(shù)，將次氮基三乙酸基偶聯(lián)到麥芽糖結(jié)合蛋白在其N-和C-末端之間的位置上。該傳感器可被用于檢測包含His標(biāo)簽的蛋白質(zhì)。實施例3用包含巻曲螺旋作為分子骨架的自組裝傳感器構(gòu)建體對溶液中加上了His標(biāo)簽的蛋白質(zhì)進行檢測按照下文所述來制造包含異二聚巻曲螺旋作為分子骨架的傳感器構(gòu)建體。用本領(lǐng)域己知的重組方法，將E-螺旋(EVSALEK七元序列)通過肽接頭偶聯(lián)到WinZip-A2螺旋上(見，例如，J.Mol.Biol.2000Jan21;295(3):627-39)。E-螺旋的N-末端被突變，以包括進半胱氨酸殘基，用于與RET標(biāo)記進行硫醇偶聯(lián)。用N-末端半胱氨酸修飾過的K-螺旋(KVSALKE七元序列)是通過化學(xué)肽合成或重組方法來制造的，用具有硫醇反應(yīng)活性的次氮基三乙酸對其進行標(biāo)記。此外，使用本領(lǐng)域己知的基因融合和重組方法，將E-螺旋(其N-末端被突變，以包括進半胱氨酸殘基，用于與RET標(biāo)記進行硫醇偶聯(lián))通過肽接頭與WinZip-Bl螺旋(見，例如，J.Mol.Biol.2000Jan21;295(3):627-39)偶聯(lián)。將這三種肽螺旋一起孵育，使得其形成圖5A示出的自組裝巻曲螺旋傳感器構(gòu)建體。當(dāng)與加上了His標(biāo)簽的蛋白質(zhì)結(jié)合時，該傳感器構(gòu)建體的FRET性質(zhì)會有所改變，如圖5B所示。實施例4包含重組FV抗體的自組裝傳感器構(gòu)建體通過單獨生產(chǎn)兩種融合蛋白來制造包含重組Fv抗體片段的傳感器構(gòu)建體(見，例如，JMolBiol.2001S印7;312(l):221-8)。第一融合蛋白包含F(xiàn)v分子的VH部分，其C-末端與接頭相連，該接頭將其連接到肽螺旋WinZip-A2的N-末端上，形成VH::接頭::WinZip-A2。該接頭包含有柔性的14個氨基酸的肽，其大約2.4-2.6nm長，由氨基酸Gly、Ser、Thr、Pro構(gòu)成。第二融合蛋白包含F(xiàn)v分子的VL部分，其C-末端與接頭相連，該接頭將其連接到另一種肽螺旋WinZip-Bl的N-末端上，形成VL::接頭::WinZip-Bl。該接頭包含有柔性的14個氨基酸的肽，其大約2.4-2.6nm長，由氨基酸Gly、Ser、Thr、Pro構(gòu)成。然后用PpL和SPA-E去標(biāo)記這兩種融合蛋白。將加上了六-組氨酸標(biāo)簽的PpL和SPA-E在五.co/Z中表達(dá)，通過固定金屬親和色譜(IMAC)來純化，再分別用RET供體和RET受體熒光團標(biāo)記。然后將熒光團標(biāo)記過的PpL和SPA-E與合適的融合蛋白一起孵育，以允許分別與VL和VH結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合。實施例5包含單克隆抗體的自組裝傳感器構(gòu)建體按照實施例4中所述來制造熒光團橋聯(lián)的PpL和SPA-E，用于標(biāo)記單克隆抗體的VH和VL區(qū)域。PpL僅能結(jié)合VL的構(gòu)架區(qū)，SPA-E則既能與VH結(jié)合，還以較輕的程度與Fc結(jié)合。因此SPA-E與Fc的結(jié)合親和力小于能與Fc結(jié)合的S"eptococa^蛋白質(zhì)G的Bl(SPG-B1)結(jié)構(gòu)域與Fc的結(jié)合親和力，故而首先用單克隆抗體與SPG-B1孵育，封閉掉SPA-E與Fc的結(jié)合。然后將用熒光團標(biāo)記的PpL和SPA-E與抗體一起孵育。雖然參考某些優(yōu)選的實施方式，對本發(fā)明進行了相當(dāng)詳細(xì)的討論，但是其它實施方式也是可行的。針對本發(fā)明的方法公開的步驟并不是限制性的，它們也并不意味著所描述的每一步對于本發(fā)明來說都是關(guān)鍵的，實際上，它們僅是示例性的步驟。因此，對本申請文件所含的優(yōu)選實施方式的描述應(yīng)不用于對所附的權(quán)利要求的范圍加以限制。本文提到的所有參考文獻(xiàn)都通過引用全部并入本文。權(quán)利要求1.一種方法，用子檢測樣品中的待分析物，所述方法包括如下步驟(a)提供一種傳感器構(gòu)建體，所述傳感器構(gòu)建體包括(i)能與所述待分析物特異性結(jié)合的分子識別結(jié)構(gòu)域；(ii)第一標(biāo)記，包含RET供體；以及(iii)第二標(biāo)記，包含針對所述第一標(biāo)記的所述RET供體的RET受體，所述RET受體與所述RET供體分開使得Fdrster共振能量轉(zhuǎn)移得以發(fā)生的距離，其中，當(dāng)所述分子識別結(jié)構(gòu)域結(jié)合所述待分析物時，所述待分析物與所述RET供體和/或所述RET受體的接近對所述RET供體和所述RET受體之間的FRET相互作用產(chǎn)生干擾；(b)將所述樣品與所述傳感器構(gòu)建體相接觸，然后(c)測量來自所述傳感器構(gòu)建體的光學(xué)信號，其中，當(dāng)檢測到對所述RET供體和所述RET受體之間的F6rster共振能量轉(zhuǎn)移相互作用的干擾時，則確定所述樣品中存在所述待分析物。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述RET受體與所述RET供體分開的距離小于大約25納米。3.如權(quán)利要求2所述的方法，其包含多個RET供體和RET受體。4.如權(quán)利要求l所述的方法，其中，所述RET供體選自熒光蛋白、發(fā)光蛋白、非蛋白熒光團、非蛋白化學(xué)發(fā)光化合物以及熒光納米晶體的組。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述供體是選自由GFP、EGFP、RFP、BFP、CFP、ECFP、YFP、EYFP和上述物質(zhì)衍生物所構(gòu)成的組的熒光蛋白。6.如權(quán)利要求l所述的方法，其中，所述RET受體選自由熒光蛋白、發(fā)光蛋白、非蛋白熒光團、熒光納米晶體和猝滅劑所構(gòu)成的組。7.如權(quán)利要求1所述的方法，還包括如下步驟在將所述傳感器構(gòu)建體與所述樣品接觸之前，對所述傳感器構(gòu)建體的所述RET供體和所述RET受體之間的F6rster共振能量轉(zhuǎn)移相互作用產(chǎn)生的對照光學(xué)信號加以測量；以及測定所述對照光學(xué)信號與步驟(C)中所述光學(xué)信號之間的差異，其中，所述對照光學(xué)信號與步驟(C)中所述光學(xué)信號之間的差異代表所述樣品中所述待分析物的含量。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中，對所述對照光學(xué)信號與步驟(c)中所述光學(xué)信號之間的差異進行的測定包括對所述傳感器構(gòu)建體的所述熒光或發(fā)光的衰減動力學(xué)或強度的變化加以測量。9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述傳感器構(gòu)建體包含多肽。10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述多肽包含抗體的Fv部分，以及所述分子識別結(jié)構(gòu)域包含所述Fv部分的CDR區(qū)域。11.如權(quán)利要求IO所述的方法，其中，提供傳感器構(gòu)建體的步驟包含，單獨提供包含所述分子識別結(jié)構(gòu)域、所述第一標(biāo)記和所述第二標(biāo)記的所述多肽。12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述第一標(biāo)記包含接頭，其中包含蛋白質(zhì)A的E結(jié)構(gòu)域；所述第二標(biāo)記包含蛋白質(zhì)L的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。13.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述分子識別結(jié)構(gòu)域包含螯合的金屬。14.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述分子識別結(jié)構(gòu)域包含寡核苷酸。15.用于檢測待分析物的傳感器構(gòu)建體，其中包含(a)能與所述待分析物的表位特異性結(jié)合的分子識別結(jié)構(gòu)域；(b)第一標(biāo)記，包含RET供體；以及(c)第二標(biāo)記，包含針對所述第一標(biāo)記的所述RET供體的RET受體，所述RET受體與所述RET供體分幵使得F6rster共振能量轉(zhuǎn)移得以發(fā)生的距離，其中，當(dāng)所述分子識別結(jié)構(gòu)域結(jié)合所述待分析物時，所述待分析物的一部分插入到所述RET受體和所述RET供體之間。16.如權(quán)利要求15所述的傳感器構(gòu)建體，其中，所述傳感器構(gòu)建體包含多肽。17.如權(quán)利要求16所述的傳感器構(gòu)建體，其中，所述傳感器構(gòu)建體包含單鏈Fv(scFv)，并且其中所述分子識別結(jié)構(gòu)域包含所述scFv的CDR區(qū)域。18.如權(quán)利要求17所述的傳感器構(gòu)建體，其中，所述第一標(biāo)記與所述scFV偶聯(lián)。19.如權(quán)利要求17所述的傳感器構(gòu)建體，其中，所述第二標(biāo)記與所述scFv偶聯(lián)。20.如權(quán)利要求16所述的傳感器構(gòu)建體，其中，所述傳感器構(gòu)建體包含抗體的Fv部分，并且，其中，所述分子識別結(jié)構(gòu)域包含所述Fv部分的CDR區(qū)域。21.如權(quán)利要求20所述的傳感器構(gòu)建體，其中，所述第一標(biāo)記與所述Fv的VH基團偶聯(lián)，所述第二標(biāo)記與所述Fv的Vt基團連接。22.如權(quán)利要求21所述的傳感器構(gòu)建體，其中，所述第一標(biāo)記包含蛋白質(zhì)A的E結(jié)構(gòu)域，所述第二標(biāo)記包含蛋白質(zhì)L的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。23.如權(quán)利要求20所述的傳感器構(gòu)建體，其中，所述第一標(biāo)記與所述Fv的Vr基團相連，所述第二標(biāo)記與所述Fv的VH基團相連。24.如權(quán)利要求23所述的傳感器構(gòu)建體，其中，所述第一標(biāo)記包含蛋白質(zhì)L的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述第二標(biāo)記包含蛋白質(zhì)A的E結(jié)構(gòu)域。25.如權(quán)利要求16所述的傳感器構(gòu)建體，其中，所述傳感器構(gòu)建體包含抗體。26.如權(quán)利要求25所述的傳感器構(gòu)建體，其中，所述第一標(biāo)記包含選自由蛋白質(zhì)L的結(jié)合結(jié)構(gòu)域和蛋白質(zhì)A的E結(jié)構(gòu)域所組成的組的接頭。27.如權(quán)利要求25所述的傳感器構(gòu)建體，其中，所述第二標(biāo)記包含選自由蛋白質(zhì)L的結(jié)合結(jié)構(gòu)域和蛋白質(zhì)A的E結(jié)構(gòu)域所組成的組的接頭。28.如權(quán)利要求16所述的傳感器構(gòu)建體，其中，所述分子識別結(jié)構(gòu)域包含肽表位。29.如權(quán)利要求15所述的傳感器構(gòu)建體，其中，所述分子識別結(jié)構(gòu)域包含寡核苷酸。30.如權(quán)利要求15所述的傳感器構(gòu)建體，其中，所述第一標(biāo)記包含所述分子識別結(jié)構(gòu)域。31.如權(quán)利要求15所述的傳感器構(gòu)建體，其中，所述第二標(biāo)記包含所述分子識別結(jié)構(gòu)域。32.如權(quán)利要求16所述的傳感器構(gòu)建體，其中，所述傳感器構(gòu)建體包含一對異二聚巻曲螺旋多肽。33.如權(quán)利要求32所述的傳感器構(gòu)建體，其中，所述異二聚巻曲螺旋多肽的對選自由WinZip-A2/WinZip-Bl和E/K螺旋構(gòu)成的組。34.如權(quán)利要求16所述的傳感器構(gòu)建體，其中，所述傳感器構(gòu)建體包含周質(zhì)結(jié)合蛋白。35.如權(quán)利要求28所述的傳感器構(gòu)建體，其中，所述周質(zhì)結(jié)合蛋fl是麥芽糖結(jié)合蛋白。36.如權(quán)利要求16所述的傳感器構(gòu)建體，其中，所述分子識別結(jié)構(gòu)域能與傳感器構(gòu)建體特異性結(jié)合。37.用于檢測待分析物的傳感器構(gòu)建體，其中包含(a)分子骨架，包含能與所述待分析物特異性結(jié)合的分子識別結(jié)構(gòu)域；(b)第一標(biāo)記，包含RET供體；以及(c)第二標(biāo)記，包含針對所述第一標(biāo)記的所述RET供體的RET受體，所述RET受體與所述RET供體分開使得F6rster共振能量轉(zhuǎn)移得以發(fā)生的距離，其中，當(dāng)所述分子識別結(jié)構(gòu)域結(jié)合所述待分析物時，所述待分析物的一部分插入到所述RET受體和所述RET供體之間。38.如權(quán)利要求37所述的傳感器構(gòu)建體，其中，所述傳感器構(gòu)建體包含多肽。39.如權(quán)利要求37所述的傳感器構(gòu)建體，其中，所述分子識別結(jié)構(gòu)域包含螯合的金屬。40.用于制造權(quán)利要求20所述的傳感器構(gòu)建體的試劑盒，其中包含作為單獨組分的如下物質(zhì)(a)包含抗體Fv部分的多肽；(b)第一標(biāo)記，包含RET供體；以及(c)第二標(biāo)記，包含針對所述第一標(biāo)記的所述RET供體的RET受體，其中，所述第一標(biāo)記和所述第二標(biāo)記中的任何一種包含蛋白質(zhì)A的E結(jié)構(gòu)域，并且其中另一種標(biāo)記包含蛋白質(zhì)L的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。41.用于制造傳感器構(gòu)建體的試劑盒，其中包含作為單獨組分的如下物質(zhì)(a)第一標(biāo)記，包含RET供體以及第一種異二聚巻曲螺旋多肽；(b)第二標(biāo)記，包含針對所述第一標(biāo)記的所述RET供體的RET受體，以及第二種異二聚巻曲螺旋多肽，其中，所述第一種異二聚巻曲螺旋多肽能與第二種異二聚巻曲螺旋多肽特異性結(jié)合；以及(c)分子骨架，其中包含分子識別結(jié)構(gòu)域，其中，所述分子骨架與接頭相連，所述接頭能與所述第一標(biāo)記或所述第二標(biāo)記特異性結(jié)合。全文摘要本發(fā)明提供了傳感器構(gòu)建體10，其用于檢測樣品中待分析物60的存在情況，其包括分子骨架20，通過Frster共振能量轉(zhuǎn)移相互作用的一對標(biāo)記40、50以及至少一種分子識別結(jié)構(gòu)域30。當(dāng)待分析物60與分子識別結(jié)構(gòu)域30結(jié)合時，標(biāo)記40、50之間的Frster共振能量相互作用被打斷，導(dǎo)致光學(xué)信號的改變。文檔編號G01N21/64GK101124472SQ200580008558公開日2008年2月13日申請日期2005年3月17日優(yōu)先權(quán)日2004年3月17日發(fā)明者蘇維文申請人:夏威夷大學(xué)