專利名稱：結(jié)節(jié)性硬化癥途徑的缺陷引起的疾病的診斷和治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于鑒定TSC信號傳導(dǎo)途徑中的異常的組合物和方法。特別地，本發(fā)明涉及診斷和治療諸如結(jié)節(jié)性硬化癥之類的病癥的方法，所述病癥是由TSC基因中的突變引起的。本發(fā)明還涉及用于治療由TSC信號傳導(dǎo)紊亂介導(dǎo)的癌癥的方法和組合物。
背景結(jié)節(jié)性硬化癥(Tuberous Sclerosis，TSC)是相對常見的可遺傳性基因病癥，在每6000人口中發(fā)生約1例，并以多種器官中錯構(gòu)瘤的形成為特征(Young&Povey，Mol.Med.Today 4，313-319(1998))。常見的臨床癥狀包括顛癇發(fā)作、智力遲鈍、孤獨癥、腎衰竭、面部血管纖維瘤和心臟橫紋肌瘤(Gomez，Ann.NY Acad.Sci.615，1-7(1991))。另外，許多患病個體在某些骨骼區(qū)內(nèi)，尤其是手指和腳趾骨骼(指骨和趾骨)內(nèi)，具有囊腫樣區(qū)域。特有的皮膚病變包括可能在幼年時期形成的清楚界定的皮膚著色下降(色素沉著不足)的區(qū)域、以及自約四歲開始出現(xiàn)在面頰和鼻翼上的相對小的微紅色小結(jié)。這些微紅色病變最終擴大，混為一體(聚結(jié))，并形成疣樣外觀(皮脂腺瘤)。也可能形成另外的皮膚病變，包括皮膚色素沉著增加的扁平“咖啡色”區(qū)域(咖啡牛奶斑)；出現(xiàn)在指甲周圍或其下的良性纖維狀小瘤(纖維瘤)；或者下背上粗糙隆起的“多節(jié)”性病變(鯊魚皮樣斑)。
TSC可能在出生時就存在，但病癥跡象會很微小，且充分的癥狀需要些許時日形成。結(jié)果，TSC經(jīng)常多年不被識別和誤診。在多數(shù)情況下，識別TSC的最初線索就是癲癇發(fā)作或延緩發(fā)育的存在。在其它情況下，最初的跡象可能是皮膚上的白斑(黑色素沉著不足斑)。
這種病癥的診斷基于仔細(xì)的臨床檢查，結(jié)合可以顯示腦中結(jié)節(jié)的頭顱計算機斷層分析(CT)或磁共振成像(MRI)，以及可以顯示那些器官之中的腫瘤的心、肝和腎的超聲波。診斷也包括仔細(xì)檢查皮膚各種各樣的皮膚特征、手指甲和腳趾甲的指甲纖維瘤、牙齒和齒齦的牙洞和/或齒齦纖維瘤、以及眼睛放大的瞳孔?？衫梦榈聼艋蜃贤夤舛ㄎ缓谏爻林蛔惆?，它們有時難以在嬰兒以及淡色或淺色皮膚的個體中發(fā)現(xiàn)。
在嬰兒中，如果孩子在出生時具有心臟橫紋肌瘤或癲癇發(fā)作(嬰兒痙攣)，則TSC可疑。通過皮膚和大腦的仔細(xì)檢查，有可能在極小的嬰兒中診斷TSC。然而，多數(shù)孩子一直到后來存活到當(dāng)其癲癇發(fā)作開始以及其它癥狀如面部血管纖維瘤出現(xiàn)時都未被診斷。
對于結(jié)節(jié)性硬化癥沒有特效的療法。治療是對癥進(jìn)行的，可包括針對癲癇發(fā)作的抗痙攣療法、針對皮膚癥狀的皮膚擦除術(shù)和激光去除技術(shù)、針對神經(jīng)行為問題的藥物療法、治療由腎臟問題導(dǎo)致的高血壓、以及外科手術(shù)以去除生長的腫瘤。
結(jié)節(jié)性硬化癥個體的預(yù)后隨癥狀的嚴(yán)重程度而變化。沒有治愈的。具有溫和癥狀的那些個體一般行為良好并且過著長期多產(chǎn)的生活，而具有更嚴(yán)重形式癥狀的個體可能具有嚴(yán)重的殘疾。在罕見的情況下，癲癇發(fā)作、感染或者重要器官中的腫瘤可能造成一些器官(如腎臟和腦)中的并發(fā)癥，這可引起嚴(yán)重的麻煩甚至死亡。
需要改善的TSC早期診斷以允許更早的治療。也需要另外的療法。優(yōu)選療法為系統(tǒng)性治療癥狀的那些療法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及用于鑒定TSC信號傳導(dǎo)途徑中的異常的組合物和方法。特別地，本發(fā)明涉及診斷和治療諸如結(jié)節(jié)性硬化癥之類的病癥的方法，所述病癥是由TSC基因中的突變引起的。本發(fā)明還涉及用于治療由TSC信號傳導(dǎo)紊亂介導(dǎo)的癌癥的方法和組合物。
從而，在有些實施方案中，本發(fā)明提供了檢測受試者中增強的S6激酶活性的方法，包括提供來自受試者的生物學(xué)樣品；并檢測所述生物學(xué)樣品中增強的S6激酶活性。在有些實施方案中，檢測增強的S6激酶活性包括S6激酶磷酸酶測定。例如，在有些實施方案中，S6激酶磷酸酶測定包括使磷酸化特異性的(phosphospecific)抗體與S6激酶底物雜交。在某些實施方案中，增強的S6激酶活性可指示選自TSC1蛋白和TSC2蛋白的失活蛋白。在有些實施方案中，失活蛋白是由于編碼所述TSC1蛋白或所述TSC2蛋白的基因中的突變(如截短)引起的。在有些實施方案中，本發(fā)明還包括基于所述增強的S6激酶活性的檢測，為所述受試者提供診斷的步驟。在有些實施方案中，所述診斷是診斷所述受試者中的結(jié)節(jié)性硬化癥。在有些實施方案中，本發(fā)明還包括對所述受試者提供有關(guān)結(jié)節(jié)性硬化癥的治療的步驟。在有些實施方案中，所述治療包括向所述受試者施用S6激酶抑制劑。本發(fā)明不限于特定的S6激酶抑制劑?？煽紤]任何合適的S6激酶抑制劑，包括但不限于雷帕霉素(rapamycin)和雷帕霉素衍生物。
本發(fā)明也提供了用于結(jié)節(jié)性硬化癥診斷的試劑盒，其包含用于在受試者檢測增強的S6激酶活性的試劑。在有些實施方案中，所述試劑包括對S6激酶底物特異性的磷酸化特異性的抗體。在有些實施方案中，所述試劑盒還包含有關(guān)利用所述試劑在所述受試者中診斷結(jié)節(jié)性硬化癥的說明書。在某些實施方案中，所述說明書包括美國食品藥品監(jiān)督管理局所要求的用于體外診斷產(chǎn)品的說明書。
本發(fā)明還提供了在受試者中治療結(jié)節(jié)性硬化癥的方法，包括提供診斷患結(jié)節(jié)性硬化癥的受試者；和S6激酶抑制劑；并向所述受試者施用所述抑制劑。在有些優(yōu)選的實施方案中，所述施用導(dǎo)致所述受試者中結(jié)節(jié)性硬化癥癥狀的減少。本發(fā)明不限于特定的S6激酶抑制劑?？煽紤]任何合適的S6激酶抑制劑，包括但不限于雷帕霉素和雷帕霉素衍生物。
又在其它實施方案中，本發(fā)明提供了篩選化合物的方法，包括提供表達(dá)S6激酶的細(xì)胞；和一種或多種測試化合物；并篩選所述測試化合物抑制所述S6激酶的激酶活性的能力。在有些實施方案中，篩選所述化合物抑制S6激酶活性的能力包括S6激酶磷酸酶測定。在有些實施方案中，S6激酶磷酸酶測定包括使磷酸化特異性的抗體與S6激酶底物雜交。在有些實施方案中，所述細(xì)胞在體外。在有些實施方案中，所述細(xì)胞為TSC2-/-細(xì)胞。在其它實施方案中，所述細(xì)胞在體內(nèi)。在有些實施方案中，所述細(xì)胞處于非人動物(如大鼠或小鼠)之中。在有些實施方案中，所述大鼠為Eker大鼠。在有些實施方案中，所述測試化合物為藥物。在有些實施方案中，所述測試化合物為雷帕霉素。在其它實施方案中，所述測試化合物為雷帕霉素衍生物。本發(fā)明還提供了由所述方法鑒定到的藥物。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供了治療疾病的方法，包括提供患有疾病的受試者和能夠降低細(xì)胞能水平的試劑，并向所述受試者施用該試劑。在優(yōu)選的實施方案中，所述疾病包含缺陷型細(xì)胞。在其它實施方案中，所述缺陷型細(xì)胞包含缺陷型TSC途徑。在更進(jìn)一步的實施方案中，所述方法還提供了向所述受試者共施用雷帕霉素。
在優(yōu)選的實施方案中，缺陷型TSC途徑包含TSC途徑的缺陷型元件，例如TSC1、TSC2、Rheb、mTOR、S6K和/或4EBP-1。
在有些優(yōu)選的實施方案中，所述試劑靶向缺陷型細(xì)胞。在其它實施方案中，所述試劑會抑制己糖激酶。在其它實施方案中，所述試劑為2-脫氧-葡萄糖。在其它實施方案中，所述試劑為線粒體解偶聯(lián)劑FCCP。在其它實施方案中，所述試劑會抑制PKC。在其它實施方案中，所述試劑為楸毒素(Rottlerin)。在又一些其它實施方案中，所述試劑為5-氨基咪唑-4-氨基甲酰核糖核苷酸。
在其它優(yōu)選的實施方案中，所述疾病是結(jié)節(jié)性硬化癥。在其它實施方案中，所述疾病是癌癥。
本發(fā)明還提供了治療疾病的方法，包括提供患有疾病的受試者和能夠降低細(xì)胞能水平的試劑，并向所述受試者施用該試劑。在一些這樣的實施方案中，所述疾病由(kb)基因中的突變造成，例如波-杰綜合征(Peutz-Jeghers syndrome)，Cowden′s disease(多發(fā)性錯構(gòu)瘤綜合征)，青年性息肉病(juvenile polyposis)，Bannayan-Riley-Ruvalcaba綜合癥(以前的Bannayan-Zonana-，Riley-Smith-，和Ruvalcaba-Myhre-Smith綜合癥)。
在有些實施方案中，將S6激酶抑制劑(例如，雷帕霉素)以治療水平提供給患有波-杰綜合征或有關(guān)的癌癥和/或錯構(gòu)瘤的受試者，包括但不限于Cowden′s disease(多發(fā)性錯構(gòu)瘤綜合征)，青年性息肉病，Bannayan-Riley-Ruvalcaba綜合征(以前的Bannayan-Zonana-，Riley-Smith-，和Ruvalcaba-Myhre-Smith綜合征)。


圖1顯示了TSC1-TSC2對S6K的抑制。圖1a顯示了TSC1-TSC2抑制S6K激酶活性。如圖所示，在存在或缺乏TSC1-TSC2下，將HA-S6K轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中。圖1b顯示TSC1-TSC2選擇性抑制S6K中Thr 389而非Thr 421/Ser 424的磷酸化。圖1c顯示了TSC1-TSC2并不抑制Ras誘導(dǎo)的ERK的活化。圖1d顯示了Thr 389上S6K磷酸化的劑量依賴性抑制(左)。TSC1-TSC2對Akt的基礎(chǔ)的或者胰島素刺激的磷酸化作用沒有影響(右)。
圖2顯示了內(nèi)源性TSC2和來自疾病的突變對S6K磷酸化作用的影響。圖2a顯示了TSC2 RNA干預(yù)對S6K的基礎(chǔ)的和刺激的磷酸化作用的促進(jìn)。圖2b顯示了TSC2RNA干預(yù)增強了內(nèi)源性S6K和S6的磷酸化。圖2c顯示了來自疾病的TSC2突變體在其抑制S6K的能力方面受損。
圖3顯示了Akt對TSC2的磷酸化。圖3a顯示了TSC2的Akt-依賴性遷移率變動(mobility shift)。圖3b顯示了體內(nèi)32P-標(biāo)記的TSC2的二維磷肽(phosphopeptide)圖譜。圖3c顯示了在胰島素(400nM)、LY294002(50μM)或雷帕霉素(20nM)存在下HA-TSC2的二維磷肽圖譜。
圖4顯示了TSC2中Akt-依賴性磷酸化位點的確定。圖4a顯示了TSC2中推測的Akt磷酸化位點的示意圖。果蠅(Drosophila)dTsc2中的保守位點加框表示。標(biāo)出了用于體外Akt磷酸化測定的TSC2片段1和片段2區(qū)域。圖4b顯示了Akt磷酸化位點的突變分析。突變體標(biāo)示于各圖下方。圖VIII為加框區(qū)的示意圖，表示因相應(yīng)的丙氨酸取代而改變的特定磷酸化位點。各突變體中缺失的磷肽在圖I、II、IV和VI中以空心圓表示。圖4c顯示了純化的Akt對重組TSC2片段的磷酸化作用。也顯示了體外磷酸化的TSC2片段的二維磷肽圖譜(底部)。
圖5顯示Akt磷酸化位點的突變改變了TSC2活性。圖5a顯示丙氨酸取代磷酸化位點增強了TSC2活性，而由酸性殘基取代則降低活性。圖5b顯示了TSC2突變體對4E-BP1磷酸化的抑制。圖5c顯示了酸性殘基取代會破壞TSC1-TSC2復(fù)合體的形成。圖5d顯示了TSC2的磷擬態(tài)(phosphomimetic)突變體是不穩(wěn)定的。TSC2的穩(wěn)定性是在放線菌酮(300μM，0-6h)的存在下測定的。圖5e顯示磷擬態(tài)TSC2突變體是高度泛素化的。
圖6a和6b顯示了本發(fā)明的其它實施方案。TSC1-TSC2會抑制S6K的營養(yǎng)物刺激的磷酸化和激酶活性(圖6a)，表明TSC1-TSC2也參與營養(yǎng)物反應(yīng)。
圖7顯示TSC1-TSC2通過mTOR發(fā)揮功能而抑制S6K。圖7a顯示S6K-dC104突變體的Thr 389磷酸化不受雷帕霉素的抑制。圖7b顯示TSC1-TSC2并不抑制S6K-dC104突變體的Thr 389磷酸化。圖7c顯示TSC1-TSC2并不抑制胰島素誘導(dǎo)的S6K-dNC激酶活性。圖7d顯示TSC1-TSC2抑制mTOR激酶活性。圖7e顯示TSC1-TSC2抑制mTOR的磷酸化。TSC1-TSC2的共轉(zhuǎn)染會抑制mTOR上Ser 2448的磷酸化，正如通過使用抗-磷-mTOR抗體的免疫印跡所檢測到的那樣(左)。RNAi-C對內(nèi)源TSC2的減少增強了mTOR的磷酸化(右)。圖7f顯示了提出的關(guān)于TSC1-TSC2調(diào)節(jié)細(xì)胞生長功能的模型。
圖8顯示了2-DG能量耗盡(energy depletion)對S6K、S6、4EBP1、mTOR、Akt、AMPK和TSC2磷酸化的影響。圖8a顯示了ATP耗盡對S6K和4EBP1的脫磷酸化作用。圖8b顯示了TSC2的遷移率變動。圖8c顯示2-DG誘導(dǎo)內(nèi)源性S6K、S6、4EBP1、mTOR而非AKT的脫磷酸化。圖8d顯示2-DG誘導(dǎo)AMPK的磷酸化。圖8e顯示了2-DG處理的時間曲線。圖8f顯示2-DG降低胞內(nèi)ATP水平。圖8g顯示2-DG提高AMP/ATP比。圖8h顯示低葡萄糖抑制S6K。
圖9顯示2-DG刺激內(nèi)源性AMPK和TSC2的相互作用。圖9a顯示2-DG刺激內(nèi)源性TSC2和AMPK之間的免疫共沉淀。圖9b顯示了內(nèi)源性TSC2和AMPK的交互免疫沉淀。圖9c顯示了內(nèi)源性TSC1、TSC2、pAMPK和AMPK在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)水平。圖9d顯示TSC2的C-末端片段與內(nèi)源性AMPK相互作用。
圖10顯示TSC2對于2-DG誘導(dǎo)的S6K去磷酸化是必需的。圖10a顯示RNA干預(yù)破壞(knockdown)TSC2阻斷了2-DG反應(yīng)。圖10b顯示RNA干預(yù)破壞TSC2后并不阻斷雷帕霉素誘導(dǎo)的S6K脫磷酸化。圖10c顯示AMPK過表達(dá)對S6K的抑制作用被TSC2 RNAi阻斷。圖10d顯示TSC2的破壞對2-DG誘導(dǎo)的ACC和eEF2磷酸化作用幾乎沒有影響。圖10e顯示雷帕霉素對2-DG誘導(dǎo)的ACC和eEF2磷酸化作用幾乎沒有影響。圖10f顯示ATP耗盡誘導(dǎo)的S6K和4EBP1脫磷酸化作用在TSC2-/-細(xì)胞中受損。圖10g顯示2-DG誘導(dǎo)的4EBP1脫磷酸化作用在TSC2-/-細(xì)胞中受損。
圖11顯示ATP耗盡和AMPK誘導(dǎo)了TSC2磷酸化。圖11a顯示2-DG誘導(dǎo)的TSC2遷移率變動歸因于磷酸化作用。圖11b顯示AMPK表達(dá)誘導(dǎo)緩慢遷移形式的TSC2。如圖所示，HA-TSC1和Myc-TSC2與或不與活性AMPKαI亞單位共轉(zhuǎn)染，并分別由抗-HA和抗-Myc抗體印跡。圖11c顯示AMPK抑制劑阻斷2-DG誘導(dǎo)的TSC2遷移率變動。如圖所示，在2-DG處理前30分鐘添加AMPK抑制劑(化合物C，10μM)。圖11d顯示激酶失活的AMPK突變體阻斷2-DG誘導(dǎo)的S6K脫磷酸化。HEK293細(xì)胞用漸增含量的激酶失活的AMPK突變體(AMPKDN)轉(zhuǎn)染。圖11e顯示AMPK抑制劑阻斷2-DG誘導(dǎo)的S6K脫磷酸化。圖11f顯示AMPK抑制劑部分地阻斷由葡萄糖剝奪(glucose deprivation)誘導(dǎo)的S6K脫磷酸化。
圖12顯示AMPK在S1227和S1345上磷酸化TSC2。圖12a顯示2-DG和AMPK在體內(nèi)在多位點誘導(dǎo)TSC2磷酸化。圖12b顯示S1337和S1341為2-DG處理所磷酸化的AMPK-依賴性位點。圖12c顯示AMPK在體外在S1345而非S1337或1341上直接磷酸化TSC2。圖12d顯示TSC2中的Ser1345在體內(nèi)被磷酸化。圖12e顯示TSC2中的T1227在體內(nèi)被磷酸化。圖12f顯示AMPK在體外在T1227上磷酸化TSC2。圖12g顯示野生型TSC2而非S1337A/S1341A/S1345A突變體應(yīng)答2-DG而表現(xiàn)出遷移率變動。
圖13顯示AMPK磷酸化對于TSC2應(yīng)答能量限制調(diào)節(jié)S6K磷酸化的功能很重要。圖13a顯示TSC2中AMPK-依賴性位點的突變降低TSC2活性。圖13b顯示突變體TSC2可與TSC1形成復(fù)合體。圖13c顯示表達(dá)AMPK磷酸化突變體TSC2(T1227A/S1345A)的細(xì)胞對2-DG處理的應(yīng)答較弱。圖13d顯示TSC2-3A突變體抑制S6K的活性較小。用TSC2逆轉(zhuǎn)錄病毒感染LEF(TSC2-/-上皮)細(xì)胞，并選擇穩(wěn)定表達(dá)新霉素抗性的細(xì)胞。圖13e顯示TSC2的AMPK-依賴性磷酸化對于葡萄糖剝奪誘導(dǎo)的S6K脫磷酸化很重要。
圖14顯示TSC2在保護細(xì)胞免于葡萄糖剝奪所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞大小的調(diào)節(jié)中起著重要作用。圖14a顯示TSC2而非TSC2-3A保護LEF細(xì)胞免于葡萄糖剝奪所誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。圖14b顯示葡萄糖剝奪在載體和TSC2-3A中而非表達(dá)TSC2的LEF細(xì)胞中誘導(dǎo)DNA片段化。圖14c顯示葡萄糖剝奪在載體和TSC2-3A中而非表達(dá)TSC2的LEF細(xì)胞中誘導(dǎo)caspase-3和PARP的切割。圖14d顯示2-DG降低HEK293細(xì)胞的細(xì)胞大小。HEK293細(xì)胞在12.5mM 2-DG、TSC2 RNAi或20nM雷帕霉素存在下培養(yǎng)72小時。圖14e顯示低葡萄糖(2.8mM)降低HEK293細(xì)胞的細(xì)胞大小。圖14f顯示TSC2-3A在細(xì)胞大小調(diào)節(jié)方面是缺陷型的。圖14g顯示了提出的TSC2在細(xì)胞能量信號傳導(dǎo)途徑中的模型。
圖15a顯示了AMPK識別基序。Bas和Hyd分別定義了堿性和疏水性殘基。圖15b顯示了已知的AMPK底物的比對。以粗體顯示了磷酸化殘基，且將擬合識別基序的殘基加下劃線。圖15c顯示了TSC2中的推定的AMPK位點的序列比對。
圖16a-16f顯示了TSC2在保護細(xì)胞免受葡萄糖耗盡-誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起作用。圖16a顯示了TSC2和雷帕霉素、而不是TSC2-3A會保護LEF細(xì)胞免受葡萄糖耗盡-誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。在25mM葡萄糖(G+)或沒有葡萄糖的培養(yǎng)基(G-)中、含有或不含20nM雷帕霉素情況下，培養(yǎng)能穩(wěn)定地表達(dá)載體、TSC2或TSC2-3A的LEF細(xì)胞。在培養(yǎng)72小時時照像。注意到TSC2野生型表達(dá)細(xì)胞在形態(tài)上更小。圖16b顯示了雷帕霉素會抑制葡萄糖耗盡-誘導(dǎo)的LEF細(xì)胞中的caspase-3活化。在沒有葡萄糖的培養(yǎng)基中、含有或不含20nM雷帕霉素的情況下培養(yǎng)能穩(wěn)定地表達(dá)載體、TSC2或TSC2-3A的LEF細(xì)胞48小時。顯示了抗剪切的-caspase-3和肌動蛋白的蛋白印跡。圖16c顯示了葡萄糖耗盡對EEF8(TSC2-/-)和EEF4(TSC2+/+)細(xì)胞中細(xì)胞死亡的作用。在沒有葡萄糖的培養(yǎng)基中、含有或不含20nM雷帕霉素的情況下培養(yǎng)EEF細(xì)胞96小時。圖16d顯示了葡萄糖耗盡對EEF細(xì)胞中caspase-3活化的影響。在沒有葡萄糖的培養(yǎng)基中、含有或不含20nM雷帕霉素的情況下培養(yǎng)EEF4和EEF8細(xì)胞72小時。顯示了用剪切的caspase-3和肌動蛋白進(jìn)行的蛋白印跡。圖16e顯示了葡萄糖耗盡對MEF(TSC1+/+)和MEF(TSC1-/-)細(xì)胞中細(xì)胞死亡的影響。在沒有葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)MEF 48小時。圖16f顯示了葡萄糖耗盡對MEF(TSC1+/+)和MEF(TSC1-/-)細(xì)胞中的caspase-3活化的影響。在沒有葡萄糖的培養(yǎng)基中、含有或不含20nM雷帕霉素的情況下培養(yǎng)MEF 16小時。顯示了用剪切的-caspase-3和肌動蛋白進(jìn)行的蛋白印跡。
圖17a-17c顯示了TSC2在能量饑餓引起的細(xì)胞大小控制中起作用。圖17a顯示了2DG能減小HEK293細(xì)胞的細(xì)胞大小。在有12.5mM2DG、TSC2 RNAi，或20nM雷帕霉素存在下培養(yǎng)HEK293細(xì)胞72小時。收獲細(xì)胞，進(jìn)行FACS分析，以確定細(xì)胞大小。X-軸代表相對細(xì)胞大小。為了對比，將如灰色曲線所示的對照組細(xì)胞大小分布曲線包含在每個圖中。圖17b顯示了低葡萄糖(2.8mM)能減小HEK293細(xì)胞的細(xì)胞大小。實驗類似于在圖A中的那些。圖17c證實，TSC2的AMPK依賴型磷酸化對于TSC2在能量饑餓的細(xì)胞大小調(diào)節(jié)中的功能是重要的。如所示的，在含有25mM(上圖)或1mM葡萄糖(下圖)的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)能穩(wěn)定地表達(dá)TSC2、TSC2-3A和載體的TSC2-/-LEF細(xì)胞96小時。收獲細(xì)胞，進(jìn)行FACS分析。顯示了G1群體的細(xì)胞大小分布。
定義為有助于對本發(fā)明的理解，許多術(shù)語和短語定義如下如本文所使用的，術(shù)語“S6K”和“S6激酶”可互換使用，指S6K激酶(如人或非人S6K激酶)。
如本文所使用的，術(shù)語“在所述生物學(xué)樣品中檢測增強的S6激酶活性”是指使用任何合適的方法，檢測S6激酶的激酶活性相對于對照樣品(如從已知具有正常水平的S6激酶活性的個體獲得的對照樣品)的激酶活性水平是否存在增強。在有些實施方案中，激酶活性利用下文實驗部分描述的免疫測定予以測定。不過，可以使用能夠提供相對于對照的激酶活性測量的任何測定。在有些實施方案中，增強的S6激酶活性可指示TSC1或TSC2蛋白的失活。
如本文所使用的，術(shù)語“所述受試者中結(jié)節(jié)性硬化癥的陽性診斷”是指受試者中結(jié)節(jié)性硬化癥的診斷。如本文所使用的，術(shù)語“所述受試者中結(jié)節(jié)性硬化癥的陰性診斷”是指受試者不具有結(jié)節(jié)性硬化癥的診斷。
如本文所使用的，術(shù)語“TSC途徑”或“結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合體途徑”一般是指涉及TSC-1基因、TSC-1蛋白、TSC-2基因和/或TSC-2蛋白的生物學(xué)(如分子、遺傳、細(xì)胞、生物化學(xué)、藥物、環(huán)境)事件(如細(xì)胞途徑、細(xì)胞機制、細(xì)胞級聯(lián))。TSC途徑組分的實例包括，但不限于TSC-1、TSC-2、TSC-1/TSC-2、Rheb、mTOR、S6K和4EBP-1。
如本文所使用的，術(shù)語“具有結(jié)節(jié)性硬化癥的受試者”一般是指具有缺陷型TSC途徑的受試者。缺陷型TSC途徑可通過任何公認(rèn)的鑒定方法識別(如在表型上、遺傳上、生物化學(xué)上和分子上)。用于鑒定具有結(jié)節(jié)性硬化癥的受試者的一種方法包括進(jìn)行診斷測定，以檢測缺陷型TSC途徑(如文中所述的診斷測定試驗)。
如本文所使用的，術(shù)語“診斷有結(jié)節(jié)性硬化癥的受試者”是指已在醫(yī)學(xué)上(如由治療醫(yī)師)確定具有結(jié)節(jié)性硬化癥的受試者。
如本文所使用的，術(shù)語“缺陷型TSC途徑”或“具有缺陷型TSC途徑的樣品”是指證實在TSC途徑(如在表型上、遺傳上、生物化學(xué)上和分子上)內(nèi)表現(xiàn)出具有調(diào)節(jié)異常(如該途徑的調(diào)節(jié)產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)會導(dǎo)致針對細(xì)胞或組織的不利影響)的樣品。鑒定缺陷型TSC途徑的一種方法包括進(jìn)行診斷測定，以鑒定缺陷型TSC途徑(如文中所述的診斷測定試驗)。
如本文所使用的，術(shù)語“降低細(xì)胞能量水平”或“細(xì)胞能量水平的下降”一般是指細(xì)胞葡萄糖水平、氨基酸水平或ATP水平的下降(如降低、削減、減小)。
如本文所使用的，術(shù)語“所述試劑降低細(xì)胞能量水平”或“降低細(xì)胞能量水平的方法”一般是以細(xì)胞能量為對象。實例包括但不限于ATP和葡萄糖。另外，該術(shù)語一般也是以輔助產(chǎn)生細(xì)胞能量的組分為對象。實例包括但不限于線粒體、用于產(chǎn)生ATP的酶(如己糖激酶)、能量產(chǎn)生途徑(如三羧酸循環(huán))以及調(diào)節(jié)ATP代謝的藥物(如2-脫氧-葡萄糖)。
如本文所使用的，術(shù)語“肥大”一般是指器官或機體部分由于其組成細(xì)胞大小的增加所致的增大或過度生長。實例包括但不限于右心室肥大、肥厚型心肌病和良性前列腺肥大。
如本文所使用的，術(shù)語“S6激酶抑制劑”是指能抑制S6激酶的激酶活性的化合物。在優(yōu)選的實施方案中，抑制劑將激酶活性抑制到對照樣品中所見的激酶活性的水平。在特別優(yōu)選的實施方案中，S6激酶抑制劑可減輕由增強的S6激酶活性所致疾病的癥狀(如結(jié)節(jié)性硬化癥)。
如本文所使用的，術(shù)語“表位”是指與特定抗體進(jìn)行接觸的抗原部分。
當(dāng)使用蛋白或蛋白片段免疫宿主動物時，該蛋白的眾多區(qū)域可誘導(dǎo)產(chǎn)生與給定區(qū)域或者該蛋白上的三維結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合的抗體；這些區(qū)域或結(jié)構(gòu)稱之為“抗原決定簇”?？乖瓫Q定簇可與完整抗原(即用于引發(fā)免疫應(yīng)答的“免疫原”)競爭與抗體的結(jié)合。
當(dāng)術(shù)語“特異性結(jié)合”或“特異性地結(jié)合”用于指抗體與蛋白或肽之間的相互作用時，意味著所述相互作用依賴于蛋白上特定結(jié)構(gòu)(即抗原決定簇或表位)的存在；換言之，抗體識別并結(jié)合特定的蛋白結(jié)構(gòu)而不是通常意義上的蛋白。舉例來說，如果一抗體是表位“A”特異性的，則在含標(biāo)記的“A”和所述抗體的反應(yīng)中存在含表位A的蛋白(或者游離的未標(biāo)記的A)將降低與抗體結(jié)合的被標(biāo)記A的含量。
如本文所使用的，當(dāng)術(shù)語“非特異性結(jié)合”及“背景結(jié)合”用于指抗體與蛋白或肽之間的相互作用時，是指不依賴于特定結(jié)構(gòu)的存在的相互作用(即抗體與通常的蛋白而不是特定結(jié)構(gòu)如表位結(jié)合)。
如本文所使用的，術(shù)語“受試者”是指任何動物(如哺乳動物)，包括但不限于人、非人靈長類動物、嚙齒動物等，所述受試者將是特定治療的接受者。典型地，術(shù)語“受試者”和“患者”在文中互換使用，用于指人類受試者。
如本文所使用的，術(shù)語“磷酸化特異性的抗體”是指能與磷酸化形式的多肽(如S6K)特異性結(jié)合而不與非磷酸化形式的多肽特異性結(jié)合的抗體。在有些實施方案中，磷酸化特異性的抗體與在特定位置磷酸化的多肽特異性結(jié)合。
如本文所使用的，術(shù)語“有關(guān)使用所述試劑盒在所述受試者中檢測結(jié)節(jié)性硬化癥的說明書”包括有關(guān)使用試劑盒中所含試劑在來自受試者的生物學(xué)樣品中檢測和/或表征結(jié)節(jié)性硬化癥的說明書。在有些實施方案中，所述說明書還包括美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)所要求的有關(guān)標(biāo)注分析物特殊試劑(ASR)或體外診斷產(chǎn)品的目的用途的聲明。FDA將體外診斷歸類為醫(yī)療器械，并要求其通過510(k)手續(xù)批準(zhǔn)。510(k)申請所需信息包括1)體外診斷產(chǎn)品的名稱，包括商品或?qū)Ｓ忻?、通用或常用名，以及裝置的分類名；2)產(chǎn)品的目的用途；3)如果適用的話，遞交510(k)呈遞書的所有人或操作者的機構(gòu)登記號；如果已知的話，所述體外診斷產(chǎn)品依FD&C法513章所處的分類、其合適的組別，或者如果所有人或操作者判定所述裝置未依此章分類，(應(yīng)提交)這種判定以及判定所述體外診斷產(chǎn)品未如此分類的根據(jù)的聲明；4)建議的足以描述所述體外診斷產(chǎn)品的商記、標(biāo)簽及廣告，其目的用途、以及使用說明書。適用的情況下，應(yīng)提供照片或工程圖；5)表明所述裝置類似于和/或有別于美國商業(yè)流通中可比類型的其它體外診斷產(chǎn)品的聲明，并附具支持該聲明的數(shù)據(jù)；6)作為實質(zhì)等同判定基礎(chǔ)的安全性和有效性數(shù)據(jù)的510(k)總結(jié)；或者支持FDA發(fā)現(xiàn)實質(zhì)等同的510(k)安全性和有效性信息將在書面請求書的30天之內(nèi)公諸于眾的聲明；7)遞交人確信據(jù)其所知在上市前通告中所遞交的所有數(shù)據(jù)和信息真實準(zhǔn)確且未遺漏重要事實的聲明；8)FDA作出實質(zhì)等同判定所必需的有關(guān)所請求體外診斷產(chǎn)品的任何附加信息。附加信息可由美國FDA的互聯(lián)網(wǎng)頁獲得。
如本文所使用的，術(shù)語“計算機存儲器”及“計算機存儲裝置”是指計算機處理器可讀的任何存儲介質(zhì)。計算機存儲器的實例包括但不限于RAM、ROM、計算機芯片、數(shù)字化視頻光盤(DVD)、壓縮盤(CD)、硬盤驅(qū)動器(HDD)以及磁帶。
如本文所使用的，術(shù)語“基于所述檢測增強的S6激酶活性，為所述受試者提供診斷”是指基于所述受試者中增強S6激酶活性的存在提供醫(yī)學(xué)診斷(如結(jié)節(jié)性硬化癥)。
如本文所使用的，術(shù)語“計算機可讀介質(zhì)”是指為計算機處理器提供存儲和提供信息(如數(shù)據(jù)和指令)的任何裝置或系統(tǒng)。計算機可讀介質(zhì)的實例包括但不限于DVD、CD、硬盤驅(qū)動器、磁帶以及在網(wǎng)絡(luò)上用于運行介質(zhì)的服務(wù)器。
如本文所使用的，術(shù)語“處理器”和“中央處理器單元”或“CPU”互換使用，是指能夠從計算機存儲器(如ROM或其它計算機存儲器)讀取程序，并根據(jù)所述程序執(zhí)行系列步驟的裝置。
如本文所使用的，術(shù)語“非人動物”是指所有非人動物，包括但不限于脊椎動物如嚙齒動物、非人靈長類動物、綿羊、牛、反芻動物、兔類動物、豬、山羊、馬、犬、貓、鳥類等。
如本文所使用的，術(shù)語“核酸分子”是指含核酸的任何分子，包括但不限于DNA或RNA。該術(shù)語涵蓋包括任何已知的DNA和RNA堿基類似物的序列，所述堿基類似物包括但不限于4-乙酰胞嘧啶、8-羥基-N6-甲基腺苷、氮雜環(huán)丙烯基胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-(羧羥甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、次黃苷、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基次黃苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、beta-D-mannosylqueosine、5′-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羥乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羥乙酸、oxybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷(queosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-羥乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羥乙酸、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶以及2，6-二氨基嘌呤。
術(shù)語“基因”是指包含產(chǎn)生多肽、前體或RNA(如rRNA、tRNA)所必需的編碼序列的核酸(如DNA)序列。多肽可由全長編碼序列或者由編碼序列的任何部分編碼，只要保留了全長或片段的期望活性或功能特性(如酶活性、配體結(jié)合、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫原性等)即可。該術(shù)語也涵蓋結(jié)構(gòu)基因的編碼區(qū)以及在任一端位于靠近編碼區(qū)5′和3′端1kb或更長距離的序列，從而該基因?qū)?yīng)于全長mRNA的長度。位于編碼區(qū)5′端且存在于mRNA之上的序列稱之為5′非翻譯序列。位于編碼區(qū)3′端或下游且存在于mRNA之上的序列稱之為3′非翻譯序列。術(shù)語“基因”涵蓋了cDNA和基因組形式的基因。基因的基因組形式或克隆含有被稱之為“內(nèi)含子”或“間插區(qū)”或“間插序列”的非編碼序列所打斷的編碼區(qū)。內(nèi)含子為轉(zhuǎn)錄成核RNA(hnRNA)的基因區(qū)段；內(nèi)含子可含調(diào)控元件如增強子。內(nèi)含子被從核或初級轉(zhuǎn)錄物上去除或“剪接掉”；因此內(nèi)含子在信使RNA(mRNA)轉(zhuǎn)錄物中是不存在的。mRNA在翻譯期間行使功能，確定新生多肽中氨基酸的序列或順序。
如本文所使用的，術(shù)語“異源基因”是指不在其天然環(huán)境中的基因。舉例來說，異源基因包括來自一個物種、并被引入到另一個物種中的基因。異源基因也包括在某些方面已被改變了的生物體天然基因(如突變、以多拷貝加入、連接非天然調(diào)控序列等)。異源基因有別于內(nèi)源基因，在于異源基因序列典型地與并非天然發(fā)現(xiàn)在染色體中與該基因序列有關(guān)的DNA序列相連接，或者結(jié)合有天然未見過的染色體部分(如在所述基因正常不表達(dá)的基因座中表達(dá)的基因)。
如本文所使用的，術(shù)語“基因表達(dá)”是指通過基因“轉(zhuǎn)錄”(即經(jīng)由RNA聚合酶的酶促反應(yīng))將基因中編碼的遺傳信息轉(zhuǎn)換為RNA(如mRNA、rRNA、tRNA或snRNA)，以及對蛋白編碼基因而言，通過mRNA“翻譯”轉(zhuǎn)換為蛋白的過程。此過程中基因表達(dá)可在許多階段被調(diào)控。“上調(diào)”或“激活”是指提高基因表達(dá)產(chǎn)物(如RNA或蛋白)產(chǎn)量的調(diào)控，而“下調(diào)”或“阻遏”是指降低產(chǎn)量的調(diào)控。參與上調(diào)或下調(diào)的分子(如轉(zhuǎn)錄因子)通常分別稱之為“激活物”和“阻遏物”。
除了含有內(nèi)含子，基因組形式的基因也可以包括位于存在于RNA轉(zhuǎn)錄物上的序列的5′和3′端的序列。這些序列稱之為“側(cè)翼”序列或區(qū)域(這些側(cè)翼序列位于存在于mRNA轉(zhuǎn)錄物上的非翻譯序列的5′或3′端)。5′側(cè)翼區(qū)可含有調(diào)控序列，如調(diào)節(jié)或影響基因轉(zhuǎn)錄的啟動子和增強子。3′側(cè)翼區(qū)可含有指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄終止、翻譯后切割以及多聚腺苷?；男蛄?。
術(shù)語“野生型”是指從天然存在的來源分離的基因或基因產(chǎn)物。野生型基因是在種群中最頻繁觀察到的基因，因而武斷地指定為基因的“正常”或“野生型”形式。相反，術(shù)語“修飾的”或“突變體”是指當(dāng)與野生型基因或基因產(chǎn)物相比時，在序列上和或功能特性上表現(xiàn)出修飾(即改變的特征)的基因或基因產(chǎn)物。應(yīng)當(dāng)指出，天然存在的突變體可以是分離的；這些是通過當(dāng)與野生型基因或基因產(chǎn)物相比時，它們具有改變的特征(如改變的核酸序列)這一事實鑒定的。
如本文所使用的，術(shù)語“核酸分子編碼”、“DNA序列編碼”和“DNA編碼”是指脫氧核糖核酸鏈上的脫氧核糖核苷酸的順序或序列。這些脫氧核糖核苷酸的順序決定了多肽(蛋白)鏈上的氨基酸的順序。因而DNA序列編碼氨基酸序列。
如本文所使用的，術(shù)語“具有編碼基因的核苷酸序列的寡核苷酸”和“具有編碼基因的核苷酸序列的多核苷酸”是指包含基因編碼區(qū)，或者換言之，編碼基因產(chǎn)物的核酸序列的核酸序列。所述編碼區(qū)可以cDNA、基因組DNA或RNA的形式存在。當(dāng)以DNA的形式存在時，寡核苷酸或多核苷酸可以是單鏈(即有義鏈)或雙鏈的。如果需要，可以將合適的控制元件如增強子/啟動子、剪接結(jié)合處、多聚腺苷?；盘柕戎糜谂c基因編碼區(qū)極為接近之處，以允許轉(zhuǎn)錄的準(zhǔn)確起始和/或初級RNA轉(zhuǎn)錄物的正確加工。
備選地，本發(fā)明的表達(dá)載體中所用的編碼區(qū)可含有內(nèi)源性增強子/啟動子、剪接結(jié)合處、間插序列、多聚腺苷?；盘柕?，或者內(nèi)源和外源控制元件的組合。
如本文所使用的，術(shù)語“互補的”或“互補”用來指通過堿基配對規(guī)則相關(guān)聯(lián)的多核苷酸(即核苷酸序列)。舉例來說，序列“A-G-T”和序列“T-C-A”互補?；パa可以是“部分的”，其中僅僅某些核酸堿基依據(jù)堿基配對規(guī)則匹配?；蛘?，核酸之間可以存在“完全”或“全部”的互補。核酸鏈之間的互補程度對于核酸鏈間雜交的效率和強度具有重大影響。這在擴增反應(yīng)、以及依賴于核酸之間的結(jié)合的檢測方法中尤為重要。
術(shù)語“同源”是指互補程度?？纱嬖诓糠滞椿蛲耆?即相同)。部分互補的序列是至少部分地抑制完全互補的核酸分子與“基本上同源的”靶核酸雜交的核酸分子。完全互補的序列與靶序列的雜交的抑制可使用雜交測定(DNA或RNA印跡、溶液雜交等)，在低嚴(yán)謹(jǐn)性條件下進(jìn)行檢查。在低嚴(yán)謹(jǐn)性條件下，基本上同源的序列或探針將競爭并抑制完全同源的核酸分子與靶標(biāo)的結(jié)合(即雜交)。這并不是說低嚴(yán)謹(jǐn)性條件是允許非特異性結(jié)合的條件；低嚴(yán)謹(jǐn)性條件要求兩序列彼此之間的結(jié)合是特異性(即選擇性)的相互作用。非特異性結(jié)合的不存在可通過使用基本上不互補(如小于約30％的同一性)的第二靶標(biāo)進(jìn)行測試；在非特異性結(jié)合不存在時，探針將不會與第二不互補靶標(biāo)雜交。
當(dāng)用于指雙鏈核酸序列如cDNA或基因組克隆時，術(shù)語“基本上同源”是指在如上文所述的低嚴(yán)謹(jǐn)性條件下能與所述雙鏈核酸序列的一條或兩條鏈雜交的任何探針。
基因可產(chǎn)生多種RNA，它們是通過初級RNA轉(zhuǎn)錄物的差異性剪接產(chǎn)生的。作為同一基因剪接變體的cDNA將含有序列相同或完全同源的區(qū)域(代表兩cDNA上存在同一外顯子或同一外顯子的一部分)，以及完全不同的區(qū)域(例如，代表cDNA 1上存在外顯子“A”，而cDNA 2含有外顯子“B”)。由于兩cDNA含有序列相同的區(qū)域，它們都將與衍生自完整基因或含有見于兩cDNA上的序列的基因部分的探針雜交；這兩個剪接變體因此與此探針并且彼此之間基本上同源。
當(dāng)用于指單鏈核酸序列時，術(shù)語“基本上同源”是指在如上文所述的低嚴(yán)謹(jǐn)性條件下能與所述單鏈核酸序列雜交(即是其互補物)的任何探針。
如本文所使用的，術(shù)語“雜交”用來指互補核酸的配對。雜交和雜交強度(即核酸之間的結(jié)合強度)受到諸如核酸之間互補程度、涉及的條件的嚴(yán)謹(jǐn)性、形成的雜交鏈的Tm、以及核酸內(nèi)G∶C比等因素的影響。在其結(jié)構(gòu)內(nèi)包含互補核酸配對的單個分子被表述為“自雜交的”。
如本文所使用的，術(shù)語“Tm”用來指“解鏈溫度”。解鏈溫度是雙鏈核酸分子群半數(shù)解離為單鏈的溫度。用于計算核酸Tm的公式是本領(lǐng)域眾所周知的。正如標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)中所指出的那樣，如果核酸處于1MNaCl的水溶液中的話，簡單估計的Tm值可通過公式Tm＝81.5+0.41(％G+C)計算(參見Anderson和Young，Quantitative FilterHybridization，in Nucleic Acid Hybridization )。其它方法包括更為復(fù)雜的將結(jié)構(gòu)還有序列特征考慮到Tm的計算中的算法。
如本文所使用的，術(shù)語“嚴(yán)謹(jǐn)性”用來進(jìn)行核酸雜交的有關(guān)溫度、離子強度、以及存在化合物如有機溶劑的存在情況的條件。在“低嚴(yán)謹(jǐn)性條件”下，目的核酸序列將與其精確互補物、具有單堿基錯配的序列、密切相關(guān)的序列(如具有90％或更高同源性的序列)、以及僅有部分同源性的序列(如具有50-90％同源性的序列)雜交。在“中嚴(yán)謹(jǐn)性條件”下，目的核酸序列將僅與其精確互補物、具有單堿基錯配的序列、以及密切相關(guān)的序列(如90％或更高同源性)雜交。在“高嚴(yán)謹(jǐn)性條件”下，目的核酸序列將僅與其精確互補物以及(取決于條件如溫度)具有單堿基錯配的序列雜交。換言之，在高嚴(yán)謹(jǐn)性條件下，可提高溫度從而排除與具有單堿基錯配序列的雜交。
當(dāng)“高嚴(yán)謹(jǐn)性條件”用于指核酸雜交時，包括等同于如下的條件在由5×SSPE(43.8g/l NaCl，6.9g/l NaH2PO4H2O和1.85g/l EDTA，pH由NaOH調(diào)整至7.4)、0.5％SDS、5×Denhardt′s試劑和100μg/ml變性鮭魚精DNA組成的溶液中于42℃結(jié)合或雜交，接著在包括0.1×SSPE、1.0％SDS的溶液中于42℃洗滌(如果使用的是長度約500個核苷酸的探針)。
當(dāng)“中嚴(yán)謹(jǐn)性條件”用于指核酸雜交時，包括等同于如下的條件在由5×SSPE(43.8g/l NaCl，6.9g/l NaH2PO4H2O和1.85g/l EDTA，pH由NaOH調(diào)整至7.4)、0.5％SDS、5×Denhardt′s試劑和100μg/ml變性鮭魚精DNA組成的溶液中于42℃結(jié)合或雜交，接著在包括1.0×SSPE、1.0％SDS的溶液中于42℃洗滌(如果使用的是長度約500個核苷酸的探針)。
“低嚴(yán)謹(jǐn)性條件”包括等同于如下的條件在由5×SSPE(43.8g/l NaCl，6.9g/l NaH2PO4H2O和1.85g/l EDTA，pH由NaOH調(diào)整至7.4)、0.1％SDS、5×Denhardt′s試劑[50×Denhardt′s每500ml含5g Ficoll(型號400，Pharamcia)、5g BSA(級分V；Sigma)]和100μg/ml變性鮭魚精DNA組成的溶液中于42℃結(jié)合或雜交，接著在包括5×SSPE、0.1％SDS的溶液中于42℃洗滌(如果使用的是長度約500個核苷酸的探針)。
本領(lǐng)域熟知可采用眾多的等同條件構(gòu)成低嚴(yán)謹(jǐn)性條件；可考慮諸如探針的長度和性質(zhì)(DNA、RNA、堿基組成)和靶標(biāo)的性質(zhì)(DNA、RNA、堿基組成、存在于溶液之中或者固定的等)以及鹽和其它組分的濃度(如甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇的存在與否)等因素，并且可改變雜交溶液以產(chǎn)生不同于但又等同于上文所列條件的低度嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件。另外，本領(lǐng)域公知促進(jìn)在高嚴(yán)謹(jǐn)性條件下雜交的條件(如提高雜交和/或洗滌步驟的溫度、在雜交溶液中使用甲酰胺等)(見上文“嚴(yán)謹(jǐn)性”定義)。
如本文所使用的，當(dāng)術(shù)語“部分”用于指核苷酸序列(如同在“給定核苷酸序列的一部分”中那樣)時，是指該序列的片段。所述片段大小可從四個核苷酸到全部核苷酸序列減去一個核苷酸(10個核苷酸、20、30、40、50、100、200等)的范圍內(nèi)變化。
當(dāng)術(shù)語“分離的”用于核酸時，如同在“分離的寡核苷酸”或“分離的多核苷酸”中那樣，是指經(jīng)鑒定并與在其天然來源中其通常所結(jié)合的至少一種組分或污染物分離出來的核酸序列。分離的核酸是以有別于其天然所見的形式或背景下存在的核酸。相反，未分離的核酸是以它們天然存在的狀態(tài)所見到的核酸如DNA和RNA。舉例來說，給定的DNA序列(如基因)見于宿主細(xì)胞染色體上靠近相鄰基因之處；RNA序列例如編碼特定蛋白的特定mRNA序列作為與編碼眾多蛋白的眾多其它mRNA的混合物見于細(xì)胞之中。然而，編碼給定蛋白的分離的核酸包括例如通常表達(dá)所述給定蛋白的細(xì)胞之中所述核酸處于不同于天然細(xì)胞內(nèi)的染色體位置、或者以其它方式側(cè)接了與天然所見的不同的核酸序列的此種核酸。分離的核酸、寡核苷酸或多核苷酸可以單鏈或雙鏈的形式存在。當(dāng)分離的核酸、寡核苷酸或多核苷酸待用于表達(dá)蛋白時，所述寡核苷酸或多核苷酸將至少包含有義或編碼鏈(即所述寡核苷酸或多核苷酸可以是單鏈的)，但也可以包含有義和反義鏈兩者(即所述寡核苷酸或多核苷酸可以是雙鏈的)。
如本文所使用的，術(shù)語“純化的”或“純化”是指從樣品中除去組分(如污染物)。例如，抗體可通過除去污染的非免疫球蛋白類蛋白而純化；它們也可通過除去不與靶分子結(jié)合的免疫球蛋白而純化。非免疫球蛋白類蛋白的去除和/或不與靶分子結(jié)合的免疫球蛋白的去除導(dǎo)致樣品中靶-反應(yīng)性免疫球蛋白的百分比增大。在另一個實例中，重組多肽在細(xì)菌宿主細(xì)胞中表達(dá)，并且通過除去宿主細(xì)胞蛋白而純化所述多肽；由此提高樣品中重組多肽的百分比。
“氨基酸序列”以及術(shù)語如“多肽”或“蛋白”并不意味著將氨基酸序列限定于與所述蛋白分子有關(guān)的完整的天然氨基酸序列。
如本文所使用的，術(shù)語“天然蛋白”表示蛋白不含由載體序列編碼的氨基酸殘基；也就是說，天然蛋白僅含天然存在的蛋白中所見的那些氨基酸。天然蛋白可通過重組手段生產(chǎn)，或者可從天然來源中分離。
如本文所使用的，當(dāng)術(shù)語“部分”涉及蛋白(如同在“給定蛋白的一部分”中那樣)時，是指該蛋白的片段。所述片段大小可從四個氨基酸殘基到全部氨基酸序列減去一個氨基酸的范圍內(nèi)變化。
術(shù)語“DNA印跡”是指在瓊脂糖或丙烯酰胺凝膠上分析DNA，以根據(jù)大小分級分離DNA，接著將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持物例如硝酸纖維素或尼龍膜上。然后用標(biāo)記探針探測固定的DNA，以檢測與所用探針互補的DNA物質(zhì)。所述DNA可在電泳前由限制性酶切割。電泳后，所述DNA可在向固相支持物轉(zhuǎn)移之前或期間部分脫嘌呤和變性。DNA印跡是分子生物學(xué)家的標(biāo)準(zhǔn)工具(J.Sambrook等，MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，NY，pp9.31-9.58 )。
如文中所用的，術(shù)語“RNA印跡”是指通過瓊脂糖凝膠上的RNA電泳以根據(jù)大小分級分離RNA，接著將RNA從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持物例如硝酸纖維素或尼龍膜上的RNA分析。然后用標(biāo)記探針探測固定的RNA，以檢測與所用探針互補的RNA物質(zhì)。RNA印跡是分子生物學(xué)家的標(biāo)準(zhǔn)工具(J.Sambrook等，前文，pp 7.39-7.52 )。
術(shù)語“蛋白印跡”是指對固定于支持物如硝酸纖維素或膜上的蛋白(或多肽)的分析。將蛋白在丙烯酰胺凝膠上電泳以分離所述蛋白，接著將蛋白從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持物例如硝酸纖維素或尼龍膜上。然后將固定的蛋白暴露于具有針對目的抗原的反應(yīng)性的抗體?？贵w的結(jié)合可通過多種方法檢測，包括使用放射標(biāo)記的抗體。
如本文所使用的，術(shù)語“細(xì)胞培養(yǎng)物“是指細(xì)胞的任何體外培養(yǎng)物。該術(shù)語包含連續(xù)傳代細(xì)胞系(如具有永生表型)、原代細(xì)胞培養(yǎng)物、轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系、有限細(xì)胞系(如未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞)、以及體外維持的任何其它細(xì)胞群。
如本文所使用的，術(shù)語“真核細(xì)胞”是指有別于“原核細(xì)胞”的生物體。該術(shù)語旨在涵蓋具有表現(xiàn)出真核細(xì)胞的常見特征的所有生物體，所述特征包括例如存在由核膜包繞的真正的細(xì)胞核(其內(nèi)存有染色體)、存在膜包繞的細(xì)胞器、以及在真核生物體中通常觀察到的其它特征。因而，該術(shù)語包括但不限于諸如真菌、原生動物及動物(如人)的生物體。
如本文所使用的，術(shù)語“在體外”是指人工環(huán)境以及在人工環(huán)境中發(fā)生的過程或反應(yīng)。體外環(huán)境可包括但不限于試管和細(xì)胞培養(yǎng)物。術(shù)語“在體內(nèi)”是指天然環(huán)境(如動物或細(xì)胞)以及在天然環(huán)境內(nèi)發(fā)生的過程或反應(yīng)。
術(shù)語“測試化合物”以及“候選化合物”是指用于治療或預(yù)防疾病、病患、不適、或身體機能紊亂(如結(jié)節(jié)性硬化癥)的候選物的任何化學(xué)實體、試劑、藥物等。測試化合物包括已知的和潛在的治療化合物兩者。測試化合物可通過使用本發(fā)明的篩選方法篩選而判定為治療劑。在本發(fā)明的有些實施方案中，測試化合物包括反義化合物。
如本文所使用的，術(shù)語“樣品”以其最廣泛的意義使用。在一種意義上，它意味著包括由任何來源獲得的樣本或培養(yǎng)物，以及生物學(xué)和環(huán)境樣品。生物學(xué)樣品可從動物(包括人)獲得，并且涵蓋體液(如血液或尿液)、固體、組織和氣體。生物學(xué)樣品包括血液制品，例如血漿、血清等。環(huán)境樣品包括環(huán)境材料例如表面物質(zhì)、土壤、水、晶體和工業(yè)樣品。不過此類實例不應(yīng)解釋為限制適用于本發(fā)明的樣品類型。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于鑒定TSC信號傳導(dǎo)途徑中的異常的組合物和方法。特別地，本發(fā)明涉及診斷和治療諸如結(jié)節(jié)性硬化癥之類的病癥的方法，所述病癥是由TSC基因中的突變引起的。例如，在有些實施方案中，本發(fā)明提供了通過診斷由TSC1或TSC2基因中的突變引起的S6K激酶活性的增強而診斷結(jié)節(jié)性硬化癥的方法。在其它實施方案中，本發(fā)明提供了通過施用抑制S6K激酶活性的化合物(如雷帕霉素)治療結(jié)節(jié)性硬化癥的方法。本發(fā)明還涉及用于治療由TSC信號傳導(dǎo)紊亂介導(dǎo)的癌癥的方法和組合物。
I.TSC1和TSC2TSC1(也稱之為錯構(gòu)瘤蛋白(hamartin))編碼具有130,000(130K)相對分子量(Mr)的蛋白，它含有卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域，但沒有明顯的催化結(jié)構(gòu)域。TSC2(也稱之為抗結(jié)核菌素(tuberin))編碼200K的蛋白，它含有卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域和羧基末端區(qū)域，與Rap GTPase-激活蛋白(GAP)3享有同源性。TSC2對Rap和Rab5具有弱的GAP活性。在小鼠中，TSC1或TSC2的純合性失活都是胚胎致死性的，而雜合型動物傾向于長瘤(Onda等，J.Clin.Invest.104，687-695(1999)；Au等，Am.J.Hum.Genet.62，286-294(1998)；Kobayashi，T.等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 98，8762-8767(2001)；每一篇都特此并入作為參考)。在黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)中，dTsc1或dTsc2的失活都增加細(xì)胞大小和增殖，而dTsc1和dTsc2一起而非個別地過表達(dá)則降低細(xì)胞大小，表明Tsc1和Tsc2形成調(diào)節(jié)細(xì)胞生長的功能性復(fù)合體(Gao和Pan，Genes Dev.15，1383-1392(2001)；Ito等，Cell96，529-539(1999)；Potter等，Cell 105，357-368(2001)；Tapon等，Cell 105，345-355(2001)；每一篇都特此并入作為參考)。此外，遺傳分析顯示dTsc1和dTsc2在細(xì)胞生長的調(diào)節(jié)中在胰島素/胰島素樣生長因子(IGF)受體下游發(fā)揮作用(Gao和Pan，前文；Potter等，前文；Tapon等，前文)。已充分確認(rèn)了胰島素途徑的組分在細(xì)胞生長中很重要(Kozma等，Bioessays 24，65-71(2002)；Stocker和Hafen，Curr.Opin.Genet.Dev.10，529-535(2000)；每一篇都特此并入作為參考)。該途徑的成員包括正調(diào)節(jié)子胰島素受體(IR)、胰島素受體底物(IRS)、磷脂酰肌醇-3-OH激酶、(PI(3)K)、PDK-1、Akt、TOR、S6K和eIF4E(真核細(xì)胞起始因子4E)。這些正調(diào)節(jié)子的過表達(dá)將增加細(xì)胞大小和/或數(shù)目，而正調(diào)節(jié)子的減效或無義突變在果蠅中則降低細(xì)胞數(shù)目和大小(Weinkove和Leevers，Curr.Opin.Genet.Dev.10，75-80(2000)；特此并入作為參考)。在小鼠中，心臟中組成型活性的PI(3)K或Akt的過表達(dá)導(dǎo)致肥大(Shioi，T.等，EMBO J.19，2537-2548(2000)；Shioi，T.等，Mol.Cell.Biol.22，2799-2809(2002)；每一篇都特此并入作為參考)。缺失編碼IGF或者其受體(DeChiara等，Nature 345，78-80(1990)；Liu等，Cell 75，59-72(1993))IRSs20或S6K IRSS20或S6K的基因?qū)е滦∈蟀?Shima等，EMBO J.17，6649-6659(1998)；特此并入作為參考)，說明這些基因在細(xì)胞生長調(diào)控中的功能重要性。盡管TSC1和TSC2腫瘤抑制蛋白已證明參與調(diào)控增殖和細(xì)胞大小，TSC1-TSC2復(fù)合體在胰島素信號傳導(dǎo)途徑中的精確功能尚未被闡明，其作為腫瘤抑制物發(fā)揮作用的分子機制也未被闡明。
在人類腫瘤中有眾多的遺傳和外在變化會造成PI(3)K信號傳導(dǎo)的增強(Vogt，Trends Mol.Med.7，482-484(2001))。在人類中，胰島素/IGF信號傳導(dǎo)途徑中細(xì)胞生長的負(fù)調(diào)節(jié)子PTEN的突變，導(dǎo)致Akt、mTOR、S6K和eIF-4E的過度激活，并引起幾類腫瘤，包括錯構(gòu)瘤(Young和Povey，前文；Neshat等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 98，10314-10319(2001)；每一篇都特此并入作為參考)。在胰島素信號傳導(dǎo)的正組分中，mTOR對于通過S6K和4E-BP1的翻譯調(diào)控進(jìn)行細(xì)胞生長和增殖的調(diào)節(jié)是至關(guān)重要的(Schmelzle和Hall，Cell 103，253-262(2000)；特此并入作為參考)。S6K和4E-BP1的磷酸化介導(dǎo)了有絲分裂原和營養(yǎng)物信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)以刺激翻譯。編碼眾多核糖體蛋白和翻譯因子的mRNA含5′末端寡聚嘧啶串(TOP)。所述TOP序列應(yīng)答有絲分裂原刺激而賦予選擇性翻譯誘導(dǎo)。top mRNA的翻譯與S6K對40S核糖體S6蛋白的磷酸化作用相關(guān)(Shah等，Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.279，E715-E729(2000)；特此并入作為參考)。磷酸化不足的4E-BP1結(jié)合并抑制含CAP mRNA的e1F4E-依賴性翻譯(Shah等，前文)。這些e1F4E-調(diào)控的信息通常編碼參與增殖的蛋白，例如c-Myc和細(xì)胞周期蛋白D1(Sonenberg和Gingras，Curr.Opin.Cell Biol.10，268-275(1998)；特此并入作為參考)。S6K磷酸化的激活以及4E-BP1磷酸化的失活與PI(3)K-誘導(dǎo)的腫瘤形成相關(guān)(Neshat等，PNAS 98，10314(2001)；特此并入作為參考)。mTOR在腫瘤形成中的重要性得到了雷帕霉素抑制腫瘤生長的事實的支持(Podsypanina等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 98，10320-10325(2001)；特此并入作為參考)。
在本發(fā)明形成過程期間進(jìn)行的實驗(見實驗部分)證明了TSC1-TSC2抑制S6K和4E-BP1的磷酸化。數(shù)據(jù)顯示TSC1-TSC2通過mTOR發(fā)揮其調(diào)控S6K和4E-BP1活性的功效。進(jìn)一步的實驗證明TSC1-TSC2的功能應(yīng)答胰島素處理而受Akt-依賴性磷酸化的負(fù)調(diào)控，并且TSC2抑制S6K的活性與其腫瘤抑制功能相關(guān)。
哺乳動物細(xì)胞中的已有研究已證實，Akt能促進(jìn)S6K的活化(Aoki等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 98，136-141(2001)；Burgering等，Nature 376，599-602(1995)；每一篇都特此并入作為參考)。胰島素對Akt的活化或者組成型活性的Akt突變體的表達(dá)導(dǎo)致S6K磷酸化和激酶活性的增強。Akt對S6K的活化為一間接過程，并且可由mTOR介導(dǎo)(Scott等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 95，7772-7777(1998)；Sekulic，A.等，Cancer Res.60，3504-3513(2000)；每一篇都特此并入作為參考)。本發(fā)明并不局限于特定的機制。實際上，對于機制的理解并非實施本發(fā)明所必需的。盡管如此，認(rèn)為在本發(fā)明形成過程期間進(jìn)行的實驗提供了Akt調(diào)控S6K的可能機制。在該模型中，TSC1-TSC2在Akt下游和mTOR上游發(fā)揮功能以控制哺乳動物細(xì)胞中S6K和4E-BP1的活性(圖7f)。還認(rèn)為TSC1-TSC2的生理功能之一在于抑制S6K和4E-BP1的磷酸化，而它們是翻譯和細(xì)胞生長的關(guān)鍵調(diào)節(jié)子(Dufner和Thomas，Exp.Cell Res.253，100-109(1999)；特此并入作為參考)。TSC1-TSC2的這種活性對于其生理功能很重要，因為它受到疾病相關(guān)TSC2突變的損害(圖2c)。與此一致，已在TSC1無效細(xì)胞中觀察到S6K磷酸化作用的增強(Kwiatkowski等，Hum.Mol.Genet.11，525-534；特此并入作為參考)。目前尚無有關(guān)TSC1-TSC2的功能測定，不過，在有些實施方案中，本發(fā)明提供了有關(guān)S6K和4E-BP1磷酸化作用的抑制和增強的測定，這提供了簡單且相關(guān)的TSC1-TSC2功能測定。
果蠅中的遺傳研究調(diào)查了TSC1-TSC2在細(xì)胞生長調(diào)控中的功能。本發(fā)明并不局限于特定的機制。實際上，對于機制的理解并非實施本發(fā)明所必需的。盡管如此，認(rèn)為TSC1-TSC2參與了細(xì)胞大小和細(xì)胞生長的調(diào)節(jié)，并且TSC1-TSC2信號傳導(dǎo)途徑為抑制細(xì)胞生長提供了靶標(biāo)(如在癌癥中)。
在本發(fā)明形成過程期間進(jìn)行的研究顯示Akt能刺激mTOR，從而通過解除TSC1-TSC2的抑制而刺激S6K活性(圖7f)。果蠅中dS6K的激活需要dPDK1而不是dPI(3)K和dAkt46。然而，轉(zhuǎn)基因小鼠模型表明了Akt在S6K活化和細(xì)胞大小調(diào)節(jié)中的正面作用(Tuttle等，NatureMed.7，1133-1137(2001)；特此并入作為參考)。在本發(fā)明形成過程期間進(jìn)行的實驗表明Akt促進(jìn)S6K的活化。Akt對TSC2的磷酸化通過至少兩種機制影響其功能第一，磷酸化降低TSC2的活性；第二，磷酸化使得TSC2蛋白不穩(wěn)定。這種去穩(wěn)定化是通過破壞TSC1和TSC2之間復(fù)合體的形成并誘導(dǎo)游離TSC2的泛素化實現(xiàn)的。TSC1-TSC2介導(dǎo)的mTOR抑制的解阻遏是胰島素途徑中S6K激活的一種可能機制。在本發(fā)明形成過程期間進(jìn)行的實驗顯示了TSC1-TSC2是如何作為腫瘤遏制劑發(fā)揮功能而抑制細(xì)胞生長以及如何界定其在胰島素信號傳導(dǎo)中的角色的分子基礎(chǔ)。TSC1-TSC2的主要生理功能是抑制mTOR、S6K和4E-BP1活性。
Akt和mTOR在胰島素信號傳導(dǎo)中的作用很復(fù)雜。mTOR中的Ser2448已證明是Akt40的直接磷酸化靶標(biāo)。Ser 2448的磷酸化受胰島素刺激(Scott等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，7772-7777(1998)；特此并入作為參考)并與mTOR活性相關(guān)，但用丙氨酸取代Ser2448并不影響mTOR激活S6K42的能力，表明Akt在mTOR活化中的作用更為復(fù)雜。不過，這種突變是在雷帕霉素抗性mTOR突變體(含S2035I突變)中構(gòu)建的，該突變體對4E-BP1具有低活性(Reynolds等，J.Biol.Chem.277，17657-17662(2002)；特此并入作為參考)。因此，此結(jié)果不足以排除Ser2448磷酸化在mTOR功能中的重要性。實際上，最近的研究還證實了Ser2448磷酸化在mTOR活化中的正面作用(Reynolds等，前文)。mTOR中Ser2448的磷酸化由于氨基酸補充而增強，支持了Ser2448磷酸化在mTOR活化中的作用(Reynolds等，前文；Nave等，Biochem J.344，427-431(1999)；特此并入作為參考)。在本發(fā)明形成過程期間進(jìn)行的實驗發(fā)現(xiàn)mTOR中Ser2448的磷酸化因營養(yǎng)物剝奪而減弱，且因營養(yǎng)物刺激而增強。雷帕霉素對S6K的抑制是通過蛋白磷酸酶PP2A49介導(dǎo)的。雷帕霉素處理或氨基酸饑餓會激活針對S6K的PP2A-樣活性，并已檢測到PP2A和S6K之間的弱結(jié)合(Peterson等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 96，4438-4442(1999)；特此并入作為參考)。已經(jīng)確認(rèn)了mTOR在S6K活化中的正面功能。在本發(fā)明形成過程期間進(jìn)行的實驗顯示TSC1-TSC2抑制mTOR的激酶活性和磷酸化。
本發(fā)明并不局限于特定的機制。實際上，對于機制的理解并非實施本發(fā)明所必需的。盡管如此，認(rèn)為雷帕霉素衍生物及S6K的其它抑制劑可作為TSC及其它細(xì)胞生長紊亂(如癌癥)的治療試劑進(jìn)行應(yīng)用。
以前的研究指出，mTOR對S6K和4EBP1的磷酸化在翻譯調(diào)控中扮演著重要角色(Brown等，Nature 377441-446(1995)；Hara等，J.Biol.Chem.27314484-94(1998)；Shah等，Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.，279E715-729(2000))。TSC1或TSC2突變體細(xì)胞表現(xiàn)出S6K和4EBP1兩者提高的磷酸化作用(Goncharova等，J.Biol.Chem.27730958-30967(2002)；Kenerson等，Cancer Res.625645-5650(2002)；Kwiatkowski等，Hum.Mol.Gen.11525-534(2002)；Onda等，Mol.Cell Neurosci.21561-574(2002)。相反，TSC1和TSC2過表達(dá)抑制S6K和4EBP1的磷酸化(Goncharova等，2002；Inoki等，Nat.Cell Bio.4648-657(2002)；Tee等，Proc.Natl.Acad.Sci.9913571-13576(2002)。本發(fā)明并不局限于特定的機制。實際上，對于機制的理解并非實施本發(fā)明所必需的。盡管如此，認(rèn)為TSC1/TSC2的主要細(xì)胞功能之一在于通過抑制S6K和4EBP1的磷酸化而抑制翻譯。
翻譯速率受多個信號傳導(dǎo)途徑的調(diào)控，包括營養(yǎng)物的可獲得性、生長因子、胞內(nèi)ATP水平以及環(huán)境壓力(Browne和Proud，Eur.J.Biochem.2695360-5368(2002)；Proud，Eur.J.Biochem.2695338-5349(2002)。ATP耗盡可降低S6K和4EBP1的磷酸化并抑制翻譯。以前的研究提示mTOR可能介導(dǎo)ATP耗盡信號，因為mTOR對ATP具有毫摩爾級的Km，這與生理ATP水平相當(dāng)(Dennis等，Genes Dev.161472-1487(2001)。然而，正常細(xì)胞ATP水平在生理學(xué)能量饑餓的條件下并不顯著改變。相反，由于細(xì)胞ATP濃度比AMP濃度要高得多，ATP水平相對小的下降將導(dǎo)致AMP水平相對顯著的升高，這由5′AMP活化的蛋白激酶(AMPK)感知并刺激所述酶(Hardie等，Ann.Rev.Biochem.67821-855(1998)。D-葡萄糖類似物2-脫氧葡萄糖(2-DG)以及5-氨基咪唑-4-羧酰胺核糖核苷酸(AICAR)激活A(yù)MPK(Corton等，Eur.J.Biochem.229558-565(1995)。2-DG和AICAR已證明可增強真核延伸因子2(eEF2)的磷酸化作用，表明AMPK在翻譯中起著負(fù)面作用(Horman等，Curr.Bio.121419-1423(2002)。也已報道2-DG和AICAR兩者都抑制S6K活性(Kimura等，Genes Cells 865-79(2003)；Krause等，Eur.J.Biochem.2693751-3759(2002)。AMPK的S6K抑制機制似乎是通過mTOR途徑進(jìn)行的(Kimura等，2003)。
在本發(fā)明形成過程期間進(jìn)行的研究顯示TSC2受細(xì)胞能量水平的調(diào)控。能量饑餓對AMPK的激活導(dǎo)致TSC2在T1227和S1345處的直接磷酸化(圖12)。RNA干預(yù)對TSC2蛋白的破壞消除了ATP耗盡誘導(dǎo)的S6K脫磷酸化(圖10)。而且，TSC2-/-細(xì)胞應(yīng)答能量饑餓而表現(xiàn)出S6K脫磷酸化的缺陷型應(yīng)答(圖10)。此外，能量耗盡誘導(dǎo)的S6K脫磷酸化通過表達(dá)野生型TSC2而恢復(fù)，但在TSC2-/-細(xì)胞中的AMPK磷酸化突變體并不如此，證明了AMPK對TSC2的磷酸化在通過細(xì)胞能量饑餓進(jìn)行的翻譯調(diào)控中有重大功能(圖13)。
本發(fā)明并不局限于特定的機制。實際上，對于機制的理解并非實施本發(fā)明所必需的。盡管如此，認(rèn)為TSC2在保護細(xì)胞免于葡萄糖剝奪所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中扮演著至關(guān)重要的角色。TSC2的AMPK-依賴性磷酸化對于細(xì)胞能量應(yīng)答中TSC2的功能很重要，因為TSC2-/-細(xì)胞中野生型TSC2的表達(dá)而非AMPK磷酸化突變體的表達(dá)防止了葡萄糖剝奪所誘導(dǎo)的凋亡(圖13)。本發(fā)明并不局限于特定的機制。實際上，對于機制的理解并非實施本發(fā)明所必需的。盡管如此，認(rèn)為TSC2和AMPK磷酸化在細(xì)胞能量應(yīng)答中具有至關(guān)重要的作用。
II.診斷應(yīng)用在有些實施方案中，本發(fā)明提供了診斷TSC的方法。TSC的早期診斷允許及早干預(yù)。例如，可識別腫瘤并在它們造成傷害之前除去，并且可在較早的時間點開始藥物治療(如用本發(fā)明的藥物)。
在有些實施方案中，本發(fā)明提供了直接診斷TSC1或TSC2中的突變的方法。在其它實施方案中，本發(fā)明提供了間接診斷TSC1或TSC2中的突變的方法(如通過增強的S6K活性的診斷)。下文的說明提供了示例性的診斷篩選方法。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公認(rèn)可以使用替代性的診斷方法。
A.直接檢測在有些實施方案中，本發(fā)明提供了直接檢測TSC1或TSC2中的突變的方法。TSC1和TSC2中的突變一般是隨機的。多數(shù)突變導(dǎo)致移碼或者過早發(fā)生的終止密碼子。因而，在有些實施方案中，突變體TSC1或TSC2基因是截短的。
1.直接檢測在有些實施方案中，突變是通過TSC1或TSC2基因的DNA測序檢測的。在有些實施方案中，利用本領(lǐng)域眾所周知的自動化測序法。使用DNA測序檢測改變的TSC1或TSC2核酸序列(如含移碼或過早發(fā)生的終止密碼子)，從而診斷TSC。
2.截短的TSC1或TSC2蛋白的檢測在其它實施方案中，檢測的是截短的TSC1或TSC2蛋白?？墒褂萌魏魏线m的方法檢測截短的TSC1或TSC2蛋白。例如，在有些實施方案中，利用來自Ambergen有限公司(Boston，MA)的無細(xì)胞翻譯法。Ambergen有限公司已開發(fā)了用于標(biāo)記、檢測、定量、分析以及分離由無細(xì)胞或細(xì)胞翻譯系統(tǒng)產(chǎn)生的新生蛋白而無需使用放射性氨基酸或其它放射性標(biāo)記的方法。標(biāo)記被氨?；羣RNA分子上。潛在的標(biāo)記包括天然氨基酸、非天然氨基酸、氨基酸類似物或衍生物或者化學(xué)部分。這些標(biāo)記在翻譯過程期間從所得的誤氨?；痶RNA中被引入到新生蛋白之中。
Ambergen的蛋白標(biāo)記技術(shù)的一項應(yīng)用是無凝膠截短試驗(GFTT)測定(參見美國專利6,303,337，特此并入作為參考)。在有些實施方案中，利用這種測定篩選TSC1或TSC2蛋白中的截短突變。在GFTT測定中，標(biāo)記(如熒光團)在翻譯期間被引入到新生蛋白靠近蛋白的N-末端處。第二且不同的標(biāo)記(如具有不同發(fā)射波長的熒光團)被引入到新生蛋白靠近蛋白的C-末端處。然后從翻譯系統(tǒng)中分離蛋白并測量來自標(biāo)記的信號。來自N和C末端信號的測量值的比較提供了有關(guān)具有C-末端截短的分子的分?jǐn)?shù)的信息(即如果來自C-末端標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)化信號為來自N-末端標(biāo)記信號的50％，則50％的分子具有C-末端截短)。
又在另一個實施方案中，截短的蛋白通過抗體結(jié)合檢測。例如，在有些實施方案中，利用兩種抗體。設(shè)計一種抗體(參見下文抗體產(chǎn)生的說明)識別TSC1或TSC2的C-末端，而設(shè)計第二抗體識別TSC1或TSC2的N-末端。被N-末端而非C-末端抗體識別的蛋白是截短的。在有些實施方案中，使用定量免疫測定確定C-末端與N-末端抗體結(jié)合的比率。
抗體結(jié)合通過本領(lǐng)域公知的技術(shù)檢測(如放射性免疫測定、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)、“夾心”免疫測定、免疫放射測定、凝膠擴散沉淀反應(yīng)、免疫擴散測定、原位免疫測定(如使用膠體金、酶或者例如放射性同位素標(biāo)記)、蛋白印跡、沉淀反應(yīng)、凝集試驗(如凝膠凝集試驗、血細(xì)胞凝集試驗等)、補體結(jié)合試驗、免疫熒光測定、蛋白A試驗以及免疫電泳測定等。
在一個實施方案中，抗體結(jié)合通過檢測一抗上的標(biāo)記進(jìn)行檢測。在另一個實施方案中，一抗通過檢測二抗或試劑與一抗的結(jié)合進(jìn)行檢測。在另一實施方案中，二抗是標(biāo)記的。許多方法在本領(lǐng)域公知可用于在免疫測定中檢測結(jié)合，并且落在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
在有些實施方案中，利用自動化檢測分析。免疫測定自動化的方法包括美國專利5,885,530、4,981,785、6,159,750和5,358,691中所述的那些，每一篇都特此并入作為參考。在有些實施方案中，結(jié)果的分析和說明也被自動化。例如，在有些實施方案中，使用基于免疫測定結(jié)果產(chǎn)生預(yù)后的軟件。
在其它實施方案中，免疫測定描述在美國專利5,599,677和5,672,480之中，每一篇都特此并入作為參考。
B.間接檢測在其它實施方案中，TSC1或TSC2中的突變是間接檢測的。在本發(fā)明形成過程期間進(jìn)行的實驗證明，TSC1和TSC2能抑制S6K激酶活性(見實驗部分)。TSC1或TSC2中的突變會導(dǎo)致S6K激酶活性的增強。在有些實施方案中，S6K激酶活性的增強使用磷-S6K特異性抗體進(jìn)行分析(見圖1和2以及下文的實驗部分)。本發(fā)明并不局限于檢測S6K激酶活性的特定方法。可利用任何合適的方法，包括本領(lǐng)域公知的那些。
III.抗體本發(fā)明提供了分離的抗體或抗體片段(如FAB片段)。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了與包含本文公開的蛋白(如TSC1、TSC2、S6K、mTOR及Akt)的至少五個氨基酸殘基的分離多肽特異性結(jié)合的單克隆抗體或片段。這些抗體可應(yīng)用于本文中所述的診斷和藥物篩選方法中。
針對本發(fā)明蛋白的抗體可以是任何單克隆、多克隆或重組(如嵌合、人源化等)抗體，只要它能夠識別所述蛋白即可。通過使用本發(fā)明的蛋白作為抗原，根據(jù)常規(guī)的抗體或抗血清制備過程，可生產(chǎn)抗體。
本發(fā)明涵蓋單克隆、重組及多克隆抗體或其片段的應(yīng)用?？墒褂萌魏魏线m的方法產(chǎn)生在本發(fā)明的方法和組合物之中使用的抗體，包括但不限于文中所公開的那些。例如，為制備單克隆抗體，在允許產(chǎn)生抗體的條件下向動物(如哺乳動物)給予蛋白本身或者連同合適的載體或稀釋劑一起給予蛋白。為增強抗體生產(chǎn)能力，可給予完全或不完全弗氏佐劑。通常地，蛋白每2周到6周給予一次，總計約2次到約10次。適用于此類方法的動物包括但不限于靈長類動物、兔、狗、豚鼠、小鼠、大鼠、綿羊、山羊等。
為制備單克隆抗體生產(chǎn)細(xì)胞，選擇其抗體效價已得到證實的個體動物(如小鼠)，并且在末次免疫2天到5天后收集其脾臟或淋巴結(jié)，并使其中所含的抗體生產(chǎn)細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞相融合，以制備期望的單克隆抗體生產(chǎn)者雜交瘤。例如，可如下文所述通過使標(biāo)記蛋白與抗血清反應(yīng)，然后測量與抗體結(jié)合的標(biāo)記試劑的活性，進(jìn)行抗血清中抗體效價的測量。細(xì)胞融合可根據(jù)已知的方法進(jìn)行，例如Koehler和Milstein所描述的方法(Nature 256495 ；特此并入作為參考)。作為融合促進(jìn)劑，可使用例如聚乙二醇(PEG)或仙臺病毒(HVJ)，優(yōu)選PEG。
骨髓瘤細(xì)胞的實例包括NS-1、P3U1、SP2/0、AP-1等?？贵w生產(chǎn)細(xì)胞(脾細(xì)胞)數(shù)目與待用骨髓瘤細(xì)胞數(shù)目的比例優(yōu)選為約1∶1到約20∶1。PEG(優(yōu)選PEG 1000-PEG 6000)優(yōu)選以約10％到約80％的濃度添加。通過于約20℃到約40℃、優(yōu)選約30℃到約37℃，將兩種細(xì)胞的混合物溫育約1分鐘至10分鐘，可有效地進(jìn)行細(xì)胞融合。
可使用多種方法以篩選產(chǎn)生抗體(如針對本發(fā)明的蛋白)的雜交瘤。例如，將雜交瘤上清添加到抗體直接地或者連同載體吸附在其上的固相(如微板)上，然后添加抗-免疫球蛋白抗體(如果細(xì)胞融合中使用的是小鼠細(xì)胞，則使用抗-小鼠免疫球蛋白抗體)或者由放射性物質(zhì)或酶標(biāo)記的蛋白A，以檢測針對結(jié)合在固相上的蛋白的單克隆抗體。備選地，將雜交瘤上清添加到其上吸附了抗-免疫球蛋白抗體或蛋白A的固相上，然后添加由放射性物質(zhì)或酶標(biāo)記的蛋白，以檢測針對結(jié)合在固相上的蛋白的單克隆抗體。
單克隆抗體的選擇可依據(jù)任何已知的方法或其修飾型進(jìn)行。通常地，采用其中添加了HAT(次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷)的動物細(xì)胞培養(yǎng)基?？刹捎萌魏芜x擇和生長培養(yǎng)基，只要雜交瘤能夠生長即可。例如，可使用含1％到20％、優(yōu)選10％到20％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基、含1％到10％胎牛血清的GIT培養(yǎng)基、用于雜交瘤培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基(SFM-101，Nissui Seiyaku)等。通常地，培養(yǎng)在約5％CO2氣體下于20℃到40℃、優(yōu)選37℃進(jìn)行約5天到3周、優(yōu)選1周到2周。雜交瘤培養(yǎng)物上清的抗體效價可按照與如上針對抗血清中抗-蛋白的抗體效價所述相同的方式測量。
單克隆抗體(如針對本發(fā)明的多肽)的分離和純化可根據(jù)與常規(guī)多克隆抗體相同的方式進(jìn)行，例如免疫球蛋白的分離和純化，例如鹽析、乙醇沉淀、等電點沉淀、電泳、離子交換劑(如DEAE)的吸附以及解吸附、超速離心、凝膠過濾、或者其中由活性吸附劑如結(jié)合抗原的固相、蛋白A或蛋白G僅收集一種抗體、并使結(jié)合解離以獲得抗體的特殊純化方法。
在其它實施方案中，本發(fā)明考慮針對本發(fā)明蛋白的重組抗體或其片段。重組抗體包括但不限于人源化及嵌合抗體。產(chǎn)生重組抗體的方法是本領(lǐng)域公知的(參見美國專利6,180,370和6,277,969以及″Monoclonal Antibodies″H.Zola，BIOS Scientific PublishersLimited 2000.Springer-Verlay New York，Inc.，New York；每一篇都特此并入作為參考)。
多克隆抗體可通過任何已知的方法或者這些方法的改動形式進(jìn)行制備，包括從患者獲得抗體。例如，制備免疫原(針對蛋白的抗原)和載體蛋白的復(fù)合物，然后根據(jù)針對上文單克隆抗體制備所述相同的方式用所述復(fù)合物免疫動物。從免疫動物中回收含有所針對的抗體的物質(zhì)，并分離和純化所述抗體。
關(guān)于待用來免疫動物的免疫原和載體蛋白的復(fù)合物，可采用任何載體蛋白以及載體和半抗原的任意混合比例，只要針對在載體上交聯(lián)并用于免疫的半抗原的抗體有效產(chǎn)生即可。例如，可以每1份半抗原應(yīng)用約0.1份到約20份、優(yōu)選約1份到約5份的重量比率，將牛血清白蛋白、牛環(huán)球蛋白(cycloglobulin)、匙孔血藍(lán)蛋白等與半抗原偶聯(lián)。
另外，多種縮合劑可用于半抗原和載體的偶聯(lián)。例如，戊二醛、碳化二亞胺、馬來酰亞胺活化酯、含巰基或二硫基吡啶基的活化酯試劑等可應(yīng)用于本發(fā)明中。向允許抗體生產(chǎn)的動物位點給予縮合產(chǎn)物本身或?qū)⑵溥B同合適的載體或稀釋劑一起給予。為增強抗體生產(chǎn)能力，可給予完全或不完全弗氏佐劑。通常地，將蛋白以每2周到6周給予一次，總計約3次到約10次。
從由上述方法免疫的動物的血液、腹水等回收多克隆抗體?？寡逯械目贵w效價可根據(jù)上文針對雜交瘤培養(yǎng)物上清所述相同的方式測量?？贵w的分離和純化可根據(jù)針對上文單克隆抗體所述相同的免疫球蛋白分離和純化方法進(jìn)行。
本文中用作為免疫原的蛋白不限于任何特定類型的免疫原。例如，本發(fā)明的多肽(還包括核苷酸序列部分改變的基因)可用作為免疫原。此外，可使用蛋白片段。片段可通過任何方法獲得，包括但不限于表達(dá)所述基因的片段、蛋白的酶促加工、化學(xué)合成等。
IV.藥物篩選在有些實施方案中，本發(fā)明提供了篩選測定(如篩選抑制S6K的激酶活性的藥物)。本發(fā)明提供了體外(如在細(xì)胞培養(yǎng)物中)和體內(nèi)(如在TSC動物模型中)篩選任何數(shù)目的候選治療化合物的測定。
A.候選化合物本發(fā)明的藥物篩選方法使用可用于TSC治療的任何數(shù)目的候選化合物。在有些實施方案中，候選化合物為雷帕霉素或雷帕霉素衍生物。雷帕霉素為抗真菌抗生素，其可自鏈霉菌如吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)中提取。用于制備雷帕霉素的方法在Sehgal等的美國專利號3,929,992和3,993,749中公開，每一篇都特此并入作為參考。另外，雷帕霉素的單?；投；苌锛捌渲苽浞椒ㄔ诿绹鴮＠?,316,885中公開，特此并入作為參考。美國專利號4,650,803(特此并入作為參考)公開了雷帕霉素的水溶性前藥，即雷帕霉素衍生物，包括如下雷帕霉素前藥甘氨酸鹽(酯)前藥、丙酸鹽(酯)前藥以及吡咯烷丁酸鹽(酯)前藥。美國專利號5,118,678(特此并入作為參考)公開了雷帕霉素的氨基甲酸鹽(酯)。美國專利號5,100,883(特此并入作為參考)公開了雷帕霉素的氟化酯。美國專利號5,118,677(特此并入作為參考)公開了雷帕霉素的酰胺酯。美國專利號5,130,307(特此并入作為參考)公開了雷帕霉素的氨基酯。美國專利號5,117,203(特此并入作為參考)公開了雷帕霉素的磺酸鹽(酯)以及氨基磺酸鹽(酯)。美國專利號5,194,447(特此并入作為參考)公開了雷帕霉素的磺酰氨基甲酸鹽(酯)。
本發(fā)明的藥物篩選方法不限于雷帕霉素?？墒褂萌魏螖?shù)目的候選化合物。在有些實施方案中，對商業(yè)上可獲得的或者已知的候選化合物文庫進(jìn)行篩選。組合化學(xué)文庫的制備和篩選是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員眾所周知的。此類組合化學(xué)文庫包括但不限于肽文庫(參見美國準(zhǔn)里No.5,010,175、Furka，Int.J.Pept.Prot.Res.37487-493(1991)以及Houghton等，Nature 35484-88(1991)；每一篇都特此并入作為參考)。也可以使用產(chǎn)生化學(xué)多樣性文庫的其它化學(xué)組成。此類化學(xué)組成包括但不限于類肽(peptoid)(PCT公開號WO 91/19735；特此并入作為參考)、編碼肽(PCT公開號WO93/20242；特此并入作為參考)、隨機生物寡聚體(PCT公開號WO92/00091；特此并入作為參考)、苯并二氮雜(美國專利號5,288,514；特此并入作為參考)、多構(gòu)體(diversomers)例如乙內(nèi)酰脲、苯并二氮雜和二肽(Hobbs等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 906909-6913(1993)；每一篇都特此并入作為參考)、類乙烯基(vinylogous)多肽(Hagihara等，J.Amer.Chem.Soc.1146568(1992)；特此并入作為參考)、具有β-D-葡萄糖骨架的非肽酰肽模擬物(Hirschmann等，J.Amer.Chem.Soc.1149217-9218(1992)；特此并入作為參考)、模擬有機合成的小化合物文庫(Chen等，J.Amer.Chem.Soc.1162661(1994)；特此并入作為參考)、低聚氨基甲酸鹽(酯)(Cho等，Science 2611303(1993)；特此并入作為參考)、和/或肽酰膦酸鹽(酯)(Campbell等，J.Org.Chem.59658(1994)；特此并入作為參考)、核酸文庫(見Ausubel、Berger及Sambrook，均見前文)、肽核酸文庫(參見美國專利號5,539,083；特此并入作為參考)、抗體文庫(參見Vaughn等，NatureBiotechnology，14(3)309-314(1996)以及PCT/US96/10287；每一篇都特此并入作為參考)、碳水化合物文庫(參見Liang等，Science，2741520-1522(1996)以及美國專利號5,593,853；每一篇都特此并入作為參考)、小有機分子文庫(參見苯并二氮雜，Baum C&EN，January18，page 33(1993)；類異戊二烯，美國專利號5,569,588；噻唑烷酮及間胺苯硫酮(metathiazanones)，美國專利號5,549,974；吡咯烷類，美國專利號5,525,735和5,519,134；嗎啉代化合物，美國專利No.5,506,337；苯并二氮雜，美國專利號5,288,514等；每一篇都特此并入作為參考。
在其它實施方案中，化合物文庫為空間上可尋址的并行固相或液相文庫；要求去卷積的合成文庫法；“一珠一化合物”的文庫法；以及使用親合層析選擇的合成文庫法。生物學(xué)文庫和類肽文庫途徑優(yōu)選用于肽文庫；而其它四種途徑適用于肽、非肽寡聚體或小分子化合物文庫(Lam(1997)Anticancer Drug Des.12145；特此并入作為參考)。
合成分子文庫的實例可見于現(xiàn)有技術(shù)，例如在DeWitt等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.906909 ；Erb等，Proc.Nad.Acad.Sci.USA 9111422 ；Zuckermann等，J.Med.Chem.372678 ；Cho等，Science 2611303 ；Carrell等，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33.2059 ；Carell等，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332061 以及Gallop等，J.Med.Chem.371233 之中。每一篇都特此并入作為參考。
化合物文庫可存在于溶液中(如Houghten，Biotechniques 13412-421 ；特此并入作為參考)、或者珠子(Lam，Nature35482-84 )、芯片(Fodor，Nature 364555-556 ；每一篇都特此并入作為參考)、細(xì)菌或芽孢(美國專利號5,223,409；特此并入作為參考)、質(zhì)粒上(Cull等，Proc.Nad.Acad.Sci.USA8918651869 ；特此并入作為參考)或者噬菌體上(Scott和Smith，Science 249386-390 ；Devlin Science 249404-406 ；Cwirla等，Proc.Natl.Acad.Sci.876378-6382 ；Felici，J.Mol.Biol.222301 ；每一篇都特此并入作為參考)。
B.體外藥物篩選在有些實施方案中，本發(fā)明提供了體外藥物篩選測定。在有些實施方案中，所述體外藥物篩選測定為細(xì)胞培養(yǎng)物測定。在一個實施方案中，所述測定是基于細(xì)胞的測定，其中表達(dá)突變體TSC1或TSC2的細(xì)胞與測試化合物相接觸，并確定測試化合物調(diào)整S6K活性的能力。確定測試化合物調(diào)整S6K活性的能力可使用任何合適的方法實現(xiàn)，包括但不限于文中所公開的那些。例如，所述細(xì)胞可以是哺乳動物來源的。
在其它實施方案中，提供了無細(xì)胞測定法，其中S6K或mTOR蛋白或其生物學(xué)活性部分與測試化合物相接觸，并評價測試化合物改變S6K激酶活性或mTOR活性的能力。無細(xì)胞測定法包括在足以允許兩組分相互作用和結(jié)合的條件和時間下，制備靶基因蛋白和測試化合物的反應(yīng)混合物，從而形成可以取出和/或檢測的復(fù)合物。
在更進(jìn)一步的實施方案中，細(xì)胞系(如嚙齒動物或人類細(xì)胞系如TSC2-/-細(xì)胞系(如LexF2細(xì)胞))用候選化合物處理，并評價這些細(xì)胞系在裸鼠中誘導(dǎo)腫瘤的能力(參見美國專利6,235,873，特此并入作為參考)。例如，在有些實施方案中，將用候選化合物處理過的細(xì)胞系誘導(dǎo)腫瘤的能力與未用候選化合物處理的對照細(xì)胞系的能力進(jìn)行比較。
C.體內(nèi)藥物篩選在其它實施方案中，使用了體內(nèi)藥物篩選方法。在有些實施方案中，使用作為TSC動物模型的Ecker大鼠(可獲自如Fox Chase CancerCenter，Philadelphia，PA)。在其它實施方案中，使用TSC小鼠模型(參見Kwiatkowski等，Hum Mol Genet 2002 Mar 1；11(5)525-34；特此并入作為參考)。向動物模型給予候選化合物，并觀察候選化合物對TSC癥狀的影響。優(yōu)選的化合物是可減輕或消除TSC癥狀但不對動物造成其它不利影響的那些化合物。還利用動物模型(例如文中所述的那些)確定用此種試劑進(jìn)行的治療的效力、毒性、副作用或作用機制。此外，通過上文所述的篩選測定法鑒定到的新試劑可以例如用于如本文所述的治療中。
V.療法在有些實施方案中，本發(fā)明提供了用于治療TSC的療法。在其它實施方案中，本發(fā)明提供了用于治療癌癥的療法。
A.TSC療法在有些實施方案中，本發(fā)明提供了治療TSC的方法。在有些實施方案中，該方法包括施用S6K或mTOR抑制劑(如在上文所述藥物篩選測定中鑒定的化合物)。在有些實施方案中，治療包括施用雷帕霉素或雷帕霉素衍生物或者利用上文所述藥物篩選方法鑒定的其它治療性化合物。在另一些實施方案中，所述TSC療法包括遺傳療法(如基因治療)。在更進(jìn)一步的實施方案中，所述治療包括抗體治療(如人源化抗體治療)。
1.藥物療法在有些實施方案中，利用上文所述藥物篩選方法鑒定的小分子治療劑被用作TSC治療劑?；衔飪?yōu)選配制為藥物化合物(例如，如下文所述)。劑量使用例如下文所述方法確定。相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域熟練技術(shù)人員熟知如何配制、確定劑量和施用本發(fā)明的治療化合物。
2.遺傳療法本發(fā)明考慮使用任何遺傳操作以調(diào)整TSC1和TSC2的表達(dá)。例如，在有些實施方案中，遺傳療法包括向受試者給予野生型形式的TSC1或TSC2。在體外或體內(nèi)向細(xì)胞遞送核酸構(gòu)建體可利用任何合適的方法進(jìn)行。合適的方法是將核酸構(gòu)建體引入到細(xì)胞中從而期望的事件得以發(fā)生(如野生型TSC1或TSC2基因的表達(dá))的方法。
向細(xì)胞中引入攜帶遺傳信息的分子可通過多種方法中的任一種實現(xiàn)，包括但不限于直接注射裸DNA構(gòu)建體、用載有所述構(gòu)建體的膠體金顆粒轟擊、以及使用例如脂質(zhì)體、生物聚合物等高分子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。優(yōu)選的方法使用衍生自病毒的基因遞送載體，包括但不限于腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、痘苗病毒以及腺伴隨病毒。因為與逆轉(zhuǎn)錄病毒相比效率更高，衍生自腺病毒的載體是優(yōu)選的用于將核酸分子體內(nèi)轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中的基因遞送載體。腺病毒載體已證明能提供極為有效的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移到動物模型的多種實體瘤內(nèi)以及免疫缺陷小鼠的人實體瘤異體移植物中。腺病毒載體以及基因轉(zhuǎn)移方法的實例描述在PCT公開WO 00/12738和WO 00/09675以及美國專利申請?zhí)朜o.6,033,908、6,019,978、6,001,557、5,994,132、5,994,128、5,994,106、5,981,225、5,885,808、5,872,154、5,830,730和5,824,544中，每一篇都特此全文并入作為參考。
載體可以多種方法給予受試者。例如，在本發(fā)明的有些實施方案中，利用直接注射向腫瘤或與腫瘤有關(guān)的組織中給予載體。在其它實施方案中，施用是經(jīng)由血液或淋巴循環(huán)(參見PCT公開99/02685，特此全文并入作為參考)。腺病毒載體示例性的劑量水平優(yōu)選為向灌注液中添加108到1011個載體顆粒。
3.抗體療法在有些實施方案中，本發(fā)明提供了利用抗體療法抑制S6K或mTOR的方法。優(yōu)選的抗體是減輕TSC癥狀(如通過抑制S6K或mTOR的信號傳導(dǎo)功能)的那些抗體。優(yōu)選的針對S6K的抗體是抑制S6K的激酶活性的抗體。任何合適的抗體(如單克隆、多克隆或合成的)可用在本文所公開的治療方法中。在優(yōu)選的實施方案中，用于癌癥治療的抗體為人源化抗體。人源化抗體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的(參見上文的描述以及美國專利6,180,370、5,585,089、6,054,297和5,565,332；每一篇都特此并入作為參考)。在優(yōu)選的實施方案中，將基于抗體的治療劑如下文所述配制為藥物組合物。
B.癌癥療法本發(fā)明并不局限于TSC的治療。如上文所述，還認(rèn)為雷帕霉素及雷帕霉素衍生物(如上文所描述的那些)可用于多種癌癥的治療中。雷帕霉素及衍生物可利用任何合適的篩選方法(如上文所描述的那些)就其降低腫瘤生長的能力進(jìn)行篩選。例如，在有些實施方案中，癌癥動物模型用雷帕霉素治療。在其它實施方案中，具有腫瘤的裸鼠或腫瘤細(xì)胞系被用于藥物篩選。本發(fā)明并不局限于雷帕霉素作為癌癥治療劑的用途。如上文所述，認(rèn)為抑制mTOR和S6K信號傳導(dǎo)的化合物可作為癌癥治療劑得到應(yīng)用。
C.藥物組合物本發(fā)明還提供了藥物組合物(如，包括上文所述的藥物化合物)。本發(fā)明的藥物組合物可以許多方式施用，取決于是否期望局部或全身治療以及待治療的區(qū)域。施用可以是局部(包括眼部以及粘膜施用，包括陰道和直腸遞送)、肺部(如通過粉劑或氣溶膠的吸入或吹入，包括通過噴霧器；氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、表皮和經(jīng)皮)、口服或腸胃外。腸胃外施用包括靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)注射或輸注；或者顱內(nèi)，如鞘內(nèi)或心室內(nèi)施用。
用于局部施用的藥物組合物和試劑可包括經(jīng)皮貼片、膏劑、洗液、霜劑、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧、液體及粉劑。常規(guī)的藥學(xué)載體、水性、粉末或油基(oily bases)、增稠劑等可能是期望的。
用于口服施用的組合物和制劑包括粉劑或顆粒、懸液或者水或非水介質(zhì)中的溶液、膠囊、囊劑或片劑?？赡苄枰龀韯⒄{(diào)味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或者粘合劑。
用于腸胃外、鞘內(nèi)或心室內(nèi)施用的組合物和制劑可包括無菌水溶液，其可能也含緩沖劑、稀釋劑及其它合適的添加劑，例如但不限于滲透增強劑、載體化合物及其它藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
本發(fā)明的藥物組合物包括但不限于溶液、乳劑以及含脂質(zhì)體的制劑。這些組合物可由多種組分產(chǎn)生，包括但不限于預(yù)形成的液體、自乳化的固體以及自乳化的半固體。
本發(fā)明的藥物制劑可方便地以單位劑量的形式存在，可通過制藥業(yè)中眾所周知的常規(guī)技術(shù)制備。此類技術(shù)包括使活性成分與藥學(xué)載體或賦形劑進(jìn)行結(jié)合的步驟。通常制劑通過均一和緊密地使活性成分與液體載體或者精細(xì)分開的固體載體或兩者兼而有之進(jìn)行結(jié)合來制備，然后如有必要，對產(chǎn)品塑形。
本發(fā)明的組合物可配制為許多可能的劑型中的任一種，例如但不限于片劑、膠囊、液體糖漿、軟凝膠、栓劑和灌腸劑。本發(fā)明的組合物也可以配制為處于水性、非水性或混合介質(zhì)中的懸液。水性懸液還可以含有提高懸液粘度的物質(zhì)，例如包括羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇和/或葡聚糖。懸液也可以含有穩(wěn)定劑。
在本發(fā)明的一個實施方案中，藥物組合物可作為泡沫配制和使用。藥物泡沫包括諸如但不限于乳劑、微乳劑、霜劑、果凍和脂質(zhì)體等的制劑。盡管在性質(zhì)上基本上相似，這些制劑在組分以及成品的一致性方面變化不等。
在細(xì)胞水平促進(jìn)寡核苷酸攝入的試劑也可以添加到本發(fā)明的藥物及其它組合物中。例如，陽離子脂質(zhì)如脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑(lipofectin)(美國專利號5,705,188)、陽離子甘油衍生物、以及多聚陽離子分子如多聚賴氨酸(WO97/30731)，也促進(jìn)寡核苷酸的細(xì)胞攝入。
本發(fā)明的組合物可以另外含有常見于藥物組合物之中的其它佐劑組分。從而，例如，組合物可以含有附加的、相容的藥學(xué)活性物質(zhì)，例如象止癢劑、收斂劑、局部麻醉劑或抗炎因子，或者可以含有用于在物理學(xué)上配制本發(fā)明組合物的各種劑型的附加物質(zhì)，例如染料、調(diào)味劑、防腐劑、抗氧化劑、遮光劑、增稠劑和穩(wěn)定劑。不過，此類物質(zhì)在加入時，不應(yīng)當(dāng)過度地干擾本發(fā)明組合物組分的生物學(xué)活性。制劑可以被滅菌，并且如果期望，可與輔劑混合，如潤滑劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、濕潤劑、乳化劑、用于影響滲透壓的鹽、緩沖劑、顏料、調(diào)味料和/或芳香物質(zhì)等，它們并不會有害地與制劑的核酸相互作用。
本發(fā)明的有些實施方案提供了含有(a)一種或多種本發(fā)明的化合物和(b)一種或多種其它化療劑的藥物組合物。此類化療劑的實例包括但不限于抗癌藥物例如柔紅霉素、放線菌素、阿霉素、博來霉素、絲裂霉素、氮芥、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、環(huán)磷酰胺、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷(CA)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、氟脫氧尿苷(5-FUdR)、氨甲蝶呤(MTX)、秋水仙堿、長春新堿、長春堿、依托泊甙、替尼泊苷(teniposide)、順鉑及乙烯雌酚(DES)?？寡姿?，包括但不限于非甾體類抗炎藥和皮質(zhì)類固醇，以及抗病毒藥物，包括但不限于利巴韋林、阿糖腺苷、阿昔洛韋和更昔洛韋，也可以組合到本發(fā)明的組合物中。其它化療劑也落在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。兩種或多種組合的化合物可一起或者相繼使用。
給藥取決于待治療疾病狀態(tài)的嚴(yán)重度和反應(yīng)性，療程從數(shù)天持續(xù)到數(shù)月，或者直到實現(xiàn)了治愈或者達(dá)到了疾病狀態(tài)的減輕。最佳給藥日程可根據(jù)患者體內(nèi)藥物累積的測量值計算。施用醫(yī)師能夠容易地確定最佳劑量、給藥方法及重復(fù)頻率。最佳劑量可根據(jù)個別寡核苷酸的相對效力而變，并且一般可根據(jù)發(fā)現(xiàn)在體外及體內(nèi)動物模型中有效的EC50或者根據(jù)本文所描述的實施例予以估計。一般而言，劑量為每kg體重0.01μg到100g，并且可以每日、每周、每月或每年給予一次或多次。治療醫(yī)師能夠根據(jù)測量的體液或組織中藥物的殘留時間及濃度估計施用的重復(fù)頻率。在成功治療之后，可能期望對受試者進(jìn)行維持治療以防止病態(tài)的復(fù)發(fā)，其中的寡核苷酸以維持劑量給藥，每kg體重從0.01μg到100g的范圍內(nèi)變化，從每日一次或多次到每20年一次。
VI.討論蛋白合成是受廣泛系列的胞內(nèi)和胞外條件如促有絲分裂生長因子、氨基酸濃度以及細(xì)胞能量水平調(diào)控的主要細(xì)胞過程(Schmidt，Oncogene 182988-2996(1999)。主要的翻譯控制之一是由mTOR對S6K和4EBP1的磷酸化介導(dǎo)的(Proud，2002)。在本發(fā)明形成的過程期間進(jìn)行的研究證明了TSC2響應(yīng)于細(xì)胞能量水平而中起著主要的生理作用(圖7G)。本發(fā)明并不局限于特定的機制。實際上，對于機制的理解并非實施本發(fā)明所必需的。盡管如此，認(rèn)為Akt對TSC2的磷酸化傳遞生長因子信號并阻抑了TSC2抑制S6K和4EBP1磷酸化的能力。相反，由低細(xì)胞能量水平發(fā)動的AMPK對TSC2的磷酸化刺激了TSC2活性。這些結(jié)果證明了TSC2的AMPK-依賴性磷酸化是ATP耗盡誘導(dǎo)的S6K脫磷酸化所必需的。
蛋白合成使用約25-30％的總細(xì)胞能量，因此必需與細(xì)胞能量狀態(tài)密切協(xié)調(diào)。翻譯抑制可能代表了能量限制條件下細(xì)胞中主要的生理應(yīng)答。本發(fā)明并不局限于特定的機制。實際上，對于機制的理解并非實施本發(fā)明所必需的。盡管如此，在圖7G中還是提出了一種機制?；趫D7G中所示的模型，mTOR處于TSC1/TSC2下游的能量感測途徑中。不過，AMPK很可能是細(xì)胞能量感受器，并在TSC1/TSC2上游發(fā)揮功能。AMPK可通過至少兩種機制抑制翻譯，一種是通過真核細(xì)胞延伸因子2(eEF2)的磷酸化(Horman等，2002)，而另一種是通過TSC2的磷酸化。不過，AMPK對eEF2的磷酸化并不依賴于TSC-mTOR途徑。本發(fā)明并不局限于特定的機制。實際上，對于機制的理解并非實施本發(fā)明所必需的。盡管如此，認(rèn)為AMPK的激活通過響應(yīng)于能量饑餓和低代謝狀況而阻抑包括S6K、4EBP1和eEF2在內(nèi)的多個翻譯調(diào)節(jié)子的功能在蛋白合成的抑制中起著主要作用。TSC2是AMPK的關(guān)鍵下游靶標(biāo)。
葡萄糖剝奪在TSC2-/-LEF細(xì)胞中誘導(dǎo)大規(guī)模的細(xì)胞凋亡。野生型TSC2的表達(dá)徹底阻斷了細(xì)胞凋亡，而TSC2-3A突變體的表達(dá)則不能保護細(xì)胞免于細(xì)胞凋亡。而且，TSC2僅保護免于葡萄糖剝奪所致的影響，而不保護免于DNA損傷所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。本發(fā)明并不局限于特定的機制。實際上，對于機制的理解并非實施本發(fā)明所必需的。盡管如此，認(rèn)為TSC2在細(xì)胞能量應(yīng)答中起著至關(guān)重要并且是特定的作用。TSC2在細(xì)胞能量應(yīng)答中的功能還得到了因葡萄糖剝奪或2-DG處理所致的能量限制也降低細(xì)胞大小這一事實的支持。另外，TSC2表達(dá)也降低細(xì)胞大小。本發(fā)明并不局限于特定的機制。實際上，對于機制的理解并非實施本發(fā)明所必需的。盡管如此，認(rèn)為能量限制和TSC2類似地調(diào)控培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞的大小。本研究也確立了AMPK對TSC2的磷酸化在針對細(xì)胞能量限制的生理應(yīng)答中的重要性。認(rèn)為AMPK-依賴性磷酸化對TSC2的激活導(dǎo)致了蛋白合成的下降和細(xì)胞能量的保全(圖7G)。與該模型相一致，雷帕霉素顯著地保護LEF細(xì)胞免于葡萄糖剝奪所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(未發(fā)表的數(shù)據(jù))。能量饑餓條件下TSC2-/-細(xì)胞無能力阻抑翻譯可招致有害效應(yīng)并引發(fā)細(xì)胞凋亡。本發(fā)明披露了TSC2在細(xì)胞生長和細(xì)胞存活中的重要生理學(xué)功能。在有些實施方案中，認(rèn)為降低細(xì)胞能量水平的任何方法(如葡萄糖或氨基酸、調(diào)控ATP代謝的藥物的供給的減少等)可應(yīng)用于本發(fā)明的治療方法中。
值得一提的是已發(fā)現(xiàn)AMPK中的突變牽涉到家族性肥厚型心肌病(Hardie和Hawley，2001)。此外，在心臟肥大的阻抑中雷帕霉素對mTOR的抑制已得到文獻(xiàn)的充分記載(Shioi等，Circulation 1071664-1670(2003)。在果蠅以及來自本研究的哺乳動物細(xì)胞中，TSC2為細(xì)胞大小控制的顯性負(fù)調(diào)節(jié)子(Potter和Xu，Curr.Opin.Genet.Dev.11279-286(2001)。所有這些觀察結(jié)果與TSC2在AMPK下游起作用而抑制mTOR的這種非限制性模型相一致。這提供了TSC2在心臟肥大中介導(dǎo)AMPK功能的用途。
LKB 1是一種腫瘤抑制基因。LKB 1的突變是波-杰綜合癥的起因(Hemminki等，Nature 391184-187(1998)；and Jenne等，Nat.Genet.1838-43(1998))。尚不清楚LKB1作為腫瘤抑制劑的分子機理，因為以前不知道LKB1的關(guān)鍵生理底物。近來已經(jīng)證實，LKB1是AMPK的上游活化激酶(Hong等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1008839-8843(2003)；Sutherland等Curr Biol 131299-1305(2003；Hawley等J.Biol.2(28)(2003))。LKB1能在活化環(huán)中直接磷酸化AMPK，并提高AMPK激酶活性。波-杰綜合癥的特征在于主要在腸中的多錯構(gòu)瘤。有趣地，波-杰綜合癥中的錯構(gòu)瘤類似于在TSC中看到的良性腫瘤，盡管腫瘤發(fā)生在不同的組織中(Yoo等Nat.Rev.Cancer2529-535(2002))。本發(fā)明不限于特定的機理。實際上，對機理的理解并非實施(制備和使用)本發(fā)明所必需的。盡管如此，認(rèn)為這些觀察和在形成本發(fā)明形成過程中產(chǎn)生的其它數(shù)據(jù)一起，暗示著LKB1的腫瘤抑制劑功能的一種可能的分子機理，其中LKB1腫瘤抑制劑會通過AMPK活化TSC2腫瘤抑制劑。LKB1通過間接抑制mTOR途徑和蛋白合成，抑制細(xì)胞生長。
在一些實施方案中，將S6激酶抑制劑(如雷帕霉素等)以治療水平提供給患有波-杰綜合癥或有關(guān)的癌癥和/或錯構(gòu)瘤的受試者，包括但不限于，Cowden′s disease(多發(fā)性錯構(gòu)瘤綜合癥)，青年性息肉病，Bannayan-Riley-Ruvalcaba綜合癥(以前的Bannayan-Zonana-，Riley-Smith-，和Ruvalcaba-Myhre-Smith綜合癥)。本發(fā)明不限于特定的機理。實際上，對機理的理解并非實施(制備和使用)本發(fā)明所必需的。盡管如此，認(rèn)為這LKB1腫瘤抑制劑會通過AMPK活化TSC2腫瘤抑制劑，因此，LKB1通過間接抑制mTOR途徑和蛋白合成而抑制細(xì)胞生長。
總而言之，腫瘤抑制劑TSC2整合了來自多個途徑的信號以調(diào)控翻譯、細(xì)胞大小和細(xì)胞凋亡。TSC2參與了針對代謝狀態(tài)和能量水平的細(xì)胞應(yīng)答。TSC2的AMPK-依賴性磷酸化激活為細(xì)胞防備不利生長環(huán)境，并保護其免于細(xì)胞死亡。除了引起結(jié)節(jié)性硬化癥，TSC1/TSC2腫瘤抑制劑復(fù)合體的失活在致癌途徑和細(xì)胞肥大中也具有作用。本發(fā)明提供了耗盡細(xì)胞能量水平、選擇性殺死TSC1-或TSC2-癌細(xì)胞的方法，從而提供了對癌癥及其它病況的治療。
實驗提供如下實施例是為了證明和進(jìn)一步闡釋本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案和方面，而不應(yīng)當(dāng)解釋為對其范圍的限制。
在下面的實驗內(nèi)容中，適用如下縮略語N(正常)；M(摩爾濃度)；mM(毫摩爾濃度)；μM(微摩爾濃度)；mol(摩爾)；mmol(毫摩爾)；μmol(微摩爾)；nmol(納摩爾)；pmol(皮摩爾)；g(克)；mg(毫克)；μg(微克)；ng(納克)；l或L(升)；ml(毫升)；μl(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；μm(微米)；nm(納米)以及℃(攝氏度)。
A.方法抗體、質(zhì)粒及試劑抗-S6K、抗-磷S6K、抗-mTOR、抗-磷mTOR、抗-Akt、抗-磷Akt、抗磷4EBP-1以及抗-磷ERK抗體來自Cell Signalling有限公司。抗-TSC2和抗-Myc抗體來自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)?？?HA和抗-Flag抗體分別來自Covance(Princeton，NJ)和Sigma(St Louis，MO)。HA-標(biāo)記的S6K1(α11)和GST-S6構(gòu)建體獲自于J.Blenis(Columbia Univ，NY，NY)。Flag-標(biāo)記的mTOR和激酶失活的mTOR獲自于S.Schreiber(Harvard Univ，Cambridge，MA)。所有其它DNA構(gòu)建體，包括H-RasV12、PTEN、PTEN-CS、Akt、Akt-KM、Flag-泛素和Flag-4E-BP1均為實驗室儲存。所有TSC2的突變構(gòu)建體是通過PCR誘變產(chǎn)生的，并通過DNA測序驗證。LY294002來自Calbiochem(San Diego，CA)；磷酸酶來自New England Biolabs(Beverly，MA)。MG132來自Peptide Institute。放線菌酮和渥曼青霉素來自Sigma。D-PBS來自Gibco。雷帕霉素來自Cell Signalling。
細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和免疫沉淀將HEK293細(xì)胞接種并維持在含10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中。在無血清條件下，利用Lipofectamine試劑(Invitrogen，Carlsbad，CA)，依照制造商的說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。簡言之，轉(zhuǎn)染后4小時，細(xì)胞在含10％FBS的DMEM中恢復(fù)16小時，然后饑餓16-24小時。然后在裂解緩沖液(pH 7.5的10mM Tris-HCl，100mM氯化鈉，1％NP-40，1％Triton X-100，50mM氟化鈉，2mM EDTA，1mM苯甲磺酰氟，10μg ml-1亮抑酶肽和10μg ml-1抑酶肽)中裂解細(xì)胞并由所示抗體和蛋白G-Sepharose珠免疫沉淀。通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分析免疫復(fù)合物。
激酶測定對于S6K測定法，連同或不連同各種質(zhì)粒，用10-20ng HA-S6K構(gòu)建體轉(zhuǎn)染生長于6孔板中的HEK293細(xì)胞，如圖所示。HA-S6K由抗-HA抗體自血清饑餓的細(xì)胞中免疫沉淀，并利用純化的GST-S6作為底物，通過體外激酶測定法予以分析(Pearson等，EMBO J.14，5279-5287(1995))。
對于Akt激酶測定法，在2μg RasV12的存在下將10μg GST-Akt或GST-Akt-KM(激酶失活)DNA轉(zhuǎn)染到10cm板的HEK293細(xì)胞中。純化GST-Akt并用于在體外磷酸化5μg純化的GST-TSC2片段1(氨基酸910-1112)或片段2(氨基酸1357-1765)。mTOR激酶測定法如以前所描述的那樣進(jìn)行(Dennis等，Science 294，1102-1105(2001))。簡要地，HEK293細(xì)胞用Flag-mTOR瞬時轉(zhuǎn)染，連同或不連同TSC1-TSC2進(jìn)行。裂解細(xì)胞，并由抗-Flag抗體免疫沉淀，并利用純化的GST-S6K作為底物通過體外激酶測定法予以分析。mTOR激酶緩沖液含2mM ATP。GST-S6K的磷酸化由抗-磷-Thr 389 S6K抗體通過免疫印跡分析予以測定。
RNA干預(yù)(RNA interference)RNAi-N和RNAi-C代表對應(yīng)于TSC2氨基酸殘基164-170(RNAi-N)和1518-1524(RNAi-C)的雙鏈RNA寡核苷酸(Elbashir等，Nature 411，494-498(2001))。HEK293細(xì)胞利用Lipofectamine試劑由200-1000ng RNAi連同或不連同所示質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，如上文所述。內(nèi)源TSC2水平由抗-TSC2抗體通過免疫印跡予以測定。
代謝標(biāo)記和二維磷肽作圖HEK293細(xì)胞用HA-標(biāo)記的TSC2、Myc-標(biāo)記的TSC1以及所示質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。對細(xì)胞進(jìn)行4小時磷酸鹽及血清饑餓，之后與0.25mCi ml-132P-正磷酸鹽(ICN)溫育4小時。
細(xì)胞用冰冷PBS洗滌一次并裂解。免疫沉淀HA-標(biāo)記的TSC2，通過SDS-PAGE拆分，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。磷酸化的TSC2通過放射自顯影顯像，然后進(jìn)行磷肽作圖分析。簡言之，切下磷酸化的TSC2條帶，甲醇固定并在500μl溶于100mM乙酸的0.5％聚乙烯吡咯烷酮-40中于37℃溫育30分鐘。然后將樣品用20μg TPCK-處理的胰蛋白酶(Sigma)于37℃在pH 8.0含5％乙腈的75mM碳酸氫銨緩沖液中消化。消化后，樣品真空干燥，并懸浮于10μl水中。將樣品點到纖維素板上，并利用pH 8.9的1％碳酸氫銨緩沖液進(jìn)行第一維電泳。板在層析緩沖液(正丁醇∶嘧啶∶乙酸∶水；20∶24∶6∶30)中通過第二維層析予以分離。干燥板，且通過放射自顯影顯像磷肽。
B.結(jié)果TSC1-TSC2對S6K活性的影響為闡釋TSC1-TSC2在細(xì)胞生長調(diào)節(jié)中的功能機制，研究了哺乳動物細(xì)胞中TSC1-TSC2對S6K活性的影響。除胰島素-及Ras-刺激的S6K激酶活性之外，TSC1和TSC2的共表達(dá)還抑制基礎(chǔ)S6K激酶活性(圖1a)。TSC1-TSC2的這種抑制活性與其在細(xì)胞生長調(diào)節(jié)中的負(fù)作用一致。S6K活性因幾個殘基(包括Thr 389、Thr 421和Ser 424)上的磷酸化而激活(Dufner和Thomas，Exp.Cell Res.253，100-109(1999))。這些殘基的磷酸化被胰島素、Akt和激活的Ras所刺激(圖1b)。另外，TSC1-TSC2的共表達(dá)在所有三種條件下均抑制Thr389的磷酸化(圖1b)。Thr 389是已知的與S6K29的激活相關(guān)的雷帕霉素敏感型磷酸化位點。TSC1和TSC2的共表達(dá)對S6K中Thr 421或Ser 424(其為雷帕霉素非敏感位點(Dufner等，同上))的磷酸化幾乎沒有影響(圖1b)。本發(fā)明并不局限于特定的機制。實際上，對于機制的理解并非實施本發(fā)明所必需的。盡管如此，認(rèn)為這些結(jié)果表明TSC1-TSC2復(fù)合體可通過mTOR發(fā)揮作用。
為測試TSC1-TSC2在S6K活化中的特異性，研究了TSC1-TSC2對ERK的作用，該ERK也為Ras所激活。結(jié)果顯示TSC1-TSC2的過表達(dá)對Ras-誘導(dǎo)的ERK磷酸化沒有影響，而相同實驗中S6K的磷酸化被抑制(圖1c)。這些觀察結(jié)果證明TSC1-TSC2特異性地抑制S6K的磷酸化及活化。
為確定TSC1-TSC2在胰島素途徑中的位置，研究了TSC1-TSC2過表達(dá)對處于mTOR和S6K上游的胰島素誘導(dǎo)的Akt磷酸化的影響。結(jié)果證明TSC1-TSC2不能抑制胰島素誘導(dǎo)的Akt磷酸化，但的確以劑量依賴型的方式抑制S6K的磷酸化(圖1d)。本發(fā)明并不局限于特定的機制。實際上，對于機制的理解并非實施本發(fā)明所必需的。盡管如此，預(yù)計TSC1-TSC2在Akt下游或與之平行地發(fā)揮功能。
RNA干預(yù)利用RNA干預(yù)(RNAi)測試內(nèi)源TSC2對S6K的影響。使用對應(yīng)于TSC2氨基端(RNAi-N)或者C-末端(RNAi-C)區(qū)域的兩種RNA雙鏈體來抑制內(nèi)源TSC2的表達(dá)(圖2a)。RNAi-C或RNAi-N的轉(zhuǎn)染導(dǎo)致HEK293細(xì)胞中內(nèi)源TSC2蛋白水平的顯著下降，而TSC2 RNAi對MEK2的表達(dá)水平?jīng)]有影響。該數(shù)據(jù)證明TSC2 RNAi對內(nèi)源TSC2蛋白水平的降低增強了轉(zhuǎn)染的S6K的基礎(chǔ)及胰島素刺激的磷酸化(圖2a)。采用不相關(guān)RNA寡核苷酸的對照實驗對S6K磷酸化沒有影響。也研究了TSC2 RNAi對內(nèi)源Akt、S6K和S6磷酸化的影響。TSC2 RNAi的轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)了內(nèi)源S6K和S6兩者而非Akt磷酸化小量但可重復(fù)的增長(圖2b)。S6磷酸化的增長說明TSC2 RNAi增強了S6K活性。與共轉(zhuǎn)染的血細(xì)胞凝集素(HA)-標(biāo)記的S6K相比，內(nèi)源S6K磷酸化的增長不太顯著。這是因為轉(zhuǎn)染效率小于100％。未轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的內(nèi)源S6K稀釋了RNAi在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的效應(yīng)。因此，由TSC2 RNAi轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中內(nèi)源S6K的實際增長應(yīng)當(dāng)比圖2b中所示數(shù)據(jù)更為顯著。上述觀察結(jié)果證明TSC1-TSC2的一種生理功能在于抑制S6K激酶的磷酸化及活化。
TSC突變對激酶活性的影響以前已在患者中鑒定了TSC1和TSC2中的許多突變(Dabora等，Am.J.Hum.Genet.68，64-80(2001)；Jones等，Am.J.Hum.Genet.64，1305-1315(1999)；特此并入作為參考)。下面測試了這些疾病來源的突變對TSC2抑制S6K活性的能力的影響。具體地，測試了親水性或帶電殘基的點突變，因為表面殘基的突變不太可能影響TSC2的三級結(jié)構(gòu)。與野生型對照相比，在所分析的11種疾病相關(guān)的突變體中，全部都表現(xiàn)出抑制S6K磷酸化的能力下降(圖2c)。本發(fā)明并不局限于特定的機制。實際上，對于機制的理解并非實施本發(fā)明所必需的。盡管如此，預(yù)計這些數(shù)據(jù)表明TSC1-TSC2對S6K活性的抑制是生理學(xué)相關(guān)的。
Akt對TSC2的磷酸化盡管果蠅中的遺傳研究已確認(rèn)dTsc1-dTsc2可拮抗IR在細(xì)胞生長控制中的功能，該途徑中dTsc1-dTsc2的精確功能尚不清楚。遺傳證據(jù)也顯示dTsc1-dTsc2可能在Akt下游或與之平行地發(fā)揮功能(Gao和Pan，Genes Dev.15，1383-1392(2001)；Potter等，Cell 105，357-368(2001))。為區(qū)別這種兩種可能性，研究了Akt對TSC1和TSC2的影響。Akt而非激酶失活突變體Akt-KM的共表達(dá)導(dǎo)致慢遷移形式TSC2的累積，表明Akt可促進(jìn)TSC2的磷酸化(圖3a)。相反，Akt對TSC1沒有影響。另外，用阻斷Akt的內(nèi)源激活的PI(3)K抑制劑LY294002處理，也提高了TSC2的遷移率。此外，采用PTEN或催化失活突變體PTEN-CS的實驗也支持Akt負(fù)責(zé)TSC2的磷酸化的觀點。PTEN而非PTEN-CS的表達(dá)提高了TSC2的遷移率(圖3a)。磷酸酶處理證實遷移率變動是磷酸化的結(jié)果(圖3a)。
為表征Akt對TSC2的磷酸化，進(jìn)行了體內(nèi)32P-標(biāo)記和二維磷肽作圖分析。結(jié)果顯示TSC2在體內(nèi)在多位點磷酸化(圖3b)。Akt或PTEN的共表達(dá)影響了一個磷肽亞組(圖3b，小圖V和VI)。Akt可提高這些磷肽的強度，而PTEN則降低此強度。這些結(jié)果也示意性地列出(圖3b，小圖IV)。陰影點表示其強度因Akt或PTEN的共表達(dá)而改變的磷肽。胰島素刺激稍微地提高了由Akt增強的相同磷肽的磷酸化(圖3c，小圖II)。用間接抑制Akt的LY294002處理也降低了相同磷肽亞組的磷酸化(圖3c，小圖III)。相反，雷帕霉素對mTOR的抑制對TSC2磷酸化沒有影響(圖3c，圖IV)。這些結(jié)果表明胰島素-Akt途徑負(fù)責(zé)TSC2的磷酸化，而mTOR或S6K不參與其中。
TSC2的突變分析TSC2的序列分析證明它含有八個推斷的Akt共有磷酸化位點(Datta等，Genes Dev.13，2905-2927(1999))，其中兩個在dTsc2中是保守的(圖4a)。獲得了具有兩個推斷Akt位點內(nèi)部缺失的大鼠TSC2 cDNA。本研究中使用這種短形式的TSC2，其也在表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)數(shù)據(jù)庫的若干克隆中鑒定到。為進(jìn)一步研究TSC2的磷酸化，對這六個推斷的Akt磷酸化位點(圖4a)進(jìn)行個別(A1-A5)或者組合突變(6A)(圖4b)。Ser 939(A1；小圖I)、Ser 1086/Ser1088(A2；小圖II)、Thr 1422(A4；小圖IV)而非Ser 1378(A3；小圖III)或Ser1756(A5；小圖V)的突變影響了TSC2的磷肽模式(圖4b)。6A突變體中消失的磷肽(小圖VI)在小圖VIII中表示為陰影點。這些磷肽的模式與Akt或PTEN的共表達(dá)(比較圖3b小圖IV和圖4b小圖VIII)或者由LY294002處理(圖3c，圖III)所改變的那些磷肽模式精確匹配。這些數(shù)據(jù)證明Ser 939、Ser1086/Ser 1088和Thr 1422是TSC2的正確體內(nèi)磷酸化所必需的。本發(fā)明并不局限于特定的機制。實際上，對于機制的理解并非實施本發(fā)明所必需的。盡管如此，我們認(rèn)為這些位點是Akt-依賴性的磷酸化位點。
為證明Akt在上文所鑒定的殘基上磷酸化TSC2，利用純化的重組蛋白研究了Akt是否在體外磷酸化TSC2。從轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中純化谷光甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)-Akt，而TSC2片段1和2在大腸桿菌中表達(dá)和純化。野生型Akt而非激酶失活的Akt-KM突變體有效地在體外磷酸化TSC2片段1和2(圖4a，c)。此外，片段1中的Ser 939、Ser 1086和Ser 1088突變以及片段2中的Thr 1422突變均消除了體外的Akt-依賴性磷酸化(圖4c)。該數(shù)據(jù)顯示無論在體內(nèi)還是體外，Akt都直接在多位點磷酸化TSC2。
根據(jù)Akt和TSC2在果蠅細(xì)胞生長控制中相反的功能，似乎可能被Akt磷酸化則抑制TSC2功能。Akt磷酸化位點突變?yōu)楸彼嵩鰪娏薚SC2抑制S6K的能力，而突變?yōu)榱讛M態(tài)酸性殘基則降低TSC2的抑制活性(圖5a)。Akt信號傳導(dǎo)途徑的另一個下游靶標(biāo)為4E-BP1，其參與PI(3)K/Akt-誘導(dǎo)的細(xì)胞生長調(diào)控(Miron等，Nature Cell Biol.3，596-601(2001))。與此相一致的，磷擬態(tài)TSC2突變體在抑制4E-BP1磷酸化方面不如丙氨酸突變體有效(圖5b)。本發(fā)明并不局限于特定的機制。實際上，對于機制的理解并非實施本發(fā)明所必需的。盡管如此，這些數(shù)據(jù)被認(rèn)為表明了Akt依賴性的磷酸化會抑制TSC2功能。
TSC1和TSC2之間復(fù)合體的形成對于其生物學(xué)功能很重要。疾病相關(guān)的TSC2突變削弱了與TSC1的相互作用(圖2c)，這還支持了TSC1-TSC2復(fù)合體形成的功能重要性。也發(fā)現(xiàn)TSC2中Akt位點的磷酸化模擬突變削弱了其與TSC1的相互作用，如通過免疫共沉淀實驗所測定的那樣(圖5c)。游離TSC2由于其對泛素-依賴性降解的敏感性而不穩(wěn)定，而TSC1-TSC2復(fù)合體的形成穩(wěn)定了TSC2(Benvenuto等，Oncogene 19，6306-6316(2000))。當(dāng)利用同量的DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染時，磷擬態(tài)TSC2突變體一致地以比野生型或TSC2突變體更低的水平表達(dá)。TSC2的磷酸化模擬突變體，與疾病來源的TSC2R611Q突變體類似，不如野生型TSC2或丙氨酸突變體穩(wěn)定(圖5d)。在10μM MG132——一種蛋白體依賴性蛋白降解抑制劑——的存在下研究了TSC2突變體的泛素化。如所預(yù)期的那樣，磷擬態(tài)突變體被泛素化，而野生型TSC2和丙氨酸取代突變體以較小的程度被泛素化(圖5e)。同樣地，疾病來源的TSC2R611Q突變體也是高度泛素化的。因此，Akt-依賴性的磷酸化通過使其與TSC1的結(jié)合去穩(wěn)定化、促進(jìn)泛素介導(dǎo)的降解來抑制TSC2的功能。
營養(yǎng)物刺激營養(yǎng)物刺激激活S6K而失活4E-BP1(Shah等，Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.279，E715-E729(2000))。營養(yǎng)物誘導(dǎo)的S6K和4E-BP1磷酸化被雷帕霉素阻斷，說明了mTOR在營養(yǎng)物信號傳導(dǎo)中的主要作用。相反，營養(yǎng)物刺激對Akt35的活化沒有影響。營養(yǎng)物刺激的S6K磷酸化和激酶活性受TSC1-TSC2抑制(圖6a)，表明TSC1-TSC2也參與所述營養(yǎng)應(yīng)答。與S6K相比少得多的TSC1-TSC2蛋白被表達(dá)的條件下觀察到S6K活性的抑制。未檢測到S6K和TSC1-TSC2之間直接的相互作用，TSC1-TSC2選擇性抑制S6K中雷帕霉素敏感型位點Thr389的磷酸化(圖1b)。4E-BP1的磷酸化對于雷帕霉素抑制很敏感，而mTOR已證明直接磷酸化4E-BP1(Gingras等，Genes Dev.13，1422-1437(1999))。TSC1-TSC2的共表達(dá)也應(yīng)答營養(yǎng)物的刺激而抑制4E-BP1的磷酸化(圖5b)。本發(fā)明并不局限于特定的機制。實際上，對于機制的理解并非實施本發(fā)明所必需的。盡管如此，綜上認(rèn)為，這些觀察結(jié)表明TSC1-TSC2可能通過mTOR發(fā)揮功能而調(diào)控S6K和4E-BP1的磷酸化。
為研究mTOR在TSC1-TSC2功能中的作用，分析了雷帕霉素抗性突變體S6K-dC104和S6KdNC(Dennis等，Science 294，1102-1105(2001)；Weng等，Mol.Cell.Biol.15，2333-2340(1995)；每一篇都特此并入作為參考)。S6K-dC104含C-末端缺失，S6K-dC104中Thr 389的磷酸化受LY249002而非雷帕霉素的抑制(Dennis等，前文)。與此形成對照，S6K-dC104的激酶活性受雷帕霉素抑制(Weng等，前文；Schalm等，Curr.Biol.12，632-639(2002))。與所報道的觀察結(jié)果一致，S6K-dC104中Thr 389的磷酸化受渥曼青霉素或LY294002而非雷帕霉素的抑制(圖7a)。TSC1-TSC2既不抑制基礎(chǔ)的也不抑制胰島素刺激的S6K-dC104中Thr 389的磷酸化(圖7b)。S6K-dC104的激酶活性受TSC1-TSC2抑制(圖7c)。這些結(jié)果說明TSC1-TSC2的效果與雷帕霉素的效果相仿。S6K的N-末端區(qū)含TOR信號傳導(dǎo)(TOS)基序(Schalm等，同前)。TOS基序的缺失會嚴(yán)重降低激酶活性，并消除mTOR的刺激。然而，進(jìn)一步缺失C末端會部分地拯救N-末端缺失的激酶活性，并使得S6K-dNC對雷帕霉素具完全抗性(Schlam等，同前)。S6K-dNC的激酶活性也抗TSC1-TSC2的抑制(圖7c)。TSC1-TSC2對S6K突變體的影響與雷帕霉素的效力嚴(yán)格相關(guān)，因此支持TSC1-TSC2和mTOR在同一途徑中行使功能的模型。
為確定TSC1-TSC2對mTOR的影響，進(jìn)行了免疫沉淀的mTOR的體外激酶測定。TSC1-TSC2共轉(zhuǎn)染抑制了mTOR激酶使S6K的Thr 389磷酸化的能力(圖7d)，表明mTOR活性受TSC1-TSC2抑制。為進(jìn)一步測試TSC1-TSC2對mTOR活性的影響，研究了mTOR在牽涉到mTOR激活的Ser 2448處的磷酸化作用(Nave等，Biochem J.344，427-431(1999))。結(jié)果證明TSC1-TSC2的過表達(dá)以劑量依賴性的方式抑制mTOR中Ser 2448的磷酸化(圖7e)。此外，RNAi對內(nèi)源TSC2的降低造成了mTOR中Ser 2448磷酸化的提高，這支持了TSC1-TSC2在mTOR調(diào)節(jié)中的負(fù)作用。推測Akt可使MTOR中的Ser2448磷酸化(Nave等，前文；Scott等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 95，7772-7777(1998)；Sekulic等，Cancer Res.60，3504-3513(2000))。本發(fā)明并不局限于特定的機制。實際上，對于機制的理解并非實施本發(fā)明所必需的。盡管如此，現(xiàn)認(rèn)為，由于Akt的活化不受TSC1-TSC2的抑制，TSC1-TSC2介導(dǎo)的mTOR在Ser 2448處磷酸化的抑制是競爭共用激酶Akt的結(jié)果。也有可能是TSC1-TSC2阻斷了mTOR對Akt的可接近性和/或促進(jìn)了mTOR的磷酸化。
ATP耗盡誘導(dǎo)了TSC2磷酸化蛋白合成受多種細(xì)胞條件包括細(xì)胞能量水平的調(diào)控。已觀察到葡萄糖類似物2-脫氧-葡萄糖(2-DG，其通過間接抑制己糖激酶而阻斷細(xì)胞葡萄糖利用)、線粒體解偶聯(lián)劑FCCP以及PKC抑制劑楸毒素(Rottlerin)(Soltoff，J.Biol.Chem.27637986-37992(2001)對細(xì)胞ATP的耗盡造成了S6K和4EBP1的脫磷酸化(圖8A)。另外，在D-PBS中培養(yǎng)細(xì)胞所致的營養(yǎng)物耗盡會抑制S6K和4EBP1的磷酸化(Hara等，1998)。ATP耗盡和營養(yǎng)物剝奪也導(dǎo)致TSC2在5％SDS-PAGE凝膠上分辨時有明顯的遷移上移(upshift)(圖8B)，說明TSC2磷酸化很可能被這些細(xì)胞條件加強。
以前已報道過使用20-100mM濃度的2-DG處理可實現(xiàn)胞內(nèi)ATP水平的20-50％下降，并導(dǎo)致對S6K和4EBP1磷酸化的抑制(Dennis等，2001)。其結(jié)論是2-DG對S6K和4EBP1磷酸化的抑制直接地歸結(jié)于mTOR對降低ATP水平的感測，其中mTOR對ATP具有1mM左右的Km(Dennis等，2001)。在本發(fā)明形成過程期間進(jìn)行的實驗觀察到100mM的甘露醇(一種滲透劑)也顯著抑制S6K的磷酸化(圖8C)，表明高濃度2-DG的效應(yīng)是歸因于細(xì)胞ATP水平耗盡及其作為滲透劑的混合應(yīng)答。還觀察到在低濃度2-DG如25mM時，S6K上T389的磷酸化被有效抑制，而相似濃度的甘露醇幾乎沒有作用(圖8C)。對于S6和4EBP1的磷酸化觀察到相似的結(jié)果(圖8C)。與mTOR活性相關(guān)的mTOR S2448磷酸化(Nave等，1999；Scott等，Proc.Natl.Acad.Sci.957772-7777(1998)；Sekulic等，2000)也被25mM 2-DG抑制(圖8C)。相反，25mM 2-DG對于Akt磷酸化幾乎沒有作用(圖8C)。本發(fā)明并不局限于特定的機制。實際上，對于機制的理解并非實施本發(fā)明所必需的。盡管如此，現(xiàn)認(rèn)為這些結(jié)果證明2-DG特異性地抑制S6K、4EBP1和mTOR的磷酸化，但并不通過Akt進(jìn)行信號傳導(dǎo)。
AMPK較之于mTOR對細(xì)胞能量狀態(tài)的變化更為敏感，因為它受AMP/ATP比率的激活。25mM 2-DG激活A(yù)MPK，如AMPK中T172磷酸化的顯著提高所示(圖8D)。25mM 2-DG誘導(dǎo)快速的AMPK激活，并伴隨著作為處理時間的函數(shù)的S6K脫磷酸化(圖8E)。這些數(shù)據(jù)與AMPK激活與作用于S6K和4EBP1的抑制密切關(guān)聯(lián)的最近報道相一致(Horman等，2002；Kimura等，2003；Krause等，2002)。本發(fā)明并不局限于特定的機制。實際上，對于機制的理解并非實施本發(fā)明所必需的。盡管如此，現(xiàn)認(rèn)為這些結(jié)果證明了AMPK的活化可能對ATP耗盡誘導(dǎo)的S6K和4EBP1脫磷酸化負(fù)有責(zé)任。在用25mM 2-DG處理的細(xì)胞中觀察到統(tǒng)計學(xué)上顯著的ATP水平的下降和AMP/ATP比率的升高(圖8F，G)。然而，根據(jù)以前發(fā)表的數(shù)據(jù)，ATP濃度的下降并不顯著影響mTOR的激酶活性(Dennis等，2001)。本發(fā)明并不局限于特定的機制。實際上，對于機制的理解并非實施本發(fā)明所必需的。盡管如此，現(xiàn)認(rèn)為在對輕度能量耗盡的應(yīng)答中，AMPK是首要的能量傳感器。葡萄糖限制也會降低S6K磷酸化、提高AMPK磷酸化并導(dǎo)致TSC2的遷移率變化(圖8H)。
2-DG刺激內(nèi)源AMPK和TSC2之間的相互作用為確定AMPK是否負(fù)責(zé)TSC2的磷酸化，研究了AMPK和TSC2相互作用的存在。AMPK的免疫沉淀顯示TSC1和TSC2兩者都微弱地被AMPK免疫共沉淀(圖9A)。已發(fā)現(xiàn)TSC2和TSC1在2-DG刺激后優(yōu)先地與AMPK相互作用。也進(jìn)行了與識別活性形式的AMPK的抗-磷AMPK抗體(pAMPK)的免疫共沉淀。該抗體特異性地沉淀來自對照和經(jīng)2-DG處理的細(xì)胞裂解物二者中的活性形式AMPK(圖9A)。然而，在抗-pAMPK免疫沉淀中未回收到TSC2或TSC1。這種觀察現(xiàn)象并不令人驚訝，因為在AMPK中T172位于活化環(huán)之中(Scott等，J.Mol.Bio.317309-323(2002)；Stein等，Biochem.J.345(part 3)437-443(2000)。本發(fā)明并不局限于特定的機制。實際上，對于機制的理解并非實施本發(fā)明所必需的。盡管如此，現(xiàn)認(rèn)為，基于已知的激酶結(jié)構(gòu)這些結(jié)果證明，AMPK與活化環(huán)的結(jié)合可阻斷底物結(jié)合。
為確定活性AMPK是否與TSC2相關(guān)，進(jìn)行了抗-TSC2抗體的相互免疫共沉淀，繼之以抗-AMPK和抗-pAMPK抗體的蛋白印跡。觀察到內(nèi)源AMPK和TSC2之間的相互作用被2-DG促進(jìn)(圖9B)。這種相互作用通過將TSC2抗體和競爭肽事先溫育而被有效競爭，證明了免疫共沉淀的特異性(圖9B)。圖9C顯示裂解物中的蛋白水平相似。上述觀察結(jié)果證明2-DG處理可刺激內(nèi)源TSC2和AMPK之間的相互作用。
也進(jìn)行了內(nèi)源AMPK和過表達(dá)的TSC2之間的共免疫沉淀研究，證實了2-DG促進(jìn)TSC2和AMPK之間的相互作用(圖9D)。缺失分析表明，TSC2的C-末端結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)與AMPK的相互作用，而N-末端結(jié)構(gòu)域并非必需的。
TSC2是介導(dǎo)細(xì)胞能量應(yīng)答所必需的為確定在2-DG對S6K的失活中TSC2的作用，用TSC2 RNAi寡聚物處理HEK293細(xì)胞。TSC2 RNAi顯著降低內(nèi)源TSC2蛋白水平，但對無關(guān)蛋白MEK2沒有影響(圖10A)。2-DG誘導(dǎo)的S6K脫磷酸化在TSC2破壞細(xì)胞中被阻斷，但對照細(xì)胞中沒有。相反，TSC2的破壞對應(yīng)答2-DG的AMPK磷酸化沒有顯著影響。即使當(dāng)TSC2表達(dá)被破壞時，雷帕霉素對mTOR的抑制也阻斷了S6K的磷酸化，表明mTOR處于TSC2的下游(圖10B)。
還研究了AMPK在S6K調(diào)控中的作用?；钚訟MPKαI或αII催化亞基的共表達(dá)導(dǎo)致了S6K磷酸化的下降(圖10C)。本發(fā)明并不局限于特定的機制。實際上，對于機制的理解并非實施本發(fā)明所必需的。盡管如此，現(xiàn)認(rèn)為AMPK可對S6K磷酸化負(fù)調(diào)控。RNAi對TSC2的破壞阻斷了AMPK表達(dá)的抑制效應(yīng)，表明TSC2在AMPK下游起作用。TSC2 RNAi和雷帕霉素都不影響乙酰CoA羧化酶(ACC)和真核細(xì)胞延伸因子2(eEF2)兩種AMPK底物——的磷酸化(圖10D，E)，支持了TSC2在介導(dǎo)AMPK對S6K調(diào)控中的特異性作用。
推測認(rèn)為，如果TSC2在介導(dǎo)ATP耗盡對S6K的抑制中發(fā)揮作用，則EEF8(TSC2-/-)和EEF4(TSC2+/+)成纖維細(xì)胞應(yīng)當(dāng)對各種ATP耗盡試劑有不同的應(yīng)答。正如所預(yù)期的那樣，EEF8細(xì)胞表現(xiàn)出高得多的S6K磷酸化水平(圖10F)。為比較EEF4和EEF8細(xì)胞的結(jié)果，長時和短時曝光的S6K磷酸化免疫印跡都示于圖10F中。觀察到楸毒素、FCCP、以及在更小程度上疊氮化物、寡霉素和魚藤酮(retenone)導(dǎo)致EEF4細(xì)胞中S6K磷酸化的下降。這些試劑對S6K磷酸化的影響在EEF8細(xì)胞中更微弱(圖10F)。對于4EBP1的磷酸化觀察到相似的結(jié)果。不過，EEF4和EEF8細(xì)胞之間AMPK的激活沒有差別(圖10F)。本發(fā)明并不局限于特定的機制。實際上，對于機制的理解并非實施本發(fā)明所必需的。盡管如此，現(xiàn)認(rèn)為TSC2在介導(dǎo)ATP耗盡對S6K和4EBP1磷酸化的影響中起著重要作用。用2-DG和D-PBS處理進(jìn)行了類似實驗。在EEF8(TSC2-/-)細(xì)胞中，2-DG和D-PBS4EBP1磷酸化幾乎沒有影響。這與EEF4(TSC2+/+)細(xì)胞中對4EBP1磷酸化的抑制形成對照(圖10G)。本發(fā)明并不局限于特定的機制。實際上，對于機制的理解并非實施本發(fā)明所必需的。盡管如此，現(xiàn)認(rèn)為這些數(shù)據(jù)與以前發(fā)表的營養(yǎng)物耗盡誘導(dǎo)的S6K脫磷酸化在TSC2-/-細(xì)胞中受損的觀察結(jié)果相一致(Gao等，Nat.Cell Biol.4699-704(2002)。
TSC2被AMPK所磷酸化用λ磷酸酶進(jìn)行的處理將TSC2轉(zhuǎn)換為更快的遷移條帶(圖11A)，表明2-DG-誘導(dǎo)的遷移率變化歸因于磷酸化。TSC1也是磷蛋白，其因λ磷酸酶處理而遷移下移(downshift)(圖11A)。不過，2-DG處理并不改變TSC1的遷移率。活性AMPKαI的共轉(zhuǎn)染也誘導(dǎo)TSC2而非TSC1的遷移上移(upshift)，表明AMPK調(diào)控TSC2的磷酸化(圖11B)。利用AMPK抑制劑(化合物C)測定了內(nèi)源AMPK是否參與TSC2磷酸化(Zhou等，J.Clin.Invest.1081167-1174(2001)。將HEK293細(xì)胞和10μM AMPK抑制劑一起溫育可提高TSC2的遷移率，支持了內(nèi)源AMPK在TSC2磷酸化中的作用(圖11C)。
通過表達(dá)顯性失活的AMPK研究了AMPK和2-DG-誘導(dǎo)的S6K脫磷酸化之間的功能關(guān)系。AMPK的激酶失活催化亞基αII(AMPK-DN)的劑量依賴性表達(dá)部分地阻斷了2-DG處理對S6K的抑制(圖11D)。此外，溫育HEK 293細(xì)胞與AMPK抑制劑顯著逆轉(zhuǎn)了2-DG對S6K磷酸化的抑制效應(yīng)(圖11E)。相反，AMPK抑制劑的處理對Akt磷酸化沒有影響。AMPK抑制劑也顯著阻斷葡萄糖剝奪所誘導(dǎo)的S6K脫磷酸化(圖11F)。本發(fā)明并不局限于特定的機制。實際上，對于機制的理解并非實施本發(fā)明所必需的。盡管如此，認(rèn)為這些數(shù)據(jù)表明AMPK激活應(yīng)答能量饑餓而在TSC2磷酸化和S6K抑制中起著重要作用。
TSC2中的T1227和S1345是主要的AMPK磷酸化位點為闡述AMPK對TSC2調(diào)控的機制，對TSC2進(jìn)行了體內(nèi)標(biāo)記和二維磷肽作圖分析。2-DG刺激(25和40mM)增強了多種肽的磷酸化(比較圖12A中小圖a、b和c)。有意思的是，活性AMPKαI亞基的共表達(dá)也提高了為2-DG處理所刺激的相同肽的磷酸化(比較圖12A中小圖a和d)。小圖e中的陰影點表示由2-DG或AMPK誘導(dǎo)的磷肽。本發(fā)明并不局限于特定的機制。實際上，對于機制的理解并非實施本發(fā)明所必需的。盡管如此，現(xiàn)認(rèn)為這些結(jié)果清楚地證明了2-DG處理會刺激TSC2磷酸化，而AMPK在TSC2磷酸化中起著主要作用。
以前，尋找了TSC2序列中用于AMPK識別的共有位點(Hardie等，1998)，并且發(fā)現(xiàn)大鼠TSC2含8個推斷的AMPK位點。所有推斷的AMPK位點被單獨突變，并對每個單獨的突變體進(jìn)行二維磷肽作圖分析。這些數(shù)據(jù)顯示除T1227A和S1345A外的所有單獨突變體都具有與野生型TSC2相似的磷肽圖譜。S1345A突變體影響大多數(shù)2-DG和AMPK可誘導(dǎo)的磷肽(圖12A小圖f中的斑點1、2、3、5、6、7、8)。本發(fā)明并不局限于特定的機制。實際上，對于機制的理解并非實施本發(fā)明所必需的。盡管如此，現(xiàn)認(rèn)為這些結(jié)果表明S1345很可能是體內(nèi)AMPK磷酸化位點。此外，S1345的磷酸化影響其它殘基的磷酸化，例如鄰近于AMPK位點S1345的S1337和S1341(圖12B)。
為證實S1345能否被AMPK直接在體外磷酸化，自大腸桿菌中表達(dá)并純化了含S1345的TSC2片段(圖12C)。該TSC2片段被免疫沉淀的AMPK而非激酶失活的AMPK突變體磷酸化(圖12C，頂部小圖)。將S1345突變?yōu)楸彼?S1345A)或天冬氨酸(S1345D)徹底消除了AMPK對TSC2的體外磷酸化，顯示S1345是直接的AMPK磷酸化位點。本發(fā)明并不局限于特定的機制。實際上，對于機制的理解并非實施本發(fā)明所必需的。盡管如此，現(xiàn)認(rèn)為這些數(shù)據(jù)說明S1337和S1341并非直接的AMPK磷酸化位點(圖12C)，盡管這些殘基的磷酸化被2-DG和AMPK所增強(圖12A，B)。為了確認(rèn)體外AMPK磷酸化位點也在體內(nèi)在TSC2中被磷酸化，將體外AMPK磷酸化的TSC2的二維磷肽圖譜與體內(nèi)標(biāo)記的TSC2進(jìn)行了比較(圖12D)。體外磷酸化的TSC2片段與體內(nèi)磷酸化的TSC2-S1345A突變體的混合證明了斑點3和6是歸因于直接AMPK磷酸化(圖12D)。
觀察到TSC2-T1227A突變體中斑點4消失，而斑點9減輕(圖12E，比較小圖a和b)。免疫沉淀的AMPK對純化的TSC2-F2片段的體外磷酸化表明AMPK特異性地在T1227處使TSC2磷酸化(圖12F)。二維磷肽作圖分析證實T1227對應(yīng)于2D圖譜中的斑點4(圖12E)。本發(fā)明并不局限于特定的機制。實際上，對于機制的理解并非實施本發(fā)明所必需的。盡管如此，現(xiàn)認(rèn)為AMPK在T1227處使TSC2磷酸化。
S1345的突變影響多個磷酸化位點，包括S1337和1341，盡管這些位點不是AMPK共有位點(圖12A，B)。建立了TSC2-S1337/1341/1345A(TSC2-3A)三聯(lián)突變體，并測試了由2-DG誘導(dǎo)的遷移率變化。2-DG依賴性遷移上移在該三聯(lián)突變體中大量消除(圖12G)，說明這些殘基是被能量耗盡誘導(dǎo)的主要磷酸化位點。
AMPK磷酸化增強了TSC2功能利用TSC2磷酸化突變體評估了AMPK磷酸化的功能重要性。轉(zhuǎn)染有TSC2-3A突變體的HEK 293細(xì)胞表現(xiàn)出該突變體不大能應(yīng)答2DG處理而抑制S6K(圖13A)。該結(jié)果與被AMPK磷酸化促進(jìn)了TSC2抑制S6K能力的觀念一致。也測試了TSC2-3A與TSC1相互作用的能力，并發(fā)現(xiàn)突變體TSC2能夠正常地與TSC1形成復(fù)合體(圖13B)。
為研究AMPK對TSC2的磷酸化是否在應(yīng)答2-DG處理的S6K和4EBP1脫磷酸化中起作用，EEF8(TSC2-/-)成纖維細(xì)胞用表達(dá)野生型或者T1227A/S1345A突變體的逆轉(zhuǎn)錄病毒瞬時轉(zhuǎn)染。TSC2的表達(dá)降低了S6K和4EBP1的基礎(chǔ)磷酸化(圖13C)。在載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，2-DG處理幾乎不導(dǎo)致S6K和4EBP1磷酸化降低。相反，在野生型TSC2表達(dá)細(xì)胞中，2-DG顯著降低S6K和4EBP1的磷酸化(圖13C)。表達(dá)TSC2T1227A/S1345A突變體的細(xì)胞與表達(dá)野生型的相比，對2-DG處理反應(yīng)較小(圖13C)。本發(fā)明并不局限于特定的機制。實際上，對于機制的理解并非實施本發(fā)明所必需的。盡管如此，現(xiàn)認(rèn)為這些數(shù)據(jù)證明TSC2中T1227和S1345的AMPK-依賴性磷酸化在針對2-DG處理的細(xì)胞應(yīng)答中起著重要作用。
為進(jìn)一步確立TSC2和AMPK磷酸化在應(yīng)答細(xì)胞能量改變中的功能重要性，建立了來自上皮起源的TSC2-/-LEF細(xì)胞的穩(wěn)定TSC2表達(dá)細(xì)胞系。TSC2的表達(dá)降低了S6K磷酸化，而TSC2-3A的表達(dá)對S6K具有弱得多的影響，盡管野生型和該3A突變體二者以相似的水平表達(dá)(圖13D)。16小時的葡萄糖剝奪降低了野生型TSC2表達(dá)細(xì)胞中S6K的磷酸化，但在載體或TSC2-3A表達(dá)細(xì)胞中具有小得多的效應(yīng)，盡管AMPK活化未受影響(圖13E)。本發(fā)明并不局限于特定的機制。實際上，對于機制的理解并非實施本發(fā)明所必需的。盡管如此，現(xiàn)認(rèn)為這些結(jié)果證明TSC2是葡萄糖剝奪對S6K的失活所必需的。此外，TSC2磷酸化是針對能量限制的細(xì)胞應(yīng)答所必需的。逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的LEF細(xì)胞中TSC2的表達(dá)水平比HEK293細(xì)胞中TSC2的內(nèi)源表達(dá)水平稍微低一些。因此，TSC2在用于此實驗的穩(wěn)定細(xì)胞中并未過表達(dá)。
TSC2保護細(xì)胞免于葡萄糖剝奪所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡載體感染的LEF細(xì)胞在移至無葡萄糖條件之后72小時經(jīng)歷重大的細(xì)胞死亡(圖14A和圖16A)。相反，表達(dá)TSC2的LEF細(xì)胞幾乎未表現(xiàn)出細(xì)胞死亡的增加。本發(fā)明并不局限于特定的機制。實際上，對于機制的理解并非實施(制備和應(yīng)用)本發(fā)明所必需的。盡管如此，本發(fā)明認(rèn)為，這些數(shù)據(jù)表明TSC2能通過葡萄糖饑餓挽救細(xì)胞死亡。同樣地，在EEF8(TSC2-/-)而非對照EEF4(TSC2+/+)細(xì)胞中觀察到葡萄糖剝奪誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。本發(fā)明并不局限于特定的機制。實際上，對于機制的理解并非實現(xiàn)本發(fā)明所必需的。盡管如此，現(xiàn)認(rèn)為這些結(jié)果令人信服地確立了TSC2在保護細(xì)胞免于能量饑餓誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中起著至關(guān)重要的作用。
為確定AMPK磷酸化在TSC2功能中的重要性，也研究了表達(dá)TSC2-3A的LEF細(xì)胞。TSC2-3A不能保護LEF細(xì)胞免于葡萄糖剝奪所誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(圖14A和圖16A)。盡管本發(fā)明并不局限于特定的機制，且對于機制的理解并非實施本發(fā)明所必需的，但這些數(shù)據(jù)表明，在能量饑餓條件下，未受控制的高mTOP活性對細(xì)胞死亡負(fù)有責(zé)任。通過DNA損傷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的鬼臼亞乙苷能在表達(dá)載體及野生型TSC2的細(xì)胞中均造成細(xì)胞死亡，表明TSC2特異性地參與能量而非DNA損傷應(yīng)答。本發(fā)明并不局限于特定的機制。實際上，對于機制的理解并非實施本發(fā)明所必需的。盡管如此，現(xiàn)認(rèn)為這些數(shù)據(jù)證明AMPK對TSC2的磷酸化在保護細(xì)胞免于葡萄糖剝奪所誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中起著關(guān)鍵作用。
還進(jìn)行實驗以進(jìn)一步研究葡萄糖剝奪所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡?；跓晒獾腄NA片段化測定顯示，葡萄糖剝奪在表達(dá)載體和TSC2-3A而非表達(dá)TSC2的LEF細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(圖14B)。細(xì)胞凋亡標(biāo)志的蛋白印跡揭示，caspase 3和PARP二者在葡萄糖剝奪所誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中都被切割，證明細(xì)胞確實在經(jīng)歷細(xì)胞凋亡(圖14C)。在有些實施方案中，雷帕霉素處理抑制了TSC2-/-和TSC2-3A表達(dá)細(xì)胞中的caspase 3活化(圖16B)。在形成本發(fā)明的過程中進(jìn)行的其它實驗還證實了能量剝奪在其它細(xì)胞系中的影響，包括TSC2-/-EEF8細(xì)胞(成纖維細(xì)胞)和TSC1-/-MEF細(xì)胞。已觀察到葡萄糖剝奪誘導(dǎo)了TSC2-/-EEF8(圖16C和16D)和TSC1-/-MEF細(xì)胞(圖16E和16F)中的細(xì)胞凋亡。本發(fā)明并不局限于特定的機制。實際上，對于機制的理解并非實施本發(fā)明所必需的。盡管如此，現(xiàn)認(rèn)為這些結(jié)果證明了TSC1和TSC2二者在細(xì)胞能量應(yīng)答中起作用，并提供了調(diào)節(jié)細(xì)胞能量反應(yīng)的靶物。
ATP耗盡和TSC2對細(xì)胞大小的調(diào)控已證明TSC2在果蠅細(xì)胞大小的控制中起著關(guān)鍵作用。觀察到RNAi對TSC2的破壞會導(dǎo)致HEK293細(xì)胞大小的可再現(xiàn)的增大(圖14D和圖17A)。RNAi對細(xì)胞大小的微小作用可能是因為RNAi對TSC2的不完全消除?，F(xiàn)發(fā)現(xiàn)2-DG處理能顯著降低細(xì)胞大小(圖14D和圖17A)。RNAi對TSC2的破壞部分地阻斷了2-DG誘導(dǎo)的細(xì)胞大小效應(yīng)。TSC2和2-DG的細(xì)胞大小效應(yīng)是細(xì)胞周期依賴性的，因為這些處理類似地影響G1和G2兩類細(xì)胞。本發(fā)明并不局限于特定的機制。實際上，對于機制的理解并非實施本發(fā)明所必需的。盡管如此，現(xiàn)認(rèn)為這些結(jié)果證明TSC2在2-DG誘導(dǎo)的細(xì)胞大小減小中起著重要作用。
也研究了葡萄糖饑餓對細(xì)胞大小的影響。在2.8mM葡萄糖(正常培養(yǎng)基中具有25mM葡萄糖)中培養(yǎng)72小時的HEK293細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞大小的顯著下降(圖14E和圖17B)。用雷帕霉素處理也能降低細(xì)胞大小，如以前所報道的那樣(Fingar等，Genes Dev.161472-1487(2002)。這些數(shù)據(jù)與TSC2介導(dǎo)能量限制信號而調(diào)控細(xì)胞大小相一致。
也觀察到表達(dá)TSC2的LEF細(xì)胞比表達(dá)載體或TSC2-3A的細(xì)胞顯著更小(圖14A和圖16A)。FACS分析研究證實，TSC2的表達(dá)能顯著降低LEF TSC2-/-細(xì)胞的大小(圖14F)。有意思的是，當(dāng)與野生型TSC2相比時，TSC2-3A表現(xiàn)出弱化的降低LEF TSC2-/-細(xì)胞的細(xì)胞大小的能力。另進(jìn)行了雷帕霉素處理作為對照。本發(fā)明并不局限于特定的機制。實際上，對于機制的理解并非實施本發(fā)明所必需的。盡管如此，現(xiàn)認(rèn)為這些觀察結(jié)果與以前的生物學(xué)觀察結(jié)果一致，并首次提供了令人信服的實驗證據(jù)證明TSC2負(fù)調(diào)控哺乳動物細(xì)胞的細(xì)胞大小。此外，這些數(shù)據(jù)證明AMPK依賴性磷酸化為TSC2的生理學(xué)功能提供了至關(guān)重要的作用。
在其它的實施方案中，進(jìn)行實驗來證實TSC2的AMPK磷酸化在細(xì)胞大小控制中的生理學(xué)相關(guān)性，以及葡萄糖限制對細(xì)胞大小的影響。測試了不同濃度的葡萄糖，發(fā)現(xiàn)1mM葡萄糖是不會在TSC2-/-LEF細(xì)胞中誘導(dǎo)明顯細(xì)胞凋亡的最低濃度。FACS分析證實，1mM葡萄糖不會降低TSC2-/-LEF細(xì)胞的細(xì)胞大小(圖17C)。有趣地，1mM葡萄糖明顯地增加了TSC2-/-細(xì)胞的細(xì)胞大小。本發(fā)明并不局限于特定的機制。實際上，對于機制的理解并非實施(制備和使用)本發(fā)明所必需的。盡管如此，現(xiàn)認(rèn)為這些數(shù)據(jù)表明TSC2在應(yīng)答能量饑餓而進(jìn)行細(xì)胞大小控制中起重要作用。也在1mM葡萄糖中培養(yǎng)了表達(dá)TSC2和TSC2-3A的細(xì)胞。野生型TSC2的表達(dá)恢復(fù)了正常的細(xì)胞能量應(yīng)答，能量饑餓引起的顯著的細(xì)胞大小減少(圖17C)。相反，表達(dá)TSC2-3A的細(xì)胞沒有恢復(fù)正常的細(xì)胞能量應(yīng)答，且其行為與TSC2-/-細(xì)胞沒有差別。能量饑餓造成表達(dá)TSC2-3A的細(xì)胞的顯著細(xì)胞大小增加(圖17C)。本發(fā)明并不局限于特定的機制。實際上，對于機制的理解并非實施(制備和使用)本發(fā)明所必需的。盡管如此，現(xiàn)認(rèn)為這些數(shù)據(jù)表明AMPK依賴型磷酸化在TSC2的生理學(xué)功能中起重要作用，以應(yīng)答細(xì)胞能量饑餓而調(diào)節(jié)細(xì)胞大小。關(guān)于TSC2-/-細(xì)胞的細(xì)胞大小增加的一個示例性的且非限制性的可能解釋是，TSC2-/-細(xì)胞不能應(yīng)答能量饑餓，并不管低能量水平而繼續(xù)生長。但是，能量限制可能通過活化細(xì)胞周期檢驗點而阻止細(xì)胞周期進(jìn)展。因此，在低葡萄糖條件下，TSC2-/-和表達(dá)TSC2-3A的細(xì)胞的細(xì)胞大小會增加，但是在沒有葡萄糖的條件下會死亡。這些結(jié)果與觀察到的TSC2在細(xì)胞生長和細(xì)胞能量水平之間的協(xié)調(diào)中起作用相一致。
特此將上述說明書中提及的所有出版物和專利并入作為參考。盡管本發(fā)明是結(jié)合具體的優(yōu)選實施方案描述的，應(yīng)當(dāng)理解所主張的發(fā)明不應(yīng)不適當(dāng)?shù)鼐窒抻诖祟惥唧w的實施方案。實際上，實施本發(fā)明所述方式的各種修飾對相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域熟練技術(shù)人員是顯而易見的，旨在落入如下權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.檢測在受試者中增強的S6激酶活性的方法，包括a)提供來自受試者的生物學(xué)樣品；和b)檢測所述生物學(xué)樣品中增強的S6激酶活性的存在與否。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述檢測增強的S6激酶活性的存在與否包括S6激酶磷酸酶測定法。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述S6激酶磷酸酶測定法包括使磷酸化特異性的抗體與S6激酶底物雜交。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述增強的S6激酶活性是選自TSC1蛋白和TSC2蛋白之中的失活蛋白的指征。
5.權(quán)利要求1的方法，其中還包括基于所述的檢測增強的S6激酶活性的存在與否而向所述受試者提供診斷。
6.權(quán)利要求1的方法，其中還包括向所述受試者提供治療結(jié)節(jié)性硬化癥的步驟，其中所述的治療包括向所述受試者施用S6激酶抑制劑。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述的S6激酶抑制劑包含雷帕霉素。
8.篩選化合物的方法，包括a)提供i)表達(dá)S6激酶的細(xì)胞；和ii)一種或多種測試化合物；以及b)篩選所述測試化合物抑制所述S6激酶的激酶活性的能力。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述篩選所述化合物抑制S6激酶活性的能力包括S6激酶磷酸酶測定法。
10.治療疾病的方法，包括a)提供i)受試者，其中所述受試者患有疾病，該疾病包含缺陷型細(xì)胞，其中所述缺陷型細(xì)胞包含缺陷型TSC途徑；ii)藥劑；其中所述藥劑能降低細(xì)胞ATP水平；以及b)向所述受試者施用所述藥劑；其中所述藥劑靶向所述缺陷型細(xì)胞。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述藥劑選自己糖激酶抑制劑、2-脫氧-葡萄糖、PKC抑制劑、楸毒素和5-氨基咪唑-4-羧酰胺核糖核苷酸。
12.權(quán)利要求10的方法，其中所述藥劑為線粒體解偶聯(lián)劑FCCP。
13.權(quán)利要求10的方法，還包括共施用雷帕霉素。
14.權(quán)利要求10的方法，其中所述的疾病是結(jié)節(jié)性硬化癥。
15.權(quán)利要求10的方法，其中所述的疾病是癌癥。
16.權(quán)利要求10的方法，其中所述的疾病是心臟肥大。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述藥劑是雷帕霉素。
18.權(quán)利要求10的方法，其中所述缺陷型TSC途徑包括選自TSC1、TSC2、Rheb、mTOR、S6K和4EBP-1中的所述TSC途徑的缺陷型元件。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于鑒定TSC信號傳導(dǎo)途徑中的異常的組合物和方法。特別地，本發(fā)明涉及診斷和治療諸如結(jié)節(jié)性硬化癥之類病癥的方法，所述病癥是由TSC基因中的突變引起的。本發(fā)明還涉及用于治療由TSC信號傳導(dǎo)紊亂介導(dǎo)的癌癥的方法和組合物。
文檔編號G01N33/53GK1910291SQ200480040394
公開日2007年2月7日 申請日期2004年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月24日
發(fā)明者K-L·關(guān) 申請人:密歇根大學(xué)董事會