專利名稱：自校正流通測(cè)定裝置的制作方法
背景技術(shù)：
多種不同的分析方法和設(shè)備普遍用于流通測(cè)定中，用于確定測(cè)試樣品中可能存在的分析物的存在和/或濃度。例如，免疫測(cè)定法利用免疫系統(tǒng)機(jī)制，其中抗體是響應(yīng)作為有機(jī)體的病原或外源的抗原的存在而產(chǎn)生的。這些抗體和抗原即免疫反應(yīng)物能夠彼此結(jié)合，借此產(chǎn)生能夠用來(lái)確定生物樣品中特定抗原的存在或濃度的高度特異性反應(yīng)機(jī)制。
有幾種公知的免疫測(cè)定法，這些方法利用由可檢測(cè)的成分標(biāo)記的免疫反應(yīng)物，從而能夠?qū)Ψ治鑫镞M(jìn)行分析檢測(cè)。例如，“夾心型”測(cè)定法一般涉及使測(cè)試樣品與可檢測(cè)的探針(例如染色乳膠或放射性同位素)混合，這些探針與分析物的特異性結(jié)合部分綴合。綴合探針(conjugated probes)與分析物形成復(fù)合物。這些復(fù)合物然后到達(dá)固定抗體區(qū)，在此處抗體與分析物之間發(fā)生結(jié)合，從而形成三元的“夾心復(fù)合物”。夾心復(fù)合物位于用于檢測(cè)分析物的區(qū)域。此技術(shù)用來(lái)獲得定量或半定量結(jié)果。這些夾心型測(cè)定的一些實(shí)例在Grubb等人的U.S.4,168,146和Tom等人的U.S.4,366,241中有所描述。
另一種技術(shù)是“競(jìng)爭(zhēng)型”測(cè)定。在“競(jìng)爭(zhēng)型”測(cè)定中，標(biāo)記物一般是與樣品中存在的任何未標(biāo)記分析物競(jìng)爭(zhēng)與抗體結(jié)合的標(biāo)記分析物或分析物類似物。競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定法一般用于檢測(cè)諸如半抗原之類的分析物，每種半抗原是單價(jià)的并且僅能夠結(jié)合一個(gè)抗體分子。競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定裝置的實(shí)例在Deutsch等人的U.S.4,235,601、Liotta的U.S.4,442,204和Buechler等人的U.S.5,208,535中有所描速。
這些測(cè)定法中的許多種類都依賴于校正來(lái)提供有效和有意義的結(jié)果，特別是對(duì)于半定量和定量檢測(cè)而言。具體地說(shuō)，通?？刹捎猛獠炕騼?nèi)部校正系統(tǒng)。在外部校正系統(tǒng)中，由含有一組已知量分析物的標(biāo)準(zhǔn)樣品獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后將從樣品獲得的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，以便求出樣品中分析物的存在和/或數(shù)量。外部校正方法相對(duì)容易設(shè)計(jì)和簡(jiǎn)便實(shí)施。然而，其經(jīng)常受到環(huán)境和逐批差異的影響，因此是不可靠的。
另一方面，傳統(tǒng)的內(nèi)部校正系統(tǒng)一般采用具有校正區(qū)和檢測(cè)區(qū)的膜，在檢測(cè)區(qū)上固定有特異于分析物的捕獲試劑。遺憾的是，校正區(qū)提供可靠準(zhǔn)確的與檢測(cè)區(qū)的比較結(jié)果的能力經(jīng)常受到限制。此外，大多數(shù)內(nèi)部校正區(qū)相對(duì)昂貴，因此它們對(duì)某些應(yīng)用領(lǐng)域是不實(shí)際的。
因此，目前需要一種準(zhǔn)確廉價(jià)的流通測(cè)定的準(zhǔn)確校正系統(tǒng)。
發(fā)明概述按照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，公開(kāi)了一種能夠檢測(cè)測(cè)試樣品中分析物的存在或數(shù)量的流通測(cè)定裝置(例如夾心型、競(jìng)爭(zhēng)型等)。這種測(cè)定裝置包括與檢測(cè)探針和校正探針相通的多孔膜，所述的兩種探針能夠分別產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)和校正信號(hào)。例如，在一些實(shí)施方案中，探針選自發(fā)色團(tuán)、催化劑、熒光化合物、化學(xué)發(fā)光化合物、磷光化合物、放射性化合物、直接目視標(biāo)記物、脂質(zhì)體、以及這些物質(zhì)的組合。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，探針含有膠乳微粒。
多孔膜限定出檢測(cè)/校正區(qū)，在該區(qū)域內(nèi)固定有直接或間接與檢測(cè)探針、校正探針或它們的組合結(jié)合的聚電解質(zhì)捕獲試劑?？刹捎米鳛榉治鑫锏奶禺愋越Y(jié)合部分(member)的第二捕獲試劑。檢測(cè)/校正區(qū)能夠產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)和校正信號(hào)，從而能夠由校正信號(hào)校正的檢測(cè)信號(hào)確定分析物的量。
按照本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，公開(kāi)了一種用于檢測(cè)測(cè)試樣品中分析物的存在或數(shù)量的方法。該方法包括提供流通測(cè)定裝置。含有分析物的測(cè)試樣品與所述裝置中存在的檢測(cè)探針和校正探針接觸。在檢測(cè)/校正區(qū)，測(cè)定檢測(cè)信號(hào)和校正信號(hào)的強(qiáng)度。測(cè)試樣品內(nèi)分析物的量與用校正信號(hào)強(qiáng)度校正的檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度成正比。
以下更詳細(xì)地論述本發(fā)明的其它特征和方面。
附圖簡(jiǎn)述本發(fā)明的全面和可實(shí)施的內(nèi)容，包括其最佳方式，針對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，都參照附圖在說(shuō)明書的剩余部分得到更加具體的闡述，其中

圖1是本發(fā)明的流通測(cè)定裝置的一個(gè)實(shí)施方案的透視圖；圖2圖示出抗體與羧基化納米顆粒共價(jià)綴合的一個(gè)實(shí)施方案；
圖3是本發(fā)明的流通測(cè)定裝置的一個(gè)實(shí)施方案的示意圖；圖4是本發(fā)明的流通測(cè)定裝置的另一個(gè)實(shí)施方案的示意圖；圖5是本發(fā)明的流通測(cè)定裝置的又一個(gè)實(shí)施方案的示意圖；圖6是本發(fā)明的流通測(cè)定裝置的另一個(gè)實(shí)施方案的示意圖。
附圖標(biāo)記在本說(shuō)明書和附圖中的重復(fù)使用意味著其代表本發(fā)明的相同或類似特征或部件。
代表性實(shí)施方案詳述定義正如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“分析物”通常是指待檢測(cè)的物質(zhì)。例如，分析物可包括抗原性物質(zhì)、半抗原、抗體以及這些物質(zhì)的組合。分析物包括但不限于毒素、有機(jī)化合物、蛋白質(zhì)、肽、微生物、氨基酸、核酸、激素、類固醇、維生素、藥物(包括那些為了治療目的而施用的藥物和那些為了違法目的而施用的藥物)、藥物中間體或副產(chǎn)物、細(xì)菌、病毒顆粒以及任何上述物質(zhì)的代謝物或抗體。一些分析物的具體實(shí)例包括鐵蛋白；肌酸激酶MIB(CK-MB)；地高辛；苯妥英；苯巴比妥；卡馬西平；萬(wàn)古霉素；慶大霉素；茶堿；丙戊酸；奎尼定；促黃體生成激素(LH)；促卵泡激素(FSH)；雌二醇、黃體酮；C-反應(yīng)蛋白；lipocalins；IgE抗體；維生素B2微球蛋白；糖化血紅蛋白(Gly、Hb)；氫化可的松；毛地黃毒苷；N-乙酰普魯卡因酰胺(NAPA)；普魯卡因酰胺；風(fēng)疹抗體，例如風(fēng)疹-IgG和風(fēng)疹I(lǐng)gM；毒胞質(zhì)抗體，例如毒胞質(zhì)IgG(Toxo-IgG)和毒胞質(zhì)IgM(Toxo-IgM)；睪酮；水楊酸鹽；乙酰氨基苯酚；乙肝病毒表面抗原(HBsAg)；乙肝核心抗原的抗體，例如抗-乙肝核心抗原IgG和IgM(抗-HBC)；人免疫缺陷病毒1和2(HIV1和2)；人T-細(xì)胞白血病病毒1和2(HTLV)；乙肝e抗原(HBeAg)；乙肝e抗原的抗體(抗-HBe)；促甲狀腺素(TSH)；甲狀腺素(T4)；全三碘甲狀腺原氨酸(全T3)；游離三碘甲狀腺原氨酸(游離T3)；癌胚抗原(CEA)；以及α-胎兒蛋白(AFP)。濫用和受控物質(zhì)的藥物包括但不限于麻黃堿；脫氧麻黃堿；巴比妥酸鹽，例如異戊巴比妥、司可巴比妥、戊巴比妥、苯巴比妥和巴比妥；苯二氮雜類，例如利眠寧和安定；大麻素類，例如印度大麻和大麻；可卡因；芬太尼；LSD；安眠酮；鴉片制劑，例如海洛因、嗎啡、可待因、鹽酸二氫嗎啡酮、氫可酮、美沙酮、氧可酮、氧嗎啡酮和鴉片；苯環(huán)利定；和丙氧吩。其它潛在的分析物在Everhart等人的U.S.6,436,651和Tom等人的U.S.4,366,241中有所描述。
本文所用術(shù)語(yǔ)“測(cè)試樣品”通常是指被懷疑含有分析物的材料。測(cè)試樣品可從源體獲得后直接使用，或者進(jìn)行預(yù)處理以改善樣品的特性。測(cè)試樣品可來(lái)自任何生物源，例如生理流體，包括血液、唾液、眼晶狀體液、腦脊髓液、汗液、尿液、乳液、腹水、raucous、滑液、腹膜液、羊膜液等。測(cè)試樣品在使用前可預(yù)處理，例如用血液制備血漿、稀釋粘稠液等。處理方法包括過(guò)濾、蒸餾、濃縮、干擾成分的滅活、以及試劑的加入。除了生理流體之外，還可以使用其它液態(tài)樣品，例如用于環(huán)境或食品產(chǎn)生性能測(cè)定的水、食品等。此外，被懷疑含有分析物的固體材料也可用作測(cè)試樣品。在一些情況下，有益的是，改善固體測(cè)試材料以形成液態(tài)介質(zhì)或釋放分析物。
詳細(xì)描述現(xiàn)在詳細(xì)參照本發(fā)明的多個(gè)不同實(shí)施方案，其中的一個(gè)或多個(gè)實(shí)例在以下列出。每個(gè)實(shí)例都是為了解釋本發(fā)明，而對(duì)本發(fā)明沒(méi)有限定作用。事實(shí)上，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，在不脫離本發(fā)明的范圍或精髓的情況下能夠?qū)Ρ景l(fā)明作出多種修改和變型。例如，作為實(shí)施方案的一部分而闡述或描述的特征可用在另一個(gè)實(shí)施方案上，從而產(chǎn)生又一個(gè)實(shí)施方案。于是，本發(fā)明意在覆蓋這樣的修改和變型，即它們?cè)谒降臋?quán)利要去書及其等同物的范圍內(nèi)。
總體上，本發(fā)明涉及一種用于流通測(cè)定裝置的內(nèi)部自校正系統(tǒng)。具體地說(shuō)，本發(fā)明利用由測(cè)定裝置的多孔膜限定出的單個(gè)檢測(cè)/校正區(qū)的用途。通過(guò)消除環(huán)境因素，例如溫度、pH和檢測(cè)信號(hào)的儀器不穩(wěn)定性的影響，同時(shí)實(shí)施信號(hào)檢測(cè)和內(nèi)部校正能夠大大增加檢測(cè)的可靠性和重復(fù)性。
例如，參照?qǐng)D1，現(xiàn)在更詳細(xì)地描述按照本發(fā)明形成的流通測(cè)定裝置20的一個(gè)實(shí)施方案。如圖所示，裝置20包含任選由剛性材料21支撐著的多孔膜23。通常，多孔膜23可以由測(cè)試樣品能夠通過(guò)的任何材料制成。例如，用來(lái)形成多孔膜23的材料可包括但不限于天然材料、合成材料、或者天然存在的、被合成改性的材料，例如多糖(諸如紙和纖維素衍生物之類的纖維素材料，例如醋酸纖維素和硝基纖維素)；硅石；均勻分散在多孔聚合物基質(zhì)中的無(wú)機(jī)材料，例如去活氧化鋁、硅藻土、MgSO4或其它無(wú)機(jī)細(xì)碎材料，其中聚合物為例如氯乙烯、氯乙烯-丙烯共聚物和氯乙烯-醋酸乙烯酯共聚物；布，包括天然存在的(例如棉花)及合成的(例如尼龍或人造纖維)；多孔凝膠，例如硅膠、瓊脂糖、右旋糖苷和明膠；聚合物膜，例如聚丙烯酰胺等等。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，多孔膜23是由硝基纖維素和/或聚酯砜材料形成的。應(yīng)該理解，術(shù)語(yǔ)“硝基纖維素”是指纖維素的硝酸酯，其可以是單獨(dú)的硝基纖維素，或者是硝酸與其它酸(例如具有1-7個(gè)碳原子的脂肪族羧酸)的混合酯。
裝置20還可以包含芯吸(wicking)墊28。芯吸墊28通常接收已經(jīng)通過(guò)整個(gè)多孔膜23遷移的流體。正如本領(lǐng)域內(nèi)所公知的，芯吸墊28有助于促進(jìn)毛細(xì)作用和通過(guò)膜23的流體流動(dòng)。
為了在測(cè)試樣品內(nèi)啟動(dòng)分析物的檢測(cè)，使用者可直接將測(cè)試樣品加入到一部分多孔膜23上，然后樣品可通過(guò)膜23移動(dòng)到達(dá)檢測(cè)/校正區(qū)31(在下面描述)?；蛘呤?，測(cè)試樣品可以先加到與多孔膜23以流體相通的取樣墊(未示出)上。可用來(lái)形成取樣墊的一些適宜材料包括但不限于硝基纖維素、纖維素、多孔聚乙烯墊和玻璃纖維濾紙。如果需要的話，取樣墊還可含有擴(kuò)散地或非擴(kuò)散地附著到其上的一種或多種測(cè)定預(yù)處理試劑。
在圖示的實(shí)施方案中，測(cè)試樣品從取樣墊(未示出)移動(dòng)到以與取樣墊一端相通的方式放置的綴合墊22上。綴合墊22由測(cè)試樣品能夠通過(guò)的材料形成。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，綴合墊22由玻璃纖維形成。雖然僅僅示出一個(gè)綴合墊22，但是應(yīng)該理解，其它綴合墊也可用于本發(fā)明。
為了易于準(zhǔn)確檢測(cè)測(cè)試樣品內(nèi)分析物的存在或缺乏，將探針施加在裝置20的多個(gè)不同部位。如以下更詳細(xì)描述的，探針用于分析物的檢測(cè)和校正。通常能夠產(chǎn)生可目視檢測(cè)或通過(guò)儀器設(shè)備檢測(cè)的信號(hào)的任何物質(zhì)都可以用作探針。各種合適的物質(zhì)包括發(fā)色團(tuán)；催化劑；熒光化合物；化學(xué)發(fā)光化合物；磷光化合物；放射性化合物；直接目視標(biāo)記物，包括膠狀金屬(例如金)和非金屬顆粒、染料顆粒、酶或底物、或有機(jī)聚合物膠乳顆粒；脂質(zhì)體或含有信號(hào)生成物的其它囊泡等等。例如，適合用作探針的一些酶公開(kāi)在Litman等人的U.S.4,275,149中，該文獻(xiàn)在此作為參考全部引入本文。酶/底物系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)例是酶堿性磷酸酶和底物硝基藍(lán)四唑-5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽、或者這些物質(zhì)的衍生物或類似物、或者底物4-甲基傘形基(umbelliferyl)-磷酸鹽。其它合適的探針在Jou等人的U.S.5,670,381和Tarcha等人的U.S.5,252,459中有所描述，這些文獻(xiàn)在此作為參考全部引入本文。
在一些實(shí)施方案中，探針可含有產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的熒光化合物。熒光化合物可以是熒光分子、聚合物、樹(shù)枝狀物質(zhì)、顆粒等等。合適熒光分子的一些實(shí)例例如包括但不限于熒光素、銪螯合物、藻膽蛋白質(zhì)、若丹明以及這些物質(zhì)的衍生物和類似物?？赡恳暀z測(cè)的有色化合物也能夠用作探針，借此在無(wú)需其它信號(hào)生成試劑的情況下，提供了樣品中分析物的存在或濃度的直接有色讀數(shù)。
探針，諸如如上所述的探針，可單獨(dú)使用或與微粒(有時(shí)稱作“珠”或“微珠”)結(jié)合使用。例如，可使用天然存在的微粒，例如晶核、支原體、質(zhì)粒、質(zhì)體、哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如紅細(xì)胞血影)、單細(xì)胞微生物(例如細(xì)菌)、多糖(例如瓊脂糖)等等。此外，還可采用合成微粒。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，采用用熒光染料或有色染料標(biāo)記的膠乳微粒。雖然任何膠乳微粒都可用于本發(fā)明，但是膠乳微粒一般是由以下物質(zhì)形成的聚苯乙烯、丁二烯苯乙烯、苯乙烯-丙烯酸-乙烯基三元共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、苯乙烯-馬來(lái)酐共聚物、聚醋酸乙烯酯、聚乙烯基吡啶、聚二乙烯基苯、聚對(duì)苯二甲酸丁二酯、丙烯腈、氯乙烯-丙烯酸酯等，或者這些物質(zhì)的酐、羧基、氨基、羥基或酰肼衍生物。其它合適的微粒在Jou等人的U.S.5,670,381和Tarcha等人的U.S.5,252,459中有所描述，這些文獻(xiàn)在此作為參考全部引入本文。一些商業(yè)上可購(gòu)得的合適熒光顆粒的實(shí)例包括商品名為“FluoSphere”(Red580/605)和“TransfluoSphere”(543/620)、由Molecular Probes，Inc.出售的熒光羧基化微球，以及也是由Molecular Probes，Inc.出售的“Texas Red”和5-及6-羧基四甲基若丹明。商業(yè)上可購(gòu)得的合適有色膠乳微粒的實(shí)例包括由Bang’sLaboratory，Inc.出售的羧基化膠乳珠。
當(dāng)探針是顆粒時(shí)，諸如以上所述的顆粒，顆粒的平均直徑通?？筛鶕?jù)諸如所選顆粒類型、膜的孔徑和膜成分之類的因素按需改變。例如，在一些實(shí)施方案中，顆粒狀標(biāo)記物的平均直徑可為約0.01微米-約1000微米。在一些實(shí)施方案中為約0.01微米-約100微米，而在一些實(shí)施方案中為約0.01微米-約10微米。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，顆粒具有約0.1微米-約2微米的平均直徑。通常，顆?；旧鲜乔蛐蔚?，但是包括但不限于板形、桿形、棒形、不規(guī)則形狀等的其它形狀也適用于本發(fā)明。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，顆粒的成分、形狀、尺寸和/或密度可廣泛變化。
在一些情況下，需要用一些方式來(lái)給探針改性，以便使探針能夠更容易地結(jié)合到分析物上。在這樣的情況下，探針用某些粘附到其上的特異性結(jié)合部分來(lái)改性，以形成探針綴合物。特異性結(jié)合部分通常是指特異性結(jié)合對(duì)，即兩個(gè)不同的分子，其中一個(gè)分子化學(xué)和/或物理結(jié)合到第二個(gè)分子上的一員。例如，免疫反應(yīng)特異性結(jié)合部分可包括抗原、半抗原、適體(aptamers)、抗體和這些物質(zhì)的復(fù)合物，包括那些通過(guò)DNA重組方法或肽合成而形成的物質(zhì)?？贵w可以是單克隆或多克隆抗體、重組蛋白質(zhì)或其混合物或片段，以及抗體和其它特異性結(jié)合部分的混合物。這些抗體的制備細(xì)節(jié)和它們用作特異性結(jié)合部分的適宜性是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。其它通常的特異性結(jié)合對(duì)包括但不限于生物素和親和素、糖類和凝集素、互補(bǔ)核苷酸序列(包括用于DNA雜交測(cè)定中的探針和捕獲核酸序列，用于檢測(cè)靶核酸序列)、互補(bǔ)肽序列(包括用重組方法形成的那些互補(bǔ)肽序列)、效應(yīng)子和受體分子、激素和激素結(jié)合蛋白、酶輔因子和酶、酶抑制劑和酶等。此外，特異性結(jié)合對(duì)可包括作為原始特異性結(jié)合部分類似物的部分。例如，可使用分析物的衍生物或片段，即分析物-類似物，只要它具有至少一個(gè)與分析物共同的表位即可。
特異性結(jié)合部分一般可利用任何各種公知技術(shù)附著到探針上。例如，特異性結(jié)合部分對(duì)探針(例如微粒)的共價(jià)附著，可利用羧基、氨基、醛基、溴乙酰基、碘乙?；?、巰基、環(huán)氧基和其它反應(yīng)性或連接性官能團(tuán)以及殘余的游離基和游離基陽(yáng)離子來(lái)實(shí)現(xiàn)，通過(guò)這些基團(tuán)可完成蛋白偶合反應(yīng)。還可包括作為官能化共聚單體的表面官能團(tuán)，因?yàn)槲⒘５谋砻婵珊休^高表面濃度的極性基團(tuán)。此外，雖然微粒探針經(jīng)常在合成之后官能化，在某些情況下例如為聚(苯硫酚)，但是微粒能夠與蛋白質(zhì)直接共價(jià)連接，而無(wú)需進(jìn)一步改性。例如，參照?qǐng)D2，該圖表示出用于共價(jià)綴合探針的本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案。如圖所示，綴合的第一個(gè)步驟是，用碳二亞胺活化探針表面上的羧基。在第二個(gè)步驟中，活化的羧酸基團(tuán)與抗體的氨基反應(yīng)，從而形成酰胺鍵?；罨?或抗體偶合可發(fā)生在緩沖液中，例如磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)(例如pH為7.2)或2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)(例如pH為5.3)。如圖所示，所獲得的探針然后可例如用乙醇胺封閉，從而形成探針綴合物。除了共價(jià)鍵合之外，其它附著技術(shù)，例如物理吸附，也可用于本發(fā)明。
再參照?qǐng)D1，裝置20也包括檢測(cè)/校正區(qū)31。檢測(cè)/校正區(qū)31一般提供單個(gè)的不同的檢測(cè)/校正區(qū)(例如線、點(diǎn)等)，以便使用者能夠在沿裝置的一個(gè)部位準(zhǔn)確確定測(cè)試樣品內(nèi)特定分析物的濃度。例如，在圖示的實(shí)施方案中，采用單線。
而且，此線可位于基本上垂直于通過(guò)裝置20的測(cè)試樣品流的方向上。同樣，在一些實(shí)施方案中，此線位于基本上平行于通過(guò)裝置20的測(cè)試樣品流的方向上。
檢測(cè)/校正區(qū)31含有一種或多種能夠直接或間接地結(jié)合到探針上的固定捕獲試劑(即，與探針綴合的特異性結(jié)合部分、與探針復(fù)合的分析物等)。在一些實(shí)施方案中，第一固定捕獲試劑被構(gòu)造為結(jié)合到檢測(cè)探針上，而第二捕獲試劑被構(gòu)造為結(jié)合到校正探針上。第一和第二固定捕獲試劑可以相同或不同。
一般來(lái)說(shuō)，各種類型的捕獲試劑均可固定在檢測(cè)/校正區(qū)31內(nèi)。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，捕獲試劑可以與作為用來(lái)形成探針綴合物的特異性結(jié)合部分的同一種類或類別材料(例如抗體、抗原、它們的類似物等)相同或由其形成。這樣，在該實(shí)施方案中，捕獲試劑在結(jié)合到分析物上時(shí)可用作探針的固定結(jié)合位點(diǎn)。具體地說(shuō)，分析物，例如抗體、抗原等可具有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。在到達(dá)檢測(cè)/校正區(qū)31并通過(guò)綴合墊22之后，這些結(jié)合位點(diǎn)之一被綴合到探針上的特異性結(jié)合部分所占據(jù)。然而，分析物的游離結(jié)合位點(diǎn)可結(jié)合到固定捕獲試劑上。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，固定捕獲試劑可以是通過(guò)離子的相互作用直接或間接結(jié)合到探針上的聚電解質(zhì)。例如，聚電解質(zhì)可具有凈正電或負(fù)電荷，以及通常為中性的凈電荷。具有凈正電荷的聚電解質(zhì)的一些適宜實(shí)例包括但不限于聚賴氨酸(在商業(yè)上從Sigma-AldrichChemical Co.，Inc.of St.Louis，Missouri購(gòu)得)、聚乙烯亞胺；環(huán)氧氯丙烷官能化的聚胺和/或聚酰胺型胺類，例如聚(二甲基胺-共-環(huán)氧氯丙烷)；聚二烯丙基二甲基-氯化銨；陽(yáng)離子纖維素衍生物，例如用季銨鹽水溶性單體接枝的纖維素共聚物或纖維素衍生物等等。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，可采用作為含有季銨鹽水溶性單體的纖維素衍生物的CelQuatSC-230M或H-100(從National Starch&Chemical，Inc.購(gòu)得)。此外，具有凈負(fù)電荷的聚電解質(zhì)的一些適宜實(shí)例包括但不限于聚丙烯酸，例如聚(乙烯-共-甲基丙烯酸，鈉鹽)等等。還應(yīng)該理解，其它聚電解質(zhì)也可用于本發(fā)明，例如兩親聚電解質(zhì)(即具有極性和非極性部分)。例如，合適的兩親聚電解質(zhì)的一些實(shí)例包括但不限于聚(苯乙烯基-b-N-甲基2-乙烯基碘化吡啶鎓)和聚(苯乙烯基-b-丙烯酸)，它們可從Polymer Scource，Inc.of Dorval，Canada購(gòu)得。
雖然通常可使用任何聚電解質(zhì)，但是為特定應(yīng)用而選擇的聚電解質(zhì)可根據(jù)探針的性質(zhì)、特異性結(jié)合部分、感興趣的分析物、多孔膜的類型等而變化。尤其是，聚電解質(zhì)所分布的電荷使其結(jié)合到具有相反電荷的物質(zhì)上。這樣，例如，經(jīng)常較好地配備具有凈正電荷的聚電解質(zhì)，以便與帶負(fù)電的探針結(jié)合，而經(jīng)常較好地配備具有凈負(fù)電荷的聚電解質(zhì)，以便與帶正電的探針結(jié)合。因此，在這樣的情形下，這些分子之間的離子相互作用使所需的結(jié)合發(fā)生在檢測(cè)/校正區(qū)31內(nèi)。不過(guò)，雖然離子的相互作用主要用來(lái)實(shí)現(xiàn)所需的結(jié)合，但是聚電解質(zhì)也能夠與具有相似電荷的探針結(jié)合。
因?yàn)榫垭娊赓|(zhì)被設(shè)計(jì)成與探針結(jié)合，所以一般期望聚電解質(zhì)基本上非擴(kuò)散地固定在多孔膜23的表面上。這樣，聚電解質(zhì)能以聚電解質(zhì)基本上不擴(kuò)散到多孔膜23的基質(zhì)中的方式施加到多孔膜23上。尤其是，聚電解質(zhì)一般與多孔膜23的表面上存在的官能團(tuán)形成離子和/或共價(jià)鍵，以便它們?nèi)匀还潭ㄔ谄渖稀ｋm然不是必需的，但是期望聚電解質(zhì)與多孔膜23之間形成共價(jià)鍵，以便將聚電解質(zhì)更持久地固定在其上。
例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，用來(lái)形成聚電解質(zhì)的單體先形成溶液，然后直接施加到多孔膜23上。各種溶劑(例如有機(jī)溶劑、水等)可用來(lái)形成該溶液。一旦施加，單體的聚合就用熱量、電子束輻射、自由基聚合等來(lái)啟動(dòng)。在一些情況中，隨著單體聚合，它們與多孔膜23的某些官能團(tuán)形成共價(jià)鍵，借此將所生成的聚電解質(zhì)固定在其上。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，乙烯亞胺單體能夠與一些多孔膜(例如硝基纖維素)表面上存在的羧基形成共價(jià)鍵。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，聚電解質(zhì)能夠在施加到多孔膜23上之前形成。如果需要的話，聚電解質(zhì)可先利用有機(jī)溶劑、水等形成溶液。其后，聚電解質(zhì)溶液直接施加到多孔膜23上，然后進(jìn)行干燥。干燥之后，聚電解質(zhì)可如上所述，與多孔膜23表面上存在的具有與聚電解質(zhì)相反電荷的某些官能團(tuán)形成離子鍵。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，帶正電的聚乙烯亞胺可與一些多孔膜(例如硝基纖維素)表面上存在的帶負(fù)電的羧基形成離子鍵。
此外，聚電解質(zhì)還可利用各種公知技術(shù)交聯(lián)到多孔膜23上。例如，在一些實(shí)施方案中，環(huán)氧氯丙烷官能化的聚胺和/或聚酰胺型胺類可用作能夠交聯(lián)的帶正電核的聚電解質(zhì)。這些材料的實(shí)例在Keim的U.S.3,700,623；Keim的U.S.3,772,076；和Keim的U.S.4,537,657中有所描述，這些文獻(xiàn)在此作為參考全部并入本文，并且據(jù)信以KymeneTM為商品名由Hercules，Inc.，Wilmington，Del.出售。例如，KymeneTM450和2064是含有環(huán)氧環(huán)和季銨鹽基團(tuán)的環(huán)氧氯丙烷官能化的聚胺和/或聚酰胺型胺化合物，這些化合物在固化時(shí)能夠與某些類型的多孔膜(例如硝基纖維素)上存在的羧基形成共價(jià)鍵并與多孔膜的聚合物骨架交聯(lián)。在一些實(shí)施方案中，交聯(lián)溫度可為約50℃-約120℃，交聯(lián)時(shí)間可為約10-約600秒。
雖然上面已經(jīng)描述了用于將聚電解質(zhì)非擴(kuò)散地固定到多孔膜23上的各種技術(shù)，但是應(yīng)該理解，任何其它非擴(kuò)散地固定聚電解質(zhì)化合物的技術(shù)均可用于本發(fā)明。事實(shí)上，上述方法僅意在作為可用于本發(fā)明的技術(shù)的示范性實(shí)例。例如，在一些實(shí)施方案中，能夠基本上抑制這些聚電解質(zhì)擴(kuò)散到多孔膜23的基質(zhì)內(nèi)的某些成分可加入到聚電解質(zhì)溶液中。
總之，可按照本發(fā)明構(gòu)建各種流通測(cè)定裝置。關(guān)于這一點(diǎn)，現(xiàn)在更詳細(xì)地描述本發(fā)明的多個(gè)不同的實(shí)施方案。然而，應(yīng)該理解，下述實(shí)施方案僅僅是示范性的，本發(fā)明還包括其它實(shí)施方案。例如，參照?qǐng)D3，該圖表示出一個(gè)特定實(shí)施方案，其中探針41用于檢測(cè)，探針43用于校正。在該實(shí)施方案中，檢測(cè)探針41加入到綴合墊22上，并且在以與測(cè)試樣品相通的方式放置時(shí)，由此能夠流過(guò)裝置20(如方向箭頭L所指示的)。檢測(cè)探針41與分析物A的特異性結(jié)合部分90綴合，因此，在探針41與分析物A接觸之后就結(jié)合到其上，從而形成分析物/探針復(fù)合物49。分析物/探針復(fù)合物49然后可流過(guò)裝置20，直到到達(dá)檢測(cè)/校正區(qū)31為止。
在檢測(cè)/校正區(qū)31內(nèi)，固定聚電解質(zhì)捕獲試劑(未示出)，以便通過(guò)離子的相互作用結(jié)合到校正探針43上。在此實(shí)施方案中，在施加測(cè)試樣品之前，校正探針43固定到聚電解質(zhì)上。校正探針43可包括例如與特異性結(jié)合部分91(例如抗體、抗原等)綴合的膠乳顆粒。在檢測(cè)/校正區(qū)31，分析物/探針復(fù)合物49可結(jié)合到校正探針43的特異性結(jié)合部分91上，從而形成夾心復(fù)合物50。任何未結(jié)合的探針41將流過(guò)檢測(cè)/校正區(qū)31。如果需要的話，可預(yù)先確定聚電解質(zhì)捕獲試劑的量，以便檢測(cè)/校正區(qū)31內(nèi)的校正信號(hào)達(dá)到其完全預(yù)定的信號(hào)強(qiáng)度電位。也就是說(shuō)，預(yù)先確定所沉積的探針43的量，因?yàn)樗捎玫木垭娊赓|(zhì)的量被設(shè)定在一個(gè)預(yù)定的公知水平。
一旦完全展開(kāi)，探針43的強(qiáng)度水平就可用來(lái)校正檢測(cè)/校正區(qū)31處的探針41的強(qiáng)度水平，以確定測(cè)試樣品中存在的分析物的量。此校正步驟可借助于讀取設(shè)備目視進(jìn)行，或利用其它技術(shù)進(jìn)行。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，探針41和43可以用熒光生成化合物來(lái)標(biāo)記，從而探針41和43的信號(hào)強(qiáng)度可以用常規(guī)技術(shù)來(lái)測(cè)定。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，探針41和43用同一外源來(lái)激發(fā)。在此實(shí)施方案中，此外源供應(yīng)激發(fā)波長(zhǎng)的輻射，借此使探針41在與探針43發(fā)射的波長(zhǎng)不同的波長(zhǎng)處發(fā)光。這使得探針41和43的存在能夠單獨(dú)測(cè)定?；蛘呤?，探針41和43還可利用分開(kāi)的外源分別測(cè)定。
一般來(lái)說(shuō)，熒光是在某些熒光化合物中發(fā)生的三級(jí)過(guò)程的結(jié)果。在第一階段，能量由外源(例如白熾燈或激光器)來(lái)提供，并被熒光化合物所吸收，從而產(chǎn)生激發(fā)的電子單態(tài)。在第二階段，激發(fā)態(tài)存在有限的時(shí)間，在該時(shí)間，熒光化合物經(jīng)歷構(gòu)象變化，還經(jīng)歷許多可能的與其分子環(huán)境的相互作用。在此期間，激發(fā)態(tài)的能量被部分消耗，從而產(chǎn)生熒光發(fā)生起源的松弛態(tài)。第三階段是能量發(fā)出的熒光發(fā)射態(tài)，使熒光化合物回到其基態(tài)。所發(fā)出的能量低于其激發(fā)能量(光或激光)，并由此具有更長(zhǎng)的波長(zhǎng)。這種能量或波長(zhǎng)的漂移或差別使發(fā)射能量被檢測(cè)到并與激發(fā)能量分開(kāi)。
熒光檢測(cè)一般采用使發(fā)射光子與激發(fā)光子分開(kāi)的濾波，和記錄發(fā)射光子并產(chǎn)生可記錄輸出(通常為電信號(hào)或攝影圖像)的檢測(cè)器。一般存在四種公認(rèn)類型的檢測(cè)器熒光光度計(jì)和微板讀數(shù)器；熒光顯微鏡；熒光掃描儀；和流式細(xì)胞儀。一種用于本發(fā)明的合適熒光檢測(cè)器是由SPEX Industries，Inc.of Edison，New Jersey出售的FluoroLog IIISpectrofluorometer。
雖然不是必需的，但是特別需要的檢測(cè)和校正探針對(duì)的選擇標(biāo)準(zhǔn)包括(1)無(wú)論是吸收光譜還是熒光光譜，都極少有或沒(méi)有光譜疊加，從而可單獨(dú)測(cè)定發(fā)射強(qiáng)度；(2)當(dāng)檢測(cè)探針與校正探針開(kāi)始靠近時(shí)，這二者之間沒(méi)有明顯的熒光能量傳遞，從而它們是獨(dú)立發(fā)射的；以及(3)具有較長(zhǎng)的發(fā)射波長(zhǎng)(例如大于約600nm)，從而生物流體的自身熒光對(duì)熒光測(cè)定的影響最小。
而且，如果需要的話，一種被稱作“時(shí)間解析熒光檢測(cè)”的技術(shù)也可用于本發(fā)明。將時(shí)間解析熒光檢測(cè)設(shè)計(jì)成通過(guò)利用某些熒光材料(例如銪(Eu(III))和鋱(Tb(III))的鑭系螯合物)的熒光特征，能夠減小來(lái)自發(fā)射源或來(lái)自散射過(guò)程(由激發(fā)輻射的散射所導(dǎo)致的)的背景信號(hào)。這些螯合物能夠在明顯更短的波長(zhǎng)激發(fā)之后表現(xiàn)出強(qiáng)烈的紅移、窄帶、長(zhǎng)壽命的發(fā)射。典型的是，螯合物由于分子中的發(fā)色團(tuán)靠近鑭系元素而擁有強(qiáng)的紫外吸收帶。在發(fā)色團(tuán)吸收光之后，激發(fā)能量可從所激發(fā)的發(fā)色團(tuán)傳遞到鑭系元素。這符合鑭系元素的熒光發(fā)射特征。利用合并有窄帶發(fā)射濾波器的脈沖激發(fā)和時(shí)間門檢測(cè)，僅能特異性檢測(cè)來(lái)自鑭系螯合物的熒光，而拒絕來(lái)自樣品中存在的其它物種的發(fā)射(一般是較短壽命的或具有較短波長(zhǎng)的發(fā)射)。用于測(cè)定熒光的其它時(shí)間解析技術(shù)在Davidson的U.S.5,585,279和Hemmila等人的U.S.5,637,509中有所描速，這些文獻(xiàn)在此作為參考并入本文。
不考慮用來(lái)測(cè)定探針41和43的信號(hào)強(qiáng)度的技術(shù)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，單個(gè)檢測(cè)/校正區(qū)31的使用能夠使檢測(cè)和校正探針41和43在裝置20的同一部位進(jìn)行測(cè)定。這個(gè)“單個(gè)測(cè)定部位”方法為測(cè)定裝置的使用者，尤其是那些把家庭和護(hù)理點(diǎn)應(yīng)用作為目標(biāo)的使用者，提供了一種簡(jiǎn)單的吸引人的方法。
在檢測(cè)/校正區(qū)31，由用校正探針43的信號(hào)強(qiáng)度所校正的檢測(cè)探針41的信號(hào)強(qiáng)度確定分析物的量。具體地說(shuō)，探針43的總量是預(yù)先確定和已知的，由此能夠用于校正目的。這樣，測(cè)試樣品中分析物的量與Is(探針41的信號(hào)強(qiáng)度)成正比，而探針43的信號(hào)強(qiáng)度Ic應(yīng)該保持相對(duì)穩(wěn)定，而不管分析物是否存在。基于此校正值所屬的強(qiáng)度范圍，可以確定分析物的總體濃度范圍。結(jié)果，在大致相同的條件下同時(shí)進(jìn)行校正和樣品的測(cè)試，由此提供了具有提高的靈敏度的可靠定量或半定量結(jié)果。
如果需要的話，在已知的分析物濃度范圍，作出Is和Ic之比與分析物濃度的曲線，從而產(chǎn)生校正曲線。為了確定未知測(cè)試樣品中分析物的量，可隨后根據(jù)校正曲線將信號(hào)比轉(zhuǎn)換成分析物的濃度。應(yīng)該注意，可以作出Is和Ic的替換型數(shù)學(xué)關(guān)系與分析物濃度的曲線，從而產(chǎn)生校正曲線。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，可以作出Is/(Is+Ic)值與分析物濃度的曲線，從而產(chǎn)生校正曲線。
參照?qǐng)D4，該圖表示出另一個(gè)實(shí)施方案，其中探針41用于檢測(cè)，探針43用于校正。檢測(cè)探針41施加到綴合墊22上，并且由此在以與測(cè)試樣品相通的方式放置時(shí)能夠流過(guò)裝置20(如方向箭頭L所示)。檢測(cè)探針41與分析物A的特異性結(jié)合部分90綴合，因此在探針41接觸分析物A之后就結(jié)合到其上，從而形成分析物/探針復(fù)合物49。分析物/探針復(fù)合物49然后可流過(guò)裝置20，直到它們到達(dá)檢測(cè)/校正區(qū)31為止。校正探針43經(jīng)聚電解質(zhì)捕獲試劑固定在檢測(cè)/校正區(qū)31內(nèi)。例如，校正探針43可包括標(biāo)記微粒、聚合物或通過(guò)離子相互作用結(jié)合到聚電解質(zhì)上的分子。此外，特異性結(jié)合部分91(例如抗體、抗原等)也單獨(dú)固定在檢測(cè)/校正區(qū)31內(nèi)?；跈z測(cè)探針41的性質(zhì)，復(fù)合物49或未結(jié)合的探針41都沒(méi)有結(jié)合到聚電解質(zhì)捕獲試劑上。相反，分析物/探針復(fù)合物49結(jié)合到特異性結(jié)合部分91上，從而形成復(fù)合物50，且任何未結(jié)合的探針41都流過(guò)檢測(cè)/校正區(qū)31。一旦完全展開(kāi)，就可以確定檢測(cè)/校正區(qū)31上的探針41的強(qiáng)度信號(hào)Is，以便計(jì)算測(cè)試樣品中存在的分析物的量。在該實(shí)施方案中，測(cè)試樣品中的分析物的量與Is成正比。此外，校正探針43的強(qiáng)度信號(hào)Ic也可用來(lái)校正Is。例如，在已知的分析物濃度范圍，作出Is和Ic之比與分析物濃度的曲線，從而產(chǎn)生校正曲線。
參照?qǐng)D5，該圖表示出又一個(gè)實(shí)施方案，其中探針41用于檢測(cè)，探針43用于校正。檢測(cè)探針41和校正探針43施加到綴合墊22上，并且由此在以與測(cè)試樣品相通的方式放置時(shí)能夠流過(guò)裝置20(如方向箭頭L所示)。檢測(cè)探針41與分析物A的特異性結(jié)合部分90綴合，因此在探針41接觸分析物A之后就結(jié)合到其上，從而形成分析物/探針復(fù)合物49。分析物/探針復(fù)合物49然后可流過(guò)裝置20，直到它們到達(dá)檢測(cè)/校正區(qū)31為止。聚電解質(zhì)固定到檢測(cè)/校正區(qū)31內(nèi)，以便通過(guò)離子相互作用與校正探針43(例如標(biāo)記的微粒、聚合物或分子)選擇性結(jié)合。具體地說(shuō)，探針43的尺寸小于探針41的，從而探針43在探針41之前到達(dá)檢測(cè)/校正區(qū)31，并占據(jù)由聚電解質(zhì)提供的所有結(jié)合位點(diǎn)?；蛘呤?，探針41和43的電荷使得僅有探針43結(jié)合到聚電解質(zhì)上。在任何情況下，特異性結(jié)合部分91(例如抗體、抗原等)也單獨(dú)固定在檢測(cè)/校正區(qū)31內(nèi)。在檢測(cè)/校正區(qū)31，分析物/探針復(fù)合物49可結(jié)合到特異性結(jié)合部分91上，從而形成復(fù)合物50。任何未結(jié)合的探針41都流過(guò)檢測(cè)/校正區(qū)31。一旦完全展開(kāi)，就可以確定檢測(cè)/校正區(qū)31上的探針41的強(qiáng)度信號(hào)Is，以便計(jì)算測(cè)試樣品中存在的分析物的量。在該實(shí)施方案中，測(cè)試樣品中分析物的量與Is成正比。此外，校正探針43的強(qiáng)度信號(hào)Ic也可用來(lái)校正Is。例如，在已知的分析物濃度范圍，作出Is和Ic之比與分析物濃度的曲線，從而產(chǎn)生校正曲線。
在一些實(shí)施方案中，裝置20可包含易于檢測(cè)感興趣的分析物的附加區(qū)。例如，如圖6所示，裝置20可包含位于檢測(cè)/校正區(qū)31上游的捕獲區(qū)33。捕獲區(qū)33含有特異于檢測(cè)探針或校正探針的第一捕獲試劑。例如，在圖示的實(shí)施方案中，檢測(cè)探針41施加到綴合墊22上，并且由此在以與測(cè)試樣品相通的方式放置時(shí)能夠流過(guò)裝置20。檢測(cè)探針41與分析物A的特異性結(jié)合部分90綴合，因此在探針41接觸分析物A之后就結(jié)合到其上，從而形成分析物/探針復(fù)合物49。分析物/探針復(fù)合物49然后可流過(guò)裝置20，直到它們到達(dá)捕獲區(qū)33為止。對(duì)應(yīng)于分析物A的特異性結(jié)合部分91(例如抗體或抗原)固定到捕獲區(qū)33內(nèi)。這樣，在捕獲區(qū)33，分析物/探針復(fù)合物49可結(jié)合到固定在其上的特異性結(jié)合部分91上，從而形成復(fù)合物50。
任何未結(jié)合的探針41然后流到檢測(cè)/校正區(qū)31。在該實(shí)施方案中，能夠通過(guò)離子相互作用結(jié)合到任何未結(jié)合的探針41上的第二捕獲試劑(例如聚電解質(zhì))也固定到檢測(cè)/校正區(qū)31內(nèi)。而且，校正探針43也可以固定在檢測(cè)/校正區(qū)31內(nèi)的第二捕獲試劑上。例如，校正探針43可包括也通過(guò)離子相互作用結(jié)合到聚電解質(zhì)上的膠乳微粒。
一旦完全展開(kāi)，就可以確定檢測(cè)/校正區(qū)31上探針41的強(qiáng)度信號(hào)Is，以便計(jì)算測(cè)試樣品中存在的分析物的量。在該實(shí)施方案中，測(cè)試樣品中的分析物的量與Is成反比。此外，校正探針43的強(qiáng)度信號(hào)Ic也可用來(lái)校正Is。例如，在已知的分析物濃度范圍，作出Is和Ic之比與分析物濃度的曲線，從而產(chǎn)生校正曲線。為了確定未知測(cè)試樣品中分析物的量，可隨后根據(jù)校正曲線將信號(hào)比轉(zhuǎn)換成分析物的濃度。應(yīng)該注意，可以作出Is和Ic的替換型數(shù)學(xué)關(guān)系與分析物濃度的曲線，從而產(chǎn)生校正曲線。
雖然上面已經(jīng)描述了測(cè)定結(jié)構(gòu)的多個(gè)不同的實(shí)施方案，但是應(yīng)該理解，本發(fā)明的測(cè)定一般可具有任何所需的結(jié)構(gòu)，并且不必含有上述所有部件。而且，本文沒(méi)有具體提及的其它公知的測(cè)定部件也可用于本發(fā)明。例如，多種測(cè)定結(jié)構(gòu)在Lambotte等人的U.S.5,395,754；Jou等人的U.S.5,670,381；和Malick等人的U.S.6,194,220中有所描述，這些文獻(xiàn)在此作為參考全部并入本文。此外，還應(yīng)該理解，按照本發(fā)明也可形成競(jìng)爭(zhēng)型測(cè)定。競(jìng)爭(zhēng)型測(cè)定的技術(shù)和結(jié)構(gòu)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。
作為實(shí)例，能夠容易地修改以上所述以及圖3所示的裝置20，以形成競(jìng)爭(zhēng)型測(cè)定。在該實(shí)施方案中，檢測(cè)探針41可以是分析物或分析物類似物，而校正探針43可包括例如與感興趣的分析物的特異性結(jié)合部分綴合的膠乳微粒。當(dāng)施加測(cè)試樣品時(shí)，檢測(cè)探針41就穿過(guò)多孔膜23，直到它們到達(dá)檢測(cè)/校正區(qū)31為止。在區(qū)31，檢測(cè)探針41及測(cè)試樣品內(nèi)的任何分析物A競(jìng)爭(zhēng)特異性結(jié)合部分91(例如抗體、抗原等)。任何未結(jié)合的探針41將流過(guò)檢測(cè)/校正區(qū)31。在此實(shí)施方案中，測(cè)試樣品中分析物的量與Is(探針41的信號(hào)強(qiáng)度)成反比。如果需要的話，在已知的分析物濃度范圍，作出Is和Ic(探針43的信號(hào)強(qiáng)度)之比與分析物濃度的曲線，從而產(chǎn)生校正曲線。
參照以下實(shí)施例可以更好地理解本發(fā)明。
實(shí)施例1本發(fā)明的用來(lái)校正夾心型測(cè)定的內(nèi)部檢測(cè)/校正區(qū)的性能得到證實(shí)。首先，將HF120多孔膜樣品層壓在長(zhǎng)約30厘米的相應(yīng)支撐卡上。從Molecular Probes，Inc.獲得具有0.2微米粒度和505/515納米激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)的熒光珠(校正探針)。珠在濃度為0.28％(重量百分比)的儲(chǔ)存緩沖液中進(jìn)行洗滌和儲(chǔ)存。將40微升的熒光珠溶液與10微升的聚賴氨酸溶液混合，并拉絲(striped)到膜上，形成檢測(cè)/校正線。具有2.36毫克/毫升濃度的單克隆抗體CRP Mab 5804(得自于Biogenesis，Inc.)固定在多孔膜樣品上，形成捕獲線。然后在37℃將膜樣品干燥1小時(shí)。將纖維素纖維芯吸墊(Millipore Co.)固定到膜的一端并切成4毫米的條帶。
將半粘性樣品放入含有熒光珠(檢測(cè)探針)和不同濃度CRP抗原的混合物的多個(gè)微孔內(nèi)。對(duì)于每個(gè)混合物熒光珠的量都一樣，即為4毫克。如下形成熒光檢測(cè)珠。首先，提供具有羧基官能團(tuán)的聚苯乙烯珠(得自于Molecular Probes，Inc.)。這些珠具有0.5微米的粒度和580/605納米的激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)。將100微升的聚苯乙烯珠(2％濃度)用MES緩沖液洗滌兩次，并離心分離。將造粒珠重新懸浮到100微升的MES緩沖液中并與50微升含有4毫克碳二亞胺(得自于Polysciences，Inc.)的MES緩沖液混合?；旌衔镌谑覝叵掠诨旌掀髦蟹磻?yīng)20分鐘。活化珠然后用硼酸鹽緩沖液洗滌兩次。將活化珠重新懸浮到200微升的硼酸鹽緩沖液中并與15微升濃度為6.4毫克/毫升的C-反應(yīng)蛋白的單克隆抗體(得自于Biogenisis，Inc.的CRP Mab5811)混合。反應(yīng)在室溫下于混合器中過(guò)夜。所得到的反應(yīng)混合物然后與100微升的乙醇胺用混合器混合15分鐘。棄去上清液，并將珠用PBS緩沖液洗滌兩次，在4℃儲(chǔ)存在含有0.1M PBS、0.15M NaCl、1％BSA、5％甘油和0.1％NaN3的儲(chǔ)存緩沖液中，從而得到濃度為4mg/ml的綴合珠。
然后用Fluorolog III Spectrofluoremeter(SPEX Industries，Inc.，Edison，NJ)以直角的方式在檢測(cè)/校正線處測(cè)定熒光強(qiáng)度。結(jié)果如下面的表1所示，其中Is代表檢測(cè)/校正線處檢測(cè)探針的信號(hào)強(qiáng)度，Ic代表檢測(cè)/校正線處校正探針的信號(hào)強(qiáng)度。
表1信號(hào)強(qiáng)度的結(jié)果
由以上結(jié)果可見(jiàn)，當(dāng)樣品中不存在分析物時(shí)，檢測(cè)探針就穿過(guò)捕獲線并捕獲在檢測(cè)/校正線上。當(dāng)樣品中存在分析物時(shí)，檢測(cè)探針就與分析物復(fù)合并捕獲在捕獲線上，而任何剩余的檢測(cè)探針捕獲在檢測(cè)/校正線處。因此，檢測(cè)/校正線上檢測(cè)探針的強(qiáng)度(Is)與分析物的濃度成反比，而檢測(cè)/校正線處校正探針的強(qiáng)度(Ic)對(duì)于不同的分析物濃度都保持相對(duì)穩(wěn)定，即約444±27。Ic的偏差據(jù)信是由于環(huán)境變化、測(cè)定條件和儀器的不穩(wěn)定性導(dǎo)致的。然而，預(yù)期此偏差對(duì)Is具有類似的作用。因此，Is/Ic據(jù)信在這種情況下可提供更準(zhǔn)確的結(jié)果。
實(shí)施例2本發(fā)明的用來(lái)校正夾心型測(cè)定的內(nèi)部檢測(cè)/校正區(qū)的性能得到證實(shí)。首先，將HF120多孔膜樣品層壓在長(zhǎng)約30厘米的相應(yīng)支撐卡上。然后如下形成熒光聚合物(校正探針)。首先，將0.5克的聚丙烯酸(MW＝450,000，D.P.＝6250)溶解在20毫升的甲醇中。將1毫升甲醇中的3.8毫克二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)加入到該溶液中，以便激活聚丙烯酸聚合物。將所得到的溶液攪拌30分鐘。通過(guò)將10毫克5-(和-6-)-((N-(5-氨基戊基)氨基)-羰基)四甲基若丹明(544/590納米的激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)，Molecular Probes，Inc.)溶解在1毫升的甲醇溶液中而制成熒光染料溶液。將該染料溶液加入到活化聚丙烯酸溶液中并攪拌。反應(yīng)在室溫下持續(xù)24小時(shí)，此時(shí)鋁箔包裹在溶液周圍。反應(yīng)終止后，加入乙醚以形成沉淀。對(duì)沉淀進(jìn)行離心并浸在乙醇中，以除去任何未反應(yīng)的熒光染料。在除去乙醇溶液之后，將剩余的紅色凝膠在空氣中干燥。
然后將上述的熒光聚合物(校正探針)溶解在水中并與CelQuat100-H(從National Starch&Chemical，Inc.購(gòu)得的纖維素聚電解質(zhì)衍生物)混合。將該混合物拉絲到膜上，形成檢測(cè)/校正線。將具有6.4毫克/毫升濃度的單克隆抗體CRP Mab 5811(得自于Biogenesis，Inc.)固定在多孔膜樣品上，形成捕獲線。然后在37℃將膜樣品干燥1小時(shí)。將纖維素纖維芯吸墊(Millipore Co.)固定到膜的一端并切成4毫米的條帶。
將半粘性樣品放入含有熒光珠(檢測(cè)探針)和不同濃度CRP抗原的混合物的多個(gè)微孔內(nèi)。對(duì)于每個(gè)混合物熒光珠(檢測(cè)探針)的量都一樣，即為4微克。如下形成熒光檢測(cè)珠(檢測(cè)探針)。首先，提供具有羧基官能團(tuán)的聚苯乙烯珠(得自于Molecular Probes，Inc.)。這些珠具有0.2微米的粒度和505/515納米的激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)。將100微升的聚苯乙烯珠(2％濃度)用MES緩沖液洗滌兩次，并離心分離。將造粒珠重新懸浮到200微升的MES緩沖液中并與20微升含有4.8毫克碳二亞胺(得自于Polysciences，Inc.)的MES緩沖液混合。混合物在室溫下于混合器中反應(yīng)20分鐘?；罨槿缓笥门鹚猁}緩沖液洗滌兩次。將活化珠重新懸浮到200微升的硼酸鹽緩沖液中并與90微升濃度為2.36毫克/毫升的C-反應(yīng)蛋白的單克隆抗體(得自于Biogenisis，Inc.的CRP Mab 5804)混合。反應(yīng)在室溫下于混合器中過(guò)夜。所得到的反應(yīng)混合物然后與100微升的乙醇胺用混合器混合15分鐘。棄去上清液，并將珠用PBS緩沖液洗滌兩次，然后在4℃儲(chǔ)存在含有0.1M PBS、0.15M NaCl、1％BSA、5％甘油和0.1％NaN3的儲(chǔ)存緩沖液中，從而得到濃度為4mg/ml的綴合珠。
然后用Fluorolog II Spectrofluoremeter(SPEX Industries，Inc.，Edison，NJ)以直角方式在檢測(cè)/校正線處測(cè)定熒光強(qiáng)度。結(jié)果如下面的表2所示，其中Is代表檢測(cè)/校正線處檢測(cè)探針的信號(hào)強(qiáng)度，Ic代表檢測(cè)/校正線處校正探針的信號(hào)強(qiáng)度。
表2信號(hào)強(qiáng)度的結(jié)果
由以上結(jié)果可見(jiàn)，當(dāng)樣品中不存在分析物時(shí)，檢測(cè)探針就穿過(guò)捕獲線并捕獲在檢測(cè)/校正線上。當(dāng)樣品中存在分析物時(shí)，檢測(cè)探針就與分析物復(fù)合并捕獲在捕獲線上，而任何剩余的檢測(cè)探針捕獲在檢測(cè)/校正線處。因此，檢測(cè)/校正線上檢測(cè)探針的強(qiáng)度(Is)與分析物的濃度成反比，而檢測(cè)/校正線處校正探針的強(qiáng)度(Ic)對(duì)于不同的分析物濃度都保持相對(duì)穩(wěn)定，即約36±6。Ic的偏差據(jù)信是由于環(huán)境變化、測(cè)定條件和儀器的不穩(wěn)定性導(dǎo)致的。然而，預(yù)期此偏差對(duì)Is具有類似的作用。因此，Is/Ic據(jù)信在這種情況下可提供更準(zhǔn)確的結(jié)果。
雖然已經(jīng)就本發(fā)明的具體實(shí)施方案詳細(xì)描述了本發(fā)明，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，在領(lǐng)會(huì)上述內(nèi)容之后，容易構(gòu)思這些實(shí)施方案的替換形式、變型和等同物。因此，本發(fā)明的范圍應(yīng)該由所附的權(quán)利要求書及其等同物來(lái)確定。
權(quán)利要求
1.一種能夠檢測(cè)測(cè)試樣品中分析物的存在或數(shù)量的流通測(cè)定裝置，所述流通測(cè)定裝置包括多孔膜，所述多孔膜與能夠產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)的檢測(cè)探針和能夠產(chǎn)生校正信號(hào)的校正探針相通，所述多孔膜限定出檢測(cè)/校正區(qū)，在所述檢測(cè)/校正區(qū)內(nèi)，固定有被構(gòu)造為直接或間接與所述檢測(cè)探針、所述校正探針或它們的組合結(jié)合的聚電解質(zhì)捕獲試劑，其中在所述檢測(cè)/校正區(qū)內(nèi)，所述檢測(cè)探針能夠產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)，所述校正探針能夠產(chǎn)生校正信號(hào)，并且所述分析物的量能夠由所述校正信號(hào)校正的所述檢測(cè)信號(hào)來(lái)確定。
2.如權(quán)利要求1所述的流通測(cè)定裝置，其中所述檢測(cè)探針和所述校正探針選自發(fā)色團(tuán)、催化劑、熒光化合物、化學(xué)發(fā)光化合物、磷光化合物、放射性化合物、直接目視標(biāo)記物、脂質(zhì)體、以及這些物質(zhì)的組合。
3.如權(quán)利要求2所述的流通測(cè)定裝置，其中所述檢測(cè)探針和所述校正探針是熒光化合物。
4.如權(quán)利要求1所述的流通測(cè)定裝置，其中所述檢測(cè)探針、所述校正探針或它們的組合含有微粒。
5.如權(quán)利要求1所述的流通測(cè)定裝置，其中所述檢測(cè)探針、所述校正探針或它們的組合與分析物的特異性結(jié)合部分綴合。
6.如權(quán)利要求5所述的流通測(cè)定裝置，其中作為分析物的特異性結(jié)合部分的第二捕獲試劑固定在所述檢測(cè)/校正區(qū)內(nèi)的所述多孔膜上。
7.如權(quán)利要求6所述的流通測(cè)定裝置，其中所述第二捕獲試劑被構(gòu)造成當(dāng)與所述檢測(cè)探針接觸時(shí)，直接或間接地結(jié)合到所述檢測(cè)探針上。
8.如權(quán)利要求1所述的流通測(cè)定裝置，其中所述聚電解質(zhì)具有凈正電荷。
9.如權(quán)利要求8所述的流通測(cè)定裝置，其中所述聚電解質(zhì)選自聚賴氨酸、聚乙烯亞胺、環(huán)氧氯丙烷官能化的聚胺或聚酰胺型胺類、聚二烯丙基二甲基-氯化銨、陽(yáng)離子纖維素衍生物及其組合。
10.如權(quán)利要求1所述的流通測(cè)定裝置，其中所述聚電解質(zhì)具有凈負(fù)電荷。
11.如權(quán)利要求10所述的流通測(cè)定裝置，其中所述聚電解質(zhì)是兩親的。
12.如權(quán)利要求1所述的流通測(cè)定裝置，其中所述聚電解質(zhì)捕獲試劑被構(gòu)造成直接或間接結(jié)合到所述校正探針上。
13.如權(quán)利要求1所述的流通測(cè)定裝置，其中所述聚電解質(zhì)捕獲試劑被構(gòu)造成直接或間接結(jié)合到所述檢測(cè)探針上。
14.如權(quán)利要求1所述的流通測(cè)定裝置，其中所述多孔膜還限定出位于所述檢測(cè)/校正區(qū)上游的捕獲區(qū)，一種或多種捕獲試劑固定在所述捕獲區(qū)內(nèi)，所述捕獲試劑被構(gòu)造成直接或間接結(jié)合到所述檢測(cè)探針上。
15.如權(quán)利要求14所述的流通測(cè)定裝置，其中所述捕獲區(qū)的所述捕獲試劑是分析物的特異性結(jié)合部分。
16.如權(quán)利要求1所述的流通測(cè)定裝置，其中測(cè)試樣品內(nèi)分析物的量與檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度和校正信號(hào)強(qiáng)度之比成正比。
17.如權(quán)利要求1所述的流通測(cè)定裝置，其中所述裝置是夾心型測(cè)定裝置。
18.如權(quán)利要求1所述的流通測(cè)定裝置，其中所述裝置是競(jìng)爭(zhēng)型測(cè)定裝置。
19.一種能夠檢測(cè)測(cè)試樣品中分析物的存在或數(shù)量的流通測(cè)定裝置，所述流通測(cè)定裝置包括多孔膜，所述多孔膜與能夠產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)的檢測(cè)探針和能夠產(chǎn)生校正信號(hào)的校正探針相通，所述檢測(cè)探針與分析物的特異性結(jié)合部分綴合，所述多孔膜限定出檢測(cè)/校正區(qū)，在所述檢測(cè)/校正區(qū)內(nèi)，非擴(kuò)散地固定有被構(gòu)造為直接或間接與所述校正探針、所述檢測(cè)探針或它們的組合結(jié)合的聚電解質(zhì)捕獲試劑，其中在所述檢測(cè)/校正區(qū)內(nèi)，所述檢測(cè)探針能夠產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)，所述校正探針能夠產(chǎn)生校正信號(hào)，并且所述分析物的量能夠由所述校正信號(hào)校正的所述檢測(cè)信號(hào)來(lái)確定。
20.如權(quán)利要求19所述的流通測(cè)定裝置，其中所述檢測(cè)探針和所述校正探針選自發(fā)色團(tuán)、催化劑、熒光化合物、化學(xué)發(fā)光化合物、磷光化合物、放射性化合物、直接目視標(biāo)記物、脂質(zhì)體、以及這些物質(zhì)的組合。
21.如權(quán)利要求19所述的流通測(cè)定裝置，其中所述檢測(cè)探針和所述校正探針是熒光化合物。
22.如權(quán)利要求19所述的流通測(cè)定裝置，其中所述檢測(cè)探針、所述校正探針或它們的組合含有微粒。
23.如權(quán)利要求19所述的流通測(cè)定裝置，其中所述校正探針與分析物的特異性結(jié)合部分綴合。
24.如權(quán)利要求19所述的流通測(cè)定裝置，其中作為分析物的特異性結(jié)合部分的附加捕獲試劑固定在所述檢測(cè)/校正區(qū)內(nèi)的所述多孔膜上。
25.如權(quán)利要求24所述的流通測(cè)定裝置，其中所述附加捕獲試劑被構(gòu)造成當(dāng)與所述檢測(cè)探針接觸時(shí)，直接或間接地結(jié)合到所述檢測(cè)探針上。
26.如權(quán)利要求19所述的流通測(cè)定裝置，其中所述多孔膜還限定出位于所述檢測(cè)/校正區(qū)上游的捕獲區(qū)，一種或多種捕獲試劑固定在所述捕獲區(qū)內(nèi)，所述捕獲試劑被構(gòu)造成直接或間接結(jié)合到所述檢測(cè)探針上。
27.如權(quán)利要求26所述的流通測(cè)定裝置，其中所述捕獲區(qū)的所述捕獲試劑是分析物的特異性結(jié)合部分。
28.如權(quán)利要求19所述的流通測(cè)定裝置，其中所述裝置是夾心型測(cè)定裝置。
29.如權(quán)利要求19所述的流通測(cè)定裝置，其中所述裝置是競(jìng)爭(zhēng)型測(cè)定裝置。
30.一種用于檢測(cè)測(cè)試樣品中分析物的存在或數(shù)量的方法，所述方法包括i)提供流通測(cè)定裝置，所述流通測(cè)定裝置包括多孔膜，所述多孔膜與能夠產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)的檢測(cè)探針和能夠產(chǎn)生校正信號(hào)的校正探針相通，所述多孔膜限定出檢測(cè)/校正區(qū)，在所述檢測(cè)/校正區(qū)內(nèi)，固定有被構(gòu)造為直接或間接結(jié)合到所述檢測(cè)探針、所述校正探針或它們的組合上的聚電解質(zhì)捕獲試劑，其中在所述檢測(cè)/校正區(qū)內(nèi)，所述檢測(cè)探針能夠產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)，所述校正探針能夠產(chǎn)生校正信號(hào)；ii)使含有分析物的測(cè)試樣品與所述檢測(cè)探針和所述校正探針接觸；iii)測(cè)定在所述檢測(cè)/校正區(qū)內(nèi)產(chǎn)生的檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度和校正信號(hào)強(qiáng)度；iv)用校正信號(hào)校正檢測(cè)信號(hào)的強(qiáng)度，其中由所述校正信號(hào)校正的所述檢測(cè)信號(hào)來(lái)確定測(cè)試樣品內(nèi)分析物的量。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述檢測(cè)探針和所述校正探針選自發(fā)色團(tuán)、催化劑、熒光化合物、化學(xué)發(fā)光化合物、磷光化合物、放射性化合物、直接目視標(biāo)記物、脂質(zhì)體、以及這些物質(zhì)的組合。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述檢測(cè)探針和所述校正探針是熒光化合物。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其還包括激發(fā)所述檢測(cè)/校正區(qū)內(nèi)的所述檢測(cè)探針和所述校正探針，其中所述激發(fā)導(dǎo)致所述檢測(cè)探針發(fā)出檢測(cè)信號(hào)，所述校正探針發(fā)出校正信號(hào)。
34.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述檢測(cè)探針、所述校正探針或它們的組合與分析物的特異性結(jié)合部分綴合。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中作為分析物的特異性結(jié)合部分的第二捕獲試劑固定在所述檢測(cè)/校正區(qū)內(nèi)。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述第二捕獲試劑被構(gòu)造成當(dāng)與所述檢測(cè)探針接觸時(shí)，直接或間接地結(jié)合到所述檢測(cè)探針上。
37.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述聚電解質(zhì)捕獲試劑被構(gòu)造成直接或間接結(jié)合到所述校正探針上。
38.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述聚電解質(zhì)捕獲試劑被構(gòu)造成直接或間接結(jié)合到所述檢測(cè)探針上。
39.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述多孔膜還限定出位于所述檢測(cè)/校正區(qū)上游的捕獲區(qū)，一種或多種捕獲試劑固定在所述捕獲區(qū)內(nèi)，所述捕獲試劑被構(gòu)造成直接或間接結(jié)合到所述檢測(cè)探針上。
40.如權(quán)利要求30所述的方法，其還包括通過(guò)針對(duì)多個(gè)預(yù)定的分析物濃度繪制由校正信號(hào)強(qiáng)度校正的檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度來(lái)產(chǎn)生校正曲線。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于流通測(cè)定裝置的內(nèi)部自校正系統(tǒng)。具體地說(shuō)，本發(fā)明采用由測(cè)定裝置的多孔膜限定出的單個(gè)檢測(cè)/校正區(qū)的用途。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，這種內(nèi)部自校正系統(tǒng)提供了一種準(zhǔn)確、廉價(jià)和容易控制的確定測(cè)試樣品中分析物的存在的方法。
文檔編號(hào)G01N33/543GK1720456SQ200380105275
公開(kāi)日2006年1月11日 申請(qǐng)日期2003年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月19日
發(fā)明者衛(wèi)寧, 黃延賓, 宋旭東, R·凱勒 申請(qǐng)人:金伯利-克拉克環(huán)球有限公司