專利名稱：一種用于細菌內(nèi)毒素鱟試驗檢測法的緩沖液及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細菌內(nèi)毒素的鱟試驗檢測方法，特別提供了一種用于鱟試驗法的調(diào)節(jié)并指示樣品pH的緩沖液。
背景技術(shù)：
細菌內(nèi)毒素(Bacterial Endotoxin)是革蘭氏陰性細菌所產(chǎn)生的具有各種生物活性的大分子物質(zhì)，其主要化學(xué)成分為脂多糖(LPS)。內(nèi)毒素是注射劑藥品(原料等)中的主要污染物質(zhì)。
目前，細菌內(nèi)毒素的檢測方法主要有家兔試驗法、鱟試驗法。鱟試驗法是利用鱟試劑與內(nèi)毒素發(fā)生凝集反應(yīng)的機理，以定性(凝膠法)或定量(動態(tài)濁度法)的方式檢測藥品及機體血液中感染的細菌內(nèi)毒素的一種體外檢測方法。通常情況下，在一定的pH范圍內(nèi)(6.5-8.5)，鱟試驗法可以正常測定，但是一旦超出該范圍，測定結(jié)果會出現(xiàn)假陽性或假陰性。對于含碳酸氫鈉的樣品、特別是藥品生產(chǎn)過程中的中間產(chǎn)品，往往含有不同種類的緩沖鹽，pH往往低于6.5(如醋酸鹽)或高于8.5(碳酸鹽)，這就需要不斷稀釋并用無內(nèi)毒素的酸、堿來調(diào)節(jié)pH，并用pH試紙或pH計來監(jiān)測。這種過程非常繁復(fù)，并且難以精確控制，特別是容易引入內(nèi)毒素的污染，因此急需一種用來稀釋樣品，同時可以調(diào)節(jié)并指示樣品pH的緩沖液。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于細菌內(nèi)毒素鱟試驗檢測法，可以用來稀釋樣品，同時可以調(diào)節(jié)并指示樣品pH的緩沖液。
本發(fā)明提供了一種用于細菌內(nèi)毒素鱟試驗檢測法的緩沖液，其特征在于所述緩沖液為含有酚紅的Tris-HCl緩沖液，酚紅的重量濃度為0.005-0.1％。
本發(fā)明用于細菌內(nèi)毒素鱟試驗檢測法的緩沖液中，所述Tris-HCl緩沖液，Tris濃度最好為30-500mM，pH在7-8.5。
本發(fā)明還提供了上述用于細菌內(nèi)毒素鱟試驗檢測法的緩沖液的制備方法，其特征在于將酚紅和Tris鹽稱重后，在150-200度干烤1-5小時；再加入無內(nèi)毒素的水，用濃鹽酸調(diào)節(jié)緩沖液的pH至所需要的值(通常為7-8)；高壓消毒無菌保存或冷凍保存。
本發(fā)明用于細菌內(nèi)毒素鱟試驗檢測法的緩沖液，在pH為6.8-8.2的范圍呈粉紅色，可以稀釋樣品，同時調(diào)節(jié)樣品的pH值在適當?shù)姆秶鷥?nèi)，以使內(nèi)毒素的測定在穩(wěn)定的pH內(nèi)進行。本發(fā)明用于細菌內(nèi)毒素鱟試驗檢測法的緩沖液，在鱟試驗法測定內(nèi)毒素的實驗中，用于定性法——凝膠法時，對無內(nèi)毒素的陰性對照的測定無影響，對添加內(nèi)毒素的陽性對照顯現(xiàn)出陽性特有的凝膠反應(yīng)；用于定量法——動態(tài)濁度法時，對無內(nèi)毒素的陰性對照的測定無影響，對添加內(nèi)毒素的陽性對照內(nèi)毒素的回收率在50-200％之間。即 本發(fā)明用于細菌內(nèi)毒素鱟試驗檢測法的緩沖液，在兩種內(nèi)毒素測定法中對內(nèi)毒素的測定無影響，均符合鱟試驗法測定的規(guī)定。
具體實施例方式實施例1.用于內(nèi)毒素測定的標準曲線在內(nèi)毒素測定儀上，基于標準曲線LogT(OD0.02)＝a+b Log(c)，采用標準內(nèi)毒素濃度0.22-100EU/ml，與0.06EU/ml靈敏度的鱟試劑進行試驗，得到相應(yīng)的標準曲線為LogT(OD0.02)＝-0.4129Log(c)+3.2038，其中T(OD0.02)為特征反應(yīng)時間，c為內(nèi)毒素濃度。
實施例2.含酚紅的Tris-HCl緩沖液的配制1將0.005克酚紅、0.363克Tris鹽稱重后置于干凈的玻璃瓶中，干烤200度1小時，以消除其中的內(nèi)毒素；加入100毫升無內(nèi)毒素的水，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.0，高壓消毒無菌保存或冷凍保存?zhèn)溆谩?br> 實施例3.含酚紅的Tris-HCl緩沖液的配制2將0.1克酚紅、6.05克Tris鹽稱重后置于玻璃瓶中，干烤150度5小時，以消除其中的內(nèi)毒素；加入100毫升無內(nèi)毒素的水，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.5，高壓消毒無菌保存或冷凍保存?zhèn)溆谩?br> 實施例4.酚紅的濃度實驗配制250mM pH7.6的Tris-HCl緩沖液，分別含酚紅的濃度為0、0.005、0.01、0.05、0.1％，進行內(nèi)毒素的測定實驗。不加內(nèi)毒素的陰性對照結(jié)果皆為陰性。加入相同濃度的內(nèi)毒素，在內(nèi)毒素測定儀上測得的內(nèi)毒素濃度分別為73.0、95.6、89.2、110.2、95.6EU/ml，內(nèi)毒素的回收率分別為100、131、122、151、131％，符合回收率在50-200％之間的規(guī)定。含酚紅的緩沖液，用酸堿調(diào)節(jié)其pH值，當pH小于6.8時，呈黃色；當pH大于8.2時，呈紅色；當pH在6.8-8.2之間時，呈橙紅色。
實施例5.Tris鹽濃度實驗配制含酚紅濃度為0.01％，pH7.5的Tris-HCl緩沖液，Tris鹽濃度分別為30、63、125、250、500mM，進行內(nèi)毒素的測定實驗。不加內(nèi)毒素的陰性對照結(jié)果皆為陰性。分別加入相同濃度的內(nèi)毒素3.8EU/ml，在內(nèi)毒素測定儀上測得的內(nèi)毒素濃度分別為3.8、6.45、4.98、5.35、6.4EU/ml，內(nèi)毒素的回收率分別為100、170、131、141、168％，符合回收率在50-200％之間的規(guī)定。含酚紅的緩沖液，用酸堿調(diào)節(jié)其pH值，當pH小于6.8時，呈黃色；當pH大于8.2時，呈紅色；當pH在6.8-8.2之間時，呈橙紅色。
實施例6.Tris-HCl緩沖液的pH實驗配制含酚紅濃度為0.01％，250mM的Tris-HCl緩沖液，pH分別為7.0、7.5、8.0、8.5，進行內(nèi)毒素的測定實驗。不加內(nèi)毒素的陰性對照結(jié)果皆為陰性。分別加入相同濃度4.2EU/ml的內(nèi)毒素參照品，在內(nèi)毒素測定儀上測得的內(nèi)毒素濃度分別為3.85、5.35、5.76、4.81EU/ml，內(nèi)毒素的回收率分別為92、139、150、125％，符合回收率在50-200％之間的規(guī)定。含酚紅的緩沖液，用濃酸堿調(diào)節(jié)其pH值，當pH小于6.8時，呈黃色；當pH大于8.2時，呈紅色；當pH在6.8-8.2之間時，呈橙紅色。
實施例7.醋酸緩沖液中內(nèi)毒素的測定向含0.5％人血清白蛋白的樣品(溶解在20mMpH3.8的醋酸緩沖液中)，加入9.81EU/ml的內(nèi)毒素，采用含酚紅濃度為0.01％，150mMpH7.8的Tris-HCl緩沖液進行稀釋，稀釋4倍后溶液呈橙紅色，測得內(nèi)毒素含量為9.38EU/ml，內(nèi)毒素的回收率為96％。
實施例8.碳酸氫鈉緩沖液中內(nèi)毒素的測定配制20mMpH10的碳酸氫鈉緩沖液，加入10.7EU/ml的內(nèi)毒素，采用含酚紅濃度為0.01％，250mM pH7.7的Tris-HCl緩沖液進行稀釋，稀釋2倍后，溶液呈橙紅色，測得內(nèi)毒素含量為12.45EU/ml，內(nèi)毒素的回收率為116％。
實施例9.酚紅Tris-HCl緩沖液在凝膠法測定內(nèi)毒素中的應(yīng)用采用含酚紅濃度為0.01％，250mMpH7.7的Tris-HCl緩沖液，作為被測樣品的稀釋液，以緩沖液∶被測水樣＝1∶1的比例進行被測水樣品的稀釋，采用凝膠法測定被測水樣品中的內(nèi)毒素含量，同時做陰性、陽性對照實驗。結(jié)果陰性測定無影響，陽性測定顯現(xiàn)出陽性特有的凝膠反應(yīng)。
權(quán)利要求
1.一種用于細菌內(nèi)毒素鱟試驗檢測法的緩沖液，其特征在于所述緩沖液為含有酚紅的Tris-HCl緩沖液，酚紅的重量濃度為0.005-0.1％。
2.按照權(quán)利要求1所述用于細菌內(nèi)毒素鱟試驗檢測法的緩沖液，其特征在于所述Tris-HCl緩沖液，Tris濃度為30-500mM，pH為7-8.5。
3.一種權(quán)利要求1所述用于細菌內(nèi)毒素鱟試驗檢測法的緩沖液的制備方法，其特征在于將酚紅和Tris鹽稱重后，在150-200度干烤1-5小時；再加入無內(nèi)毒素的水，用濃鹽酸調(diào)節(jié)緩沖液的pH至所需要的值；高壓消毒無菌保存或冷凍保存。
全文摘要
一種用于細菌內(nèi)毒素鱟試驗檢測法的緩沖液，其特征在于所述緩沖液為含有酚紅的Tris－HCl緩沖液，酚紅的重量濃度為0.005－0.1％。其制備方法是將酚紅和Tris鹽稱重后，在150－200度干烤1－5小時；再加入無內(nèi)毒素的水，用濃鹽酸調(diào)節(jié)緩沖液的pH至所需要的值；高壓消毒無菌保存或冷凍保存。本發(fā)明的緩沖液可以用來稀釋被測樣品，同時可以調(diào)節(jié)并指示樣品pH。本發(fā)明的用于細菌內(nèi)毒素鱟試驗檢測法的緩沖液，在兩種內(nèi)毒素測定法中對內(nèi)毒素的測定無影響，均符合鱟試驗法測定的規(guī)定。
文檔編號G01N33/579GK1621842SQ20031011926
公開日2005年6月1日 申請日期2003年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月26日
發(fā)明者李京華, 邵英光, 王俊德 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所