專利名稱:一種16SrRNA電化學生物芯片的制作方法
【專利摘要】本實用新型公開一種16SrRNA電化學生物芯片，涉及生物醫(yī)學、電化學檢測和單分子自組裝領域。該芯片包括構建在芯片表面上的單分子自組裝層，芯片表面具有芯片微孔；所述芯片微孔中分別固定有捕獲探針和檢測探針，所述捕獲探針上捕獲有病原菌16S rRNA靶分子；所述檢測探針形成16S rRNA分子探針識別層。其有益效果在于：采用納米金與單壁碳納米管納米復合物標記檢測探針，利用生物素與親和素高度專一和生物穩(wěn)定性，用來連接探針和納米復合粒子；細菌具有簡單、迅速、檢測成本低、靈敏度高的優(yōu)點，為指導臨床合理用藥提供了強、有力的支持。
【專利說明】
-種16SrRNA電化學生物巧片
技術領域
[0001] 本實用新型設及生物醫(yī)學、電化學檢測和自組裝技術領域，具體地說是一種 ieSrRNA電化學生物忍片。
【背景技術】
[0002] 尿路感染化rina巧化act Infections,UTI)是W膀脫刺激征，即尿頻、尿急、尿 痛、甚至全身感染為臨床特征的感染性疾病。UTI的易感因素和病因已經(jīng)十分明確，即由病 原微生物(主要是細菌)入侵尿道而引發(fā)，絕大部分為革蘭陰性桿菌，如大腸埃希菌、奇異變 形菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑氏不動桿菌、陰溝腸桿菌。但UTI是一類發(fā)病率高而 臨床醫(yī)生較易忽視的疾病，臨床癥狀不典型，容易復發(fā)，治療不當極易造成耐藥菌株的出 現(xiàn)，形成難治性尿路感染。由UTI引起的腎功能衰竭、高血壓等疾病極大地降低了人們的生 活質(zhì)量，給人們的生命健康帶來了嚴重的危害，因此及時準確地診治UTI尤其重要。
[0003] 目前UTI的診斷方法雖然較多，但尚無大家公認的簡便、特異性高的有效方法。在 新近發(fā)展的多科學交叉檢測體系中，電化學是其中的一種方法。既研究發(fā)生在兩相界面處 伴隨電荷轉移現(xiàn)象的一口學科，基于電化學原理建立某一化學反應與電流響應的關系，通 過測量如電位、電流、電導或電量等物理量，求得物質(zhì)的含量或考量。自組裝技術作為一種 新型技術，在分子水平上設計分子的結構，具有靈敏度高、選擇性好的優(yōu)點，在電化學分析 領域得到了巨大的應用。
[0004] 目前，傳統(tǒng)UTI的診斷方法檢測時間長、成本高、操作繁瑣，易發(fā)生交叉污染，假陽 性率高;可見基因忍片技術并未實現(xiàn)真正意義上的快速檢測。
[0005] 綜上所述，目前亟需一種對尿路感染病原菌快速檢測的新方法，W實現(xiàn)對尿路感 染病原菌多通量、低成本、操作簡易，檢測快速，并能在普通實驗室完成檢測，更好地滿足各 級醫(yī)院的需要。 【實用新型內(nèi)容】
[0006] 本實用新型的一個目的在于提供一種ieSrRNA電化學生物忍片。
[0007] 為實現(xiàn)上述目的，本實用新型所述一種ieSrRNA電化學生物忍片，包括忍片，W及 構建在忍片表面上的單分子自組裝層，忍片表面具有忍片微孔;所述忍片微孔中分別固定 有捕獲探針和檢測探針，所述捕獲探針上捕獲有病原菌16S rRNA祀分子;所述檢測探針形 成16S rRNA分子探針識別層，其實現(xiàn)步驟如下：
[000引a.在忍片表面構建單分子自組裝層，進行活化單分子自裝層；
[0009] b.捕獲探針在忍片微孔中固定；
[0010] C.捕獲探針捕獲病原菌16S rRNA祀分子；
[0011] d.加入檢測探針后，構建16S rRNA分子探針識別層；
[0012] e.通過電化學生物忍片將分子雜交信息W電子信號的形式輸出；
[0013] f.加入辣根過氧化物酶W電子傳遞變化作為指示信號，實現(xiàn)對不同種類病原菌的 快速檢測。
[0014] 所述忍片為一種基礎界面，該界面的實現(xiàn)方法為：第一種就是在處理過程中向忍 片微孔加入了極少量的帶負電荷的物質(zhì)，在微孔中形成一個預先覆蓋層，在我們先前的試 驗中已經(jīng)證實運種分子層能夠減少帶負電荷生物分子之間的非特異性反應;第二種化學試 劑就是牛血清蛋白，它被加入到忍片微孔中，牛血清蛋白能夠包被自組裝單分子膜層，通過 減少電極表面的非特異性反應降低背景信號，增強檢測信號強度。第=種化學試劑是酪蛋 白，和酶溶液一起混勻，酪蛋白的功能類似于牛血清蛋白，但能夠阻止酶和自組裝單分子層 鏈接，增強反應的特異性。
[0015] 所述單分子自組裝層為11-琉基十一燒酸-BPA單分子自組裝層。
[0016] 所述捕獲探針在忍片微孔中固定方法:①有機金屬硫醇連接上有機復合物或者在 末端修飾上醇基后形成單分子層自組裝層，該層具有抵抗蛋白質(zhì)或核酸的沉積的功能，同 時可曝露出功能化的末端集團；單分子自組裝層在生物交聯(lián)劑和親和素的共同作用能夠被 活化;②在活化后的單分子自組裝層表面，加入捕獲探針。
[0017] 所述生物交聯(lián)劑為邸C、N服中的一種。
[0018] 所述捕獲探針和檢測探針為針對6種尿路病原菌(大腸埃希菌、奇異變形菌、肺炎 克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑氏不動桿菌、陰溝腸桿菌H6S rRNA的特異性核酸分子探針體 系，利用序列分析系統(tǒng)ARB(Software environment for sequence data)、NCBI(化tional Center of Biotechnology Information)和RDP-II:(The Ribosomal Database Project) 信息系統(tǒng)進行6種尿路病原菌16S rRNA特異性核酸探針的初步篩選;探針系統(tǒng)設計的區(qū)域 選擇如下：
[0019] 據(jù)文獻（Soumitesh化akravorty,DanicaHelb,et al .JMicrobiol 化USTAL Methods.2007，69(2) :330-339):168 rRNA含有V1-V9九個高變區(qū)，運九個區(qū)保守與特異性 兼?zhèn)?，能夠用于分子探針體系的構建。W大腸埃希菌為例，在大腸埃希菌16S rRNA的1540個 堿基中，選擇適合于檢測大腸埃希菌的V2與V3之間的保守序列區(qū)（242-433)設計檢測探針， V3高變序列區(qū)（433-497)設計捕獲探針。
[0020] WNCBI和RDP-II中為探針數(shù)據(jù)庫源，分別輸入6種尿路病原菌16S rRNA進行查詢， 得到該6種尿路病原菌的16S rRNA序列，設定6種尿路病原菌的16S rRNA堿基序列范圍，進 行FAST比較篩選。利用CLUSTAL X軟件進行多序列對位排列，找出特異性最高的序列組合。
[0021] W大腸埃希菌為例(如圖1)，在設計并篩選出的探針系列中，通過分子生物學方法 利用篩選出的特異性較高的探針對大腸埃希菌16S rRNA的檢測，得到大腸埃希菌捕獲探針 和檢測探針。
[0022] 針對奇異變形菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑氏不動桿菌、陰溝腸桿菌的檢 測探針與捕獲探針結構設計也是基于上述步驟，構建出常見尿路感染病原菌16S rRNA核酸 分子探針庫。
[0023] 所述捕獲探針為生物素化的捕獲探針。
[0024] 所述檢測探針為合成的生物素化DNA檢測探針，所述合成的生物素化DNA檢測探針 上設置有修飾層。
[0025] 所述檢測探針上設置的修飾層為:單壁碳納米管-納米金復合物;所述單壁碳納米 管-納米金復合物的制備方法為:首先制備出含有簇基端單壁層碳納米管，再用次憐酸鋼液 相還原方法制備納米金溶膠;然后在制備出的徑基化的納米金溶膠中的金顆粒表面原位生 長單壁層碳納米管層;最后利用溶劑萃取法去除有機模板劑，再經(jīng)超臨界干燥后制備出單 壁層納米管-納米金復合物。
[0026] 所述單壁層碳納米管-納米金復合物在合成的生物素化DNA檢測探針上的修飾原 理為:生物素-親和素系統(tǒng)是目前常用的級聯(lián)放大檢測信號的系統(tǒng)，親和素的每個亞基含有 一個與生物素結合的位點，并與生物素或其衍生物形成高度穩(wěn)定的復合物，其親和常數(shù)為 10-15M-1，僅比一般的共價鍵低一個數(shù)量級，但比抗原抗體反應高10-100萬倍，結合快，呈 不可逆反應，而且在抑、溫度、有機溶劑或變性劑較大的變化范圍內(nèi)均能穩(wěn)定存在；由于生 物素親和素系統(tǒng)之間高度專一和強烈的相互作用，利用生物素(Biotin)-親和素(Avidin) 之間的特異性不但可將單壁層碳納米管-納米金復合物和檢測探針連接到一起，而且具有 級聯(lián)放大信號的作用。
[0027] 所述檢測探針上標記有辣根過氧化物酶生物活性物質(zhì)。檢測探針與待檢病原菌核 酸雜交后，在辣根過氧化物酶的催化與信號放大作用下，W電化學生物忍片表面各個反應 微孔電子傳遞變化作為指示信號，實現(xiàn)對不同種類病原菌的快速檢測
[0028] 所述檢測尿路病原菌電化學生物忍片的應用方法，如圖5所示：
[0029] A.處理臨床收集的尿液標本，裂解尿液中病原菌曝露出ieSrRNA序列；
[0030] B.忍片微孔中修飾有捕獲探針，生物素化的檢測探針將識別祀基因序列；
[0031] C.捕獲探針將祀基因捕獲，同時加入具有電化學信號放大作用的親和素-辣根過 氧化物酶；
[0032] D.通過化學鍵的相互作用形成類"立明治"的辣根過氧化物酶-親和素-生物素-分 子探針立體結構；
[0033] E.通過酶的電化學傳遞及信號放大作用，電化學忍片將分子雜交信息W可讀的電 化學信號輸出。
[0034] 生物傳感界面在電化學電極陣列檢測應用時的靈敏度和準確度上起著重要作用。 在金膜上構建的硫醇自組裝單分子層是一種高度組織有序的分子層系統(tǒng)，能抵抗蛋白質(zhì)或 核酸沉積及阻止生物分子間易于產(chǎn)生的非特異性雜交，含有功能化的末端基團，被廣泛的 應用于電極表面修飾。
[0035] 細菌檢測原理:常見的尿路感染病原菌，其特異性ieSrRNA和相應的探針雜交會產(chǎn) 生各自的特異性電流信號值，通過電流信號值的不同來區(qū)分感染菌種類。
[0036] 本實用新型所述一種ieSrRNA電化學生物忍片，其有益效果在于:采用納米金與單 壁碳納米管納米復合物標記檢測探針，利用生物素與親和素高度專一和生物穩(wěn)定性，用來 連接探針和納米復合粒子;其中單壁碳納米管作為電子儲備中屯、，金納米粒子作為電子高 速傳輸通道，兩者結合能夠提高分子探針的檢測特異性與電化學生物忍片傳感陣列的整體 性能;該忍片是基于電化學檢測系統(tǒng)，得到原始的電流值和分析濃度之間的定量關系，然后 進行一系列電化學分析過程；細菌檢測分析速度快，通過對16S rDNA基因保守區(qū)進行檢 ，能夠早期、快速判斷細菌存在與否及其類別，具有簡單、迅速、檢測成本低、靈敏度高的 優(yōu)點，為指導臨床合理用藥提供了強、有力的支持。
【附圖說明】

[0037] 圖I為大腸埃希菌16S rRNA探針組合；
[0038] 圖2為單分子自組裝層結構示意圖；
[0039] 圖3為電化學生物忍片表面DNA分子識別層的構建；
[0040] 圖4為納米復合粒子修飾檢測探針；
[0041] 圖5中：A.電化學電極陣列經(jīng)不同修飾后在TMB-H202溶液中的循環(huán)伏安圖，掃速 50mV/s;B.電化學電極陣列經(jīng)不同修飾后在TMB-H202溶液中的計時電流圖；
[00創(chuàng)圖6中:A.祀DNA分子不同濃度下的差分脈沖圖（皿01凡）；B.祀DNA分子濃度與峰電 流值線性關系；
[0043] 圖7為電化學生物忍片檢測流程。
【具體實施方式】
[0044] 實施例1
[0045] 1.尿液標本的收集及處理：
[0046] ①標本收集對象：
[0047] 醫(yī)院口診及住院尿路感染患者:隨機抽樣400例，年齡7-60歲。
[004引②處理方法：
[0049] 收集上述醫(yī)院口診及臨床住院尿路感染患者的尿液，收集到的分離標本被裝在含 有15%的甘油布魯氏菌培養(yǎng)基小瓶中-70°C保存。過夜保存的標本在沒有雜菌干擾的情況 下接種到LB培養(yǎng)基上去，在生長到對數(shù)期為止。正式使用前，將在LB上培養(yǎng)的尿液W冷凍小 管的形式儲存在-70°C的環(huán)境中。
[0050] ③病原菌的快速檢測：
[0051] a.在LB培養(yǎng)小管中尿液樣本用離屯、機WlOOOX IOg離屯、5min，然后丟棄懸浮液，得 到細菌裂解液在含有ImoVl化0H，0.1 %TritonX-100，2mmol/l每升邸TA和含有Img/ml溶 解酵素的20mm〇Vl的TRIS-HCL，Ph8.0的溶液中室溫下解育5分鐘；
[0化2] b. SOiil的含有2.5 %的牛血清蛋白和0.25皿〇1/1的檢測探針的Imo Vl的憐酸鹽 緩沖液，PH7.4,在65°C環(huán)境溫度下加入到細菌裂解液中解育lOmin，和祀探針完全雜交； [0053] C.4山的裂解菌液和檢測探針的混合液然后加入到忍片中的工作電極上在65°C潮 濕條件下解育15min，等到被洗干凈干燥后，4山的辣根過氧化物酶化RP)加到工作電極上解 育15min，在忍片被清洗和干燥后，把一個預先做好的塑料模具覆蓋在忍片表面，同時把制 備好的SOiil催化溶液加入到各個微孔里面，一直到反應液把所有的電極都覆蓋住，然后用 多通道恒電位儀檢測16個微孔上的電化學反應信號，通過不同的輸出電化學信號值來鑒定 不同的細菌種類。
[0054] 實施例2
[0055]如圖6-7;在電化學電極陣列表面成功構建11-琉基十一燒酸-BPA單分子自組裝層 后，分別向2、8、14、16號反應槽中加入化L 0.1皿01/L的生物素化DNA檢測探針，將電化學電 極陣列放入到充滿氮氣的解育盒中IOmin后取出，用PBS輕輕沖洗5s，分別再往2、8、14、16號 反應槽中加入化L 0.01 皿ol/LJuL O.lOjimol/L、化L 0.05皿ol/L、l]iL 0.03]imol/L的HRP- Avidin功能化的大腸桿菌DNA祀分子探針序列，然后將解育盒放入65°C水浴箱中充分解育 雜交40min后取出，用PBS緩沖液沖洗5s，迅速在2、8、14、16號反應槽中分別加入20化TMB- 出化溶液，放入讀數(shù)器內(nèi)進行檢測。
[0056] 在電化學電極陣列表面成功構建硫醇自組裝單分子層的基礎上修飾了 HRP- Avidin。分別采用循環(huán)伏安法和計時電流法對電化學電極陣列的生物功能化進行了研究， 其中6號反應槽電極為裸電極，其相對應反應曲線為(6)，當4號電極表面成功構建11-琉基 十一燒酸自組裝單分子層后，反應曲線為(4)，與曲線(6)相比電流減小，2號電極表面構建 有11-琉基十一燒酸-BPA分子組裝層，因為有大生物分子BPA的存在，曲線(2)電流明顯的減 小。8號電極表面成功修飾上HRP-Avidin,曲線(8)反應電流明顯增大，因為HRP催化出〇2產(chǎn)生 02氧化TMB，發(fā)生強烈的氧化還原反應而產(chǎn)生明顯的電流變化。與循環(huán)伏安法相應的計時電 流檢測曲線，其中（10)為裸電極在118-肥化的計時電流曲線，（12)為構建11-琉基^^一燒酸 單分子自組裝層后的反應曲線，（14)是構建有11-琉基十一燒酸一BPA分子組裝層曲線， (16)為在分子自組裝層修飾上HRP-Avidin的反應曲線。研究表明經(jīng)生物功能化修飾后的電 化學電極陣列性能良好，10、12、14、16號電極的計時電流穩(wěn)態(tài)值(單位：1 X 10 - 5 A)分別為 0.0051、0.3020、0.9640、1.0900,能檢測出因構建和修飾不同生物大分子后電化學電極陣 列表面產(chǎn)生的1.26 X 10-6A電流變化。
[0057] 表1為常見尿路感染菌屬及其16S rDNA相互補的探針基因序列。
[005引常見尿路感染菌屬及其ieSrDNA相互補的探針基因序列
[0化9]
【主權項】
1. 一種16SrRNA電化學生物芯片，包括芯片，其特征在于：在芯片表面上構建單分子自 組裝層，芯片表面具有芯片微孔;所述芯片微孔中分別固定有捕獲探針和檢測探針，所述捕 獲探針上捕獲有病原菌16S rRNA靶分子;所述檢測探針形成16S rRNA分子探針識別層。2. 如權利要求1所述一種16SrRNA電化學生物芯片，其特征在于:所述單分子自組裝層 為11-巰基十一烷酸-BPA單分子自組裝層。3. 如權利要求1所述一種16SrRNA電化學生物芯片，其特征在于:所述檢測探針為合成 的生物素化DNA檢測探針，所述合成的生物素化DNA檢測探針上設置有修飾層。4. 如權利要求3所述一種16SrRNA電化學生物芯片，其特征在于:所述檢測探針上標記 有辣根過氧化物酶生物活性物質(zhì)。
【文檔編號】G01N27/26GK205720081SQ201620156838
【公開日】2016年11月23日
【申請日】2016年3月2日
【發(fā)明人】劉成桂, 趙朝輝, 王秦, 楊淑哲, 羅君, 趙波, 賀葦軍, 趙麗
【申請人】成都市婦女兒童中心醫(yī)院, 成都貝斯納生物科技有限公司