專利名稱：使用非線性光學(xué)技術(shù)檢測涉及構(gòu)象變化的相互作用的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用表面選擇性非線性光學(xué)技術(shù)檢測生物成分之間相互作用的方法。本發(fā)明的一個方面涉及檢測導(dǎo)致構(gòu)象變化的探針和靶之間的結(jié)合。
2.背景技術(shù)結(jié)合的檢測在現(xiàn)代分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中，檢測和定量生物分子之間的相互作用，例如結(jié)合，具有重要意義。結(jié)合到分子上的配體和藥物是現(xiàn)代生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和藥物開發(fā)的重要主題。生物成分之間的結(jié)合反應(yīng)通常導(dǎo)致構(gòu)象或偶極矩(或誘導(dǎo)的偶極矩)的變化。構(gòu)象變化(分子或分子亞基的方向或位置的變化)是很多系統(tǒng)的重要信號特征。通過直接測定構(gòu)象變化或偶極矩變化而檢測信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物(例如膜受體)活化的技術(shù)，在基礎(chǔ)研究和發(fā)現(xiàn)藥物中具有重要價值。例如可以使用本發(fā)明的方法進行高通量藥物篩選，篩選一個受體可能的激動劑或拮抗劑，所述方法用于檢測激動劑或拮抗劑是否誘導(dǎo)預(yù)示受體結(jié)合和激活的構(gòu)象變化。因為構(gòu)象變化是受體活化的直接指示物，所以是篩選藥物的極好的方式；目前的技術(shù)通常依賴于間接測定活化作用，例如伴隨鈣離子濃度變化的熒光強度的變化，而離子濃度的變化又是由受體活化引起的。目前這種直接測定活化作用的技術(shù)，例如離子通道蛋白的膜片鉗技術(shù)，不適用于高通量放大試驗，并且需要熟練的技術(shù)人員操作，因此導(dǎo)致了使用者較高的成本。
基于熒光的或基于表面細胞質(zhì)基因組的檢測技術(shù)過去用于檢測結(jié)合的相互作用，其成功率和效率有變化。使用熒光產(chǎn)生的問題包括很多(非標(biāo)記)生物樣品中天然熒光背景的存在以及光漂白。很難用熒光檢測伴隨靶結(jié)合的方向變化，因為該技術(shù)對標(biāo)記方向不十分靈敏。熒光偏振，它不是一種相干的技術(shù)，對熒光持續(xù)期間的旋轉(zhuǎn)運動敏感，使得很難將特定的偏振方向中檢測到的微小變化歸因于構(gòu)象變化(不是由于旋轉(zhuǎn)運動)。從存在于很多生物樣品中的大量熒光背景中分離探針方向的微小變化也很困難。而且，使用熒光從預(yù)示受體活化的信號中分離預(yù)示結(jié)合的信號通常并非是不重要的；例如，使用熒光偏振檢測熒光標(biāo)記的靶結(jié)合給定受體的能力-但是靶與表面，例如細胞表面的結(jié)合也會非特異性的發(fā)生，因此靶非特異性地與感興趣的受體結(jié)合仍然給出預(yù)示所述結(jié)合的信號；直接檢測構(gòu)象變化作為受體活化的指示物是一種更直接的測定活化作用的方式?？梢杂^察構(gòu)象變化導(dǎo)致標(biāo)記的微環(huán)境變化引起的波長變化，但不是所有的構(gòu)象變化都導(dǎo)致微環(huán)境變化，并且很難將由于微環(huán)境導(dǎo)致的相對變化歸因于實際發(fā)生的構(gòu)象變化程度?，F(xiàn)有技術(shù)中使用熒光檢測蛋白構(gòu)象變化的例子如下Mannuzzu et al.(1996)Science 271，213-216描述了以熒光標(biāo)記通道蛋白直接物理檢測鉀通道的構(gòu)象重排。Gether etal.，″Fluorescent labeling of purified(β2 adrenergicreceptor，″J.Biol.Chem.270，28628-28275(1995)描述了以熒光標(biāo)記的可溶性純化β2腎上腺素能受體檢測配體特異性構(gòu)象變化。Turcatti et al.，″Probing the Structure and Function of theTachykinin Neurokinin-Receptor through Biosyntheticincorporation of flourescent amino acids at specific sites，″J.Biol.Chem.271，19991-19998，(1996)描述了將非天然熒光氨基酸摻入受體以監(jiān)測配體結(jié)合。Liu et al.，″Site-Directedfluorescent labeling of P-glycoprotein on cysteine residuesin the nucleotide binding domains，″Biochemistry 35，11865-11873，(1996)描述了以熒光標(biāo)記的可溶性純化P-糖蛋白檢測配體結(jié)合。
熒光也被用于檢測靶與離子通道受體的結(jié)合，這種結(jié)合產(chǎn)生細胞跨膜電勢的變化?？缒る妱莸淖兓?例如去極化)導(dǎo)致膜上熒光或非線性活性標(biāo)記的強度、持續(xù)時間、波長等的變化。除了檢測本身的各種問題——涉及光漂白，假象和背景噪音，這些方法僅僅提供了一種探針-靶結(jié)合的間接檢測方法。例如，有可能給定的靶與離子通道探針結(jié)合，并且離子通道被激活，但是沒有導(dǎo)致跨膜電勢的變化，這或者是由于自然原因或者因為在正常產(chǎn)生跨膜電勢變化的機制的細胞中出現(xiàn)了問題。因此，當(dāng)結(jié)合反應(yīng)導(dǎo)致探針方向或構(gòu)象變化的情況時，希望以一種直接的光學(xué)方式檢測探針-靶的這種結(jié)合反應(yīng)。
分子標(biāo)志分子標(biāo)志也可用于檢測結(jié)合相互作用。現(xiàn)有技術(shù)中已知的分子標(biāo)志探針(MB)是發(fā)夾環(huán)，即包含嵌入形成發(fā)夾莖的互補序列的探針序列的單鏈寡核苷酸。存在互補核酸時，分子的環(huán)部形成雙鏈DNA。熒光團共價連接于寡核苷酸的一端，非熒光猝滅劑共價連接于另一端。一般，標(biāo)志兩端的每一端有5-8個堿基彼此互補。莖使兩個部分彼此保持緊密靠近，使熒光團的熒光通過能量轉(zhuǎn)移而猝滅。當(dāng)標(biāo)志與靶結(jié)合，探針-靶的雙倍體的剛度迫使莖伸直，使熒光團和猝滅劑分離以及熒光恢復(fù)。這樣當(dāng)存在非雜交探針時也可以檢測探針-靶雜交體。
以下(及其中的參考資料)描述了熒光參考文獻中制備、設(shè)計和使用分子標(biāo)志(MBs)Sequence Dependent Rigidity of Single Stranded DNA，Phys.Rev.Lett.，85，2400 No.11，Noel L.Goddard，1 Grégoire Bonnet，1 Oleg Krichevsky，2 and Albert Libchaber，2000.
Metal-containing DNA hairpins as hybridization probes，H.S.Joshi and Y.Tor，Chem.Commun.，2001，549-550.
Spectral Genotyping of Human Alleles，L.G.Kostrikis，S.Tyagi，M.M.Mhlanga，D.D.Ho，F(xiàn).R.Kramer，Science v.279，F(xiàn)eb.1998.
Molecular Beacons for DNA Biosensors with Micrometer to Submicrometer Dimensions，X.Liu，W.Farmerie，S.Schuster，W.Tan，Anal.Biochem.，283，56-63，2000.
Multiplex detection of single-nucleotide variations using molecular beacons，S.A.E.Marras，F(xiàn).R.Kramer，S.Tyagi，Genetic AnalysisBiomolecular Engineering，14(1999)，151-156.
Screening unlabeled DNA targets with randomly ordered fiber-optic gene arrays，F(xiàn).J.Steemers，J.A.Ferguson，D.R.Walt，Nature Biotechnology，v.18，2000，91.
Wavelength-shifting molecular beacons，S.Tyagi，S.A.E.Marras，F(xiàn).R.Kramer，NatureBiotechnology，v.18，2000，1191.
Molecular BeaconsProbes that Fluoresce upon Hybridization，S.Tyagi，F(xiàn).R.Kramer，Nature Biotechnology，v.14，1996，303.
Technology for microarray analysis of gene expression，A.Watson，A.Mazumder，M.Stewar，S.Balasubramanian，Current Opinion in Biotechnology，9，609-614，1998.
Design of a Molecular Beacon DNA Probe with Two Fluorophores，P.Zhang，T.Beck，W.Tan，Angew.Chem.Int.Ed.40，402，2001Bonnet G，Tyagi S，Libchaber A，and Kramer FR(1999)Thermodynamic basis of theenhanced specificity of structured DNA probes.Proc Natl Acad Sci USA 96，6171-6176.
Dubertret B，Calame M，and Libchaber A(2001)Single-mismatch detection using gold-quenched fluorescent oligonucleotides.Nat Biotechnol 19，365-370.
Marras SAE，Kramer FR，and Tyagi S(1999)Multiplex detection of single-nucleotidevariations using molecular beacons.Genet Anal 14，151-156.
Mullah B and Livak K(1999)Efficient automated synthesis of molecular beacons.Nucleosides & Nucleotides 18，1311-1312.
Ortiz E，Estrada G，and Lizardi PM(1998)PNA molecular beacons for rapid detection ofPCR amplicons.Mol Cell Probes 12，219-226.
Tyagi S，Marras SAE，and Kramer FR(2000)Wavelength-shifting molecular beacons.NatBiotechnol 18，1191-1196.
Tyagi S，Bratu DP，and Kramer FR(1998)Multicolor molecular beacons for allelediscrimination.Nat Biotechnol 16，49-53.
Tyagi S and Kramer FR(1996)Molecular beaconsprobes that fluoresce uponhybridization.Nat Biotechnol 14，303-308.
E1-Hajj HH，Marras SA，Tyagi S，Kramer FR，and Alland D(2001)Detection of rifampinresistance in Mycobacterium tuberculosis in a single tube with molecular beacons.J ClinMicrobiol 39，4131-4137.
Giesendorf BA，Vet JA，Tyagi S，Mensink EJ，Trijbels FJ，and Blom HJ(1998)Molecularbeaconsa new approach for semiautomated mutation analysis.Clin Chem 44，482-486.
Kostrikis LG，Tyagi S，Mhlanga MM，Ho DD，and Kramer FR(1998)Spectral genotypingof human alleles.Science 279，1228-1229.
Piatek AS，Telenti A，Murray MR，E1-Hajj H，Jacobs WR，Jr.，Kramer FR，and Alland D(2000)Genotypic analysis of Mycobacterium tuberculosis in two distinct populations usingmolecular beaconsimplications for rapid susceptibility testing.Antimicrob AgentsChemother 44，103-110.
Piatek AS，Tyagi S，Pol AC，Telenti A，Miller LP，Kramer FR，and Alland D(1998)Molecular beacon sequence analysis for detecting drug resistance in Mycobacteriumtuberculosis.Nat Biotechnol 16，359-363.
Rhee JT，Piatek AS，Small PM，Harris LM，Chaparro SV，Kramer FR，and Alland D(1999)Molecular epidemiologic evaluation of transmissibility and virulence of Mycobacteriumtuberculosis.J Clin Microbiol 37，1764-1770.
Szuhai K，Ouweland JM，Dirks RW，Lemaitre M，Truffert JC，Janssen GM，Tanke HJ，Holme E，Maassen JA，and Raap AK(2001)Simultaneous A8344G heteroplasmy andmitochondrial DNA copy number quantification in myoclonus epilepsy and ragged-redfibers(MERRF)syndrome by a multiplex molecular beacon based real-time fluorescencePCR.Nucleic Acids Res 29，E13.
Szuhai K，Sandhaus E，Kolkman-Uljee SM，Lemaitre M，Truffert JC，Dirks RW，Tanke HJ，F(xiàn)leuren GJ，Schuuring E，and Raap AK(2001)A novel strategy for human papillomavirusdetection and genotyping with SybrGreen and molecular beacon polymerase chain reaction.Am J Pathol 159，1651-1660.
Tpp I，Malmberg L，Rennel E，Wik M，and Syvnen AC(2000)Homogeneous scoring ofsingle-nucleotide polymorphismscomparison of the 5′-nuclease TaqMan assay andmolecular beacon probes.Biotechniques 28，732-738.
Vogelstein B and Kinzler KW(1999)Digital PCR.Proc Natl Acad Sci USA 96，9236-9241.
Arnold SF，Tims E，and McGrath BE(1999)Identification of bone morphogenetic proteinsand their receptors in human breast cancer cell linesimportance of BMP2.Cytokine 11，1031-1037.
Chen W，Martinez G，and Mulchandaui A(2000)Moleeular beaconsa real-timepolymerase chain reaction assay for detecting Salnonella.Anal Biochem 280，166-172.
Clayton SJ，Scott FM，Walker J，Callaghan K，Haque K，Liloglou T，Xinarianos G，Shawcross S，Ceuppens P，F(xiàn)ield JK，and Fox JC(2000)K-ras point mutation detection inlung cancercomparison of two approaches to somatic mutation detection using ARMSallele-specific amplification.Clin Chem 46，1929-1938.
Devor EJ(2001)Use of molecular beacons to verify that the serinehydroxymethyltransferase pseudogene SHMT-psl is unique to the order primates.GenomeBiol 2.6.1-6.5.
Dracheva S，Marras SAE，Elhakem AL，Kramer FR，Davis KL，and Haroutunian V(2001)N-Methyl-D-Aspartic Acid Receptor expression in Dorsolateral Prefrontal Cortex of elderlypatients with schizophrenia.American Journal of Psychiatry.158，1400-1410.
Durand R，Eslahpazire J，Jafari S，Delabre JF，Marmorat-Khuong A，di Piazza JP，and LeBras J(2000)Use of molecular beacons to detect an antifolate resistance-associatedmutation in Plasmodium falciparum.Antimicrob Agents Chemother 44，3461-3464.
Eun AJC and Wong SM(2000)Molecular beaconsa new approach to plant virusdetection.Phytopathology 90，269-275.
Fortin NY，Mulchandani A，and Chen W(2001)Use of real-time polymerase chain reactionand molecular beacons for the detection of Escherichia coli O157H7.Anal Biochem 289，281-288.
Gonzalez E，Bamshad M，Sato N，Mummidi S，Dhanda R，Catano G，Cabrera S，McBrideM，Cao XH，Merrill G，O′Connell P，Bowden DW，F(xiàn)reedman BI，Anderson SA，Walter EA，Evans JS，Stephan KT，Clark RA，Tyagi S，Ahuja SS，Dolan MJ，and Ahuja SK(1999)Race-specific HIV-1 disease-modifying effects associated with CCR5 haplotypes.Proc NatlAcad Sci U S A 96，12004-12009.
Heil SG，Lievers KJ，Boers GH，Verhoef P，den Heijer M，Trijbels FJ，and Blom HJ(2000)Betaine-Homocysteine Methyltransferase(BHMT)genomic sequencing and relevance tohyperhomocysteinemia and vascular disease in humans.Mol Genet Metab 71，511-519.
Helps C，Reeves N，Tasker S，and Harbour D(2001)Use of real-time quantitative PCR todetect Chlamydophila felis infection.J Clin Microbiol 39，2675-2676.
Kota R，Holton TA，and Henry RJ(1999)Detection of transgenes in crop plants usingmolecular beacon assays.Plant Mol Biology Rep 17，363-370.
Lewin SR，Vesanen M，Kostrikis L，Hurley A，Duran M，Zhang L，Ho DD，and MarkowitzM(1999)Use of real-time PCR and molecular beacons to detect virus replication in humanimmunodeficiency virus type 1-infected individuals on prolonged effective antiretroviraltherapy.J Virol 73，6099-6103.
Li Q，Liang J，Luan G，Zhang Y，and Wang K(2000)Molecular beacon-basedhomogeneous fluorescence PCR assay for the diagnosis of infectious diseases.AnalyticalSciences 16，245-248.
Manganelli R，Dubnau E，Tyagi S，Kramer FR，and Smith I(1999)Differential expressionof 10 sigma factor genes in Mycobacterium tuberculosis.Mol Microbiol 31，715-724.
Martinson JJ，Hong L，Karanicolas R，Moore JP，and Kostrikis LG(2000)Globaldistribution of the CCR2-64I/CCR5-59653T HIV-1 disease-protective haplotype.Aids 14，483-489.
McKillip JL and Drake M(2000)Molecular beacon polymerase chain reaction detection ofEscherichia coli O157H7 in milk.J Food Prot 63，855-859.
Metzner KJ，Jin X，Lee FV，Gettie A，Bauer DE，Di Mascio M，Perelson AS，Marx PA，HoDD，Kostrikis LG，and Connor RI(2000)Effects of in vivo CD8(+)T cell depletion onvirus replication in rhesus macaques immunized with a live，attenuated simianimmunodeficiency virus vaccine.J Exp Med 191，1921-1931.
Park S，Wong M，Marras SA，Cross EW，Kiehn TE，Chaturvedi V，Tyagi S，and Perlin DS(2000)Rapid identification of Candida dubliniensis using a species-specific molecularbeacon.J Clin Microbiol 38，2829-2836.
Pierce KE，Rice JE，Sanchez JA，Brenner C，and Wangh LJ(2000)Real-time PCR usingmolecular beacons for accurate detection of the Y chromosome in single humanblastomeres.Mol Hum Reprod 6，1155-1164.
Poddar SK(2000)Symmetric vs asymmetric PCR and molecular beacon probe in thedetection of a target gene of adenovirus.Mol Cell Probes 14，25-32.
Poddar SK(1999)Detection of adenovirus using PCR and molecular beacon.J VirolMethods 82，19-26.
Sebti A，Kiehn TE，Perlin D，Chaturvedi V，Wong M，Doney A，Park S，and Sepkowitz KA(2001)Candida dubliniensis at a Cancer Center.Clin Infect Dis 32，1034-1038.
Shih IM，Zhou W，Goodman SN，Lengauer C，Kinzler KW，and Vogelstein B(2001)Evidence that genetic instability occurs at an early stage of colorectal tumorigenesis.CancerRes 61，818-822.
Smit ML，Giesendorf BA，Vet JA，Trijbels FJ，and Blom HJ(2001)Semiautomated DNAmutation analysis using a robotic workstation and molecular beacons.Clin Chem 47，739-744.
Steuerwald N，Cohen J，Herrera RJ，and Brenner CA(1999)Analysis of gene expression insingle oocytes and embryos by real-time rapid cyele fluorescence monitored RT-PCR.MolHum Reprod 5，1034-1039.
Valentin A，Trivedi H，Lu W，Kostrikis LG，and Pavlakis GN(2000)CXCR4 mediatesentry and productive infection of syncytia-inducing(X4)HIV-1 strains in primarymacrophages.Virology 269，294-304.
Van Schie RC，Marras SA，Contoy JM，Nowak NJ，Catanese JJ，and de Jong PJ(2000)Semiautomated clone vetification by real-time PCR using molecular beacons.Biotechniques 29，1296-1306.
Vet JA，Majithia AR，Marras SAE，Tyagi S，Dube S，Poiesz BJ，and Kramer FR(1999)Multiplex deteetion of four pathogenic retroviruses using molecular beacons.Proc NatlAcad Sci USA 96，6394-6399.
Xiao G，Chicas A，Olivier M，Taya Y，Tyagi S，Kramer FR，and Bargonetti J(2000)ADNA damage signal is required for p53 to activate gadd45.Cancer Res 60，1711-1719.
Zhang L，Lewin SR，Markowitz M，Lin HH，Skulsky E，Karanicolas R，He Y，Jin X，Tuttleton S，Vesanen M，Spiegel H，Kost R，van Lunzen J，Stellbrink HJ，Wolinsky S，Borkowsky W，Palumbo P，Kostrikis LG，and Ho DD(1999)Measuring recent thymicemigrants in blood of normal and HIV-1-infected individuals before and after effectivetherapy.J Exp Med 190，725-732.
De Baar MP，van Dooren MW，de Rooij E，Bakker M，van Gemen B，Goudsmit J，and deRonde A(2001)Single rapid real-time monitored isothermal RNA amplification assay forquantification of Human Immunodeficiency Virus Type 1 isolates from groups M，N，andO.J Clin Microbiol 39，1378-1384.
De Baar MP，Timmermans EC，Bakker M，de Rooij E，van Gemen B，and Goudsmit J(2001)One-tube real-time isothermal amplification assay to identify and distinguish HumanImmunodeficiency Virus TyPe 1 subtypes A，B，and C and circulating recombinant formsAE and AG.J Clin Microbiol 39，1895-1902.
De Ronde A，van Dooren M，van Der Hoek L，Bouwhuis D，de Rooij E，van Gemen B，deBoer R，and Goudsmit J(2001)Establishment of new transmissible and drug-sensitiveHuman Immunodeficiency Virus Type 1 wild types due to transmission of nucleosideanalogue-resistant virus.J Virol 75，595-602.
Greijer A.E.，Adriaanse H.M.，Dekkers C.A.，and Middeldorp J.M.(2002)Multiplex real-time NASBA for monitoring expression dynamics of human cytomegalovirus encoded IE1and pp67 RNA.J Clin Virol 24，57-66.
Klerks MM，Leone GO，Verbeek M，van den Heuvel JF，and Schoen CD(2001)Development of a multiplex AmpliDet RNA for the simultaneous detection of Potatoleafroll virus and Potato virus Y in potato tubers.J Virol Methods 93，115-125.
Leone G，van Schijndel H，van Gemen B，Kramer FR，and Schoen CD(1998)Molecularbeacon probes combined with amplification by NASBA enable homogeneous，real-timedetection of RNA.Nucleic Acids Res 26，2150-2155.
Lanciotti R.S.and Kerst A.J.(2001)Nucleic acid sequence-based amplification assays forrapid detection of West Nile and St.Louis encephalitis viruses.J Clin Microbiol 39，4506-4513.
Szemes M.，Klerks M.M.，van den Heuvel J.F.，and Scheen C.D.(2002)Development of amultiplex AmpliDet RNA assay for simultaneous detection and typing of potato virus Yisolates.J Virol Methods 100，83-96.
Van Beuningen R，Marras SAE，Kramer FR，Oosterlaken T，Weusten J，Borst G，and vande Wiel P(2001)Development of a high-throughput detection system for HIV-1 using real-time NASBA based on molecular beacons.Proceedings-SPIE the International Society forOptical Engineering.4264，66-71.
Yates S，Penning M，Goudsmit J，F(xiàn)rantzen I，van De Weijer B，van Strijp D，and vanGemen B(2001)Quantitative detection of Hepatitis B Virus DNA by real-time nucleic acidsequence-based amplification with molecular beacon detectior.J Clin Microbiol 39，3656-3665.
Brown LJ，Cummins J，Hamilton A，and Brown T(2000)Molecular beacons attached toglass beads fluoresce upon hybridisation to target DNA.Chemical Comm，621-622.
Liu X，F(xiàn)armerie W，Schuster S，and Tan W(2000)Molecular beacons for DNA biosensorswith micrometer to submicrometer dimensions.Anal Biochem 283，56-63.
Liu X and Tan W(1999)A fiber-optic evanescent wave DNA biosensor based on novelmolecular beacons.Anal Chem 71，5054-5059.
Steemers FJ，F(xiàn)erguson JA，and Walt DR(2000)Screening unlabeled DNA targets withrandomly ordered fiber-optic gene arrays.Nat Biotechnol 18，91-94.
Antony T，Thomas T，Sigal LH，Shirahata A，and Thomas TJ(2001)A molecular beaconstrategy for the thermodynamic characterization of triplex DNAtriplex formation at thepromoter region of cyclin D1.Biochemistry 40，9387-9395.
Bonnet G，Krichevsky O，and Libchaber A(1998)Kinetics of conformational fluctuationsin DNA hairpin-loops.Proc Natl Acad Sci USA 95，8602-8606.
Fang X，Li JJ，and Tan W(2000)Using molecular beacons to probe molecular interactionsbetween lactate dehydrogenase and single-stranded DNA.Anal Chem 72，3280-3285.
Gao W，Tyagi S，Kramer FR，and Goldman E(1997)Messenger RNA release fromribosomes during 5′-translational blockage by consecutive low-usage arginine but notleucine codons in Escherichia coli.Mol Microbiol 25，707-716.
Goddard NL，Bonnet G，Krichevsky O，and Libchaber A(2000)Sequence dependentrigidity of single stranded DNA.Phys Rev Lett 85，2400-2403.
Gold B，Rodriguez M，Marras SAE，Pentecost M，and Smith I(2001)The Mycobacteriumtuberculosis IdeR is a dual functional regulator that controls transcription of genes involvedin iron acquisition，iron storage，and survival in macrophages.Molecular Microbiology 42，851-866.
Jordens JZ，Lanham S，Pickett MA，Amarasekara S，Abeywickrema I，and Watt PJ(2000)Amplification with molecular beacon primers and reverse line blotting for the detection andtyping of human papillomaviruses.J Virol Methods 89，29-37.
Joshi HS and Tor Y(2001)Metal-containing DNA hairpins as hybridization probes.Chemical Comm 6，559-550.
Kaboev OK，Luchkina LA，Tret′iakov AN，and Bahrmand AR(2000)PCR hot start usingprimers with the structure of molecular beacons(hairpin-like structure).Nucleic Acids Res28，E94.
Li JJ，Geyer R，and Tan W(2000)Using molecular beacons as a sensitive fluorescenceassay for enzymatic cleavage of single-stranded DNA.Nucleic Acids Res 28，E52.
Li JJ，F(xiàn)ang XH，Schuster SM，and Tan WH(2000)Molecular beaconsa novel approach todetect protein-DNA interactions.Angew Chem Int Ed 39，1049-1052.
Lindquist JN，Kauschke S G，Stefanovic B，Burchardt ER，and Brenner DA(2000)Characterization of the interaction between alphaCP(2)and the 3′-untranslated region ofcollagen alphal(I)mRNA.Nucleic Acids Res 28，4306-4316.
Liu J.，F(xiàn)eldman P.，and Chung T.D.(2002)Real-time monitoring in vitro transcriptionusing molecular beacons.Anal Biochem 300，40-45.
Matsuo T(1998)In situ visualization of mRNA for basic fibroblast growth factor in livingcells.Biochimica Biophysica Acta 1379，178-184.
Nazarenko IA，Bhatnagar SK，and Hohman PJ(1997)A closed tube format foramplification and detection of DNA based on energy transfer.Nucleic Acids Res 25，2516-2521.
Saha BK，Tian B，and Bucy RP(2001)Quantitation of HIV-1 by real-time PCR with aunique fluorogenic probe.J Virol Methods 93，33-42.
Schofield P，Pell AN，and Krause DO(1997)Molecular beaconstrial of a fluorescence-based solution hybridization technique for ecological studies with ruminal bacteria.ApplEnviron Mierobiol 63，1143-1147.
Sokol DL，Zhang X，Lu P，and Gewirtz AM(1998)Real time detection of DNA.RNAhybridization in living cells.Proc Natl Acad Sci USA 95，11538-11543.
Strouse RJ，Hakki FZ，Wang SC，DeFusco AW，Garrett JL，and Schenerman MA(2000)Using molecular beacons to quantify low levels of type I endonuclease activity.Biopharm13，40-47.
Tan W，F(xiàn)ang X，Li J，and Liu X(2000)Molecular beaconsa novel DNA probe for nucleicacid and protein studies.Chemistry 6，1107-1111.
Thelwell N，Millington S，Solinas A，Booth J，and Brown T(2000)Mode of action andapplication of scorpion primers to mutation detection.Nucleic Acids Res 28，3752-3761.
Tung CH，Mahmood U，Bredow S，and Weissleder R(2000)In vivo imaging of proteolyticenzyme activity using a novel molecular reporter.Cancer Res 60，4953-4958.
Whitcombe D，Theaker J，Guy SP，Brown T，and Little S(1999)Detection of PCR productsusing self-probing amplicons and fluorescence.Nat Biotechnol 17，804-807.
Yamamoto R，Baba T，and Kumar PK(2000)Molecular beacon aptamer fluoresces in thepresence of Tat protein of HIV-1.Genes Cells 5，389-396.
Ying L，Wallace MI，and Klenerman D(2001)Two-state model of conformationalfluctuation in a DNA hairpin-loop.Chemical Physics Letters 334，145-150.
Zhang P，Beck T，and Tan W(2001)Design of a molecular beacon DNA probe with twofluorophores.Angew.Chem.Int.Ed.40，402-405.
非線性光學(xué)技術(shù)表面選擇性非線性光學(xué)技術(shù)以前主要局限于物理和化學(xué)領(lǐng)域，因為相對來說極少生物樣品本質(zhì)上就具有非線性活性。例子包括使用光學(xué)非線性活性染料作為膜染料，以及用于生物細胞的成像的內(nèi)源性非線性活性染料(GFP)(Campagnola et al.，″High-resolutionnonlinear optical imaging of live cells by second harmonicgeneration，″Biophysical Journal 77(6)，3341-3349(1999)，Peleg et al.，″Nonlinear optical measurement of membranepotential around single molecules at selected cellular sites，″Proc.Natl.Acad.Sci.V.96，(1999)，6700-6704及其中的參考文獻)。下述文獻(及其中的參考文獻)是這個領(lǐng)域的示例A.Lewis，A.Khatchatouriants，M.Treinin，Z.Chen，G.Peleg，N.Friedman，O.Bouevitch，Z.Rothman，L.Loew and M.Sheves，“Second Harmonic Generation of BiologicalInterfacesProbing the Membrane Protein Bacteriorhodopsin and Imaging MembranePotential Around GFP Molecules at Specific Sites in Neuronal Cells of C.elegans，”Chemical Physics 245，133(1999).
O.Bouevich，A.Lewis，I.Pinnevsky and L.Loew，″Probing Membrane Potential with Non-linear Optics，″Biophys.J.65，672(1993).
I.Ben-Oren，G.Peleg，A.Lewis，B.Minke and L.Loew，″Infrared nonlinear opticalmeasurements of membrane potential in photoreceptor cells，″Biophys.J.71，616(1996).
G.Peleg，A.Lewis，M.Linial and L.M.Loew，“Non-linear Optical Measurement ofMembrane Potential Around Single Molecules at Selected Cellular Sites，”Proc.Acad.Sci.USA 96，6700(1999).
P.Campagnola，Mei-de Wei，A.Lewis and L.Loew，“High-Resolution Nonlinear OpticalImaging of Live Cells by Second Harmonic Generation，”Biophys.J.77，3341(1999).
J.Y.Huang，A.Lewis and L.Loew，″N[on-linear Optical Properties ofPotential Sensitive Styryl Dyes″，Biophysical J.53，665(1988).
A.Lewis，A.Khatchatouriants，M.Treinin，Z.Chen，G.Peleg，N.Friedman，O.Bouevitch，Z.Rothman，L.Loew and M.Sheves，“Second Harmonic Generation of BiologicalInterfacesProbing Membrane Proteins and Imaging Membrane Potential Around GFPMolecules at Specific Sites in Neuronal Cells of C.elegans，”Chemical Physics 245，133-144(1999).
A.Khatchatouriants，A.Lewis，Z.Rothman，L.Loew and M.Treinin，“GFP is a SelectiveNon-Linear Optical Sensor of Electrophysiological Processes in C.elegans，”Biophys.J.(inpress，2000)現(xiàn)有技術(shù)中，非線性活性染料固定在膜上并且用于細胞表面成像。然而這些染料以或“上”或“下”的方向嵌入膜中，因此由于相消性干擾減少了總的非線性信號。非線性光學(xué)活性染料也已用于測定這些染料穿過脂質(zhì)體中脂雙層的動力學(xué)(A.Srivastava和KBEisenthal，″Kinetics of molecular transport across a liposomebilayer，″Chem.Phys.Lett.292(3)345-351(1998))。
本發(fā)明具有優(yōu)于基于熒光檢測的優(yōu)點，例如背景降低，光漂白減少，簡化光學(xué)檢測，無需耗費精力和時間的洗滌步驟。這些優(yōu)點是由于非線性光學(xué)技術(shù)的低背景，是由于這種方法是一個散射過程而不是吸收過程。
因此，本發(fā)明的目的是當(dāng)結(jié)合反應(yīng)導(dǎo)致探針，靶或者探針和靶的方向或構(gòu)象變化的情況時，提供一種直接的光學(xué)方法檢測探針-靶的結(jié)合反應(yīng)。
3.發(fā)明概述本發(fā)明公開了一種篩選一種或多種與測試分子(本文中稱為靶)結(jié)合的候選結(jié)合配偶體(本文中稱為探針)的方法。該方法包括以一種或多種基頻的一種或多種光束照射樣品，所述樣品包含暴露于一種或多種候選結(jié)合配偶體的測試分子，測定樣品發(fā)射的非線性光束的一種或多種物理性質(zhì)。測定的一種或多種物理性質(zhì)的數(shù)值相對于不將所述測試分子暴露于所述一種或多種候選結(jié)合配偶體時測定的一種或多種物理性質(zhì)的數(shù)值的變化，預(yù)示所述一種或多種候選結(jié)合配偶體與所述測試分子結(jié)合。
本發(fā)明公開了一種篩選一種或多種能夠調(diào)節(jié)測試分子與其結(jié)合配偶體之間相互作用的候選調(diào)節(jié)分子的方法。該方法包括以一種或多種基頻的一種或多種光束照射樣品所述樣品包含暴露于(i)所述結(jié)合配偶體，和(ii)所述一種或多種候選調(diào)節(jié)分子的測試分子，測定所述樣品發(fā)射的非線性光束的一種或多種物理性質(zhì)。測定的所述一種或多種物理性質(zhì)的數(shù)值相對于不暴露于所述一種或多種候選調(diào)節(jié)分子時測定的所述一種或多種物理性質(zhì)的數(shù)值的變化，預(yù)示所述一種或多種候選調(diào)節(jié)分子調(diào)節(jié)所述測試分子與所述結(jié)合配偶體之間的相互作用。
本發(fā)明提供了一種檢測測試分子與結(jié)合配偶體結(jié)合后所述測試分子的構(gòu)象變化的方法，包括將所述測試分子與一種或多種候選結(jié)合配偶體接觸，該測試分子或一種或多種候選結(jié)合配偶體分別用非線性活性部分標(biāo)記，該非線活性部分對測試分子或一種或多種候選結(jié)合配偶體是非天然的。該方法包括以一種或多種基頻的一種或多種光束照射所述接觸測試分子，測定樣品發(fā)射的非線性光束的一種或多種物理性質(zhì)。測定的所述一種或多種物理性質(zhì)的數(shù)值相對于沒有所述一種或多種候選結(jié)合配偶體時測定的所述一種或多種物理性質(zhì)的數(shù)值的變化，預(yù)示至少一種所述一種或多種候選結(jié)合配偶體與所述測試分子結(jié)合，且所述結(jié)合誘導(dǎo)所述候選結(jié)合配偶體，所述測試分子，或所述候選結(jié)合配偶體和所述測試分子的構(gòu)象變化。
本發(fā)明提供了一種檢測測試分子和一種或多種結(jié)合配偶體之間結(jié)合相互作用的程度或范圍的方法，包括將所述測試分子與一種或多種候選結(jié)合配偶體接觸，該測試分子或一種或多種候選結(jié)合配偶體分別用非線性活性部分標(biāo)記，該非線性活性部分對測試分子或一種或多種候選結(jié)合配偶體是非天然的。該方法包括以一種或多種基頻的一種或多種光束照射所述接觸測試分子，測定樣品發(fā)射的非線性光束的一種或多種物理性質(zhì)。測定的所述一種或多種物理性質(zhì)的數(shù)值相對于沒有所述一種或多種候選結(jié)合配偶體時測定的所述一種或多種物理性質(zhì)的數(shù)值的變化，預(yù)示至少一種所述一種或多種候選結(jié)合配偶體與所述測試分子結(jié)合，預(yù)示所述結(jié)合誘導(dǎo)構(gòu)象變化的程度或范圍。
在一個具體實施方案中，本發(fā)明涉及一種以表面選擇性非線性光學(xué)技術(shù)檢測生物成分之間相互作用的方法。本發(fā)明的一個方面涉及檢測導(dǎo)致構(gòu)象變化的探針和靶之間結(jié)合的方法。本發(fā)明公開了一種通過其誘導(dǎo)的結(jié)合靶的構(gòu)象變化篩選一種或多種探針的方法。本發(fā)明還公開了一種篩選探針-靶結(jié)合相互作用調(diào)節(jié)劑的方法，以及通過結(jié)合誘導(dǎo)的構(gòu)象變化確定結(jié)合程度或范圍的方法。
4.附圖簡述

圖1是一個裝置的實施方案，在該裝置中產(chǎn)生和收集第二諧波光的模式是通過從帶有表面附著探針的基材進行反射。
圖2是一個裝置的實施方案，在該裝置中產(chǎn)生和收集第二諧波光的模式是以棱鏡進行全內(nèi)反射。棱鏡通過一個指標(biāo)匹配材料與帶有表面附著探針的基材偶聯(lián)。
圖3是一個裝置的實施方案，在該裝置中產(chǎn)生和收集第二諧波光的模式是以波導(dǎo)管通過波導(dǎo)管內(nèi)虛線所示的多次反射進行全內(nèi)反射。
圖4A-D是一個流動池的實施方案，該流動池用于將生物成分和其它流體送遞和移動到包含附著探針的基材。
圖5A-C是三個裝置的實施方案，在這些裝置中產(chǎn)生和收集第二諧波光的模式是通過樣品透射。在圖5A中，第二諧波光束與基諧波在一條直線上。在圖5B中，第二諧波是從與基諧波成直角的方向收集的(“直角收集”)。在圖5C中，第二諧波光是通過累計球和光纖收集的。
圖6是一個轉(zhuǎn)換的實施方案，使用一系列光學(xué)組件，將基諧波光的平行光束轉(zhuǎn)換成適于掃描基材的線形。
圖7A-B是一個陣列模式的實施方案，圖7A顯示的是構(gòu)成陣列模式的基材表面(包含附著探針)實施方案(成分1-35)。圖7B顯示的是基材陣列的一個成分，其中每一個成分是一個有壁的孔，此孔帶有表面附著探針，能容納一些流體，并能將孔中內(nèi)含物與臨近孔或基材的其它部分物理分離。
圖8是用于將寡核苷酸或多聚核苷酸樣品連接到基質(zhì)表面的表面化學(xué)的實施方案。
圖9A-B是含有多個孔的基質(zhì)的實施方案。圖9A顯示的是包含多個孔(1-16)的基質(zhì)，每個孔都含有如圖9B所示的表面附著探針。
圖10是一個在反射涂層上面使用氨基硅烷表面附著層的裝置基質(zhì)的實施方案。氨基硅烷層下面的反射涂層能改善對非線性光的收集。氨基硅烷層適用于將生物分子或其它探針與基質(zhì)偶聯(lián)。
圖11A-B是一個裝置的實施方案，在該裝置中產(chǎn)生和收集第二諧波光的模式是通過光纖。圖11A顯示的是使用一束光纖，圖11B顯示的是將小珠偶聯(lián)到纖維末端以便附著探針。
圖12A-C是三個裝置的實施方案，在這些裝置中產(chǎn)生和收集第二諧波光的模式是通過樣品透射。圖12A顯示的是基諧波和第二諧波光束以同一條直線透過樣品。圖12B顯示的是基諧波和第二諧波光束在基質(zhì)上表面(含有附著探針的上表面)發(fā)生折射，在這個表面產(chǎn)生第二諧波光。圖12C與圖12B的裝置類似，只是下表面(含有附著探針的下表面)產(chǎn)生第二諧波光。
圖13A-B是兩個裝置的實施方案，在這些裝置中通過在界面上的全內(nèi)反射產(chǎn)生第二諧波光。產(chǎn)生第二諧波光的位置點用圓圈示出。在圖13A中，使用Dove棱鏡將光導(dǎo)向能產(chǎn)生第二諧波光的表面(棱鏡的下表面，也可以是通過指標(biāo)匹配材料與棱鏡偶聯(lián)的另一表面)。在圖13B中，使用波導(dǎo)管結(jié)構(gòu)產(chǎn)生多個第二諧波光產(chǎn)生位點。
圖14A-C是三個裝置的實施方案，其中使用光纖產(chǎn)生第二諧波光(纖維末端有附著探針)。圖14A的裝置中，在同一條纖維中產(chǎn)生和收集第二諧波光。圖14B顯示的是在纖維末端使用含有表面附著探針的小珠。圖14C的裝置中，在光纖的末端(含有附著探針)產(chǎn)生第二諧波光，用光纖外部的鏡子或透鏡收集第二諧波光。
圖15A-B是兩個裝置的實施方案，該裝置中使用光學(xué)共振器以積累基諧波的能量。
圖16A-C是三個裝置的實施方案，在這些裝置中產(chǎn)生和收集第二諧波光的模式是通過界面上的光反射。
圖17是施加了電場的樣品室實施方案，樣品室(5)是敞口的，從側(cè)面圖示且充滿含有探針和靶的溶液(10)?；C波光束從右邊(15)進入樣品室，穿過1-3mm間隔區(qū)(25)隔離的透明電極(20)。電極與電源(30)相連。當(dāng)施加電壓時，靶和探針部分定向，由此產(chǎn)生非線性光(例如，第二諧波光)。
圖18是檢測懸浮細胞中探針-靶相互作用的裝置。使來源于在800nm運行的TiSapphire femtosecond laser(1000)的基諧波光源穿過濾光器(RG-645，CVI Laser)，該濾光器阻斷400nm光(第二諧波)。然后用平凸透鏡1200(焦距100mm，Melles Griot)將基諧波聚焦于含有生物細胞懸液的樣品固定器1300。在與基諧波平行的方向上，用80mm直徑的平凸準(zhǔn)直透鏡(1400)(焦距120mm，Melles Griot)收集第二諧波光，透鏡1400放置的位置是使其焦點與透鏡1200的焦點重合。讓光通過濾色器(BG-39，CVI Laser)以阻斷基諧波光，并將第二諧波光傳送到第二個平凸透鏡1600(焦距120mm，MellesGriot)，該透鏡使光聚焦通過其單色器的狹縫并聚焦到其光柵(1700)上。光電倍增管附著在單色器上并檢測第二諧波光。光電倍增管發(fā)出的信號傳遞到光子計數(shù)電子儀器(SR400，Stanford ResearchSystems)，接著傳送到計算機1900儲存和分析數(shù)據(jù)。
圖19A-C是本發(fā)明的各種實施方案。圖19A中，嵌入膜表面的受體暴露于與其有親和性的配體或粒子。結(jié)合相互作用發(fā)生后，配體或粒子就結(jié)合到膜受體上。圖19B中，細胞附著(或“鋪”)在表面或基質(zhì)上形成大致的單層細胞層(例如，約100％匯合細胞)；細胞也可以堆疊在基質(zhì)或表面形成多層細胞層。在19B的兩種情況中，入射的基諧波光可以透射穿過基質(zhì)或表面，可以沿與表面平行的方向穿過多層或單層細胞層，可以與細胞層短暫偶聯(lián)，或上述情形的一些組合。圖19C顯示的是構(gòu)象變化過程。膜表面(例如宿主細胞)受體用非線性活性標(biāo)簽標(biāo)記，該受體平均起來相對于表平面有一個方向，具體的說，該受體與表平面有θ角的超極化率(hyperpolarizability)；配體對受體結(jié)合及隨后的活化使標(biāo)簽的方向轉(zhuǎn)為β角。角度的微小變化能夠引起被檢測的非線性光的物理性質(zhì)的相當(dāng)大改變(例如，光強度)。
圖20A-B是經(jīng)修飾形成非線性活性類似物的分子標(biāo)志。圖20A中，單鏈核苷酸與非線性活性染料(灰陰影線)和增強劑(空心圓)偶聯(lián)。當(dāng)分子標(biāo)志類似物與互補靶雜交時，染料和增強劑由于構(gòu)象變化而分離，產(chǎn)生可測量的染料的非線性反應(yīng)的變化。變化量可以通過探針-靶的雜交數(shù)量來定量。圖20B顯示的是一個帶有附著染料和增強劑(Au粒子)的具體的寡核苷酸序列的例子(SEQ ID NO5)。也顯示了用于測試與該探針雜交程度的各種靶序列(分別是SEQ ID NO1-4)。
5.發(fā)明詳述本發(fā)明使用非線性光學(xué)技術(shù)檢測涉及構(gòu)象變化的探針-靶相互作用。非線性光學(xué)技術(shù)的例子包括但不限于第二諧波產(chǎn)生，和頻產(chǎn)生，差頻產(chǎn)生，第三諧波產(chǎn)生和超雷利散射(HRS)。本發(fā)明可以以任何非線性光學(xué)技術(shù)來應(yīng)用，但是很多實施方案描述了使用二級技術(shù)(例如第二諧波產(chǎn)生和超雷利散射)。下列文獻(及其中的參考文獻)描述了非線性光學(xué)領(lǐng)域Nonlinear Optics，R.W.Boyd，1991，Academic Press.
The Elements of Nonlinear Optics，P.N.Butcher and D.Cotter，Cambridge University Press，1991.
非線性光學(xué)技術(shù)非線性光是在一種或多種基頻將光束非線性轉(zhuǎn)換得到的任意光(本文也稱為基諧波光束)。非線性光學(xué)技術(shù)能夠轉(zhuǎn)換一種或多種入射光束(稱為基諧波光束)的物理性質(zhì)，例如頻率，強度等。樣品發(fā)出的非線性光束是較高次頻光束，例如第二或第三諧波等，或是以和頻或差頻發(fā)出的光束。例如，在第二諧波產(chǎn)生(SHG)時，基諧波光束的兩個光子實際上被樣品散射，從而產(chǎn)生第二諧波的一個光子。在本文中非線性光學(xué)技術(shù)也稱為表面選擇性非線性光學(xué)技術(shù)。
第二諧波產(chǎn)生(SHG)和其它表面選擇性非線性光學(xué)技術(shù)與樣品中非線性活性物質(zhì)的方向直接相關(guān)，因為基諧波和非線性光束之間有確定的相位關(guān)系，宏觀的樣品中非線性光束的波陣面(在相干長度范圍之內(nèi))是同相的。非線性活性物質(zhì)的方向上的任何變化能通過測定樣品發(fā)出的非線性光束的一種或多種物理性質(zhì)而檢測。非線性光學(xué)技術(shù)的相干性產(chǎn)生了許多優(yōu)點，有利于表面或高通量研究，在這些研究中，檢測例如單個表面或微陣列表面。樣品發(fā)出的非線性光束的相干性也使得可以區(qū)別樣品發(fā)出的多條非線性光束。本發(fā)明的可替代實施方案中，實驗如下進行，使用一種或多種頻率的多個基諧波光束，與樣品成一種或多種偏振方向入射，導(dǎo)致發(fā)出至少兩種非線性光。使用非線性光基于表面選擇性進行檢測的裝置，例如帶有第二諧波產(chǎn)生的裝置，只需最小限度的收集光(collectionoptic)，因為非線性光的產(chǎn)生只發(fā)生在界面上(不施加電場)，所以理論上，允許高精度的區(qū)分和快速掃描。
用于模擬依賴于界面非線性活性物質(zhì)的方向的一般方程式是χ(2)＝Ns<α(2)>
其中χ(2)是非線性敏感度，Ns是界面上單位面積的分子總數(shù)，<α(2)>是這些分子非線性超極化率α(2)的方向分布的均值。描述產(chǎn)生第二諧波的非線性相互作用的一般公式是α(2)(2～)＝βE(ω)E(ω)或P(2)(2ω)＝χ(2)E(ω)E(ω)，其中α和P分別是以2ω頻率振蕩的誘導(dǎo)分子和宏觀偶極子，β和χ(2)分別是超極化率和第二諧波(非線性)敏感度張量，E(ω)是以ω頻率振蕩的入射輻射的電場成分。宏觀非線性敏感度χ(2)與微觀β超極化率的方向均值相關(guān)。下一級關(guān)于誘導(dǎo)宏觀偶極子膨脹的術(shù)語描述了其它非線性現(xiàn)象，例如第三諧波產(chǎn)生。第三級術(shù)語對應(yīng)于雙光子熒光這樣的非線性現(xiàn)象。為了產(chǎn)生和頻或差頻，驅(qū)動電場(基諧波)在不同頻率(即ω1和ω2)振蕩，非線性輻射在和頻或差頻(ω1±ω2)振蕩。
SHG的強度與非線性敏感度的平方成比例，并取決于樣品中定向的非線性活性物質(zhì)的量，因此SHG的強度與這種方向的變化成比例，這種變化不僅在界面，也在大量排列的物質(zhì)(后者例如通過電場-極機制)。可以利用這種特性檢測構(gòu)象變化。例如使用非線性活性標(biāo)簽或部分檢測受體的構(gòu)象變化，該標(biāo)簽附著于或結(jié)合于受體；構(gòu)象變化引起標(biāo)簽關(guān)于表平面(或施加電場的方向)的方向的變化并導(dǎo)致非線性光學(xué)信號的物理性質(zhì)的變化。這種技術(shù)本身就對界面上的這些變化十分靈敏，也可以使它對大多數(shù)變化敏感，這是通過對極分子施加電場或簡單地通過檢測系統(tǒng)中由于其數(shù)量密度或方向的波動變化而能產(chǎn)生超雷利散射(HRS)的部分而實現(xiàn)的，如本領(lǐng)域人員知道的。
在超雷利散射(HRS)中，非線性活性分子的波動引起瞬時從中心對稱的偏離，從而發(fā)生少量的第二諧波發(fā)射，雖然這種發(fā)射是不相干的。因為除了其它性質(zhì)，波動依賴于分子大小，所以HRS可用于將溶液中的未結(jié)合分子與結(jié)合了一種或多種結(jié)合配偶體(本文中也稱為探針)的同樣的分子區(qū)別開。熱能驅(qū)動HRS所需的波動，但也可施加外力誘導(dǎo)或放大波動，因而增強HRS信號。例如，通過向溶液中注射一陣或一股流體可以將流場用于暫時定向溶液中的分子。對樣品施加脈沖和交流電場也能增強HRS信號。
文獻中有很多使用HRS檢測非線性光學(xué)分子的β(超極化率)的實例。本發(fā)明將HRS的用途擴展到檢測結(jié)合相互作用和篩選能夠結(jié)合或調(diào)節(jié)探針-靶相互作用的測試分子(本文中也稱為靶)或調(diào)節(jié)劑(下文說明)。
下列文獻(及其中的參考文獻)描述了HRS技術(shù)Clays，K.et al.，″Nonlinear Optical Properties ofProteins Measured by Hyper-Rayleigh Scattering in Solution″，Science，v.262(5138)，1419-22Vance，F(xiàn)W，Lemon B.I.，Hupp，J.T.Enormous Hyper-RayleighScattering from Nanocrystalline Gold Particle Suspensions″，J.Phys.Chem.B 10210091-93(1999).
電場誘導(dǎo)第二諧波(EFISH)是非線性光學(xué)領(lǐng)域已知的技術(shù)，可以如本發(fā)明所述，使用該技術(shù)使正常情況下不是非線性活性的系統(tǒng)(例如體相)產(chǎn)生非線性活性，這是通過施加破壞體相的對稱的電場而實現(xiàn)的。在一個具體實施方案中，用EFISH技術(shù)，通過施加dc電場誘導(dǎo)介質(zhì)中的排列，并使得能夠觀察非線性活性(例如SHG)，從而測量溶液中分子的超極化率。這有時也稱作再定向機制。
EFISH是第三級非線性光學(xué)效應(yīng)，其偏振源寫做P(2)(ω3)＝χ(2)(-ω3；ω1，ω2)Eω1Eω2偏振是施加兩個光學(xué)場(opticalfield)和一個靜電(dc)場的結(jié)果。下列文獻描述了將EFISH技術(shù)應(yīng)用到，例如液相和凝聚相樣品
R.Dworczak and D.Kieslinger，Phys.Chem.Chem.Phys.，2000，2，5057-5064.
J.L.Oudar，J.Chem.Phys.，1977，67，446.
B.F.Levine and C.G.Bethea，J.Chem.Phys.，1974，60，3856.
B.F.Levine and C.G.Bethea，J.Chem.Phys.，1975，63，2666.
K.D.Singer and A.F.Garito，J.Chem.Phys.，1981，75，3572.
C.G.Bethea，Applied Optics，1975，14，1447.
B.F.Levine and C.G.Bethea，J.Chem.Phys.，1976，65，1989.
B.F.Levine and C.G.Bethea，J.Chem.Phys.，1974，60，3856.
B.F.Levine，J.Chem.Phys.，1975，63，115.
B.F.Levine and C.G.Bethea，J.Chem.Phys.1977，66，1070.
J.L.Oudar and D.S.Chemla，J.Chem.Phys.，1977，66，2664.
R.S.Finn and J.F.Ward，J.Chem.Phys.，1974，60，454.
B.F.Levine and C.G.Bethea，Appl.Phys.Lett.，1974，24，445.
另外，用來施加電場的電極可以在空間上排列(周期性排列)以實現(xiàn)半相匹配(quasi-phase matching)。半相匹配是已知技術(shù)，用于通過改變具有相干長度周期的材料的非線性敏感度，增加非線性活性材料的有效非線性路徑長度。下列文獻(及其中的參考文獻)描述了這種技術(shù)M.Jger et al.，Appl.Phys.Lett.68，1996，1183.
M.M.Fejer et al.，IEEE Journal of Quantum Electronics，v.28，1992，2631.
G.D.Landry et T.A.Maldonado，Optics Express，v.5，1999，176.
在EFISH技術(shù)中，用來施加電場的電極可以采取例如現(xiàn)有技術(shù)中發(fā)現(xiàn)的多種形狀，形式和組成。例如，電極可以是角狀或點狀的以增加這些情形中產(chǎn)生的電場強度。電極可以各種方式定位于樣品中；例如，電極放置在基質(zhì)上(如石印，印刷，蝕刻等)，該基材本身與含有靶和探針的液體樣品接觸；或者電極放置在其中流動或容納含有靶和探針的樣品的薄腔的底部或頂部。
非隨機定向和非線性活性非隨機定向是產(chǎn)生表面選擇性非線性光學(xué)信號所必需的。只有系統(tǒng)的非中心對稱區(qū)才能產(chǎn)生非線性光。如果空間存在一點，叫做“中心”或“倒置中心”，以這個點將所有原子倒置(x，y，z)→(-x，-y，-z)，而分子或材料不發(fā)生變化，那么這個分子或材料就是中心對稱的。例如，如果一個分子是組成均一的且是球形的，它就是中心對稱的。中心對稱分子或材料沒有非線性敏感度或超極化率，而這些是第二諧波或更高諧波，和頻或差頻產(chǎn)生所必需的。非中心對稱分子或材料沒有這個倒置中心，因此是非線性活性的。非中心對稱區(qū)域可以在表面，例如陣列，基質(zhì)等，或者在體相中，例如溶液，但是，體相需要施加電場破壞區(qū)域的對稱以產(chǎn)生體相的非線性活性(同EFISH技術(shù))。
本發(fā)明利用了下述性質(zhì)，即當(dāng)探針與靶結(jié)合后，探針相對于它要附著或定位的表面的任何非隨機定向?qū)е掳械姆请S機定向。系統(tǒng)的非隨機定向使得可以利用非線性光學(xué)技術(shù)監(jiān)測，例如表面的結(jié)合活性。系統(tǒng)非隨機定向的任何變化，例如由于發(fā)生結(jié)合時的構(gòu)象變化而產(chǎn)生的非隨機定向的變化，可以修飾非線性光學(xué)信號。要確定檢測到的非線性信號的變化是由構(gòu)象變化引起的，可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的對照來實現(xiàn)，該對照包括例如測定阻斷化合物與受體的結(jié)合，已知該阻斷化合物不產(chǎn)生受體的構(gòu)象變化。
在一個實施方案中，探針或靶，或者兩者都不是天然線性活性的，隨后，在系統(tǒng)中引入不同種類的非線性活性物質(zhì)以產(chǎn)生系統(tǒng)非線性活性。這些物質(zhì)影響包含探針和靶的樣品發(fā)射出的一種或多種非線性活性光束，這些物質(zhì)包括如下所述的標(biāo)簽，修飾劑，指示劑，調(diào)節(jié)劑，抑制劑和增強劑。當(dāng)本發(fā)明以標(biāo)簽或修飾劑應(yīng)用時，靶的非隨機定向產(chǎn)生標(biāo)簽或修飾劑的非隨機定向，并直接導(dǎo)致表面選擇性非線性光學(xué)信號(例如，強度)的增加。靶與附著或定位了探針的非特異性相互作用(例如與探針的非特異性結(jié)合)，或者靶與不存在探針的表面區(qū)域的非特異性相互作用(例如與基質(zhì)或固體支持物的非特異性結(jié)合)會產(chǎn)生0值或低的多的表面選擇性非線性光學(xué)信號，這是因為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的相消性干擾。當(dāng)本發(fā)明以指示劑應(yīng)用時，探針的非隨機定向也引起表面選擇性非線性光學(xué)信號增加，因為表平面附近的表面電荷密度大于探針隨機定向時的電荷密度，而探針隨機定向?qū)е螺^低的表面電荷密度。
非線性活性標(biāo)簽本發(fā)明所使用的標(biāo)簽是非線性活性部分，粒子或分子，它們能夠共價或非共價的與分子，粒子或相(例如，脂雙層)結(jié)合，以使獲得的系統(tǒng)更具非線性光學(xué)活性。標(biāo)簽在下述情況中使用當(dāng)分子，粒子或相(例如，脂雙層)不是非線性活性的，而要使系統(tǒng)是非線性活性的；或者系統(tǒng)已經(jīng)是非線性活性的，要在系統(tǒng)中加入額外的操作參數(shù)。外源標(biāo)簽預(yù)先附著在分子或粒子上，測定前將任何未結(jié)合或未反應(yīng)的標(biāo)簽從標(biāo)記實體中分離。在一個具體實施方案中，非線性活性部分在體外附著到靶或探針分子上?；蛘撸瑯?biāo)簽留在含有探針和靶的溶液中，并吸附到一些粒子(例如增強劑)或表面，以產(chǎn)生與結(jié)合的標(biāo)簽不同的非線性活性反應(yīng)(即超極化率或二級敏感度)。作為示例，根據(jù)本領(lǐng)域公知技術(shù)，用EFISH或超雷利散射確定候選分子或粒子是否為非線性活性的，其中適宜的對照和背景測定是在沒有應(yīng)用候選非線性活性物質(zhì)存在的情況下進行的。用非線性活性標(biāo)簽和/或標(biāo)簽調(diào)節(jié)劑標(biāo)記探針，就可以用表面選擇性非線性光學(xué)技術(shù)以一種直接的光學(xué)手段檢測探針-靶的結(jié)合反應(yīng)，此時這種結(jié)合反應(yīng)導(dǎo)致探針的方向或構(gòu)象的變化。
本發(fā)明的另一個實施方案中，使用了至少兩個不同的非線性活性標(biāo)簽。附著的兩個或多個不同標(biāo)簽的方向選擇為使發(fā)射的相干非線性光束的方向容易確定。兩個或多個不同的標(biāo)簽可在下述試驗中使用應(yīng)用一種或幾種頻率的多條基諧波光束，該光束與樣品成一種或幾種偏振方向入射，導(dǎo)致發(fā)射出至少兩條非線性光束。
確定一個具體分子或粒子能否作為非線性活性標(biāo)簽使用，一種方法是利用在空氣-水界面發(fā)生的第二諧波產(chǎn)生來研究所述分子或粒子。例如，對于粒子，如果粒子在空氣-水界面聚集，該聚集方式賦予粒子凈余方向(netorientation)(在相干長度的長度等級上)，那么粒子層會產(chǎn)生第二諧波光。另一種方法是測量懸浮粒子樣品，檢測超雷利散射。還有另一種方法，包括使用EFISH確定候選分子或粒子是否是非線性活性的。通過以dc電場誘導(dǎo)介質(zhì)中的排列并觀察SHG，該作用以用于測定溶液分子的超極化率。這種類型的測量不需要粒子本身在界面上排序，但要求粒子是非線性活性的，并因此是非中心對稱的。
在一個具體實施方案中，如上文所述，修飾金屬毫微粒子及其聚集體以產(chǎn)生生物學(xué)非線性活性標(biāo)簽。下列文獻描述了對金屬毫微粒子及其聚集體的修飾J.P.Novak and D.L.Feldheim，“Assembly of Phenylacetylene-Bridged Silver and GoldNanoparticle Arrays”，J.Am.Chem.Soc.，2000，122，3979-3980.
J.P.Novak et al.，“Nonlinear Optical Properties of Molecularly Bridged Gold NanoparticleArrays”，J.Am.Chem.Soc.2000，122，12029-12030.
Vance，F(xiàn)W，Lemon B.I.，Hupp，J.T.Enormous Hyper-Rayleigh Scattering fromNanoerystalline Gold Particle Suspensions″，J.Phys.Chem.B 10210091-93(1999).
下列文獻(及其中的參考文獻)描述了由合成染料和許多其它分子生產(chǎn)生物標(biāo)簽的已有技術(shù)Greg T.Hermanson，Bioconjugate Techniques，AcademicPress，1996.
在一個具體實施方案中，采用已知程序步驟將非線性活性標(biāo)簽構(gòu)建為對光束是光敏性或光調(diào)節(jié)性的，因此用選定的光束照射樣品，標(biāo)簽就成為非線性光學(xué)活性的(或者是更多或更少的非線性光學(xué)活性)。所述光束能夠例如斷裂化學(xué)鍵(例如，應(yīng)用紫外線)，現(xiàn)有技術(shù)中稱為‘籠狀(caged)’化合物。
調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)劑包括當(dāng)調(diào)節(jié)劑接近非線性活性物質(zhì)時改變非線性活性物質(zhì)的非線性反應(yīng)的或包括改變探針-靶相互作用(例如結(jié)合反應(yīng))動力學(xué)或平衡特性的任何物質(zhì)(例如，部分，分子，生物成分或化合物)。調(diào)節(jié)劑能夠改變探針-靶結(jié)合的速率以及平衡常數(shù)，或者通常，促進或降低探針-靶相互作用。調(diào)節(jié)劑的例子如下抑制劑，藥物，小分子，激動劑和拮抗劑以及Au粒子。在例如篩選過程中可檢測候選調(diào)節(jié)劑作為調(diào)節(jié)劑的能力。
一個具體實施方案中，在存在一些相互作用調(diào)節(jié)劑的情況下檢測探針-靶相互作用，調(diào)節(jié)劑例如小分子，藥物，其它部分，分子或粒子，它們能夠以某種方式改變探針-靶的相互作用(例如，與探針有一定親和性且阻斷或抑制靶結(jié)合)。調(diào)節(jié)劑在靶-探針相互作用發(fā)生之前，之中或之后加入。
抑制劑抑制劑降低或阻止探針-靶相互作用。抑制劑可以是任意物質(zhì)，例如部分，分子，化合物或粒子。優(yōu)選的抑制劑與靶-探針之間已知的結(jié)合相互作用競爭。抑制劑也是一種調(diào)節(jié)劑。本文中，抑制劑也稱為阻斷試劑或阻斷劑。
一個具體實施方案中，通過檢測當(dāng)選抑制劑與受體和激動劑一同存在(激動劑可以是天然分子，合成分子等)時激動劑誘導(dǎo)的構(gòu)象變化的消除，從而篩選可能是受體激動劑的抑制劑的化合物。
修飾劑修飾劑指能與靶，探針或靶-探針復(fù)合物結(jié)合并能從中被檢測和區(qū)別的非線性活性物質(zhì)(例如分子或粒子)。理想情況是，修飾劑本身不顯著改變和參與靶-探針反應(yīng)。修飾劑與非線性活性標(biāo)簽，例如SHG-活性標(biāo)簽的區(qū)別在于修飾劑具有對靶，探針或靶-探針復(fù)合物的特異性結(jié)合親和性，而SHG-標(biāo)簽只是通過特定化學(xué)鍵或非特異性方式(例如靜電)附著到，例如生物成分上。修飾劑可根據(jù)其對靶，探針或靶-探針復(fù)合物的特異性結(jié)合親和性(也稱為‘分子識別’)用于檢測探針-靶復(fù)合物，并用于在表面選擇性非線性光學(xué)技術(shù)中區(qū)別靶，探針或靶-探針復(fù)合物。例如，對雙鏈DNA比對單鏈DNA親和力強(較大的結(jié)合常數(shù))的修飾劑，可用于檢測與表面附著探針的雜交，因為在單鏈靶和探針的雜交過程中，定向修飾劑的量增加。一個具體實施方案中，修飾劑由非線性活性物質(zhì)和另一物質(zhì)構(gòu)成，其中另一物質(zhì)是生物成分(蛋白，抗體等)，構(gòu)建體對探針，靶或探針-靶復(fù)合物有不同的結(jié)合親和性，以使得能夠使用表面選擇性非線性光學(xué)技術(shù)對其進行區(qū)分。修飾劑也可以是具有非線性活性的非天然分子(例如，合成的化學(xué)分子，藥物等)，它能與靶，探針或靶-探針復(fù)合物特異性結(jié)合(識別)，并且對上述三種物質(zhì)有不同的結(jié)和親和性，使得可以應(yīng)用表面選擇性非線性光學(xué)技術(shù)區(qū)分它們。一個具體實施方案中，修飾劑溶解于或懸浮于含有靶成分的溶液或水相中。
修飾劑分子或粒子的例子包括，但不限于，生物成分，核酸，蛋白，小分子，生物細胞，病毒，脂質(zhì)體，受體，激動劑，拮抗劑，抑制劑，激素，抗體，抗原，肽，受體，藥物，酶，配體，核苷，多聚核苷，碳水化合物，cDNA，激素，過敏原，cDNA，半抗原，寡核苷酸，生物素，鏈霉抗生物素，多核苷酸，寡糖，肽核酸(PNA)或核酸類似物。另外一些非限制性實施方案中，修飾劑包含下述家族的部分補骨脂素，溴化乙錠，磷酸甲酯，氨基磷酸酯，碘化丙錠，吖啶，9-氨基吖啶，吖啶橙，氯喹，pyrine，棘霉素，4′，6-二脒-2-苯基吲哚，二氫氯化物(DAPI)，琥珀酰氨吖啶-9-羧酸酯，氯喹，pyrine，棘霉素，4′，6-二脒-2-苯基吲哚，二氫氯化物(DAPI)，單鏈結(jié)合蛋白(SSB)，三吡咯肽，flavopiridol或焦寧Y。
指示劑以下部分詳細描述指示劑。指示劑包括非線性活性分子或粒子，其在表面或界面附近的非線性光學(xué)性質(zhì)和方向隨著表面的電荷極化，電荷密度或電勢的調(diào)節(jié)而調(diào)節(jié)。本發(fā)明的一個方面，固定在表面的靶與探針的結(jié)合調(diào)節(jié)表面的電荷或電勢。另一方面，細胞表面電勢由于離子通道性質(zhì)的改變而變化，所述離子通道性質(zhì)的改變例如開啟，關(guān)閉，對應(yīng)于靶(配體)結(jié)合的離子滲透性的增加或減少。本發(fā)明的另一個方面，指示劑作為標(biāo)記用于成像，例如，細胞或組織成像。優(yōu)選指示劑本身不相當(dāng)大程度地改變或參與靶-探針反應(yīng)。指示劑溶解于或懸浮在含靶成分的液體，介質(zhì)，溶液或水相中。指示劑優(yōu)選不移位到泡或細胞的脂雙層中。指示劑優(yōu)選對應(yīng)于表面電荷密度或電勢的變化而自由移動。
在水或溶劑中存在溶解的或懸浮的指示劑的情況下，測定玻璃-溶劑或玻璃-水界面的非線性光學(xué)反應(yīng)，是分析候選分子是否能作為指示劑的方法之一。由于玻璃帶有凈余負電荷，如果候選分子存在時，在界面產(chǎn)生的非線性光學(xué)輻射強度大于候選分子不存在時的背景信號，那么該候選分子可以作為指示劑。另一種分析候選分子的指示劑能力的方法是，檢測在半導(dǎo)體-液體界面產(chǎn)生的非線性光學(xué)輻射強度，它是在半導(dǎo)體和大量液體之間所施加電壓(也因此是表面電荷密度)的函數(shù)。還有一種方法是檢測候選指示劑溶液或懸液的超雷利散射(HRS)，因為如果HRS產(chǎn)生，并且候選分子本身是帶電荷的或偶極性的，那么該分子就能作為指示劑。
唑類染料4-[5-甲氧苯基-2-唑基]吡啶甲磺酸鹽(也稱為4PyMPO-MeMs)是一個可用的指示劑，它在中性pH時具有很強的第二諧波活性和化學(xué)穩(wěn)定性(Salafsky和Eisenthal，Chemical PhysicsLetters 2000，319，435-439)。另外，由于雙光子吸收導(dǎo)致的熒光斯托克司頻移很大，因此第二諧波光束容易與熒光分離。這個家族的其它染料具有相似性質(zhì)(J.H.Hall等人，″Syntheses andPhotophysical Properties of Some 5(2)-Ary1-2(5)-(4-pyridyl)oxazoles and Related Oxadiazoles and Furans″，J.HeterocyclicChem.29，1245(1992))。這些和其他分子或分子聚集體可用作本發(fā)明的指示劑。這些分子包括，但不限于5-(4-甲氧苯基)-2-(4-甲氧苯基)-2-(4-吡啶基)唑2-(4-甲氧苯基)-5-(4-吡啶基)唑2-(4-甲氧苯基)-5-(4-吡啶基)二唑2-(4-甲氧苯基)-5-(4-吡啶基)呋喃2-(4-吡啶基)-4，5-二氫萘酚[1，2-d]-1，3-唑5-芳基-2-(4-吡啶基)-4-R-唑，其中R是氫原子，甲基，乙基或其它烷基2-(4-吡啶基)環(huán)烷并[d]唑2-(4-吡啶基)菲并[9，10-d]-1，3-唑6-甲氧基-4，4-二甲基-2-(4-吡啶基)茚并[2，1-d]唑4，5-二氫-7-甲氧基-2-(4-吡啶基)萘酚[1，2-d]-1，3-唑用作指示劑的其它分子或下述家族的分子包括，但不限于部花青茋吲哚二羰菁半花青Stilbazims偶氮染料菁族Stryryl-based染料亞甲基藍二氨基苯化合物多烯偶氮茋三氰基乙烯基苯胺三氰基乙烯基偶氮三聚氰胺吩噻嗪-stilbazole聚酰亞胺磺酰取代的偶氮苯2，3-二氫-1-茚二酮-1，3-吡啶甜菜堿熒光素苯并唑苝聚甲基丙烯酸酯氧雜菁衍生的粒子指示劑毫微米到微米大小的固體微粒子或毫微粒子包括，但不限于，球狀(乳膠，聚苯乙烯，硅石，等)或條狀，它提供了一個能通過化學(xué)或靜電方式用非線性活性部分衍生的表面區(qū)域，致使整個物質(zhì)比用其它方式獲得的具有高得多的超極化率。例如，非線性活性染料通過靜電相互作用在硅石珠表面排列(染料是正電荷性，硅石表面是負電荷性)，且如果用靶反應(yīng)性接頭衍生，整個珠子就可以作為指示劑。如果非線性活性部分能夠在固體表面排列，從而部分之間的相干擾很小，總體超極化率與其數(shù)量成非線性比例(例如，二次方程的)。固體粒子的形狀可以變化，大小從毫微米到微米。可應(yīng)用的粒子包括的實例，但不限于，聚苯乙烯珠和硅石珠，它們都已經(jīng)是商品化的。
a.共價附著可用作指示劑的固體粒子，其表面能用現(xiàn)有技術(shù)已知的各種化合物衍生。非線性活性部分能共價偶聯(lián)于固體粒子或其衍生層。
例如，聚苯乙烯珠能以葡聚糖，乳糖或胺衍生(后一種情況，是通過氯甲基基團與乙二胺聯(lián)接)。硅石能以有機功能性硅烷衍生，例如使用三氯硅烷或其它功能性硅烷(例如甲氧基，胺，或其它功能性基團)，以產(chǎn)生各種化學(xué)功能性表面。衍生的珠表面隨后與非線性活性部分進行適宜的化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生指示劑。
b.靜電附著非線性活性部分能夠靜電結(jié)合于微米或毫微米大小的粒子表面，產(chǎn)生具有大的超極化率的指示劑。帶電荷的非線性活性部分，例如有機染料，可在帶相反電荷的微粒子表面定向，因此當(dāng)物體是合適的幾何形狀時，產(chǎn)生凈余的超極化率。合適的幾何形狀例如球形微粒子，其直徑約等于基諧波光的波長，即從幾十毫微米到微米，以使球體相對面的非線性活性部分之間的相消性相干擾最小化。當(dāng)越過約為光波長大小的球體的全部表面進行積分時，球體表面每個染料的超極化率是大的并且是正的。作為實例，但不限于所述實例，可使用下述程序步驟。硅石珠(約200nm，大致的球形)與低濃度的3-氨丙基三甲氧基硅烷或3-氨辛基三甲氧基硅烷反應(yīng)，因此只有約5-10％的表面硅烷醇與硅烷試劑共價偶聯(lián)。隨后，這些胺基基團與胺基反應(yīng)性同雙功能交聯(lián)劑二琥珀酰亞氨戊二酸(DSG，Pierce Chemical)反應(yīng)，在約5-10％的珠表面產(chǎn)生胺基反應(yīng)性接頭。接著，珠與4-[5-甲氧苯基-2-唑基]吡啶甲磺酸鹽(也稱為4PyMPO-MeMs)一起溫育，即通過靜電結(jié)合于表面上帶電荷的硅烷醇，并有一些程度的定向的帶正電荷的染料。離心除去珠的剩余染料。在某些情況中，靜電吸附強的足以固定帶電荷的染料，即使不存在體相濃度。
現(xiàn)有技術(shù)中已知的和可使用的一些非線性活性物質(zhì)包括，但不限于，下述物質(zhì)及其衍生物唑或二唑分子5-芳基-2-(4-吡啶基)唑2-芳基-5-(4-吡啶基)唑2-(4-吡啶基)環(huán)烷并[d]唑部花青茋吲哚二羰菁半花青Stilbazims偶氮染料菁族
Stryryl-based染料亞甲藍二氨基苯化合物多烯偶氮茋三氰基乙烯苯胺三氰基乙烯偶氮三聚氰胺吩噻嗪-stilbazole聚酰亞胺磺酰取代的偶氮苯2，3-二氫-1，3-茚二酮-1，3-甜菜堿吡啶熒光素苯并唑苝聚甲基丙烯酸酯氧青菁噻吩并噻吩為評估某物質(zhì)是否有非線性活性，下述性質(zhì)預(yù)示著潛在的非線性活性大的偶極矩差異(分子基態(tài)和激發(fā)態(tài)的偶極矩的差異)，大的熒光斯托克司頻移，芳香性或共扼鍵性質(zhì)。在進一步評估該物質(zhì)中，實驗人員可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的簡單技術(shù)確定非線性活性，例如檢測空氣-水界面的SHG，或當(dāng)介質(zhì)中存在或不存在要評估的物質(zhì)時，檢測EFISH的SHG。一旦從實驗中篩選出了適合的非線性活性物質(zhì)，如果需要，將該物質(zhì)與對生物靶有特異性的物質(zhì)綴合，由此產(chǎn)生用于表面選擇性非線性光學(xué)檢測或成像技術(shù)的靶構(gòu)建體。
增強劑本文中增強劑指當(dāng)放置于非線性活性物質(zhì)臨近時，能增強(增加)非線性活性物質(zhì)(例如，部分，分子或粒子)橫截面的物質(zhì)(例如，部分，分子或粒子)(例如，增加產(chǎn)生的第二諧波輻射的強度)?，F(xiàn)有技術(shù)中的增強效果的實例包括“共振增強”和“表面增強”。通過與增強劑的電子躍遷或細胞質(zhì)基因組共振的共振，實現(xiàn)非線性活性橫截面部分，分子或粒子的增強。在分子或表面上或其附近添加增強劑，導(dǎo)致增強劑例如共價，靜電或非共價等的偶聯(lián)于分子或表面，或者增強劑不直接與分子或表面偶聯(lián)，而是接近分子或表面，例如增強劑吸附到細胞表面，使增強劑增加探針上標(biāo)簽的非線性反應(yīng)。
下面(及其中的參考文獻)描述了生產(chǎn)，設(shè)計和使用共振-增強粒子，例如金屬毫微粒子，用于非線性光學(xué)方法(SHG，表面增強的共振拉曼，)S.Nie和S.Emory，Science，1997，75，1102；P.V.Kamat，M.Flumiani，G.V.Hartland，J.Phys.Chem.B，1998，102，3123；H.Ditlbacher等人，Appl.Phys.B，2001，DOI10，1007/s003400100700；C.Sonnichsen等人，Appl.Phys.Lett.，2000，77，2949；B.Lamprecht等人，Appl.Phys.B，1997，64，269；J.P.Novak，J.Am.Chem.Soc.，2000，122，12029；S.R.Emory，W.E.Haskins，S.Nie，J.Am.Chem.Soc.1998，120，8009；W.P.McConnell等人，J.Phys.Chem.B 2000，104，8925；F.W.Vance，B.I.Lemon，J.T.Hupp，J.Phys.Chem.B 1998，102，10091；P.Galletto等人，J.Phys.Chem.B 1999，103，8706；S.R.Emory，S.Nie，J.Phys.Chem.B 1998，102，493共振增強或表面增強的物質(zhì)的存在使得可以增加樣品的非線性活性橫截面?，F(xiàn)有技術(shù)中的共振增強物質(zhì)的實例如下金屬或金屬性的(例如金，銀)毫微粒子或膠體顆粒，金屬涂覆粒子(例如，銀涂覆的乳膠毫微球)，上述任一物質(zhì)的集合體或簇，上述任一物質(zhì)經(jīng)合理設(shè)計的簇，鏈或集合體(例如，為破壞對稱的非中心對稱集合體，粒子或簇)，等。
在某些情況下，需要進行一些實驗確定最佳的標(biāo)記策略和/或使用增強劑或修飾劑進行指定測量。例如，靠經(jīng)驗調(diào)整偶聯(lián)化學(xué)，反應(yīng)條件等，確定最佳標(biāo)記策略。當(dāng)存在和不存在候選增強劑時，通過測量，例如非線性活性物質(zhì)的SHG強度，測試候選增強劑對非線性活性物質(zhì)的影響(如果必要，增強劑通過接頭與非線性活性標(biāo)簽連接；或者例如通過探針-靶反應(yīng)使增強劑接近標(biāo)簽)。當(dāng)施加電場時(EFISH)，增強劑對非線性活性標(biāo)簽的影響可在界面(例如空氣-水或固-液)或體相中發(fā)生。
分子標(biāo)志類似物也可通過引入分子標(biāo)志的非線性類似物來操縱系統(tǒng)的非線性活性，該類似物是經(jīng)修飾整合非線性活性標(biāo)簽(或其調(diào)節(jié)劑)，而不是熒光團和猝滅劑的分子標(biāo)志探針。這些分子標(biāo)志的非線性光學(xué)類似物在本文中稱作分子標(biāo)志類似物(MB類似物或MBA)。用于本發(fā)明的MB類似物可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的程序步驟合成。
在一個具體實施方案中，如本發(fā)明所述，用MB類似物探針作為雜交探針，它能報告互補靶核酸的存在，而無需將探針-靶雜交體與雜交實驗中的多余探針分離，也無需對靶進行標(biāo)記。標(biāo)記靶不僅耗時，而且改變了樣品中原本存在的靶的水平。MB類似物探針也用于檢測活細胞中的RNA，用于監(jiān)視密閉反應(yīng)容器中特定核酸的合成，用于構(gòu)建自報告寡核苷酸陣列。使用它們可進行同質(zhì)的一試管實驗，以鑒別DNA的單個核苷變異，檢測固定在表面的用于界面監(jiān)測的病原體或細胞。
圖20A和20B說明了一個MB類似物探針的實施方案。具有超極化率，對應(yīng)于一種或幾種基諧波光束的照射能產(chǎn)生非線性光輻射的一種物質(zhì)附著到探針的一端或一個位置(例如，染料分子，見圖20B)。在接近非線性活性標(biāo)簽的探針的另一端或另一位置，附著有另一當(dāng)兩種物質(zhì)接近時能增加或減少非線性活性標(biāo)簽產(chǎn)生的非線性光輻射的物質(zhì)(例如，10nm金粒子，見圖20B)。附著是通過共價鍵或通過本領(lǐng)域已知的其它一些方式實現(xiàn)的。一個具體實施方案中，非線性活性標(biāo)簽是具有超極化率的有機染料，例如公知的唑類染料及其衍生物。唑類染料及其衍生物可商業(yè)性的從Molecular Probes(Eugene，OR)獲得，用胺基和巰基連接于各種探針，包括核酸。一種物質(zhì)，例如金毫微粒子，已知它能增強與之接近的非線性活性物質(zhì)產(chǎn)生的非線性光輻射，它可作為調(diào)節(jié)標(biāo)簽產(chǎn)生的非線性光輻射的物質(zhì)。一個具體實施方案中，MB類似物探針固定在固體表面，例如平坦的玻璃表面或微球體表面，或者MB類似物用于同質(zhì)溶液，并且在EFISH測量中用施加電場檢測。如果MBAs固定在表面上，非線性活性物質(zhì)至少在表面部分定向并滿足表面選擇性非線性光學(xué)技術(shù)所需的非中心對稱條件。
Au毫微粒子能增強非線性光輻射的強度，例如當(dāng)毫微粒子與唑染料彼此接近時，唑類染料以幾個數(shù)量級散射第二諧波。探針與互補靶雜交時，非線性光輻射的強度降低并可根據(jù)探針-靶雜交的量來定量所述降低。除了其它因素，這種技術(shù)的靈敏性取決于雜交發(fā)生之前的背景非線性光學(xué)信號。用于檢測與圖20B所示探針雜交程度的各種靶序列是圖20中的靶1-4(分別是SEQ ID NO1-4)。
本發(fā)明可用于檢測靶樣品的單核苷多態(tài)性(SNPs)，因為MBA探針在其與靶結(jié)合中有高度選擇性，并且探針和靶序列之間一個堿基對的差異將產(chǎn)生與靶完全互補時相比低得多的雜交親和性。MBA探針也可作為標(biāo)簽。
5.1探針-靶相互作用分析實驗在本發(fā)明的描述中，測試分子也稱為“靶”，候選結(jié)合配偶體也稱為“探針”。下述是能根據(jù)本發(fā)明分析的探針-靶相互作用類型的例子i)探針-靶結(jié)合導(dǎo)致探針，靶或兩者的構(gòu)象變化。
ii)探針-靶結(jié)合導(dǎo)致非線性活性物質(zhì)偶極矩的變化，所述物質(zhì)是探針，靶或兩者都是，作為探針-靶結(jié)合的結(jié)果。
探針-靶結(jié)合也能導(dǎo)致構(gòu)象和偶極矩聯(lián)合發(fā)生變化。
另外，檢測探針-靶相互作用可在界面，體相中(同質(zhì)相)，或包含界面和體相的區(qū)域進行。
本發(fā)明可應(yīng)用于分子系統(tǒng)或單一分子——即，全體反應(yīng)測量或單一分子反應(yīng)測量。
一個優(yōu)選實施方案中，靶是G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)。GPCRs是一類蛋白，當(dāng)被配體激活時會發(fā)生構(gòu)象變化，因此能應(yīng)用本發(fā)明對其進行研究。在這種情況中，如果GPCR自身不是非線性活性的，則使用非線性活性標(biāo)簽標(biāo)記該蛋白，通過非線性活性標(biāo)簽的方向變化檢測或查詢構(gòu)象變化。GPCRs能附著于表面，并且配體激活受體引起的構(gòu)象變化可導(dǎo)致標(biāo)簽方向的變化，并因此使非線性光束(例如，第二諧波產(chǎn)生)的性質(zhì)改變，例如強度，波長或偏振。如果需要，可在樣品暴露于配體之前測量背景信號。
在某些情況中，一種成分與受體的結(jié)合將導(dǎo)致被測量的非線性光的性質(zhì)的變化，即使該受體沒有被激活。例如，這可能是因為結(jié)合復(fù)合物中該成分與受體之間的相互作用，該相互作用改變了附著于受體的標(biāo)簽的方向。如果需要，可進行對照實驗將測得的非線性光性質(zhì)的變化歸因于該成分和指定受體的結(jié)合或激活。例如，使用已知結(jié)合指定受體但不產(chǎn)生構(gòu)象變化的某成分作為標(biāo)記反應(yīng)的對照；如果標(biāo)簽方向上的任何測得的變化僅僅是由于受體的激活，則通過改變標(biāo)簽的結(jié)合化學(xué)以改變標(biāo)記位點和/或遺傳修飾受體引入新的標(biāo)記位點。
例如，用與表平面(例如，宿主細胞膜)平均成θ角的方向(或超極化率方向)的非線性活性標(biāo)簽標(biāo)記受體。受體與一些配體結(jié)合和/或激活后，標(biāo)簽與表平面的平均夾角變?yōu)棣陆恰Ｓ墒荏w結(jié)合或激活引起的即使是很小的角度變化也會導(dǎo)致測量的非線性光性質(zhì)(例如，非線性光強度)的相當(dāng)大變化。例如，如果產(chǎn)生的非線性光的強度與超極化率對膜平面垂直的向量成比例，那么角度變化引起的強度變化百分比是[cos(θ)/cos(β)]2，并且非線性光強度二次方的依賴于超極化率的垂直向量。例如，假設(shè)超極化率方向是δ函數(shù)，如果θ→β變化了25-30°，那么非線性光強度將降低約9％。
在某些情況中，需要一些實驗確定最佳的標(biāo)記策略和/或使用增強劑或修飾劑進行指定測量。例如，靠經(jīng)驗調(diào)整偶聯(lián)化學(xué)，反應(yīng)條件等，確定最佳標(biāo)記策略。
或者，使靶分子溶解并利用其固有的偶極矩，通過液相中施加的電場使其極化；如果靶具有超極化率(即，靶或者原本就是非線性活性的，或者是通過附加非線性活性標(biāo)簽而變成非線性活性的)，通過EFISH技術(shù)將產(chǎn)生非線性光信號，并以該信號作為背景。加入配體(即探針)激活靶分子，將發(fā)生構(gòu)象變化。如果該構(gòu)象變化不導(dǎo)致靶分子產(chǎn)生相當(dāng)大的偶極矩變化，那么靶分子的數(shù)量和凈余方向也不發(fā)生相當(dāng)大的變化。然而，如果這種構(gòu)象變化傳到非線性部分，其整體方向?qū)⒏淖儯瑢?dǎo)致被測的非線性光性質(zhì)的變化。如果配體與靶分子的結(jié)合導(dǎo)致非線性活性靶分子產(chǎn)生相當(dāng)大的偶極矩的變化，在電場中排列的靶分子數(shù)量將改變，使被測的非線性光性質(zhì)發(fā)生變化。溶液中于施加電場下排列的分子數(shù)量依賴于該分子的偶極矩。用于模擬該依賴程度的方程式是Langevin方程N＝N0exp(-μE/kT)，其中N是排列物質(zhì)的數(shù)量，μ是其偶極矩，E是與偶極矩平行的電場大小，N0是暴露于電場中的分子數(shù)量，k是玻耳茲曼常數(shù)，T是開氏溫標(biāo)。探針-靶相互作用引起的偶極矩變化將導(dǎo)致排列分子數(shù)量的大的變化，以及這些分子產(chǎn)生的非線性光強度的大的變化。例如，帶有非線性活性標(biāo)簽和給定偶極矩的探針與靶結(jié)合，形成的具有更大或更小偶極矩的探針-靶復(fù)合物導(dǎo)致產(chǎn)生的非線性光強度的變化。如果每個分子所帶電荷的位置和數(shù)量是已知的話(例如，通常是蛋白的情況，其晶體結(jié)構(gòu)是已知的)，那么測得的由于結(jié)合引起的變化也可用于計算分子的結(jié)合構(gòu)象。
上述說明是任何導(dǎo)致偶極矩變化或構(gòu)象變化的探針-靶相互作用的例子。離子通道蛋白是另一類對應(yīng)于激活作用發(fā)生構(gòu)象變化的重要的蛋白，也可應(yīng)用本發(fā)明的方法對其進行研究。
表面選擇性非線性光學(xué)技術(shù)也是一種相干技術(shù)，即基諧波和非線性光束之間有確定的相位關(guān)系，并且宏觀樣品中非線性光束的波陣面(在相干長度之內(nèi))是同相的。這些特性提供了很多優(yōu)點，有利于表面或高通量研究，在這些研究中，例如檢測單個表面或微陣列表面。使用非線性光基于表面選擇性進行檢測的裝置，例如帶有第二諧波發(fā)生的裝置，只需最小限度的收集光，因為非線性光的產(chǎn)生只發(fā)生在界面上，所以理論上，允許高精度的區(qū)分和快速掃描。
探針-靶相互作用(例如，結(jié)合反應(yīng)，構(gòu)象變化等)與本發(fā)明在下述可測量的信息方面相互關(guān)聯(lián)，例如i)非線性或基諧波光的強度ii)非線性或基諧波光的波長或光譜iii)基諧波光在表面或基質(zhì)入射的位置(例如，為了成像)iv)非線性光的偏振現(xiàn)象v)i)，ii)，iii)或iv)的時程vi)i)，ii)，iii)，iv)和v)一個或幾個的組合本發(fā)明的優(yōu)點例舉如下i)靈敏性并且直接依賴于樣品中非線性活性物質(zhì)的方向和/或偶極矩，有利于檢測探針中的構(gòu)象變化和導(dǎo)致非線性活性物質(zhì)(例如，探針，靶或兩者)的偶極矩發(fā)生相當(dāng)大的改變的結(jié)合。
ii)與基于熒光的檢測相比，具有更高的信噪比(更低的背景)，因為只有在形成非中心對稱情況的表面，才產(chǎn)生表面選擇性非線性光，或者在施加電場以誘導(dǎo)非中心對稱的同質(zhì)相中，對表面進行的表面選擇性非線性光檢測具有非常狹小的‘景深’(depth of field)。基于熒光的檢測方案中，其熒光源包括從處于視野中但不在焦平面的物質(zhì)發(fā)出的熒光，自身熒光，和雜散激發(fā)光對發(fā)射的熒光的污染；這些不是背景非線性光輻射的來源。
iii)當(dāng)測量中要求存在液體溶液時，即在洗掉步驟消除或妨礙結(jié)合過程的測量中，非線性光學(xué)技術(shù)是有利的。本發(fā)明的這個方面可應(yīng)用于需要大量物質(zhì)存在的平衡測量(自由能，結(jié)合常數(shù)，等)，或應(yīng)用于需要在一段時間進行的動力學(xué)測量。
iv)光漂白和熱效應(yīng)比發(fā)生在熒光中的更低——分子中雙光子吸收橫截面比單光子橫截面低得多，并且非線性光學(xué)技術(shù)涉及散射，而不涉及吸收。
v)只需最小限度的收集光并預(yù)期更高的信噪比，因為基諧波和非線性光束(例如，第二諧波)相對于界面有確定的入射和射出方向。相對于基于熒光的檢測，這是一個優(yōu)點，在基于熒光的檢測中，以各向同性的方式發(fā)出熒光，并且在目標(biāo)平面(例如含有探針的界面)之外可能存在大的自身熒光背景。
vi)容易應(yīng)用于珠，生物細胞，脂質(zhì)體或其它粒子，它們不平坦的表面與支持介質(zhì)，溶液等形成界面。
vii)容易從被靶實際激活的探針中(例如，受體)區(qū)別靶和探針的結(jié)合。
viii)探針和靶之間的結(jié)合過程在存在一種或多種小分子，藥物，阻斷劑或其它成分的情況下進行，這些物質(zhì)影響探針-靶結(jié)合過程的性質(zhì)，例如平衡常數(shù)，結(jié)合動力學(xué)等。
一個實施方案使用了表面陣列，該陣列用現(xiàn)有技術(shù)中已有的各種方法構(gòu)建。對于DNA微陣列，多數(shù)是用三種非標(biāo)準(zhǔn)方法中的一種制備的(S.C.Case-Green et al.，Curr.Opin.Chem.Biol.2(1998)，404)Affymetrix，Inc.探針陣列用模式化的光指導(dǎo)的組合化學(xué)合成制備(S.A.Fodor，Science 277(1997)，393)；斑點陣列根據(jù)D.H.Duggan et al.，Nature Genet.21(Suppl.)(1999)，10；M.Schenaet al.，Science 270(1995)，467；P.O.Brown和D.Botstein，Nature Genet.21(Suppl.)(1999)，33；和L.McAllister et al.，Am.J.Hum.Genet.61(Suppl.)(1997)，1387的方法制備；噴墨技術(shù)也可用于一個堿基一個堿基的合成寡核苷酸，這是通過在適合的基質(zhì)上按順序的進行基于溶液的反應(yīng)實現(xiàn)的(A.P.Blanchard etal.，Biosens.And Bioelectron.11(1996)687。這些文獻的相關(guān)部分在此引入作為參考。
例如，核酸，寡核苷酸或核苷酸陣列如下構(gòu)建Pat.No.6,110,426，Pat.No.5,143,8546,110,426(此處將其相關(guān)部分引入作為參考)，Pat.No.5,143,854(此外將其相關(guān)部分引入作為參考)或Fodor et a1.，“Light-directed Spatially-addressableParallel Chemical Synthesis，″Science，1991，251，767-773.可溶性蛋白陣列如下構(gòu)建R.Ekins，F(xiàn).W.Chu，Trends inBiotechnology，1999，17，217，(此處將其相關(guān)部分引入作為參考)。膜蛋白陣列可根據(jù)下述方法，通過流動脂質(zhì)膜微模式(micropatterning)來構(gòu)建Groves，J.T.，Ulman，N.，Boxer，S.G.，″Micropatterning fluid bilayers on solid supports″，science，1997，275，651-3(此處將其相關(guān)部分引入作為參考)。陣列基質(zhì)可由玻璃，硅，銦錫氧化物，或已知的任何其它基質(zhì)組成。所研究的表面陣列的元件之間可包含物理屏障物，因此在化學(xué)反應(yīng)步驟中，元件(及其生物分子)彼此保持隔離。陣列位置由不同探針，各處的相同探針或它們的某種組合構(gòu)成。也可在棱鏡的下側(cè)構(gòu)建陣列使得光束全內(nèi)反射和短暫的非線性光產(chǎn)生。或者將陣列基質(zhì)與棱鏡接觸，也產(chǎn)生同樣的結(jié)果。
電泳系統(tǒng)可與表面陣列聯(lián)合使用，例如使用流體通道或微毛細管將試劑或生物成分傳遞到一個或多個位點。樣品包括微毛細管通道的陣列，彼此各不相同，每一個都允許靶-探針反應(yīng)發(fā)生；成像技術(shù)也由陣列元件組成，每個元件是微毛細管通道或通道流入或排空的反應(yīng)室。
基諧波和非線性光束的偏振可用偏振光器件選擇。通過分析非線性光束的強度(它是基諧波和非線性偏振的函數(shù))，可獲得更多關(guān)于探針-靶復(fù)合物的信息(例如，更高的信噪比)。并且，通過選擇和分析基諧波或非線性光輻射的偏振，背景輻射將降低或信號強度增加。
檢測也可使用多重內(nèi)反射板來完成(N.J.Harrick，″InternalReflection Spectroscopy″，John Wiley & Sons，Inc.，New York，1979此處將其相關(guān)部分引入作為參考)，它使得基諧波光束與陣列表面多重接觸，因此產(chǎn)生的非線性光強度增加。另一種選擇方案是構(gòu)建一側(cè)有陣列表面而一端有損耗性耦合器的光學(xué)空腔，以允許非線性光的輸出耦合，形成光學(xué)微腔，它在共振條件下能夠積累非常高的強度，因此增加產(chǎn)生的非線性光的量。
多核苷酸陣列可作為探針。寡核苷酸是靶或探針時，優(yōu)選非線性活性標(biāo)簽附著于5′或3′端。有許多聯(lián)接部分和方法將分子(可以是非線性活性標(biāo)簽)附著到寡核苷酸的5′或3′端，如下述參考文獻所例舉的Eckstein，編者，Oligonucleotides and AnaloguesAPractical Approach(IRL Press，Oxford，1991)；Zuckerman等人，Nucleic Acids Research，155305-5321(1987)(寡核苷酸上的3′硫羥基)；Sharma et al.，Nucleic Acids Research，193019(1991)(3′巰基)；Giusti et al.，PCR Methods and Applications，2223-227(1993)和Fung et al.，U.S.Pat.No.4,757,141(通過購自Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，Cafil.的Aminolink.TM.II 5′磷氨基)Stabinsky，U.S.Pat.No.4.739,044(3′氨基烷基磷?；?；Agrawal et al.，Tetrahedron Letters，311543-1546(1990)(通過氨基磷酸酯鍵附著)；Sproat et al.，Nucleic Acids Research，154837(1987)(5′巰基)；Nelson etal.，Nucleic Acids Research，177187-7194(1989)(3′氨基)；此處將其考相關(guān)部分引入作為參考。
優(yōu)選在合成過程中使用商業(yè)可獲得的聯(lián)接部分標(biāo)記寡核苷酸，例如，從Clontech Laboratories(Palo Alto，Cafil.)獲得。一個具體實施方案中，固相合成結(jié)束時，用以亞磷酰胺衍生染料的方法可以很方便的將羅丹明和熒光素染料附著到寡核苷酸的5′羥基，例如Wooet al.，U.S.Pat.No.5,231,191；和Hobbs，Jr.，U.S.Pat.No.4,997,928，此處將其相關(guān)部分引入作為參考。
優(yōu)選，寡核苷酸存在于陣列中。
蛋白陣列可用于確定一個給定的靶蛋白是否與固定在表面的探針蛋白結(jié)合；這些陣列也可用于研究與探針蛋白結(jié)合的小分子。蛋白陣列可按照如下方法制備G.MacBeath和S.L.Schreiber，″PrintingProteins as Microarrays for High-Throughput FunctionDetermination″，Science 2000，289，1760-1763，用于，例如，確定一個給定的靶蛋白是否與固定在表面的探針蛋白結(jié)合。
探針在其上形成的表面可由廣泛范圍的材料組成，生物的，非生物的，有機的，無機的，或這些物質(zhì)的任意組合，存在形式有顆粒狀，線狀，沉淀物，凝膠，薄片，管狀，球狀，容器狀，毛細管，墊狀，薄片，薄膜，板狀，片狀等。表面可以是任何便利的形狀，例如，盤狀，方形，球形，圓形等。表面優(yōu)選平面但也可選用另外各種表面構(gòu)型。例如，表面包含凸起和凹陷區(qū)域，樣品就放置于此處。表面及其外表優(yōu)選形成剛性支撐物，以使樣品在其上形成。選擇表面及其外表以提供適當(dāng)?shù)墓馕招再|(zhì)。例如，表面是聚合的Langmuir Blodgett薄膜，功能化玻璃，Si，Ge，GaAs，GaP，SixOy，SixNy，改性硅，或廣泛范圍的任意一種凝膠或聚合物，例如(聚)四氟乙烯，(聚)偏二氟乙烯，聚苯乙烯，聚碳酸酯及其組合。根據(jù)這些綜述說明，其它表面材料對本領(lǐng)域人員是顯而易見的。一個優(yōu)選實施方案中，表面是平坦的玻璃或硅石。
一些實施方案中，用已知的技術(shù)對基質(zhì)的表面進行蝕刻以提供期望的表面特性。例如，采用形成管溝，v-槽，臺式結(jié)構(gòu)等方式，使合成區(qū)域更加接近于照射光的焦點。表面也可帶有反射“鏡”結(jié)構(gòu)以最大化的發(fā)射所收集的光。
探針的化學(xué)特征(例如，蛋白結(jié)構(gòu)或寡核苷酸序列)從固體表面的一個位點到另一位點變化，或者相同的探針均一的覆蓋表面。靶可以且有單一特征或者是不同特征的靶的組合。
一個具體實方案中，測得探針-靶結(jié)合反應(yīng)的動力學(xué)是靶濃度的函數(shù)。在該實施方案中，測量非線性光強度和/或光譜的時程。測得的信息轉(zhuǎn)化為結(jié)合的靶濃度的時程(例如，以mM/s或μM/s表示的探針-靶的濃度)。也可使用探針-靶結(jié)合平衡或形成的動力學(xué)速率的藥物或調(diào)節(jié)劑，以比較添加的物質(zhì)對探針-靶反應(yīng)的影響。
不涉及使用表面選擇性非線性光學(xué)技術(shù)的各種現(xiàn)有技術(shù)，包含與本發(fā)明相關(guān)的部分。下面列出的實例及其中的參考文獻作為本發(fā)明的參考King et al..，U.S.Patent 5,633,724描述了對掃描物的掃描和分析；Fork et al.，U.S.Patent 6,121,983描述了激光的多路技術(shù)以產(chǎn)生適合于掃描的激光陣列；Foster，U.S.Patent5,485,277；Fodor et al.，U.S.Patent 5,324,633和Fodor etal.，U.S.Patent 6,124,102描述了含有附著探針陣列的基質(zhì)，以及掃描分析確定探針和靶之間結(jié)合反應(yīng)的動力學(xué)和平衡特性；Kainet al.，U.S.Patent 5,847,400描述了對基質(zhì)的激光掃描；Kinget al.，U.S.Patent 5,432,610描述了用于積聚能量的光學(xué)共振空腔；Walt et al.，U.S.Patent 5,320,814，Walt et al.，U.S.Patent 5,250,264，Walt et al.，U.S.Patent 5,298,741，Walt et al.，U.S.Patent 5,252,494，Walt et al.，U.S.Patent6,023,540，Walt et al.，U.S.Patent 5,814,524，Walt et al.，U.S.Patent 5,244,813描述了基于光纖的設(shè)備；Fiekowsky etal.，U.S.Patent 6,095,555，描述了成像及對圖象的基于軟件的分析；Stern et al.，U.S.Patent 5,631,734描述了數(shù)據(jù)采集；Stimson et al.，U.S.Patent 6,134,002描述了共焦成像技術(shù)；Sampas，U.S.Patent 6,084,991描述了基于CCD的成像技術(shù)；Stern et al.，U.S.Patent 5,631,734描述了光刻制備附著于表面的探針；Shalon et al.，U.S.Patent 6,110,426描述了制備附著于表面的探針的方法和設(shè)備；Slettnes，U.S.Patent 6,040,586描述了基于位置的掃描技術(shù)；Trulson et al，U.S.Patent 6,025,601描述了探針-靶結(jié)合于表面的成像方法。
附著于表面的細胞和細胞微陣列這部分概述了有關(guān)生物細胞與表面的分界以及在表面構(gòu)建生物細胞陣列的一些方法，它們能用于本發(fā)明的實驗。已經(jīng)描述了很多方法制備均一微模式的細胞陣列用于其它應(yīng)用，例如使用光化學(xué)抗光刻法(Mrksich和Whitesides，Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.2555-78，1996).。在這種光致抗蝕劑法中，用光致抗蝕劑均勻覆蓋玻璃平板，并在光致抗蝕劑涂層上放置遮光模以確定期望的“陣列”或模式。在曝光后，未遮蓋區(qū)域的光致抗蝕劑消除。全部的光刻限定表面被疏水性物質(zhì)均勻覆蓋，這種疏水性物質(zhì)例如有機硅烷，它不僅結(jié)合于裸露的玻璃表面，也結(jié)合于光致抗蝕劑覆蓋的表面。然后，將光致抗蝕劑從玻璃表面剝離，裸露出的玻璃上顯出斑點陣列。接著，用有機硅烷洗滌玻璃平板，該有機硅烷具有末端疏水基團或化學(xué)反應(yīng)性基團，例如氨基。疏水性有機硅烷結(jié)合于裸露玻璃上的斑點，形成的玻璃平板其疏水表面上具有疏水性或反應(yīng)性斑點組成的斑點陣列(位于初始光致抗蝕劑存在的區(qū)域)。疏水基團的斑點陣列提供了與某種細胞，包括神經(jīng)元起源細胞進行非特異性和非共價結(jié)合的基質(zhì)(Klienfeld et al.，J.Neurosci.84098-4120，1988)。反應(yīng)性離子蝕刻已被類似地應(yīng)用于硅晶片表面產(chǎn)生具有兩種不同類型紋理的表面模式。(Craighead et al.，Appl.Phys.Lett.37653，1980；Craighead et al.，J.Vac.Sci.Technol.20316，1982；Suhet al.Proc.SPIE 382199，1983)。
在基于特異性然而非共價相互作用的其它方法中，使用光致抗蝕劑沖壓產(chǎn)生被蛋白吸附性鏈烷硫醇覆蓋的金表面(Singhvi et al.，Science 264696-698，1994)。裸露的金表面用抑制蛋白的吸附的聚乙烯封端的鏈烷硫醇覆蓋。將整個表面暴露于層粘連蛋白后，胞外基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了細胞結(jié)合性蛋白，活的肝細胞均勻的附著于層粘連蛋白覆蓋的島并在其上生長。(Singhvi et al.1994)。采用涉及強的，但非共價的金屬螯合作用的精加工，以特定蛋白模式覆蓋金表面(Sigal etal.，Anal.Chem.68490-497，1996)。在這種情況中，用次氮基乙酸封端的鏈烷硫醇模式化金表面。金裸露區(qū)域用三(乙二醇)覆蓋以減少蛋白吸附。添加Ni2+后，發(fā)現(xiàn)由5個組氨酸標(biāo)記的蛋白的特異性吸附是動力學(xué)穩(wěn)定的。
通過將特定分子，例如蛋白化學(xué)交聯(lián)于模式基質(zhì)的的反應(yīng)性位點，可以實現(xiàn)更加特異的，均一的細胞結(jié)合(Aplin和Hughes，Analyt.Biochem.113144-148，1981)。對基質(zhì)的另一種光學(xué)模式的精加工制造了反應(yīng)性斑點陣列。用化學(xué)吸附于玻璃的有機硅烷洗滌玻璃平板以覆蓋玻璃。通過確定陣列模式的遮光模用深度紫外線照射有機硅烷涂層。這種照射斷裂Si-C鍵形成反應(yīng)性Si自由基。與水的反應(yīng)使Si自由基形成極性的硅烷醇基團。極性的硅烷醇基團組成陣列的斑點，并經(jīng)進一步修飾與斑點上的其它反應(yīng)性分子偶聯(lián)，如U.S.Pat.No.5,324,591所述，在此將其引入作為參考。例如，含有生物功能性基團，如自由氨基部分的硅烷可以硅烷醇基團反應(yīng)。自由氨基基團可作為生物分子共價附著的位點，所述生物分子例如蛋白，核酸，碳水化合物和脂類。利用表面上自組裝的單層使哺乳細胞在表面上的粘著模式化的其它方法，包括Lopez et al.，″Convenient Methods forPatterning the Adhesion of Mammalian Cells to Surfaces UsingSelf-Assembled Monolayers of Alkanethiolates on Gold，″J.Am.Chem.Soc.，1993，115，5877-5878，Georger et al.，″CoplanarPatterns of Self-assembled Monolayers for Selective Cell-adhesion and Outgrowth，″Thin Solid Films 210(1-2)716-719APR 30 1992，和Spafgo et al.，PNAS 91(23)11070-11074(1994)。
已經(jīng)說明了通過反應(yīng)性氨基，將凝集素非模式化的共價附著于玻璃基質(zhì)，已知凝集素與細胞表面相互作用(Aplin和Hughes，Analyt.Biochem.113144-148，1981)。在支持物上形成細胞的均一陣列的光學(xué)方法需要較少的步驟，并且比光致抗蝕劑法更快(例如，只需兩個步驟)，但需要使用昂貴光源發(fā)出的高強度的紫外線。
細胞在表面培養(yǎng)或生長，不需要另外的衍生作用?，F(xiàn)有技術(shù)中已知的這種類型的表面包括Becton-Dickinson Falcon盤等。
所有這些方法制造的細胞陣列或表面附著細胞層是均一的。在光致抗蝕劑法中，細胞結(jié)合于疏水性斑點陣列和/或特定分子附著于這些斑點，隨后結(jié)合細胞。因此，細胞以相同的方式結(jié)合到陣列中所有斑點上。在光學(xué)方法中，細胞通過粘附作用與陣列中的斑點的自由氨基基團結(jié)合。也存在并可使用將各種細胞類型附著于相同的基質(zhì)以同時結(jié)合這些細胞類型的方法。
核酸陣列核酸陣列在很多生物學(xué)和臨床研究中是有用的，這些研究中，使用陣列平行的分析一種或多種基因。遺傳性疾病通常是由于基因不適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄引起的——或者太多或者太少——或者全部缺失。這種缺陷在癌癥中尤其普遍，當(dāng)調(diào)節(jié)基因被刪除，失活，或變成組成型活性時，都發(fā)生這種缺陷。與一些由于單個缺陷基因?qū)е碌倪z傳疾病(例如囊性纖維化)不同，臨床表現(xiàn)相似的癌癥，遺傳學(xué)上是異質(zhì)的。http//www.cs.wustl.edu/～jbuhler//research/array/glossary.html-geneticallyheterogeneous。例如，即使對于一個病人，前列腺癌(前列腺腺癌)也可以是由幾個不同的，獨立的調(diào)節(jié)基因缺陷導(dǎo)致的。在一組前列腺癌病人中，每一個人都可能有一組不同的丟失或缺損基因，預(yù)示著對該疾病不同的預(yù)后和治療。
癌癥研究中，比較雜交能達到兩個目的它能精確查明使正常細胞改變?yōu)榘┘毎霓D(zhuǎn)錄差異，它能區(qū)別異質(zhì)癌癥中異常轉(zhuǎn)錄的不同模式。了解癌癥的各種不同的原理對于發(fā)明靶向各種不同的疾病的治療方法是至關(guān)重要的，這樣每個病人才能獲得最適合的和最有效的治療。
癌癥是遺傳學(xué)異質(zhì)疾病的普通實例，但決不是唯一的實例。糖尿病，心臟病，和多發(fā)性硬化也屬于這種已知其遺傳風(fēng)險因子是異質(zhì)的疾病。
肽-核酸另一實施方案中，本發(fā)明使用了肽核酸和寡聚體，它是核酸的類似物，其中肽樣主鏈取代不帶電荷的主鏈。PNAs在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的。下面的參考文獻提供了關(guān)于在很廣泛的應(yīng)用范圍中使用這些核酸類似物的綜述，包括表面和基于陣列的雜交，其中PNAs附著于表面并允許序列互補的DNAs或RNAs與其結(jié)合。
例如，使用PNA寡聚體代替DNA寡聚體作為表面附著探針成分。使用PNA寡聚體的一個主要優(yōu)點是，與例如DNAs或RNAs(含有帶電的磷酸基團)的雜交反應(yīng)僅微弱地依賴于(例如解鏈溫度)離子強度，因為它的電荷排斥比傳統(tǒng)的DNA-DNA等雜交中的小的多。因此，可使用表面選擇性非線性光學(xué)技術(shù)，在任意的離子強度條件下跟蹤探針-靶雜交。PNAs是商業(yè)上可獲得的(例如，從Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)，或者其它DNA類似物可以合成并使用。
下述參考文獻是關(guān)于使用PNAs的綜述Nielsen，et al.″Peptide nucleic acids(PNA)Oligonucleotide analogues with a polyamidebackbone″Antisense Research and Applications(1992)363-372Nielsen，et al.″Peptide nucleic acids(PNAs)Potential Antisense and Anti-gene Agents.″Anti-Cancer Drug Design 8(1993)53-63Buchardt，et al.″Peptide nucleic acids and their potential applications in biotechnology″TIBTECH 11(1993)384-386Nielsen，P.E.，Egholm，M.and Buchardt，O.″Peptide Nucleic Acid(PNA).A DNA mimicwith a peptide backbone″Bioconjugate Chemistry 5(1994)3-7Nielsen″Peptide nucleic acid(PNA)A lead for gene therapeutic drugs″AntisenseTherapeutics 4(1996)76-84
Nielsen，P.E.″DNA analogues with nonphosphodiester baokbones″Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.24(1995)167-183Hyrup，B.and Nielsen，P.E.″Peptide Nucleic Acids(PNA)Synthesis，Properties andPotential Applications″Bioorg.Med..4(1996)5-23Mesmaeker，A.D.，Altman，K.-H.，Waldner，A.and Wendeborn，S.″Backbonemodifications in oligonucleotides and peptide nucleic acid systems″Curr.Opin.Struct.Biol.5(1995)343-355Noble，et al.″Impact on Biophysical Parameters on the Biological Assessment of PeptideNucleic Acids，Antisense Inhibitors of Gene Expression″Drug.Develop.Res.34(1995)184-195Dueholm，K.L.and Nielsen，P.E.″Chemistry，properties，and applications of PNA(PeptideNucleic Acid)″New J.Chem.21(1997)19-31Knudsen and Nielsen″Application of Peptide Nucleic Acid in Cancer Therapy″Anti-Cancer Drug 8(1997)113-118Nielsen，P.E.″Design of Sequence-Specific DNA-Binding Ligands″Chem.Eur.J.3(1997)505-508Corey″Peptide nucleic acidsexpanding the scope of nucleic acid recognition″TIBTECH15(1997)224-229Nielsen，P.E.and rum，H.″Peptide nucleic acid(PNA)，a new molecular tool.″InMolecular BiologyCurrent Innovations and Future Trends，Part2.Horizon Scientific Press，(1995)73-89Nielsen，P.E.and Haaima，G.″Peptide nucleic acid(PNA).A DNA mimic with apseudopeptide backbone″Chem.Soc.Rey.(1997)73-78rum，H.，Kessler，C.and Koch，T.″Peptide Nucleic Acid″Nucleic Acid AmplificationTechnologiesApplication to Disease Diagnostics(1997)29-48Wittung，P.，Nielsen，P.andNorden，B.″Recognition of double-stranded DNA by peptidenucleic acid″Nucleosid.Nucleotid.16(1997)599-602
Weisz，K.″Polyamides as artificial regulators of gene expression″Angew.Chem.Int.Ed.Eng 36(1997)2592-2594Nielsen，P.E.″Structural and Biological Properties of Peptide Nucleic Acid(Pna)″Pure &Applied Chemistry 70(1998)105-110Nielsen，P.E.″Sequence-specific recognition of double-stranded DNA by peptide nucleicacids″Advances in DNA Sequence-Specific Agents 3(1998)267-278Nielsen″Antisense Properties of Peptide Nucleic Acid″Handbook of ExperimentalPharmacology 131(1998)545-560Nielsen″Peptide Nucleic Acids″Science and Medicine(1998)48-55Uhlmann，E.″Peptide nucleic acids(PNA)and PNA-DNA chimerasfrom high bindingaffinity towards biological function″Biol Chem 379(1998)1045-52Wang″DNA biosensors based on peptide nucleic acid(PNA)recognition layers.A review″Biosens Bioelectron 13(1998)757-62Uhlmann，E.，Peyman，A.，Breipohl，G.and Will，D.W.″PNASynthetic polyamide nucleicacids with unusual binding properties″Angewandte Chemie-International Edition 37(1998)2797-2823Nielsen，P.E.″Applications of peptide nucleic acids″Curr Opin Biotechnol 10(1999)71-75Bakhtiar，R.″Peptide nucleic acidsdeoxyribonucleic acid mimics with a peptide backbone″Biochem.Educ.26(1998)277-280Lazurkin，Y.S.″Stability and specificity of triplexes formed by peptide nucleic acid withDNA″Mol.Biol.33(1999)79-83Nielsen and Egholm″Peptide Nucleic AcidsProtocols and Applications″(1999)266 pp.
Eldrup and Nielsen″Peptide nucleic acidspotential as antisense and antigene drugs″Adv.Amino Acid Mimetics Peptidomimetics 2(1999)221-245Bentin，T.and Nielsen，P.E.″Triplexes involving PNA″Triple Helix Form.
Oligonucleotides(1999)245-255Falkiewicz，B.″Peptide nucleic acids and their structural modifications″Acta Biochim.Pol.46(1999)509-529.
下述文獻描述了在基于陣列的檢測中使用PNAs，包括將PNAs探針附著到固體表面的方法Hoffmann，R.，et al.″Low scale multiple array synthesis and DNA hybridization of peptidenucleic acids″Pept.Proc.Am.Pept.Symp.，15th(1999)233-234Matysiak，S.，Hauser，N.C.，Wurtz，S.and Hoheisel，J.D.″Improved solid supports andspacer/linker systems for the synthesis of spatially addressable PNA-libraries″NucleosidesNucleotides 18(1999)1289-1291.
5.2附加實施方案附圖闡明了利用第二或更高次諧波以及和頻或差頻產(chǎn)生的裝置和樣品的各種具體的實施方案。
圖1舉例說明了一個實施方案，其中通過從表面反射入射的基諧波光產(chǎn)生第二諧波光。光源5提供了在樣品中產(chǎn)生第二諧波光所必需的基諧波光。一般的光源是皮秒或毫微微秒激光，波長可調(diào)或不可調(diào)，并且商業(yè)上可獲得。激光器發(fā)出基頻(ω)的光線且其偏振通過使用，例如合乎該光線頻率和強度的半波板10進行選擇(例如，從MellesGriot，Oriel or Newport Corp.獲得)。光束經(jīng)透鏡15聚焦并穿過濾光器20，該濾光器設(shè)計成透過基諧波光但阻斷非線性光(例如，第二諧波)。濾光器用來阻止第二諧波光束回射到激光器腔中，這會干擾激光的性質(zhì)。光束經(jīng)過鏡子25的反射，以相對于表面特定的角度θ照射到表面的特定位置。如果需要，可使用下述儀器掃描鏡子25以控制鏡子的位置，所述儀器是檢流計控制的鏡掃描儀，旋轉(zhuǎn)的多角形的鏡掃描儀，布拉格衍射器，聲光偏轉(zhuǎn)器，或本領(lǐng)域已知的其它方法。樣品表面3O可以放置在一個x-y平移臺35上(計算機控制)從而在表面上選擇特定位置以產(chǎn)生第二諧波光束。表面可以是玻璃，塑料，硅或其它任意能反射基諧波或第二諧波光束的固體表面。樣品表面可以被密封，且表面與液體接觸。另外，使用微毛細管或其它液體運輸通道(未顯示)，泵或電泳元件將樣品30注滿或排空，上述裝置都是計算機控制的?；C波或第二諧波的輸出光束(與表面成特定夾角，即θ1-一般它們的方向接近一條直線)從表面反射，基諧波用適合于第二諧波光束的濾過器45濾過，只留下諧波光束(2ω)。第二諧波被鏡子40反射，如果必要，以偏振光50選擇其偏振，并用透鏡55聚焦到檢測器60。透鏡15和55可以是現(xiàn)有技術(shù)中用于聚焦或光束成形的透鏡的任意組合。如果需要，可使用單色器60在第二諧波光束的光譜波段中選擇特定波長。檢測器可以是光電倍增管，CCD陣列，或現(xiàn)有技術(shù)中已知的高靈敏性的其它任意檢測裝置。例如，使用以單光子計數(shù)模式運行的光電倍增管。在檢測器中，光產(chǎn)生與其強度成比例的電壓。記錄和掃描(或其組合)陣列表面每個位置的隨發(fā)展進程轉(zhuǎn)變的數(shù)據(jù)，并繪出表面每個區(qū)域產(chǎn)生的第二諧波強度的圖。
申請人設(shè)想使用和頻或差頻，其中使用與圖1結(jié)構(gòu)類似的裝置，單光源5被雙光源取代，該雙光源發(fā)出頻率ω1和ω2的兩個基諧波光束。和頻或差頻(Ω)即為Ω＝ω1±ω2。當(dāng)樣品表面是由離散元件組成的陣列時，單個元件或平行的多于一個的元件可以被基諧波光訪問。而且，依賴于特定的裝置結(jié)構(gòu)，可以檢測單個元件或平行的多個元件。
圖2舉例說明了一個實施方案，其中利用全內(nèi)反射(損耗波產(chǎn)生)產(chǎn)生第二諧波?；C波光(ω)直接指向棱鏡元件70的表面。光束在位置(a)折射，穿過棱鏡和指標(biāo)匹配膜75照射基質(zhì)80。棱鏡70和基質(zhì)80由光學(xué)透明材料構(gòu)成，并優(yōu)選相同類型的材料。棱鏡70是Dove棱鏡或支持損耗區(qū)域的任意其它元件(例如，波導(dǎo)管，纖維和薄金屬膜)。折射性的指標(biāo)匹配膜75可以是油，但優(yōu)選如Sjodin所公開的可壓縮性光學(xué)聚合物″Optical interface means″，PCT publicationWO 90/05317，1990。棱鏡75和基質(zhì)80可以是一元的，由相同材料構(gòu)成的整片(即，不含指標(biāo)匹配膜)。根據(jù)在80和85中的折射率及在其界面上光束的入射角，在80與樣品室85中的介質(zhì)形成的界面上產(chǎn)生損耗波。電場振幅從基質(zhì)表面指數(shù)性的衰減，1/e的長度為從毫微米到微米，這種衰減依賴于幾種因素，包括表面電勢，樣品室中平衡離子的密度(如果有的話)。樣品室充滿空氣，氣體或液體例如溶液或水。面向樣品室的表面80上的‘x’標(biāo)記強調(diào)目標(biāo)樣品(例如，構(gòu)建的探針)放置在這一邊。基質(zhì)80可以是能從75和85之間滑出的“芯片”，以測量不同的基質(zhì)。圖中的元件90是樣品室的一個通道，它能通過例如泵，靜電等方式將液體或氣體輸入或抽出樣品室。如果必要，整個樣品裝配在x-y平移臺95上。
圖3舉例說明了一個實施方案，其中使用板狀電介質(zhì)波導(dǎo)管將基諧波光傳遞到樣品表面(光束的產(chǎn)生，定向和檢測如圖I的元件1-5和8-13所示)?？衫闷叫邪寤螂娊橘|(zhì)波導(dǎo)管將基諧波光偶聯(lián)到波導(dǎo)管傳播模式中。圖中顯示了兩個板極(110和115)以及區(qū)域(120)。如果板極115和區(qū)域120的折射率小于光的折射率(基諧波和第二諧波兩者)，則形成波導(dǎo)管模式。這種模式在基質(zhì)中產(chǎn)生多重內(nèi)反射，它可用于增加界面產(chǎn)生的第二諧波光的量。例如，可以用在波導(dǎo)管上表面劃出或雕出的衍射光柵105將基諧波光束100與波導(dǎo)管110偶聯(lián)?；C波沿波導(dǎo)管的長度傳播并在表面的頂部和底部形成多重全內(nèi)反射。基質(zhì)110上的‘x’標(biāo)記表示所要測量的樣品表面(即，包含探針)。如果這個界面比材料110和115之間的界面明顯產(chǎn)生更多的第二諧波光，那么光強度可以忽略不計。例如，如果SH標(biāo)記的靶與固定在‘x’位置的探針結(jié)合，并且110和115之間界面的原子結(jié)構(gòu)在外延上匹配，那么110/120界面產(chǎn)生的第二諧波光比110/115界面產(chǎn)生的多得多。
另一實施方案中，一個平面波導(dǎo)管結(jié)構(gòu)110用于固體基質(zhì)(圖3)。在這個實施方案中，具有高折射率材料的一薄層115(波導(dǎo)管)，例如TiO2或Ta2O5，沉積在基質(zhì)110頂部(一般是玻璃)。波導(dǎo)管中劃有一個細的衍射光柵115，且激光器100發(fā)出的光應(yīng)用該光柵偶聯(lián)進波導(dǎo)管中。用透鏡和濾光器收集第二諧波光，并用PTM型檢測器或CCD相機檢測。
圖4A-C舉例說明了一個進行探針-靶反應(yīng)的流動池的實施方案。流動池3220的細節(jié)如圖所示。圖4A是正視圖，圖4B是橫截面視圖，圖4C是空腔的后視圖。參考圖4A，流動池3220包括其表面4202上的空腔3235?？涨坏纳疃壤缈蔀榧s10-1500mu.m，但也可采用其它深度。一般，空腔的表面積大于探針樣品的尺寸，約為13×13mm。進口4220和出口4230與空腔相通。一些實施方案中，進出口的直徑約為300-400mu.m并分別通過管4221和4231與冷卻循環(huán)池相連，以控制空腔的溫度。冷卻池的循環(huán)水以特定的溫度進出空腔。
空腔周圍形成很多溝槽4208，使其與流動池的其它部分熱隔離。由于流動池的熱質(zhì)減少，空腔的溫度將得到更加有效和精確的控制。
一些實施方案中，一個具有基本上平坦表面的面板4205將空腔分為兩個亞空腔。面板4205可以是光吸收性玻璃，例如RG1000nm濾過器。RG1000玻璃在可見光譜的高吸收性(在低于700nm的任何波長都檢測不到RG1000的表面發(fā)射率)能基本抑制任何可能會被入射波長激活的背景發(fā)光。光吸收玻璃光亮平滑的表面也減少了入射光的散射，減輕了在入射波長過濾雜散光線的負擔(dān)。玻璃還提供了一個再次分隔空腔的耐用介質(zhì)，因為玻璃相對來說更能抵抗在DNA雜交實驗或其它化學(xué)反應(yīng)中普遍存在的高鹽環(huán)境的侵蝕。
面板4205可用多個螺釘，夾子，RTV聚硅氧烷接合劑或其它粘合劑安裝在流動池中。參考圖4B，包含入口4220和出口4230的亞空腔4260被面板4205封閉。因此，冷卻池中的水與空腔3235隔離。這種設(shè)計提供了分隔的空腔以進行化學(xué)反應(yīng)和控制溫度。因為控制溫度的空腔就在進行反應(yīng)的空腔下面，所以反應(yīng)的溫度參數(shù)能被更有效的控制。
基質(zhì)130與表面4202配合并封閉空腔3235。優(yōu)選地，當(dāng)基質(zhì)和流動池匹配時，基質(zhì)上的探針陣列包含在空腔3235中。一些實施方案中，以O(shè)形環(huán)4480或其它密封材料改善基質(zhì)和流動池的匹配?？扇芜x的，面板4205的邊緣4206是傾斜的，使得可以采用更大的密封橫截面以改善匹配且不增加空腔的體積。一些實施方案中，希望保持空腔的體積越小越好以便更加精確的控制反應(yīng)參數(shù)，例如溫度或化合物的濃度。另外，更小的體積只需要更少量的材料進行實驗，因此廢棄物也減少。
再回到圖4A，凹槽4211可任選的在表面4202上形成。凹槽，例如約2mm深，2mm寬。一個實施方案中，凹槽4211當(dāng)安裝在表面4202上時被基質(zhì)遮蓋。凹槽與通道4213和連接于真空泵的真空裝置4212相通。真空泵使凹槽內(nèi)產(chǎn)生真空，從而使基質(zhì)粘附到表面4202。任選的，使用一個或多個墊圈改善流動池和基質(zhì)之間的密封。
圖4D舉例說明了基質(zhì)與流動池匹配的另一種技術(shù)。當(dāng)安裝到流動池時，面板4290施加足夠使基質(zhì)130固定在兩者之間的壓力。面板4290可用例如多個螺釘4291，夾子，夾鉗，針，或其它安裝裝置安裝。一些實施方案中，面板4290包括開口4295以使樣品暴露于入射光。開口4295可任選的被玻璃或其它基本透明或半透明的材料遮蓋。或者，面板4290由基本透明或半透明的材料構(gòu)成。
參考圖4A，面板4205包括與亞空腔3235相通的出入口4270和4280。管4271與4270連接，管4181與4280連接。管4271和4281通過連接管4222分別插入管4221和4231。連接管4222，例如，可以是T形連接管，均在其開口4223有密封裝置4225。密封裝置4225能阻止冷卻池中的水從連接管滲漏。應(yīng)該理解，可以使用其它構(gòu)型，例如能提供類似4220和4230的附加通道。
管4271和4281使得選擇的流體能引入空腔或通過空腔循環(huán)。一些實施方案中，管4271和4281可與泵相通，以使流體通過空腔循環(huán)。一個實施方案中，管4271和4281與攪動系統(tǒng)相通，該攪動系統(tǒng)攪動并使流體通過空腔循環(huán)。
參考圖4C，凹槽4215任選的在流動池的表面4203上形成。凹槽的尺寸例如為約2mm深，2mm寬。一個實施方案中，表面4203與平移臺匹配。當(dāng)流動池在平移臺上匹配時，凹槽4211被平移臺遮蓋。凹槽4215與通道4217和連接于真空泵的真空裝置4216相通。真空泵使凹槽4215內(nèi)產(chǎn)生真空，從而使表面4203粘附到平移臺上。任選的，形成額外的凹槽以增加匹配壓力。任選的，可用螺釘，夾子，針，各種類形的粘合劑或其它固定技術(shù)將流動池安裝在平移臺上。
進一步的可選實施方案中，如圖5A-C所示，珠，細胞，脂質(zhì)體或其它物體的懸液含有探針(130)。從這些樣品中散射的非線性光——例如，一個各向同性的樣品，其中的每個珠或其他物體都具有相干長度或進一步分離——以某種強度分布在各個方向產(chǎn)生?；C波光透射過懸液(130)，收集非線性輻射。可采用多種散射非線性光的收集模式。例如，從正向(A)，與基諧波光成直角(B)，或使用累計球的方法(C)收集第二諧波。C部分顯示了一個累計球165，樣品150放置其中?；C波光(145)進入入射口(170)，穿過樣品(150)，在球壁反射并被反射板(175)停止。通過出口(155)從球體表面收集散射的第二諧波光，并通過光纖線(160)偶聯(lián)到球體外。細胞是研究受體，細胞表面分子和其它生物成分構(gòu)象變化的一個方便和天然的系統(tǒng)。珠可以支撐磷脂雙層(例如，帶有膜蛋白)，或者探針例如蛋白或核酸能附著于其表面。珠給樣品提供了大量的分布表面積，它能有效代替平面表面形狀，尤其是當(dāng)基諧波和非線性光用于透射模式時。
一個可選實施方案中(圖6)，用各種光學(xué)裝置將激發(fā)光從點狀轉(zhuǎn)變成一些其它形狀。例如，呈點狀光束形狀的基諧波光束轉(zhuǎn)變成線狀，以利于掃描樣品表面。然而，除了其它因素，由于非線性光束的強度依賴于基諧波的強度(一般，以二次方程的形式依賴于基諧波的強度)，這種轉(zhuǎn)化將導(dǎo)致在給定的位置產(chǎn)生較少的非線性光強度。為了產(chǎn)生線狀的基諧波(一般，是一個約2mm直徑的圓點)，可將基諧波光束投射到具有約10倍放大率的顯微鏡物鏡，然后用150nm消色差透鏡校準(zhǔn)光束，這種方法是現(xiàn)有技術(shù)中已知的，如在U.S.Pat.No.5,834,758.中所公開的。如圖6所示，一般的基諧波光180的光束直徑為2-3mm。該光束穿過顯微鏡物鏡185。該物鏡的放大率是10，將光束擴張至約30mm。光束穿過透鏡190。該透鏡可以是150nm消色差透鏡，可以校準(zhǔn)光束。一般，經(jīng)擴張的校準(zhǔn)光束的光線強度成高斯分布。為使光束的強度變化最小化，在透鏡190后面插入掩蔽物195以掩蔽光束的頂部和底部，因此只有光束的中央部分通過。一個實施方案中，掩蔽物允許通過約7.5mm的水平光束。然后，該光束穿過柱面透鏡200，該透鏡具有100mm f.l.的水平圓柱軸，由Melles Griot在制造。柱面透鏡在垂直方向擴張光束點?；蛘撸褂秒p曲透鏡垂直方向擴張光束，此時產(chǎn)生拉平的光強度分布。光從柱面透鏡穿過透鏡205。任選的，在柱面透鏡后插入平面鏡以反射激發(fā)光朝向透鏡205。為獲得約15mm高的光束，柱面透鏡200和透鏡205的焦距比例約為1∶2，這樣能將光束放大到15mm。透鏡205，在一些實施方案中是80mm消色差透鏡，將光聚焦于樣品表面210上約15mm×50微米的線上。
如圖7A-B所示的可選實施方案中，探針模式是一個二維陣列(A，表面上陣列的俯視圖)，其中表面的每個區(qū)域—— 實施方案中是{1，35}——可以是不同的寡核苷酸或蛋白序列(或者是相同序列或不同序列的組合)。B部分是孔(215)中含有靶(225)的樣品表面(220)的側(cè)視圖，此處顯示的靶是附著有第二諧波活性標(biāo)簽(X)的蛋白?？字腥菁{液體或緩沖液，使孔中成分與基質(zhì)的其它部分或基質(zhì)陣列的其它元件物理隔離。基諧波光可以是多重的，形成的每個光束由單個鏡子導(dǎo)向以同時掃描陣列中不同的行和區(qū)域，這樣更加增強該技術(shù)用于高通量研究的潛力。
可選實施方案中，使用下述方法將探針DNA附著到基質(zhì)上Levicky et al.″Using Self-Assembly to Control the Structureof DNA Monolayers on GoldA Neutron ReflectivityStudy，″Journal of the American Chemical Society 1209787-9792(1998)，或Chrisey et al.，″Covalent Attachment ofSynthetic DNA to Self-Assembled Monolayer Films″，NucleicAcids Research 24，3031，(1996)的方未能。在Chrisey等人的方法中，如圖8中所示，使用了熔融硅石或氧化硅基材(230)并以N-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧硅烷(EDA)(235)進行衍生。一個實施方案中，EDA修飾的表面以同雙功能性交聯(lián)劑(SMPB)處理，SMPB的琥珀酰亞氨酯部分與EDA的第一位氨基團反應(yīng)(240)。堿基對序列(xzzy)(此處‘xzzy’代表整個序列)之后的巰醇-DNA寡聚體與SMPB交聯(lián)劑的馬來酰亞胺部分反應(yīng)，生成(250)所示的共價結(jié)合物質(zhì)。
可選實施方案中，如圖9所示，表面陣列的元件是物理隔離的，使得不同的試劑，靶溶液等可以選擇性的加入到任意一個或全部元件中。(A)部分是基質(zhì)(225)的頂視圖，該基質(zhì)具有隔離不同的孔區(qū)域的隔離物或壁(260)——在這個實施中是16個孔。(B)部分是帶有附著探針(270)的孔(265)的側(cè)視圖。這種陣列在現(xiàn)有技術(shù)中常見，例如96孔板等，并且是商業(yè)上可獲得的(Fisher Scientific，Inc.等)。
可選實施方案中，玻璃基質(zhì)表面用一層反射金屬，例如銀覆蓋。這種金屬層能夠增加非線性光的產(chǎn)生和收集。生物分子或其它粒子可以附著在金屬頂部的衍生層上。例如，金屬用一層二氧化硅(SiO2)涂覆，然后用一層氨基硅烷，例如3-氨基-辛基-三甲氧基硅烷涂覆。用接頭將寡核苷酸或多核苷酸附著到氨基硅烷層，該接頭將寡核苷酸的3′或5′端與氨基基團連接?；蛘?，寡核苷酸或多核苷酸吸附于氨基硅烷層。圖10說明了這種類型的實施方案，其中用銀涂層(280)衍生玻璃基質(zhì)(275)。然后，一薄層SiO2沉積到銀涂層(285)上面并用氨基硅烷(290)衍生。
一個具體實施方案中，核酸或PNA微陣列可從商業(yè)獲得或依據(jù)公開文獻構(gòu)建(例如http//cmgm.stanford.edu/pbrown/mguide/index.Html)。所使用的表面化學(xué)參見Chriseyet al.，″Covalent Attachment of Synthetic DNA to Self-Assembled Monolayer Films″，Nucleic Acids Research 24，3031，(1996)，其中寡核苷酸附著到熔融硅石片上自組裝的單層硅烷薄膜上。通過N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷實現(xiàn)硅烷化。
另一實施方案中，通過光指導(dǎo)的合成(S.A.Fodor，Science 277(1997)，393)或通過化學(xué)合成(例如Chrisey et al.，″CovalentAttachment of Synthetic DNA to Self-Assembled MonolayerFilms″，Nucleic Acids Research 24，3031，(1996))將寡核苷酸或PNAs附著到固體基質(zhì)上。
在其它實施例中，寡核苷酸或PNA的表面或微陣列可以從商業(yè)途徑獲得或根據(jù)公開的文獻(如，http//cmgm.stanford.edu/pbrown/mguide/index.html)構(gòu)建。
DNA微陣列可以從商業(yè)途徑獲得或根據(jù)公開的文獻構(gòu)建，例如(如，http//cmgm.stanford.edu/pbrown/mguide/index.html)。優(yōu)選應(yīng)用的表面化學(xué)參見Chrisey et al.，“Covalent Attachment ofSynthetic DNA to Self-Assembled Monolayer Films”，NucleicAcids Research 24，3031，(1996)，其中寡核苷酸附著于熔融硅石片的自組裝的單層硅烷薄膜。在玻璃或二氧化硅上通過N-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷和Hoheisel，J.D.“Improved solidsupports and spacer/linker systems for the synthesis ofspatially addressable PNA-libraries”Nucleosides Nucleotides18(1999)1289-1291實現(xiàn)硅烷化。與PNA寡核苷酸接觸的緩沖液或溶液可以從本領(lǐng)域已知的范圍內(nèi)選擇。雜交和沖洗溶液可見現(xiàn)有技術(shù)。例如，網(wǎng)址cmgm.stanford.edu/pbrown/protocols給出了探針-靶雜交的詳細指示。
微陣列可以在x-y平移臺上安裝，并通過個人電腦(PC控制)來驅(qū)動，所述個人電腦使用電動傳送器(從Oriel，Inc.得到)或現(xiàn)有技術(shù)中多種方法中的一種(如，V.G.Cheung et al.，“Making andreading microarrays”，Nature Genetics(Suppl.)，1999，2115-19)。
在可選擇的實施方案中，可以使用基于珠的纖維光學(xué)陣列(參考文獻34)，其中光束(如，基諧波和第二諧波)通過全內(nèi)反射沿纖維的路徑傳播?；C波光偶聯(lián)到光學(xué)纖維束或單根光學(xué)纖維，且第二諧波光在末端表面產(chǎn)生并且通過纖維反向收集。附圖11A-B舉例說明了一個纖維光學(xué)束陣列。(A)部分表示一束纖維光學(xué)電纜(295)，在其遠端有放置珠(300)的孔。(B)部分表示單根光學(xué)纖維的特寫圖?；C波光(ω)向有珠子的遠端(305)傳播。某些基諧波光與第二諧波光(2ω)一起從珠子反向散射回來，并且反向經(jīng)過纖維達到近端，所述近端有一個光列(coptical train)和檢測系統(tǒng)(未顯示)將基諧波輻射和第二諧波輻射進行分離。珠子(310)用探針覆蓋。
在可選擇的實施方案中，綠色熒光蛋白(GFP)或其非線性活性突變體被用于在體內(nèi)標(biāo)記蛋白，所述標(biāo)記通過根據(jù)本領(lǐng)域熟知的突變發(fā)生進行。GFP或其突變體是第二諧波活性的，并且可以作為蛋白的插入標(biāo)記。例如一個細胞膜受體可以通過突變發(fā)生用GFP進行標(biāo)記。在表面選擇性非線性光學(xué)技術(shù)中，用基諧波光束照射包括這種GFP標(biāo)記受體的細胞時，所述細胞產(chǎn)生某些背景第二諧波光。當(dāng)配體或其它化合物結(jié)合于受體并誘導(dǎo)活化時-并且同時產(chǎn)生構(gòu)象變化-由于受體的構(gòu)象變化導(dǎo)致的GFP標(biāo)記輕微位移，第二諧波的強度和/或光譜和/或時程將會改變(例如，歸咎于GFP蛋白總凈余方向的變化)。測量到的非線性光學(xué)性質(zhì)的變化由此與構(gòu)象變化和配體結(jié)合相關(guān)。
在可選擇的實施方案中，附圖1中非線性輻射的檢測器(65)是一個光電倍增管，以單光子計數(shù)模式工作。光電流脈沖可以是電壓轉(zhuǎn)化的，使用Model SR445 Fast Preamplifier和Model SR400Discriminator(由Stanford Research Systems，Inc.提供)進行放大和區(qū)別，并且然后送至計數(shù)器(由Kinetic Systems提供的Model3615 Hex Scaler)。通過一個DAC輸出器(由Kinetic Systems提供的Model 3112，12-Bit DAC)的光子計數(shù)門控和檢流計控制可以使用數(shù)字延遲/脈沖發(fā)生器(由Stanford Research Systems，Inc.提供的Model DG535)進行同步化。通過使用并行寄存器(由DSPTechnologies，Inc.提供的Model PR-604)，一個CAMAC控制器卡(由DSP Technologies，Inc.提供的Model 6002)和一個PC適配器卡(由DSP Technologies，Inc.提供的Model PC-004)，可以實現(xiàn)與個人電腦29的交流。
在可選擇的實施方案中，一個帶通，凹口，或濾光器被置于一個或所有光束通路中(如，基諧波，第二諧波等)，允許，例如，更寬的光譜帶寬或更多光通量。
在可選擇的實施方案中，一個界面，凹口通路，帶通，反射，或吸收濾光器可以被用于代替附圖中的濾光器以使基諧波或非線性光束通過或被阻斷。
根據(jù)另一個實施方案，通過使用一個電荷耦合檢測器(CCD)代替光電倍增管或其它光電檢測器來檢測非線性光束。CCD亞系統(tǒng)與電腦內(nèi)裝配的數(shù)據(jù)采集板互通并被其控制。數(shù)據(jù)采集板可以是本領(lǐng)域熟知的類型，例如Computer Boards Inc.生產(chǎn)的CIO-DAS16/Jr。例如，數(shù)據(jù)采集板和CCD亞系統(tǒng)可以下述方式運行。數(shù)據(jù)采集板通過將時鐘信號傳送至CCD亞系統(tǒng)來控制CCD集成周期(integration period)。在一個實施方案中，CCD亞系統(tǒng)設(shè)置CCD集成周期為4096時鐘周期。通過改變時鐘頻率，CCD集成數(shù)據(jù)的實際時間可以被控制。在一個集成周期中，每個光電二極管聚集的電荷與到達所述光電二極管的光線量成比例。集成周期結(jié)束時，電荷轉(zhuǎn)移到CCD的移位寄存器，并且開始一個新的集成周期。移位寄存器以電壓的形式存貯電荷，代表CCD陣列上入射的光線模式。然后電壓以時鐘頻率傳送到數(shù)據(jù)采集板，在此它們被數(shù)字化并且存儲在計算機內(nèi)存中。以這種方式，在每個集成周期中，一個樣品帶被成像。其后，一個后續(xù)的行進行集成，直至樣品被完全掃描。
在一個特定實施方案中，在兩個或多個光譜點或帶，使用單色器，濾光器，或其它波長選擇性設(shè)備，通過測量非線性輻射(如，第二諧波輻射)對一個樣品的非線性光譜進行測量。
在一個特定實施方案中，一個單色器(60)可被置于所述設(shè)備中檢測元件之前，以對非線性光學(xué)輻射進行光學(xué)解析(附圖1)。
在一個特定實施方案中，現(xiàn)有技術(shù)(Peleg et al.，“Nonlinearoptical measurement of membrane potential around singlemolecules at selected cellular sites，”Proc.Natl.Acad.Sci.V.96，1999，6700～6704，或Campagnola et al.，“High-resolution nonlinear optical imaging of live cells by secondharmonic generation，”Biophysical Journal 77(6)，3341～3349(1999))中描述的成像技術(shù)可以通過使用SHG標(biāo)記的組分(例如標(biāo)記的配體或受體)代替現(xiàn)有技術(shù)中使用的膜插入性染料進行。使用SHG標(biāo)記的組分，所述成像技術(shù)可被用于成像固體表面，細胞表面或其它界面。
在一個特定實施方案中，通過正位移(displacement)，抽吸，電泳方式或其它現(xiàn)有技術(shù)已知的方式控制組分流入或流出反應(yīng)室，通道(或微觀流體)可被用于將組分導(dǎo)入樣品室。
在一個特定實施方案中，所述裝置可以被裝配進用戶關(guān)閉的產(chǎn)品，使用用戶控制的界面(一個LED板，例如基于個人電腦的軟件)，所述界面帶有插入或去除可拋棄的基材(如，生物芯片)的選項，所述可拋棄的基材帶有附著的探針。
在一個特定實施方案中，一個附圖1中的光電二極管，雪崩光電二極管，或其它光電檢測器(65)可被用作光檢測手段。
在一個特定實施方案中，可以使用一個固定位置的表面陣列，并且使用本領(lǐng)域熟知的方法掃描表面上的入射光，例如檢流計鏡或多邊形鏡。
可選擇的實施方案包括一種掃描或成像方法，所述方法中樣品中非線性輻射的物理性質(zhì)作為位置(x，y，z)的函數(shù)被測量。掃描方法可以包括臺平移(x-y)和光束掃描的組合，例如，其中后者控制陣列表面上基諧波光束的入射位置。
在一個特定實施方案中，一個止流混合室被用于迅速混合樣品室中的組分。
在一個特定實施方案中，通過使用另一種方法，例如靶的放射性標(biāo)記或熒光標(biāo)記，測量靶濃度來確定比例常數(shù)(第二諧波光強度對結(jié)合于附著探針的靶的濃度的校準(zhǔn)曲線)。一旦校準(zhǔn)曲線已知，對于一個給定的探針和靶類型(如，cDNA，RNA，寡核苷酸大小等)，結(jié)合的靶的濃度可以使用所述關(guān)系和測量到的第二諧波強度進行確定。本實施方案可被普及到任何其它由樣品發(fā)出的非線性光束，包括第三諧波，和頻或差頻光。
在一個特定實施方案中，非線性光學(xué)的，表面選擇性裝置可以包括一個不帶有激發(fā)光源(如，帶有樣品室，濾光器，檢測器，單色器，計算機界面，軟件，或其它部分)的單元，以使用戶可以自己提供激發(fā)光源并且將其應(yīng)用于這里所述的方法。
在可選擇的實施方案中，可測量信息可以被實時記錄。
在本發(fā)明中使用表面選擇性非線性光學(xué)技術(shù)的裝置的各種構(gòu)型檢測探針-靶反應(yīng)或其效果的裝置可以采取多種構(gòu)型。以其最簡單的形式，所述裝置將包括下列i)一個基諧波光源ii)測量第二諧波或其它非線性光束強度的檢測器。
所述裝置更精細的版本將使用，例如一個單色器(用來選擇波長)，一個濾過器，濾光器，干涉器或其它光譜濾光器(用來選擇波長或?qū)⒒C波與高諧波分開)，一個或多個偏振光學(xué)器件，應(yīng)用電場的工具，一個或多個指引和聚焦光線的鏡片或透鏡，電腦控制器，軟件，等等。
傳送或產(chǎn)生非線性光線(如，SHG)的模式可以基于下述方法中的一種或多種TIR(全內(nèi)反射)，纖維光學(xué)(有或沒有附著的珠子)，透射(基諧波透過透過樣品)，反射(基諧波從樣品反射)，掃描成像(允許人們掃描樣品)，共焦成像或掃描，用于能量累積的共振腔，多路結(jié)構(gòu)。
測量的信息可以采取包括一個或多個下述參數(shù)的向量的形式{光強度(一般，通過PMT或光電二極管轉(zhuǎn)化為光電壓)，光的波長(使用單色器和/或濾光器確定)，時間，基材位置(用來排列樣品，例如，其中不同亞樣品作為基材位置的函數(shù)編碼，并且將基諧波導(dǎo)向各個(x，y)位置}。所述裝置的兩個一般構(gòu)型是成像掃描(基材成像-強度，波長等，作為x，y坐標(biāo)的函數(shù))和分光鏡(為某些平面或細胞，脂質(zhì)體或其它顆粒懸浮物測量強度，波長，等)。
基諧波光束可以通過多種途徑傳送到樣品。附圖12-16是傳送基諧波和產(chǎn)生第二諧波光束的不同模式的示意圖?？梢哉J為，在和頻和差頻構(gòu)型中，基諧波光束將由兩種或多種光束組成，并將在界面產(chǎn)生差頻光束或和頻光束。為達到舉例說明的目的，這里僅僅詳細描述產(chǎn)生第二諧波的情況。而且應(yīng)該明確，在所有情況下，為了選擇界面間相互作用容積的精確位置，樣品室3可以裝配到平移臺(1-，2-或3-維自由度)。在所有情況下，樣品室可以裝配有流送口和管，以用來引入(或沖洗)例如分子，顆粒，細胞，等組分。
透射附圖12A是依賴于基諧波和第二諧波光束透射的構(gòu)型的示意圖。基諧波320(ω)透過樣品室330，并且在一個體積單元(由圓圈表示)內(nèi)相互作用，所述體積單元中包括一個或多個能夠產(chǎn)生第二諧波光束325(2ω)的界面?；C波和第二諧波光束基本上在一條直線上，如光線325所示。樣品室可以包括在一些基質(zhì)中懸浮的珠子，顆粒，脂質(zhì)體，生物細胞等，提供能夠產(chǎn)生響應(yīng)基諧波的第二諧波的界面區(qū)域。如圖所示，第二諧波被檢測到與基諧波在一條直線上，但是也可以從與基諧波成角度的方向上檢測到，例如與基諧波光束成90°。
附圖12B是另一個依賴于基諧波和第二諧波光束透射的構(gòu)型的示意圖。將基諧波335傳遞到一個樣品室345，并且第二諧波在上表面產(chǎn)生-所述表面可以用固定化探針或吸附的顆粒，脂質(zhì)體，細胞等衍生化。在上表面和細胞中包含的基質(zhì)的界面上，第二諧波340在以一個圓圈表示的一個體積單元內(nèi)產(chǎn)生。
附圖12C是基本上與附圖2A中描述的構(gòu)型相似的示意圖，除了樣品室3的底面，而不是上表面，被用來產(chǎn)生第二諧波。
全內(nèi)反射附圖13A是一個波導(dǎo)管4的示意圖，所述波導(dǎo)管可以作為全內(nèi)反射波導(dǎo)管折射基諧波365并且將其導(dǎo)向波導(dǎo)管380和樣品室375之間界面的位置。在用一個圓圈表示的所述位置，基諧波將會產(chǎn)生第二諧波，并且進行全內(nèi)反射；第二諧波將與基諧波基本上共線傳播并脫離棱鏡380。一般，波導(dǎo)管380與空氣接觸。在本附圖中，波導(dǎo)管380是一個Dove棱鏡。
附圖13B是一個與附圖13A中描述的構(gòu)型相似的示意圖，除了波導(dǎo)管400使得能夠有波導(dǎo)管4和樣品室395之間全內(nèi)反射的多重點，增加基諧波光束產(chǎn)生的第二諧波光的量。
纖維光學(xué)附圖14描述了傳送或收集基諧波或第二諧波光束的纖維光學(xué)方法的多種構(gòu)型。在附圖14A中，描述了一個基諧波源和纖維光學(xué)器件之間的耦合元件410。基諧波，由此耦合到纖維光學(xué)波導(dǎo)管405中，傳送到一個樣品室415。在附圖14A中，纖維的尖端可以作為能夠產(chǎn)生第二諧波的目標(biāo)界面，或所述尖端可以僅僅將基諧波導(dǎo)入到包括懸浮細胞，顆粒等的樣品室。在附圖14A中，第二諧波光通過纖維光學(xué)器件反向收集。
附圖14B除了一個珠子附著于纖維光學(xué)器件(根據(jù)本領(lǐng)域熟知的手段)尖端外與附圖14A完全相同。所述珠子可以加強第二諧波光的收集效率或用探針或吸附的物質(zhì)衍生化，并與樣品室425的基質(zhì)呈現(xiàn)可以產(chǎn)生第二諧波光的界面。
附圖14C除了使用一個立體角檢測器450影響第二諧波光的收集外，與附圖14A和14B完全相同。
光學(xué)共振腔光學(xué)共振腔被定義為在至少兩個反射元件之間，并且沿著腔內(nèi)光路有腔內(nèi)光束。所述光學(xué)腔或共振器由兩個或多個排列的反射鏡面組成，以便捕捉入射光，并使其在反射鏡之間來回反射。這樣，腔內(nèi)的光線可以在量級上比入射光強好幾倍。這種現(xiàn)象眾所周知，并且在不同方面得到應(yīng)用(參見，例如Yariv A.″Introduction to OpticalElectronics″，2d Ed.，Holt，Reinhart and Winston，NY 1976，第8章)。相同的樣品室可以存在于光學(xué)腔內(nèi)或在光學(xué)共振腔之外。
附圖15是一個光學(xué)共振能量累積腔構(gòu)型的示意圖。附圖15A是一個光學(xué)共振腔的圖表，其中樣品室465置于腔內(nèi)，并且基諧波和第二諧波透射過樣品室465-一個對于含有懸浮顆粒，細胞，珠子等的樣品室有用的構(gòu)型?；C波455進入反射光學(xué)器件460的光學(xué)共振腔，并且在反射器件460和462(腔內(nèi)光束)之間累積能量。反射鏡460優(yōu)選是傾斜的(不與入射基諧波455的方向垂直)，以防止腔內(nèi)光束反射回光源。460和462的天然反射率和透射率可以被調(diào)整，以使基諧波在腔內(nèi)累積到合適的能量水平?；C波在樣品室由一個圓圈表示的體積單元內(nèi)產(chǎn)生第二諧波光。反射光學(xué)器件460可反射基諧波和第二諧波，但反射光學(xué)器件462可以基本上反射基諧波，但是允許隨后檢測到的第二諧波475透過。美國專利U.S.Pat.No.5,432,610(Kinget al.)描述了用于化學(xué)傳感的二極管-泵(pumped)能量累積腔，并且所述專利及其中的參考文獻在此以參考文獻的形式并入本發(fā)明。
附圖15B是一個光學(xué)共振能量累積腔構(gòu)型的示意圖，其中基諧波475通過從光學(xué)器件480的反射進入光學(xué)腔。第二反射光學(xué)器件482詳細說明光學(xué)共振腔。器件490是一個波導(dǎo)管(例如一個棱鏡)，與樣品室485接觸，并且在波導(dǎo)管和樣品室表面的界面上允許基諧波全內(nèi)反射，產(chǎn)生第二諧波光。器件482基本上反射基諧波，但是使隨后檢測到的第二諧波495透過。
反射附圖16A是涉及基諧波和第二諧波光束反射的構(gòu)型的示意圖。基質(zhì)525涂覆有一薄層反射材料520，例如金屬，并且在此之上沉積有適合附著探針或吸附顆粒，細胞等(例如，SiO2)的層515。該層與樣品室510接觸。基諧波500透過樣品室510，并且在層515和層520之間的界面產(chǎn)生第二諧波。基諧波和第二諧波505從層520的表面反射回來。
附圖16B基本上與附圖15A相同，除了第二諧波和基諧波光束是從樣品室540含有的基質(zhì)和層545之間的界面反射的535。層545是沉積到基質(zhì)550上的反射性或部分反射性涂層，并且適合吸附顆粒，細胞等或附著探針。
附圖16C顯示一個示意圖，顯示只有樣品室565需要被用于反射幾何形狀。樣品室565部分充滿一些基質(zhì)570，并且基諧波和第二諧波光束是從表面570的氣-液或蒸汽-液體界面反射的560。
檢測方式當(dāng)期望信息作為基質(zhì)位置(x，y)的函數(shù)時，電荷耦合檢測器(CCD)陣列檢測器特別有效。CCD包括一個象素陣列(也就是，光電二極管)，其中每個象素可以獨立測量照射于其上的光線。對一個給定的裝置的幾何形狀，起于一個特定基質(zhì)位置(x，y)的非線性光線可以通過測量非線性光線的強度來確定，所述非線性光線照射于和基質(zhì)有一段距離的CCD陣列位置(Q，R)-這些得以確定是由于與熒光發(fā)射自發(fā)的，隨機的，多方向的性質(zhì)相比，非線性光束是相干的，校準(zhǔn)的(并且通常與基諧波共傳播)。對于CCD陣列，檢測器中的一個或多個陣列元素{Q，R}將映射基質(zhì)表面的特定區(qū)域，允許輕松確定作為基質(zhì)位置(x，y)函數(shù)的信息。光電二極管檢測器和光電倍增管(PMTs)，雪崩光電二極管，光敏晶體管，真空光電二極管或用來將入射光轉(zhuǎn)化為電信號(也就是，電流，電壓等)的其它現(xiàn)有技術(shù)已知的檢測器也可以用來檢測光線強度。對于CCD檢測器，CCD與裝在設(shè)備電腦中的數(shù)據(jù)采集板互通并受其控制。數(shù)據(jù)采集板可以是現(xiàn)有技術(shù)熟知的類型，例如ComputerBoards Inc.生產(chǎn)的CIO-DAS16/Jr。例如，數(shù)據(jù)采集板和CCD子系統(tǒng)可以下述方式工作。數(shù)據(jù)采集板通過向CCD子系統(tǒng)發(fā)送時鐘信號控制CCD集成周期。在一個實施方案中，CCD子系統(tǒng)設(shè)置CCD集成周期為4096時鐘周期。通過改變時鐘頻率，CCD集成數(shù)據(jù)的實際時間可以被控制。在一個集成周期內(nèi)，每個光電二極管聚集的電荷與到達所述光電二極管的光線量成比例。集成周期結(jié)束時，電荷轉(zhuǎn)移到CCD的移位寄存器，并且開始一個新的集成周期。移位寄存器以電壓的形式儲存電荷，代表CCD陣列上入射的光線模式。然后電壓以時鐘頻率傳送到數(shù)據(jù)采集板，在此它們被數(shù)字化并且存儲在計算機內(nèi)存中。以這種方式，在每個集成周期中，一個樣品帶被成像。其后，一個后續(xù)行進行集成，直至樣品被完全掃描。
樣品基質(zhì)和樣品室樣品基質(zhì)和室可以具有一個或多個下述特征中的多種形式，但不限制于此完全封閉的，封閉的或非封閉的并與流動池和泵連接，將基質(zhì)與全內(nèi)反射棱鏡結(jié)合以允許非線性光束的短暫產(chǎn)生，基質(zhì)與共振腔結(jié)合用于基諧波能量累積，一個允許基諧波多通路的光學(xué)裝置用來增加非線性響應(yīng)，含有懸浮生物細胞，顆粒，珠子等的樣品室。
數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析處理檢測器測量的信息向量。信息可以是時間依賴性的和動態(tài)的。它可以對一種或多種生物成分，抑制劑，拮抗劑，激動劑，藥物，小分子等的濃度是依賴性的，所述濃度在一次測量中或兩次測量之間可以有變化。信息也可以依賴于波長等。通常，通過檢測與樣品中誘導(dǎo)的構(gòu)象變化相關(guān)的非線性光學(xué)性質(zhì)的變化，非線性光線的強度可以轉(zhuǎn)化為一個特定狀態(tài)(例如，一個成分的表面關(guān)聯(lián)濃度或細胞膜上打開或關(guān)閉的離子通道的量)的濃度或量。
數(shù)據(jù)分析的詳細內(nèi)容可以根據(jù)實驗不同而不同?，F(xiàn)有大量文獻在構(gòu)象和熒光強度之間建立聯(lián)系，(參見Glauner et al.，Nature402，813(1999)，Ghanouni et al.，Proc.Natl..Acad.Sci.，v.98，5997(2001)，和Ghanouni et al.，Journal of BiologicalChemistry，v.276，24433(2001)，及其中的參考文獻)。建立了非線性光學(xué)技術(shù)的類似方法。例如，第二諧波光強度的平方根(與光線的電場振幅成比例)與一個樣品中非線性活性物質(zhì)的量乘物質(zhì)超極化率的方向均值成比例。這是一種眾所周知的關(guān)系，可以用于通過非線性光束強度對構(gòu)象變化(并且依次地，對探針的結(jié)合親和力)進行定量。感興趣的反應(yīng)的動力學(xué)和平衡性質(zhì)可以通過測量和合適的數(shù)據(jù)分析確定。
篩選候選結(jié)合配偶體結(jié)合試驗分子的候選結(jié)合配偶體可以通過檢測探針-靶結(jié)合的構(gòu)象變化進行篩選。篩選結(jié)合于試驗分子的一種或多種候選結(jié)合配偶體的方法涉及測量一種或非線性光束的一種或多種物理性質(zhì)，所述光束從所述樣品發(fā)出所述樣品含有試驗分子和一種或多種候選結(jié)合配偶體，其中相對于不存在暴露于一種或多種候選結(jié)合配偶體的情況下測量到的值，非線性光束一種或多種物理性質(zhì)的改變表明發(fā)生了結(jié)合。在一個優(yōu)選的實施方案中，候選結(jié)合配偶體不附著于表面。
本發(fā)明可以使用的探針或靶包括但不限于天然存在的，人工改變的，或遺傳工程的，生物物質(zhì)或非生物物質(zhì)。候選的探針或靶也包括但不限于一種或多種下述組分核酸，蛋白，小分子，有機分子，生物細胞，病毒，分子標(biāo)志，脂質(zhì)體，受體，抗體，激動劑，拮抗劑，抑制劑，半抗原，配體，抗原，卵母細胞，激素，蛋白，肽，受體，藥物，脂類，神經(jīng)節(jié)苷脂，酶，核苷酸，碳水化合物，cDNA，寡核苷酸，核苷，多聚核苷，多核苷酸，脂類，神經(jīng)節(jié)苷脂，寡糖，肽核酸(PNA)，毒素，核酸類似物，離子通道受體，G偶聯(lián)蛋白受體。在一個特定實施方案中，探針可以在基質(zhì)或固體表面上以陣列的形式排列，同時探針的性質(zhì)或化學(xué)性質(zhì)保持恒定或在陣列的區(qū)域內(nèi)變化。
選擇候選結(jié)合配偶體的一個實施方案中，可以將一個外電場應(yīng)用于樣品以引起非線性光學(xué)技術(shù)所需的非中心對稱條件。例如，用非線性活性標(biāo)記進行標(biāo)記的蛋白(如，溶解的GPCRs)在電場中可以被部分定向。測量背景非線性光線信號。當(dāng)結(jié)合于蛋白的配體添加到基質(zhì)中時，它觸發(fā)蛋白的構(gòu)象變化(對該領(lǐng)域技術(shù)人員熟知)，導(dǎo)致非線性光線信號性質(zhì)的改變(如，強度的變化)。所述方案在篩選結(jié)合于蛋白的配體庫(小分子，藥物等)方面非常有用-也就是，高通量藥物篩選。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述蛋白是GPCRs，一種熟知的涉及疾病的蛋白家族，并針對其設(shè)計藥物。藥物可以是以某些方式與受體相互作用(如，結(jié)合)的激動劑，拮抗劑，抑制劑等。下述參考文獻(及其中的參考文獻)描述了可以使用的GPCRs的不同實例。
P.Ghanouni et al.，“Agonist-induced conformational changes in the G-protein-coupling domain of the β2adrenergic receptor”，Proc.Natl..Acad.Sci.，v.98，5997(2001).
P.Ghanouni et al.，“Functionally Different Agonists Induce Distinct Conformationsin the G Protein Coupling Domain of the β2Adrenergic Receptor”，Journal of BiologicalChemistry，v.276，24433(2001).
C.Bieri et al.，“Micropatterned immobilization of a G protein-coupled receptor anddirect detection of G protein activation”，Nature Biotechnology，17，1105(1999).
Helmreich，E.J.M.and Hofmann，KP，“Structure and Function of Proteins in G-protein-coupled signal transfer”，Biochimica et Biophysica Acta 1286，285(1996).
Gether et al.(1995)J Biol Chem 270，28628-28275，F(xiàn)luorescent labeling of purified.beta..sub.2 Adrenergic receptor.
Turcatti et al.(1996)J Biol Chem 271，19991-19998，Probing the Structure andFunction of the Tachykinin Neurokinin-Receptor through Biosynthetic incorporation offlourescent amino acids at specific sites.
Liu et al.(1996)Biochemistry 35，11865-11873，Site-Directed fluorescent labelingof P-glycoprotein on cysteine residues in the nucleotide binding domains.
Lodish，Harvey，et al.，Molecular Cell Biology(4thed.，2000).
篩選調(diào)節(jié)劑本發(fā)明提供一種根據(jù)調(diào)節(jié)測試分子及其結(jié)合配偶體之間相互作用的能力篩選一種或多種候選調(diào)節(jié)分子的方法。以前描述了調(diào)節(jié)劑和抑制劑分子的作用。相對于測試分子不暴露于結(jié)合配偶體時測量到的結(jié)果，從含有測試分子及其結(jié)合配偶體和調(diào)節(jié)劑的樣品發(fā)出的非線性光束的一種或多種物理性質(zhì)的任何變化，是候選調(diào)節(jié)分子調(diào)節(jié)測試分子及其結(jié)合配偶體之間相互作用(也就是，增加或減少結(jié)合)能力的指示。
例如，本發(fā)明可被用于監(jiān)控基因表達或涉及藥物篩選或高通量篩選的研究，其中測試候選藥物的結(jié)合，或其對探針-靶結(jié)合的影響，也就是，減少或增強探針-靶結(jié)合。在其它情況下，例如，可以通過一種藥物結(jié)合于生物細胞表面上受體或其它分子的能力測試其功效。在另一個特定實施方案中，通過測試阻斷激動劑結(jié)合于受體，篩選作為受體激動劑的潛在抑制劑的化合物，也就是，當(dāng)受體和激動劑與候選抑制劑同時存在時，去除由激動劑誘導(dǎo)的構(gòu)象變化。
在一個特定實施方案中，本發(fā)明被用于藥物篩選或高通量篩選，其中測試一種候選藥物活化或抑制探針(如，受體，離子通道蛋白等)的能力。測試一種候選藥物激活探針中構(gòu)象變化的能力-在這種情況下，人們尋找探針的激動劑。
在可選擇的實施方案中，靶-探針相互作用可以在一些相互作用的調(diào)節(jié)劑存在下測量-所述調(diào)節(jié)劑是，例如在某些方面改變靶-探針相互作用(如，對探針有某些親和力并阻斷或抑制靶的結(jié)合)的小分子，藥物，或其它部分，分子或粒子。使用非線性光學(xué)方法研究調(diào)節(jié)劑對探針-靶結(jié)合的影響，其中已知靶結(jié)合于探針。調(diào)節(jié)劑可以在探針-靶相互作用發(fā)生之前，之中或之后加入。
在一個特定實施方案中，一個生物探針-靶結(jié)合反應(yīng)可以在激動劑，拮抗劑，藥物，或小分子存在下被測量，所述激動劑，拮抗劑，藥物，或小分子可以阻斷，啟動或調(diào)節(jié)所述探針-靶結(jié)合反應(yīng)的結(jié)合強度(如，平衡常數(shù))。本實施方案可以用于許多情況，例如當(dāng)想得知一種藥物阻斷或調(diào)節(jié)一個用于醫(yī)學(xué)或基礎(chǔ)研究的特定探針-靶反應(yīng)的功效時。
檢測構(gòu)象變化可以通過本發(fā)明在界面或主體中研究構(gòu)象變化，其中構(gòu)象變化導(dǎo)致從樣品發(fā)出的一種或多種非線性光束的一種或多種物理性質(zhì)的變化。構(gòu)象變化可以由生物或化學(xué)結(jié)合啟動，或通過生物組分，藥物，小分子，激動劑或拮抗劑結(jié)合于與分子或粒子啟動，并且可以如這里對結(jié)合相互作用所述的進行測定。
在一個特定實施方案中，作為某些探針-靶相互作用的結(jié)果，在具有非線性易感性的界面區(qū)域上發(fā)生方向或偶極矩的變化。一個非線性活性標(biāo)記可以被附著于目標(biāo)探針上，并且探針與某些靶(例如測試其活化探針能力的候選藥物，并由此誘導(dǎo)構(gòu)象變化)在溶液中結(jié)合，導(dǎo)致方向或偶極矩的變化，并且這改變界面區(qū)域的非線性易感性，以及非線性光束的性質(zhì)(如，強度，偏振，波長)。
在另一個實施方案中，通過應(yīng)用外電場(EFISH技術(shù))建立一個非中心對稱區(qū)域。所述區(qū)域可以是界面，主體，或其某些組合。探針或靶(探針，靶或兩者都是非線活性的，其本身是非線性活性的或者使用非線性活性標(biāo)記進行標(biāo)記的)通過電場極化，并由此產(chǎn)生一個背景。當(dāng)探針和靶之間發(fā)生結(jié)合反應(yīng)時，可以激活一種或兩種物質(zhì)的構(gòu)象變化，或?qū)е挛镔|(zhì)偶極矩的變化，導(dǎo)致測量到的非線性光學(xué)信號的變化。
為了與核酸雜交(寡核苷酸，多核苷酸，RNA等)共同使用，靶寡核苷酸可以暴露于一個陣列的表面，所述表面上放置有探針寡核苷酸。在發(fā)生序列互補雜交和伴隨構(gòu)象變化的陣列中(相應(yīng)于已知位置)的探針寡核苷酸序列，基諧波光可以引起非線性光學(xué)信號的變化，或所述信號背景的變化。這些可以被檢測到，并且與陣列元素和寡核苷酸序列的空間位置有關(guān)。例如，核酸微陣列的兩個主要應(yīng)用是1)鑒定序列(基因或基因突變)-例如監(jiān)控DNA變異；和2)確定基因表達水平(豐度)。有許多形式可以用來制備陣列。例如，在一種情況下，使用機器人點樣并且暴露于一組單獨的或混合的靶(R.Ekins，F(xiàn).W.Chu，Trends in Biotechnology，1999，17，217)，探針cDNA(500-5000堿基對長度)可以在例如玻璃等固體表面上被固定化。另一種形式涉及合成寡核苷酸(20-25聚體寡核苷酸)或原位肽核酸探針(在固體基質(zhì)上，F(xiàn)odor et al.，″Light-directed，SpatiallyAddressable Parallel Chemical Synthesis，″Science 251(4995)767-773 1999年2月15日)或通過傳統(tǒng)合成后進行芯片上固定化。所述陣列然后暴露于靶DNA，雜交，并且確定互補序列的性質(zhì)或豐度。
可以制備蛋白陣列(參見例如，G.MacBeath和S.L.Schreiber，″Printing Proteins as Microarrays for High-ThroughputFunction Determination″，Science 2000，289，1760-1763)以確定一個給定靶蛋白是否在表面上結(jié)合于固定化探針蛋白。這些陣列可以用于研究小分子與靶蛋白的結(jié)合。
現(xiàn)有技術(shù)還記載了許多關(guān)于微陣列技術(shù)和應(yīng)用的綜述。例如，那些Ramsay，″DNA chips-states-of-the-art，″NatureBiotechnology 1998，16(1)，40-44(其相關(guān)部分在此作為參考文獻引入)；Marshall et al.，″DNA chips-an array ofpossibilities，″Nature Biotechnology 1998，16(1)，27-31(其相關(guān)部分在此作為參考文獻引入)；S.A.Fodor，Science 277(1997)，393(其相關(guān)部分在此作為參考文獻引入)；D.H.Duggan et al.，Nature Genet.21(Suppl.)(1999)，10(其相關(guān)部分在此作為參考文獻引入)；M.Schena et al.，Science 270(1995)，467(其相關(guān)部分在此作為參考文獻引入)；L.McAllister et al.，Am.J.Hum.Genet.61(Suppl.)(1997)，1387(其相關(guān)部分在此作為參考文獻引入)；和A.P.Blanchard et al.，Biosens.AndBioelectron.11(1996)687(其相關(guān)部分在此作為參考文獻引入)。
構(gòu)象變化也允許利用表面選擇性非線性光學(xué)技術(shù)，通過測量結(jié)合誘導(dǎo)的構(gòu)象影響，研究探針和靶之間結(jié)合的程度或范圍。在一個特定實施方案中，用非線性活性標(biāo)記進行標(biāo)記的探針附著于固體表面或基質(zhì)上。當(dāng)探針與靶結(jié)合時，探針的構(gòu)象發(fā)生變化，并且就表面而言標(biāo)記的方向和基諧波光束也發(fā)生變化。在一個優(yōu)選實施方案中，候選結(jié)合配偶體(探針)不附著于表面。在另一個實施方案中，非線性活性標(biāo)記或部分在體外附著于靶或探針分子。探針-靶結(jié)合的程度可以通過測量的非線性光學(xué)輻射的性質(zhì)(如，強度)的變化量相互聯(lián)系。例如，標(biāo)記的寡核苷酸根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方式附著于固體基質(zhì)，并且暴露于靶以測試雜交。當(dāng)對靶的雜交發(fā)生時，寡核苷酸上標(biāo)記的方向發(fā)生變化?？梢允褂矛F(xiàn)有技術(shù)已知的微陣列(在不同表面位置的不同寡核苷酸序列)或有相同寡核苷酸序列的基質(zhì)。本發(fā)明另一個示范性實施方案是，表面附著蛋白和靶-其它蛋白，配體等之間的結(jié)合，其中結(jié)合反應(yīng)觸發(fā)構(gòu)象變化。通常，可以使用本發(fā)明研究任何表面附著物質(zhì)，所述表面附著物質(zhì)與其它任何物質(zhì)或刺激物結(jié)合或相互作用時經(jīng)歷構(gòu)象變化。進一步，當(dāng)使用對電荷密度或其變化的微小變化敏感的指示劑時，表面附著探針不需要標(biāo)記。如果探針的構(gòu)象變化導(dǎo)致表面上電荷排列的變化-甚至所述變化是暫時的-靠近界面的指示劑可以用來檢測那些變化并報告構(gòu)象變化。
如上所述，在一個特定實施方案中，一個MB類似物探針被用于檢測結(jié)合的程度或范圍。例如，通過用非線性活性標(biāo)記對分子標(biāo)志探針進行標(biāo)記，并且測量在某些界面上，或在主體內(nèi)標(biāo)記方向是否改變(通過非線性光強度的變化)，人們可以研究靶鏈?zhǔn)欠窕パa以及它們互補的程度，這是由于非線性光強度中測量到的變化量可以與雜交程度相關(guān)。在一個特定實施方案中，一個Au毫微粒被用于增強非線性光輻射的強度，例如當(dāng)所述毫微粒和唑染料相互接近時，由唑染料散射產(chǎn)生的第二諧波呈若干數(shù)量級。當(dāng)探針與一個互補靶雜交時，非線性光輻射的強度減少，并且這種減少與探針-靶雜交量有定量關(guān)系。在其它參數(shù)中，本技術(shù)的靈敏度通過雜交發(fā)生前非線性光信號背景進行確定。
使用本發(fā)明的其它方案雖然本發(fā)明可被應(yīng)用于許多科學(xué)分析領(lǐng)域并且具體而言在化學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域，本發(fā)明在藥物開發(fā)或基礎(chǔ)研究中特別有用，其中測試化合物(靶)的結(jié)合和活化探針的能力，其中探針是離子通道蛋白，GPCR蛋白，或其它受體，或其它分子。
裝置具有廣泛的適應(yīng)性。在固定位置的掃描，成像，檢測技術(shù)等都可以方便地與本發(fā)明一同使用。本領(lǐng)域中掃描微陣列包括基于共焦的方案和基于非共焦的方案。U.S.Pat.No.5,834,758(Trulson等-其相關(guān)部分在此作為參考文獻引入)描述了一種使用熒光檢測的基于非共焦的微陣列成像方案。然而，樣品的放置應(yīng)該非常平坦，以使僅僅在一個單一焦平面成像，以得到良好的面外分辨率。因此，為達到這種目的，優(yōu)選應(yīng)用一種需要特定組分的精確調(diào)節(jié)的平移臺，導(dǎo)致設(shè)備的成本增加，其壽命也可能增加。所述類型裝置的成像質(zhì)量可以對機械振動敏感。而且，面外(非表面結(jié)合的)熒光團的分辨率對本技術(shù)的靈敏度產(chǎn)生限制。U.S.Pat.No.6,134,002(Stimson等-其相關(guān)部分在此作為參考文獻引入)是使樣品平面，也就是一個微陣列，成像的共焦掃描顯微鏡裝置的一個例子。雖然基于共焦的技術(shù)有良好的深度分辨率，但由于反掃描(descanning)的要求而掃描速度低，并且光通量低，減少總信噪比和本技術(shù)的靈敏度。
本發(fā)明可用于研究其它生物組分之間的結(jié)合過程細胞和病毒；蛋白-蛋白相互作用；蛋白-配體；細胞-配體；蛋白-藥物；核酸-藥物，細胞-小分子；細胞-核酸；肽-細胞；寡核苷酸或多核苷酸，病毒-細胞，蛋白-小分子等，以及通常任何導(dǎo)致構(gòu)象變化的結(jié)合反應(yīng)。仿生膜例如磷脂支持雙層(如，卵磷脂酰膽堿)也可以被應(yīng)用，并且對涉及膜蛋白探針的研究特別有用。
通過直接標(biāo)記或使用對探針或靶有結(jié)合親和力且本身固有或被提供非線性活性的修飾分子或其他候選物，可以使探針，靶，受體等成為非線性活性(使其超級化)，并且由于將修飾物與探針或靶結(jié)合的分子鍵，該修飾分子或候選物可以通過移位響應(yīng)探針或靶的構(gòu)象變化。一個受體的抗體是所述修飾分子的例子。所述修飾分子可以本身阻斷受體的活性區(qū)域，以使?jié)撛诩觿?，抑制劑，活化劑，等可以結(jié)合到受體上并產(chǎn)生作用。
本發(fā)明應(yīng)用的另一個例子是標(biāo)記受體或?qū)δ承┎《居杏H和力的其它組分。當(dāng)病毒與受體或其它組分結(jié)合或相互作用時，所述相互作用可以影響就基諧波光束方向而言標(biāo)記的方向，并由此改變測量到的非線性光線的性質(zhì)(如，非線性光線的強度)。
本技術(shù)與陣列應(yīng)用的其它例子包括細胞陣列，有或沒有膜或附著蛋白等的支持脂類雙層陣列。本領(lǐng)域存在許多將生物分子(如，核酸，蛋白和細胞)與陣列形式的固體支持物偶連的方法。廣泛的靈活度可以用于提供建立陣列的方法。它們可以涉及，例如，直接與基質(zhì)，化學(xué)衍生的基質(zhì)，某些類型的中間層(如自組裝的單層，水凝膠或其它本領(lǐng)于已知的生物相容性層)共價或非共價偶聯(lián)。探針(如，蛋白結(jié)構(gòu)或寡核苷酸序列)的性質(zhì)可以在固體表面上根據(jù)位置不同而不同，或同種探針可以均勻地覆蓋表面。靶可以具有一種單獨特征或是不同特征靶的組合。陣列可以通過各種途徑制備，包括但不限于噴墨印刷，光刻法，微接觸印刷(micro-contact printing)，或任何其它制造它們的領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的方式。
由于非線性光學(xué)技術(shù)的表面選擇性，結(jié)合過程可以被實時并且在主體生物成分存在時被測量，可以測量平衡結(jié)合曲線和動力學(xué)，組分的主體濃度可以變化，并且由于使用基于熒光的檢測，除去未結(jié)合組分的“沖洗”步驟可以是不必要的。
設(shè)計裝置時可以有廣泛的靈活度，所述裝置包括但不限于，基諧波光源，必需進行控制的光列，聚焦或傳送基諧波和非線性光束，陣列的設(shè)計，檢測系統(tǒng)，使用光柵或濾光器和收集光學(xué)器件。產(chǎn)生(輻射)或收集的模式可以變化，包括，例如使用損耗波(全內(nèi)反射)，平面波導(dǎo)管，反射，或透射幾何學(xué)，纖維光學(xué)器件，近場照射，共焦技術(shù)或使用累積能量的微腔，或集成檢測系統(tǒng)如累計球。許多在固體表面上掃描微陣列的方法可以被改變以適合應(yīng)用。例子包括Trulson等的U.S.Pat.No.′s 5,834,758(1998)，Trulson等的6,025,601(2000)，Stern等的5,631,734(1997)，和Sampas(2000)的6,084,991-其相關(guān)部分作為參考文獻在此引入。
因為第二諧波光束對表面平面產(chǎn)生一個特定的角度，人們可以讀出非線性光學(xué)輻射的性質(zhì)，例如，在兩維陣列形式中，作為基諧波入射位置的函數(shù)，不需要機械地平移檢測器或樣品，并且不需要大量收集光學(xué)器件。在“光束掃描”的實施方案中，不需要機械平移樣品表面或檢測器-僅僅是樣品上基諧波入射方向和/或角度的變化(對于固定的樣品和檢測器)-所述裝置提供更加快速的掃描能力，增加了制造的方便性并延長壽命。
當(dāng)使用本發(fā)明研究界面時，界面可以包括硅石，玻璃，硅，氮化硅，聚苯乙烯，尼龍，塑料，金屬，半導(dǎo)體或絕緣表面，或任何其混合，或任何探針例如生物組分可以吸附或附著的表面。界面也可以包括生物細胞和脂質(zhì)體表面。附著和固定化可以通過本領(lǐng)域熟知的各種技術(shù)進行。例如，寡核苷酸可以通過″Microarray BiochipTechnology″，M.Schena(Ed.)，Eaton Publishing，1998描述的技術(shù)制備-其相關(guān)部分在此作為參考文獻引入。并且，例如對于蛋白，表面可以用乙醛硅衍生化以與生物分子的表面上的胺偶聯(lián)(G.MacBeath和S.L.Schreiber，″Printing Proteinsas Microarraysfor High-Throughput Function Determination″，Science2000，289，1760-1763-其相關(guān)部分在此作為參考文獻引入)。也可以使用BSA-NHS(BSA-N-羥基琥珀酰亞胺)表面，首先將BSA分子層附著到表面，然后用N，N′-雙琥珀酰亞胺碳酸酯將其活化。BSA上活化的賴氨酸，天冬氨酸，谷氨酸殘基與蛋白上的表面胺反應(yīng)。
本發(fā)明可以應(yīng)用于全部分子或單一分子-也就是，全部反應(yīng)測量或單一分子反應(yīng)測量。
有或沒有膜蛋白或其它膜結(jié)合成分存在時，也可以使用支持磷脂雙層，例如，Salafsky et al.，Architecture and function ofmembrane proteins in planar supported bilayersA study withphotosynthetic reaction centers″Biochemistry 35(47)14773-14781(1996)-其相關(guān)部分在此作為參考文獻引入，″Biomembranes″，Gennis，SpringerVerlag，Kalb et al.，1992和Brian et al.，″Allogeneic Stimulation of Cyto-toxic T-cellsby Supported Planar Membranes，″PNAS-Biological Sciences 81(19)6159-6163(1984)-其相關(guān)部分在此作為參考文獻引入。支持磷脂雙層在本領(lǐng)域熟知，并且現(xiàn)有許多制造它們的技術(shù)，所述支持磷脂雙層有或沒有膜蛋白存在。這些支持雙層通常應(yīng)該浸入水溶液以阻止它們暴露于空氣中時被破壞。
探針可以是生物細胞，脂質(zhì)體，珠子等的一部分，它們天然形成一個界面，所述界面由于它們的尺寸可以產(chǎn)生非線性光學(xué)輻射(雖然它們名義上是中心對稱的，但它們的直徑具有可見光譜中波長的量級，并且根據(jù)該領(lǐng)域熟知的技術(shù)允許產(chǎn)生非線性光線)。可選擇地，探針可以是分子或顆粒(如，溶解于去污劑的受體)，通過應(yīng)用電場誘導(dǎo)其定向?，F(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)熟知，使用電場以產(chǎn)生一個能夠產(chǎn)生非線性輻射的-如第二諧波，和頻或差頻產(chǎn)生的非中心對稱區(qū)域。所述現(xiàn)有技術(shù)的一個方面通常被稱作′EFISH′-電場誘導(dǎo)的第二諧波產(chǎn)生。在一個特定實施方案中，一個適用的電場用于在一個區(qū)域內(nèi)極化分子以在一個相或一種物質(zhì)中建立一種有序的(非中心對稱)區(qū)域；得到的區(qū)域然后可以產(chǎn)生非線性光學(xué)輻射。
在一個特定實施方案中，探針-靶雜交可以通過在有表面附著探針的基質(zhì)上的某些位置檢測非線性光線(如第二諧波光)的強度測量；當(dāng)標(biāo)記的靶與表面上探針結(jié)合時，第二諧波光的強度發(fā)生變化，并且由于結(jié)合變?yōu)椴糠侄ㄏ?，因此滿足在界面產(chǎn)生第二諧波光的非中心對稱條件?？梢酝ㄟ^許多方法完成用界面上探針-靶結(jié)合復(fù)合物濃度模擬光強度，例如通過使用放射性標(biāo)記或熒光標(biāo)記校準(zhǔn)給定探針-靶相互作用的技術(shù)?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法控制靶對表面的非特異性結(jié)合，例如i)特意添加非互補靶并測量表面選擇性非線性光學(xué)信號，或ii)添加已知阻止探針-靶結(jié)合的阻斷劑，添加互補靶并測量得到的表面選擇性非線性光學(xué)信號。在情況i)中，添加非互補靶時，表面選擇性非線性光學(xué)信號的變化顯著低于添加互補靶時的變化。在情況ii)中，存在阻斷劑時的信號變化顯著低于沒有阻斷劑時的信號變化。
6.實施例實施例6.1一個分子標(biāo)志類似物(MB類似物)寡核苷酸，偶聯(lián)到一種非線性活性染料，并被純化，從例如Midland Certified Reagent Company(Midland，TX)的商業(yè)途徑購買。使用的非線性活性唑染料是通過3’端的胺基附著的唑(SE)1-(3-(琥珀酰亞胺基氧基羰基)芐基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)唑-2-基)溴化吡啶(PyMPO，SEMolecular Probes Corp.)。
將寡核苷酸置于EFISH室的樣品孔中?，F(xiàn)有技術(shù)中存在多種EFISH室。使用文獻C.G.Bethea(′Experimental technique of dc inducedSHG in liquidsmeasurements of the nonlinearity of CH2I2″，Applied Optics 1975，14，1447)中描述的樣品室。適用電場的方向與激光束的電場平行。一種商業(yè)豪微微秒鎖模系統(tǒng)(Mira 900 andVerdi 5W)被用作基諧波源?；C波被導(dǎo)入電極之間的室區(qū)域。使用濾光器阻斷反向反射的第二諧波進入振蕩器；使用濾光器阻斷樣品外的基諧波光。使用平面-凸透鏡(Melles Griot Inc.)收集第二諧波光并聚焦于單色器(CM110 CVI Laser)。使用帶有Bertan電源的Hamamatsu光電倍增管檢測光線。光電倍增管的信號被送到StanfordResearch Systems SR400光子計數(shù)單元，并且使用個人電腦處理。使用Bertan電源施加電場，并且使用家用電子設(shè)備脈沖電并使其與激光脈沖同步化。
當(dāng)有電場時，染料標(biāo)記的MB類似物探針通過應(yīng)用電場極化。通過對比不存在和存在靶時極化的MB類似物的平均第二諧波強度，可以測量靶對MB類似物的結(jié)合親和力(或如果親和力未知，則為序列)。不存在靶時的SHG信號代表測量背景，作為“基線”與靶存在時的信號比較。
添加完全互補靶時，MB類似物探針被活化并導(dǎo)致構(gòu)象變化，及由此產(chǎn)生的非線性活性染料的平均方向的變化。由于測量到的SHG光線強度與非線性活性染料的平均方向成比例，染料方向的改變導(dǎo)致第二諧波光束強度的變化。對MB類似物探針序列不完全互補的靶將以較低的親和力與MB類似物探針結(jié)合，并由此活化較少部分MB類似物探針分子和引起較少量構(gòu)象變化。結(jié)合親和力和第二諧波光束強度之間的關(guān)系可以方便地根據(jù)本領(lǐng)域已知方法顯示出來，所述方法涉及相對于非線性活性物質(zhì)濃度的非線性強度的變化。
實施例6.2β2腎上腺素能受體，一種GPCR蛋白，根據(jù)熟知的方法(如，Ghanouni et al.，98(11)5997PNAS)被純化并用去污劑溶解。所述蛋白在內(nèi)源半胱氨酸(Cys-265)上用1-(2，3-環(huán)氧丙基)-4-(5-(4-甲氧苯基)唑-2-基)三氟甲磺酸吡啶(PyMPO環(huán)氧化物，Molecular Probes)，即一種非線性活性染料根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法以1∶1化學(xué)計量標(biāo)記，并使用Ghanouni et al.，98(11)5997PNAS的工作作為指導(dǎo)。所述非線性活性染料附著于蛋白的部分，所述蛋白活化時進行構(gòu)象變化。分離非共價結(jié)合染料后，將受體置于位于兩個電極之間的基質(zhì)中，并將一束基諧波(如，TiSapphire系統(tǒng)的約1W平均能量，約150fs脈沖的輸出，例如Coherent Inc.的Verdi-Mira commercial system)通過所述基質(zhì)。所述裝置和樣品制備(如，應(yīng)用電場，電場誘導(dǎo)的第二諧波產(chǎn)生-EFISH)對所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的-使用標(biāo)準(zhǔn)光學(xué)器件將基諧波聚焦到樣品上并且收集第二諧波輻射。附圖18描述設(shè)備裝配，附圖17描述應(yīng)用電場的樣品固定器。根據(jù)附圖17應(yīng)用電場橫跨基質(zhì)，部分對準(zhǔn)受體及其結(jié)合染料，并建立觀察SHG必須的非中心對稱條件。在400nm測量背景信號強度，使用濾光器(BG-39，CVI Laser)阻斷基諧波，使用單色器選擇波長(CM110，CVI Laser)，一個PMT(Hamamatsu)和單光子計數(shù)電子設(shè)備(SR-400，Stanford Research Systems)。選擇400nm波長以通過染料的電子躍遷產(chǎn)生共振增強效果。將配體添加到基質(zhì)中-例如一種測試結(jié)合的候選藥物；如果配體(藥物)結(jié)合到受體上，則誘導(dǎo)探針(受體)的構(gòu)象變化，并由此改變非線性光學(xué)信號的強度。已知配體(異丙基腎上腺素)和部分激動劑(腎上腺素，沙丁胺醇和多巴酚丁胺)被用于校準(zhǔn)由構(gòu)象變化量，也就是結(jié)合親和力，帶來的非線性光學(xué)響應(yīng)。
在可選擇的實施方案中，標(biāo)記反應(yīng)可以使用各種偶聯(lián)化學(xué)和/或化學(xué)計量學(xué)(標(biāo)記探針)進行，以確定哪種偶聯(lián)化學(xué)在非線性光學(xué)測量中提供最優(yōu)信號。例如，不能先驗地知道哪些探針的亞部分由于靶活化實際上經(jīng)歷構(gòu)象變化(位移)，并且通過進行各種標(biāo)記反應(yīng)(已知在本領(lǐng)域中尋找熒光標(biāo)記的最優(yōu)標(biāo)記條件是必需的等)，當(dāng)探針被活化時，可以確定哪種化學(xué)產(chǎn)生一種經(jīng)歷構(gòu)象變化的標(biāo)記。
在可選擇的實施方案中，離子通道或受體例如GPCR受體在生物細胞中直接用非線性活性標(biāo)記和/或增強劑進行標(biāo)記。例如，Glauner等的出版物(Nature，v.402 813(1999))示范了全細胞中Shaker鉀離子通道的熒光標(biāo)記。測量背景信號。當(dāng)激動劑與受體結(jié)合時，它誘導(dǎo)受體構(gòu)象變化，改變標(biāo)記的方向和非線性光學(xué)信號(如，信號強度)。通過全細胞中的標(biāo)記和/或增強劑，一個表面選擇性非線性光學(xué)裝置被這樣用于測量受體中配體-門控構(gòu)象變化。例如，基諧波光被聚焦于一個在Becton-Dickinson Falcon plates上培養(yǎng)的細胞層-并且根據(jù)所屬領(lǐng)域熟知的方法收集第二諧波或高次諧波。在可選擇的實施方案中，標(biāo)記的細胞懸浮于基質(zhì)中，并且將基諧波光聚焦于含有上述細胞的樣品區(qū)域。附圖18描述了所述裝置的實施方案。根據(jù)所屬領(lǐng)域熟知的方法收集第二諧波，例如相對于基諧波光束在0或90度。
在可選擇的實施方案中，增強劑懸浮或溶解于含有標(biāo)記的細胞或分子的基質(zhì)中，以增強所述細胞或分子的非線性響應(yīng)。
在可選擇的的實施方案中，探針被置于人工膜或脂質(zhì)體中。如果探針在細胞中表達，然后可以根據(jù)所屬領(lǐng)域熟知的方法被純化并重組進所述膜。
在可選擇的實施方案中，探針在一個本身與棱鏡接觸的表面(或是棱鏡的底面)上接觸，培養(yǎng)或排列。所述棱鏡允許基諧波在含有探針的界面上的全內(nèi)反射，和導(dǎo)致更高非線性光學(xué)信號的高菲涅耳因子(電場振幅)。在所述結(jié)構(gòu)模式中，基諧波光束在含有探針的界面上經(jīng)歷全內(nèi)反射，并且其損耗波被用于產(chǎn)生非線性光線。附圖2舉例說明了所述類型的一個實施方案。在附圖2中，一種指標(biāo)匹配材料或液體(75)被用于將棱鏡(70)偶聯(lián)到一種含有微陣列(80)的基質(zhì)，所述微陣列與含有靶(85)的溶液接觸，在材料(80)和溶液(85)的界面發(fā)生全內(nèi)反射。棱鏡材料可以是，例如，BK7型玻璃(MellesGriot)，和所述可以從Corning Corp.或Nye Corp.購買到的指標(biāo)匹配材料。
在可選擇的實施方案中，試驗建立如Salafsky和Eisenthal，″Protein adsorption at interfaces detected by second harmonicgeneration，″J Phys.Chem.B，104(32)7752-7755(2000)，Salafsky和Eisenthal，″Second harmonic spectroscopydetection and orientation of molecules at a biomembraneinterface，″Chem.Phys.Lett.319(5-6)435-439(2000)中及其中引用的參考文獻所述。一個豪微微秒脈沖激光器(Mail-Tai，Spectra-Physics)被用做80MHz時用＜200fs脈沖在1W平均能量操作時800nm處的基諧波光源。激光束指向Dove棱鏡(Melles Griot，BK-7)入口并用凹透鏡(Oriel)(光點直徑約50微米直徑)聚焦。所述Dove棱鏡裝配到特氟隆固定器并與緩沖液或蒸餾水接觸。所述光束在棱鏡內(nèi)經(jīng)歷全內(nèi)反射(產(chǎn)生損耗波)，并且基諧波和第二諧波光束從出口處以大致一條直線出現(xiàn)。使用一個濾光器阻斷基諧波光，同時使第二諧波通過單色器(2nm帶寬狹縫)。所述單色器從380-500nm掃描，以檢測第二諧波譜。如果需要，還可以改變基諧波光波長。一個單光子計數(shù)器檢測器和光電倍增管被用于檢測單色器的輸出，并且裝有軟件的個人電腦被用于記錄數(shù)據(jù)并控制單色器波長。在添加配體或其它刺激物以產(chǎn)生或測試探針中構(gòu)象變化前，測量背景第二諧波信號。
實施例6.3選擇有合適作為分子標(biāo)志的結(jié)構(gòu)的寡脫氧核苷酸，并根據(jù)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法用伯胺在3’端和二硫基團在5’端和代替dT的生物素基團合成?？梢允褂孟率鯩B類似物，例如5′-CCT AGC TCT AAATCG CTA TGG TCG CGC(Biotin dT)AG G-3′(SEQ ID NO6)。所述胺基反應(yīng)性的非線性活性唑染料唑(SE)1-(3-(琥珀酰亞胺基氧基羰基)芐基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)唑-2-基)溴化吡啶(PyMPO，SEMolecular Probes Corp.)與伯胺結(jié)合。在所述偶聯(lián)反應(yīng)中，一種100μl含有溶解于0.1M碳酸氫鈉的100μM寡核苷酸的溶液與0.1mg溶解于100μl二甲基亞砜的染料的琥珀酰亞胺酯反應(yīng)。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌2小時。反應(yīng)產(chǎn)物用Sephadex柱(NAP-5；Amersham Pharmacia Biotech)純化，Sephadex柱用10ml 0.1M乙酸三乙銨(pH6.5)平衡。純化后，所述5’端二硫化物被裂解，并且游離巰基共價附著于直徑1.4nm的金簇，用于增強唑染料(Nanogold；Nanoprobes)的非線性響應(yīng)，并且得到一個N-丙基馬來酰亞胺并被水溶性膦配體鈍化。根據(jù)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法進行Au粒子的偶聯(lián)。例如，用二硫蘇糖醇(DTT)裂解二硫鍵，且與金偶聯(lián)前寡核苷酸被純化以除去多余的DTT。將10μl的1M DTT添加于與75μl碳酸氫鈉，pH8.3混合的25μl寡核苷酸。溫育1小時后，所述寡核苷酸溶液使用反相色譜如上所述進行純化。含有活化寡核苷酸的級分使用Sephadex柱(NAP-5)進行純化，Sephadex柱用水平衡。部分洗脫產(chǎn)品(37pmol～370pmol DNA，懸浮于180μl水)立即與6nmol單馬來酰-金粒子(Nanoprobes)反應(yīng)，在含有10％異丙醇的含水20mM NaH2PO4，150mM NaCl，1mM乙二胺四乙基乙酸鹽(EDTA)緩沖液，pH6.5中在4℃反應(yīng)24小時。反應(yīng)產(chǎn)物通過凝膠電泳法分析，在非變性丙烯酰胺凝膠上在Tris-硼酸EDTA(TBE)中在10V/cm進行電泳。
根據(jù)熟知方法，附著有非線性活性染料和金毫微粒子的生物素化的MB類似物偶聯(lián)到鏈霉抗生物素蛋白衍生化的玻璃。例如，所述生物素化的MB類似物在玻璃纖維的蝕刻部分上固定化。一批光學(xué)纖維被用于單一固定化循環(huán)。通過在纖維探針的一端進行化學(xué)蝕刻，大約2cm的覆蓋層被從中心剝裂。所述纖維探針垂直浸泡于49％氫氟酸溶液中12分鐘。HF溶液用庚烷溶劑覆蓋。用于下一步固定化實驗之前，蝕刻的纖維探針用超純水洗滌。
生物素化的MB類似物在纖維的蝕刻部分上固定化以進DNA感應(yīng)。蝕刻纖維探針首先通過浸泡于1∶1v/v濃HCl/MeOH混合物中30分鐘，用水沖洗，浸泡于濃硫酸中30分鐘進行清洗。進一步?jīng)_洗并且接下來在水中煮沸8-10分鐘。纖維的硅烷化通過在室溫下，在1mM乙酸中，將其浸泡于新鮮制備的1％(v/v)DETA溶液(從United ChemicalTechnologies，Bristol PA購買的三甲氧基甲硅烷基丙基二乙烯三胺)中20分鐘完成。DETA修飾的纖維探針用水充分沖洗以除去過量DETA。硅烷化的纖維探針在氮氣下干燥，并且在120℃烘箱中加熱固定5分鐘。然后所述硅烷化的纖維在0.1M碳酸氫鹽緩沖液(pH8.5)中在室溫下浸泡于0.5mg/ml NHS-LC-生物素(磺基琥珀酰亞胺基(sulfo succinimidyl)-6-(生物素酰胺基)己酸酯，購自Pierce，Rockford IL)3小時。通過在4℃在含有1.0mg/ml鏈霉抗生物素蛋白的溶液中將生物素化的纖維溫育過夜，鏈霉抗生物素蛋白(Sigma，St.Louis MO)結(jié)合于纖維表面。鏈霉抗生物素蛋白固定化的光學(xué)纖維然后浸泡于生物素化的MB類似物溶液(pH7.0時10mM磷酸緩沖液中10-6M)中長達20分鐘或在4℃過夜，以允許生物素化的MB類似物在表面上固定化。
使用基諧波沿著纖維擴散產(chǎn)生的第二諧波，并且測量當(dāng)?shù)诙C波與MB類似物在纖維遠端短暫相互作用后反向反射的第二諧波光束的強度，對光學(xué)纖維進行光學(xué)詢問。不存在互補靶時，由于唑染料和Au粒子在MB類似物的發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)上接近，寡核苷酸產(chǎn)生大量第二諧波光；這種情況下第二諧波光的強度可以作為背景。存在互補靶時，雜交反應(yīng)引起所述染料和Au粒子在空間上分離，極大地減少了檢測到的第二諧波光的強度。可以在發(fā)生的雜交量和第二諧波光強度之間建立一種線性關(guān)系，并由此所述有檢測系統(tǒng)的衍生化的光學(xué)纖維作為檢測選定探針的互補靶的光學(xué)設(shè)備。
實施例6.4用熒光染料光學(xué)編碼的玻璃微球體用MB類似物衍生化，并且一個有不同寡核苷酸探針的微球體陣列在光學(xué)纖維的遠端制備，如見于所屬領(lǐng)域的那樣(如，U.S.Pat.No.5,250,264，Walt et al.；U.S.Pat.No.5,298,741 Walt et al.；U.S.Pat.No.5,252,494Walt et al；U.S.Pat.No.6,023,540 Walt et al.；U.S.Pat.No.5,814,524 Walt et al.；U.S.Pat.No.5,244,813 Walt etal.；U.S.Pat.No.5,512,490 Walt et al.并且在商業(yè)上(例如Illumina Corporation))。所述陣列可以用于檢測多重靶序列。可選擇性地，光學(xué)編碼可以通過使用有與標(biāo)志相關(guān)的非線笥活性染料不同光譜特性的非線性活性染料完成，以使可以使用一種例如第二諧波產(chǎn)生的非線性光學(xué)技術(shù)進行編碼和雜交檢測。
如果非線性MB類似物被用于均一溶液，在EFISH方法中，可以將一個適用電場應(yīng)用于MB類似物，以建立所需的非中心對稱條件。
在可選擇的實施方案中，人們致力于尋找阻斷或減少MB類似物與靶進行結(jié)合的藥物，拮抗劑，激動劑，或其它物質(zhì)-這些化合物可以被稱為“抑制劑”或“阻斷劑”。在這種應(yīng)用中，標(biāo)記的靶在界面上與探針結(jié)合。抑制劑被添加于樣品中，并且如果測試的特定物質(zhì)成功阻斷或減少了探針-靶結(jié)合，測量到的非線性光線將會改變-本實施方案中的背景輻射由于靶-探針結(jié)合而產(chǎn)生；抑制劑在界面上代替探針上的靶導(dǎo)致測量到的非線性光線產(chǎn)生變化，例如界面產(chǎn)生的非線性輻射強度減少，或非線性輻射光譜中波長位移。
在一個任選實施方案中，可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法完成對確定非特異性非線性光學(xué)信號(如，不由特異性探針-靶結(jié)合產(chǎn)生)的程度的控制。例如，在核酸微陣列中，當(dāng)添加對探針互補或非互補的靶時，含有探針的區(qū)域之間的非線性光學(xué)信號的強度可以產(chǎn)生一個背景信號，所述背景信號可以在某些程度上增加(但與由于特異性探針-靶結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)生的信號相比小很多)。例如，可以通過僅僅添加非互補探針并且在含有探針和不含探針的區(qū)域測量非線性光學(xué)信號，來計算所述背景信號。存在阻斷劑時測量非線性光學(xué)信號是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知另一種控制技術(shù)，已知所述阻斷劑阻止探針-靶的結(jié)合，所述控制技術(shù)用于確定存在于更大的目標(biāo)信號中的背景或人為信號量，在這種情況下是特異性探針-靶結(jié)合反應(yīng)。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，胺反應(yīng)性的唑染料(SE)1-(3-(琥珀酰亞胺基氧基羰基)芐基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)唑-2-基)溴化吡啶(PyMPO，SEMolecular Probes Corp.)與1，2-乙二胺按1∶1摩爾比反應(yīng)，反應(yīng)條件在Molecular Probes direction中詳細說明，并允許反應(yīng)完全?；邡冗虻娜玖犀F(xiàn)在包含一個單獨的胺基基團。使用同雙功能交聯(lián)劑(Pierce，Rockford IL)，該染料可以偶聯(lián)到寡核苷酸的伯胺上。
在可選擇的實施方案中，一種附著有生物素的非線性活性染料可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進行合成，以生成染料-生物素分子，所述染料-生物素分子是生物素-熒光染料分子的非線性活性類似物，用于寡核苷酸固定化。
實施例6.5根據(jù)本領(lǐng)域已經(jīng)確立的方法，用PyMPO，SE(Molecular ProbesCorp.)在3’或5’端(或可選擇的，在胞嘧啶堿基對位置)標(biāo)記一種18-25堿基對序列的肽-核酸類似物(PNA)分子標(biāo)志(發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu))。PNA置于純化的水溶液中，并且用適用電場定向以產(chǎn)生非中心對稱區(qū)域。將PNA分子和互補序列添加至標(biāo)記的PNA中將會導(dǎo)致構(gòu)象變化，并由此產(chǎn)生測量到的非線性光束性質(zhì)的變化。
根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，PNA(線性，非發(fā)夾環(huán))也可以附著于玻璃或硅石表面。將序列互補的DNA添加于純化水與含有PNA的玻璃表面接觸，導(dǎo)致表面上PNA構(gòu)象變化，并由此導(dǎo)致測量到的非線性光束物理性質(zhì)的改變。
7.其它本發(fā)明不限于這里描述的特定實施方案的范圍。事實上，除了那些這里描述的方法外，從前面的描述來看，對本發(fā)明的各種改進對所屬領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。這些改進意欲落入附加的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
所有這里引用的文獻均在此整體且為所有目的引入，并且其程度如同每個單獨出版物，專利或?qū)＠暾埗急惶囟ǖ睾蛦为毜刂赋鲆哉w且為所有目的引入。
引用的任何出版物的公開早于申請日，并且由于在先發(fā)明，不應(yīng)該解釋為承認本發(fā)明沒有資格先于這些公開。
8.參考文獻美國專利文獻5,324,591 Jun.，1994 Georger，Jr.et al..
5,215,899 Jun.，1993 Dattagupta6,030,787 Feb.，2000 Livak et al.
5,834,758 Nov.，1998 Trulson et al.
6,025,601 Feb.，2000 Trulson et al.
5.631,734 May，1997Stern et al.
6,084,991July，2000 Sampas5,633,724May，1997 King et al.
6,121,983Sept.，2000Fork et al.
5,485,277Jan.，1996 Foster et al.
5,324,633June，1994 Fodor et al.
6,124,102Sept.，2000Fodor et al.
5,847,400Dec.，1998 Kain et al.
5,432,610July，1995 King et al.
5,320,814June，1994 Walt et al.
5,250,264Oct.，1993 Walt et al.
5,298,741March，1994Walt et al.
5,252,494Oct.，1993 Walt et al.
6,023,540Feb.，2000 Walt et al.
5,814,524Sept.，1998Walt et al.
5,244,813Sept.，1993Walt et al.
5,512,490April，1996Walt et al.
6,095,555July，2000 Fiekowsky et al.
6,134,002Oct.，2000 Stimson et al.
6,110,426Dec.，1997 Shalon et al.
6,040,586March，2000Slettnes et al.
科學(xué)文獻1.J.S.Salafsky，K.B.Eisenthal，“Second Harmonic SpectroscopyDetection and Orientation ofMolecules at a Biomembrane Interface”，Chemical Physics Letters 2000，319，435-439.
2.J.S.Salafsy，K.B.Eisenthal，“Protein Adsorption at Interfaces Detected by Second HarmonicGeneration”，Journal of Physical Chemistry B，2000，104，7752-7755.
3.R.Ekins，F(xiàn).W.Chu，Trends in Biotechnology，1999，17，217.
4.G.MacBeath and S.L.Schreiber，“Printing Proteins as Microarrays for High-ThroughputFunction Determination”，Science 2000，289，1760-1763.
5.N.J.Harrick，“Internal Reflection Spectroscopy”，John Wiley & Sons，Inc.，New York，1979.
6.Groves，J.T.，Ulman，N.，Boxer，S.G.，“Micropatterning fluid bilayers on solid supports”，Science，1997，275，651-3.
7.Fodor et al.，“Light-directed Spatially-addressable Parallel Chemical Synthesis，”Science，1991，251，767-773.
8.Ramsay，G.DNA chips-states-of-the-art.Nature Biotechhology 1998，16(1)，40-44.
9.Marshall，A.；Hodgson，J.DNA chips-an array of possibilities.Nature Biotechnology 1998，16(1)，27-31.
10.S.C.Case-Green et al.，Curr.Opin.Chem.Biol.2(1998)，404.
11.S.A.Fodor，Science 277(1997)，393.
12.D.H.Duggan et al.，Nature Genet.21(Suppl.)(1999)，10.
13.M.Schena et al.，Science 270(1995)，467.
63.P.O.Btown and D.Botstein，Nature Genet.21(Suppl.)(1999)，33.
64.L.McAllister et al.，Am.J.Hum.Genet.61(Suppl.)(1997)，1387.
16.A.P.Blanchard et al.，Biosens.And Bioelectron.11(1996)687.
17.G.J.Zhang et al.，Anal.Lett.32，2725(1999).
18.F.Kleinjung et al.，Anal.Chim.Acta 350，51(1997).
19.A.H.Uddin et al，Nucleic Acids Res.25，4139(1997).
20..P.A.E.Piunno et al.，Anal.Chem.67，2635(1995).
21.F.F.Bier et al.，Sens.Actuators B Chem.38，78(1997).
22.A.P.Abel et al.，Anal.Chem.68，2905(1996).
23.J.A.Ferguson et al.，Nature Biotechnol.14，168l(1996).
24.P.Pantano and D.R.Walt，Chem.Mater.8，2832(1996).
25.K.L.Michael et al.，Anal.Chem.70，1242(1998).
26.R.J.Fulton et al.，Clin.Chem.443，1749(1997).
27.M.Chee and D.R.Walt，unpublished results.
28.F.J.Steemers et al.，Nature Biotechnol.18，91(2000).
29.N.P.Gerry et al.，J.Mol.Biol.292，251(1999).
30.J.Liu and W.H.Tan，Anal.Chem.71，5054(1999).
31.D.R.Walt，Science 287，(2000)451.“Nonlinear optical measurement of membrane potential around single molecules at selectedcellular sites”，G.Peleg，A.Lewis，M.Linial，L.M.Loew，Proc.Natl.Acad.Sci.V.96，1999，6700-6704.G.Boyd，T.Rasing，R.Leite，Y.Shen(1984)Phys.Rev.B 30，519-526.C.Chen，T.F.Heinz，D.Richard，Y.Shen(1981)Phys.Rev.Lett.46，1010-1012.
Milan Mrksich and George M.Whitesides，″Using Self-Assembled Monolayers to Understand theInteractions of Man-Made Surfaces with Proteins and Cells，″Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.，1996，2555-78.
V.G.Cheung et al.，“Making and reading microarrays”，Nature Genetics(Suppl.)，1999，2115-19.
L.A.Chrisey，G.U.Lee，C.E.O’Ferrall，“Covalent Attachment of Synthetic DNA to Self-AssembledMonolayer Films″，Nucleic Acids Research 24，3031，(1996).
Gabriel P.Lopez，Mark W.Albers，Stuart L.Schreiber，Reed Carroll，Ernest Peralta and George M.Whitesides，Convenient Methods for Patteming the Adhesion of Mammalian Cells to SurfaeesUsing Self-Assembled Monolayers of Alkanethiolates on Gold，J.Am Chem Soc.，1993，115，5877-5878.
Rahul Singhvi，Amit Kumar，gabriel P.Lopez，Gregory N.Stephanopoulos，Daniel I.C.Wang，George M.Whitesides and Donald E.Ingber，″Engineering Cell Shape and Function，″Science，vol.264，Apr.29，1994，696-698.
Levicky R，Herne TM，Tarlov MJ，and Satija SK(1998).″Using Self-Assembly to Control theStructure of DNA Monolayers on GoldA Neutron Reflectivity Study.″Journal of the AmericanChemical Society 1209787-9792.
Ion channel，G-protein receptor referencesK.S.Glauner，L.M.Mannuzzu，C.S.Gandhi，E.Y.Isacoff，“Spectrosopic mapping of voltage sensormovement in the Shaker potassium channel”，Nature 402，813(1999).
P.Ghanouni et al.，“Agonist-induced conformational changes in the G-protein-coupling domain ofthe β2adrenergic receptor”，Proc.Natl..Acad.Sci.，v.98，5997(2001).
P.Ghanouni et al.，“Functionally Different Agonists Induce Distinct Conformations in the G ProteinCoupling Domain of the β2Adrenergic Receptor”，Journal of Biological Chemistry，v.276，24433(2001).
E.Perozo et al.，“Structural rearrangements underlying K+channel activation gating.”，Science 285，73-79(1999).
Yellen，G.，”The moving parts of voltage-gated ion channels”，Q.Rev.Biophys.31，239(1998).
Aggarwal，S.et al.，“Contribution of the S4 segment to gating charge in the Shaker K+channel”，Neuron 16，1169(1996).
Larsson et al.，“Transmembrane movement of the Shaker K+channel S4”，Neuron 16，387(1996).
Mannuzzu，L.M.et al.，“Direct physical measure of conformational rearrangement underlyingpotassium channel gating”，Science 271，213(1996).
Cha，A.and Bezanilla，F(xiàn).，“Characterizing voltage-dependent conformational changes in the ShakerK+channel with fluorescence”，Neuron 19，1127(1997).
C.Bieri et al.，“Micropattemed immobilization of a G protein-coupled receptor and direct detectionof G protein activation”，Nature Biotechnology，17，1105(1999).
Helmreich，E.J.M.and Hofmann，KP，“Structure and Function of Proteins in G-protein-coupledsignal transfer”，Biochimica et Biophysica Acta 1286，285(1996).
Mannuzzu et al.(1996)Science 271，213-216，Direct physical measure of conformationalrearrangement underlying potassium channel gating.
Gether et al.(1995)J Biol Chem 270，28628-28275，F(xiàn)luorescent labeling of purified β2 adrenergicreceptor.
Turcatti et al.(1996)J Biol Chem 271，19991-19998，Probing the Structure and Function of theTachykinin Neurokinin-Receptor through Biosynthetic incorporation of flourescent amino acids atspecific sites.
Liu et al.(1996)Biochemistry 35，11865-11873，Site-Directed fluorescent labeling of P-glycoprotein on cysteine residues in the nucleotide binding domains.
Lodish，Harvey，et al.，Molecular Cell Biology(4thed.，2000).
序列表<110>Salafsky，Joshua s.
<120>使用非線性光學(xué)技術(shù)檢測涉及構(gòu)象變化的相互作用的方法<130>11100-035-228<140>
<141>
<150>10/164,915<151>2002-06-06<160>6<210>1<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工序列的描述分子標(biāo)志的寡核苷酸結(jié)構(gòu)<400>1aaaaaaaaaa aaaaactcgc20<210>2<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工序列的描述分子標(biāo)志的寡核苷酸結(jié)構(gòu)<400>2gaaaaaaaaa aaaaaa16<210>3<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工序列的描述分子標(biāo)志的寡核苷酸結(jié)構(gòu)<400>3gaaaaaaaca aaaaaa16<210>4<211>69<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工序列的描述分子標(biāo)志的寡核苷酸結(jié)構(gòu)<220>
<221>改性的堿基<222>19..49<223>n＝a，t，g，or c<400>4ctacctacag taccagcttn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnt tactcgaggg60atcctagtc69<210>5<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工序列的描述分子標(biāo)志的寡核苷酸結(jié)構(gòu)<400>5gcgactttt tttttttttt tctcgc 25<210>6<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工序列的描述分子標(biāo)志的寡核苷酸結(jié)構(gòu)<220>
<221>改性的堿基<222>28<223>t＝Biotin dT<400>6cctagctcta aatcgctatg gtcgcgctag g 3權(quán)利要求
1.一種篩選一種或多種候選結(jié)合配偶體的方法，所述配體與測試分子結(jié)合，所述方法包括(a)用一種或多種基頻的一種或多種光束照射樣品，所述樣品包括暴露于所述一種或多種候選結(jié)合配偶體的所述測試分子；和(b)測量所述樣品發(fā)出的非線性光束的一種或多種物理性質(zhì)；其中(b)步驟中測量的一種或多種物理性質(zhì)的值相對于所述測試分子不暴露于一種或多種候選結(jié)合配偶體時測量的一種或多種物理性質(zhì)的值的變化，表明所述一種或多種候選結(jié)合配偶體與所述測試分子結(jié)合。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述測試分子結(jié)合于一種或多種非線性活性標(biāo)記。
3.權(quán)利要求2所述的方法，還包括在步驟(a)之前，將所述標(biāo)記結(jié)合到所述測試分子的步驟。
4.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述一種或多種標(biāo)記是共價附著的。
5.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述測試分子非共價結(jié)合于非線性活性分子。
6.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述測試分子和所述非線性活性標(biāo)記中的一種形成融合蛋白。
7.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述一種或多種標(biāo)記包括綠色熒光蛋白或所述非線性活性蛋白的衍生物或突變體。
8.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述標(biāo)記是籠狀的。
9.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述標(biāo)記是分子標(biāo)志類似物。
10.權(quán)利要求2所述的方法，其中紫外光裂解所述非線性活性標(biāo)記和所述測試分子之間的鍵。
11.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述標(biāo)記的非線性活性性質(zhì)可以通過暴露于化學(xué)試劑或一種或多種光束被改變。
12.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述候選結(jié)合配偶體結(jié)合于一種或多種非線性活性標(biāo)記。
13.權(quán)利要求12所述的方法，還包括在步驟(a)之前，將所述標(biāo)記與所述候選結(jié)合配偶體結(jié)合的步驟。
14.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述一種或多種標(biāo)記是共價附著的。
15.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述候選結(jié)合配偶體非共價結(jié)合于非線性活性分子。
16.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述候選結(jié)合配偶體和所述非線性活性標(biāo)記中的一種形成融合蛋白。
17.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述一種或多種標(biāo)記包括綠色熒光蛋白或所述非線性活性蛋白的衍生物或突變體。
18.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述標(biāo)記是籠狀的。
19.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述標(biāo)記是分子標(biāo)志類似物。
20.權(quán)利要求12所述的方法，其中紫外光裂解所述非線性活性標(biāo)記和所述候選結(jié)合配偶體之間的鍵。
21.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述標(biāo)記的非線性活性性質(zhì)可以通過暴露于化學(xué)試劑或一種或多種光束被改變。
22.權(quán)利要求1所述的方法，其中一種或多種物理性質(zhì)是強度。
23.權(quán)利要求1所述的方法，其中一種或多種物理性質(zhì)是偏振方向。
24.權(quán)利要求1所述的方法，其中不存在結(jié)合于測試分子的外源非線性活性標(biāo)記時，所述測試分子是非線性活性的。
25.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述一種或多種光束的波長在10～10000毫微米范圍內(nèi)。
26.權(quán)利要求1所述的方法，還包括將步驟(b)中測量的所述物理性質(zhì)的值與不暴露于所述一種或多種候選結(jié)合配偶體時測量的物理性質(zhì)的值進行比較。
27.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述測試分子或所述候選結(jié)合配偶體結(jié)合于至少兩個可區(qū)別的非線性活性標(biāo)記，其中所述一種或多種光束是多重光束，并且步驟(b)包括測量至少兩個從所述樣品發(fā)出的非線性光束的一種或多種物理性質(zhì)。
28.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述測試分子是純化的。
29.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述測試分子是一種G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)。
30.權(quán)利要求29所述的方法，其中所述GPCR結(jié)合于非線性活性標(biāo)記。
31.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述測試分子是標(biāo)記的GPCR。
32.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述非線性光束是第二諧波產(chǎn)生的光線。
33.權(quán)利要求1所述的方法，其中還包括將電場施加于所述樣品。
34.權(quán)利要求33所述的方法，其中電場是在時間上靜止的，根據(jù)時間變化的，或其組合。
35.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述樣品還包括體相。
36.權(quán)利要求35所述的方法，其中將電場應(yīng)用于所述體相。
37.權(quán)利要求36所述的方法，其中電場是在時間上靜止的，根據(jù)時間變化的，或其組合。
38.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述一種或多種非線性光束是第二諧波，第三諧波，一種或多種基頻的和頻或差頻。
39.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述測試分子是細胞，脂質(zhì)體或膜表面的一部分。
40.權(quán)利要求1所述的方法，其中還包括在所述樣品中不存在測試分子或候選結(jié)合配偶體的情況下，測量所述非線性光束的一種或多種物理性質(zhì)。
41.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述測試分子是天然或人工膜的一部分。
42.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述一種或多種候選結(jié)合配偶體是支持膜，脂質(zhì)體或生物細胞的一部分。
43.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述一種或多種候選結(jié)合配偶體在體外偶聯(lián)或結(jié)合到一固體表面。
44.權(quán)利要求43所述的方法，其中所述固體表面支持磷脂或人工雙層膜。
45.權(quán)利要求44所述的方法，其中所述磷脂或人工雙層包括膜蛋白。
46.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述一種或多種候選結(jié)合配偶體包括生物細胞，脂質(zhì)體，囊泡，珠子，金屬粒子，或非金屬粒子表面的一部分。
47.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述一種或多種候選結(jié)合配偶體在固體表面上排列。
48.權(quán)利要求47所述的方法，其中所述寡核苷酸或多核苷酸附著于毫微米到微米尺寸的表面區(qū)域上。
49.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述一種或多種候選結(jié)合配偶體在一固體表面上以陣列的形式排列。
50.權(quán)利要求49所述的方法，其中所述一種或多種候選結(jié)合配偶體包括許多不同寡核苷酸或多核苷酸，所述不同寡核苷酸或多核苷酸各自包括不同的序列并附著于一固體表面的不同區(qū)域。
51.權(quán)利要求49所述的方法，其中寡核苷酸或多核苷酸以微陣列形式排列。
52.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述一種或多種候選結(jié)合配偶體包括許多不同蛋白，所述不同蛋白各自包括不同的氨基酸序列并且附著于固體表面的不同區(qū)域上。
53.權(quán)利要求52所述的方法，其中所述一種或多種包括不同氨基酸序列的候選結(jié)合配偶體各自附著于尺寸為1～1000毫微米的表面的不同區(qū)域。
54.權(quán)利要求52所述的方法，其中所述蛋白附著于尺寸為1～1000微米的表面區(qū)域。
55.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述一種或多種候選結(jié)合配偶體包括以陣列形式排列的蛋白。
56.權(quán)利要求1所述的方法，其中照射步驟涉及反射，透射，損耗波，多重內(nèi)反射，近場光學(xué)，共焦，光學(xué)腔，平面波導(dǎo)管，纖維-光學(xué)器件或電介質(zhì)板波導(dǎo)管。
57.權(quán)利要求1所述的方法，其中測量步驟涉及反射，透射，損耗波，多重內(nèi)反射，近場光學(xué)，共焦，光學(xué)腔，平面波導(dǎo)管，纖維-光學(xué)器件或電介質(zhì)板波導(dǎo)管。
58.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述一種或多種候選結(jié)合配偶體是分子標(biāo)志類似物。
59.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述一種或多種候選結(jié)合配偶體附著于一表面。
60.權(quán)利要求59所述的方法，其中所述表面是金屬表面，半導(dǎo)體表面，玻璃表面，乳膠表面，凝膠表面，纖維-光學(xué)表面，二氧化硅表面或珠子表面。
61.權(quán)利要求59所述的方法，其中所述表面是非平面表面。
62.權(quán)利要求59所述的方法，其中所述表面是化學(xué)衍生化的。
63.權(quán)利要求62所述的方法，其中所述表面是用自組裝的單層衍生化的。
64.權(quán)利要求62所述的方法，其中所述表面是用有機硅烷衍生化的。
65.權(quán)利要求1所述的方法，其中測量步驟在不同時期重復(fù)進行。
66.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述一種或多種候選結(jié)合配偶體附著于自組裝的單層。
67.權(quán)利要求66所述的方法，其中自組裝單層屬于硅烷或末端功能硅烷化學(xué)家族。
68.權(quán)利要求1所述的方法，其中測量的非線性光束的一種或多種物理性質(zhì)表明所述結(jié)合的熱力學(xué)或動力學(xué)性質(zhì)。
69.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述結(jié)合涉及化學(xué)鍵，靜電力，物理吸著，化學(xué)親和性，化學(xué)吸附，分子識別，物理-化學(xué)結(jié)合，氫鍵或雜交方法。
70.權(quán)利要求1所述的方法，其中非線性光束是循環(huán)偏振的。
71.權(quán)利要求1所述的方法，其中樣品在一界面上，所述界面包括細胞，脂質(zhì)體，囊泡表面，或固體表面。
72.權(quán)利要求1所述的方法，其中樣品還包括一種或多種選自修飾分子，修飾粒子，增強劑，調(diào)節(jié)劑，抑制劑，分子標(biāo)志類似物，和指示劑的物質(zhì)。
73.權(quán)利要求1所述的方法，其中非線性光束的產(chǎn)生，收集或檢測的模式是一種或多種選自反射，透射，損耗波，多重內(nèi)反射，近場光學(xué)技術(shù)，共焦，光學(xué)腔，平面波導(dǎo)管，纖維-光學(xué)器件和電介質(zhì)板波導(dǎo)管，和近場技術(shù)的模式。
74.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述測試分子是藥物或阻斷劑。
75.一種篩選一種或多種候選調(diào)節(jié)分子的方法，所述調(diào)節(jié)分子具有調(diào)節(jié)測試分子及其結(jié)合配偶體之間相互作用的能力，所述方法包括(a)用一種或多種基頻的一種或多種光束照射樣品，所述樣品包括所述測試分子，所述測試分子暴露于(i)所述結(jié)合配偶體，和(ii)所述一種或多種候選調(diào)節(jié)分子；和(b)測量所述樣品發(fā)出的非線性光束的一種或多種物理性質(zhì)；其中(b)步驟中測量的一種或多種物理性質(zhì)的值相對于不暴露于一種或多種所述候選調(diào)節(jié)分子時測量的一種或多種所述物理性質(zhì)的值的變化，表明一種或多種所述候選調(diào)節(jié)分子調(diào)節(jié)所述測試分子及其結(jié)合配偶體之間的相互作用。
76.權(quán)利要求75所述的方法，其中一種或多種物理性質(zhì)是強度。
77.權(quán)利要求75所述的方法，其中一種或多種物理性質(zhì)是偏振方向。
78.權(quán)利要求75所述的方法，其中在不存在結(jié)合于測試分子的外源非線性活性標(biāo)記的情況下，所述測試分子是非線性活性的。
79.權(quán)利要求75所述的方法，其中所述一種或多種光束的波長在10～10000毫微米范圍內(nèi)。
80.權(quán)利要求75所述的方法，其中所述非線性光束是第二諧波產(chǎn)生的光線。
81.權(quán)利要求75所述的方法，其中照射步驟涉及反射，透射，損耗波，多重內(nèi)反射，近場光學(xué)，共焦，光學(xué)腔，平面波導(dǎo)管，纖維-光學(xué)器件或電介質(zhì)板波導(dǎo)管。
82.權(quán)利要求75所述的方法，其中測量步驟涉及反射，透射，損耗波，多重內(nèi)反射，近場光學(xué)，共焦，光學(xué)腔，平面波導(dǎo)管，纖維-光學(xué)器件或電介質(zhì)板波導(dǎo)管。
83.權(quán)利要求75所述的方法，其中測量步驟在不同時期重復(fù)進行。
84.權(quán)利要求75所述的方法，其中測量的非線性光束的一種或多種物理性質(zhì)表明所述結(jié)合的熱力學(xué)或動力學(xué)性質(zhì)。
85.權(quán)利要求75所述的方法，其中所述結(jié)合涉及化學(xué)建，靜電力，物理吸著，化學(xué)親和性，化學(xué)吸附，分子識別，物理-化學(xué)結(jié)合，氫鍵或雜交方法。
86.權(quán)利要求75所述的方法，其中樣品還包括一種或多種選自修飾分子，修飾粒子，增強劑，調(diào)節(jié)劑，抑制劑，分子標(biāo)志類似物和指示劑的物質(zhì)。
87.權(quán)利要求75所述的方法，其中非線性光束的產(chǎn)生，收集或檢測的模式是一種或多種選自反射，透射，損耗波，多重內(nèi)反射，近場光學(xué)技術(shù)，共焦，光學(xué)腔，平面波導(dǎo)管，纖維-光學(xué)器件和電介質(zhì)板波導(dǎo)管，和近場技術(shù)的模式。
88.權(quán)利要求75所述的方法，其中所述測試分子是純化的。
89.權(quán)利要求75所述的方法，其中所述測試分子是G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)。
90.權(quán)利要求75所述的方法，其中所述GPCR結(jié)合于非線性活性標(biāo)記。
91.權(quán)利要求75所述的方法，其中所述測試分子是標(biāo)記的GPCR。
92.權(quán)利要求75所述的方法，其中還包括將電場施加于所述樣品。
93.權(quán)利要求92所述的方法，其中電場是在時間上靜止的，根據(jù)時間變化的，或其組合。
94.權(quán)利要求75所述的方法，其中所述樣品還包括體相。
95.權(quán)利要求94所述的方法，其中將電場施加于所述體相。
96.權(quán)利要求95所述的方法，其中電場是在時間上靜止的，根據(jù)時間變化的，或其組合。
97.權(quán)利要求75所述的方法，其中所述一種或多種非線性光束是第二諧波，第三諧波，一種或多種基頻的和頻或差頻。
98.權(quán)利要求75所述的方法，其中所述樣品還包括一種或多種候選結(jié)合配偶體。
99.權(quán)利要求98所述的方法，其中還包括將步驟(b)中測量到的所述物理性質(zhì)的值與不暴露于一種或多種所述候選結(jié)合配偶體時測量到的物理性質(zhì)的值進行比較。
100.權(quán)利要求98所述的方法，其中所述測試分子或所述候選結(jié)合配偶體結(jié)合于至少兩個可區(qū)別的非線性活性標(biāo)記，其中所述一種或多種光束是多重光束，并且步驟(b)包括測量所述樣品發(fā)出的至少兩種非線性光束的一種或多種物理性質(zhì)。
101.權(quán)利要求98所述的方法，其中所述一種或多種候選結(jié)合配偶體在一固體表面上以陣列的形式排列。
102.權(quán)利要求101所述的方法，其中所述一種或多種候選結(jié)合配偶體包括許我不同寡核苷酸或多核苷酸，所述不同寡核苷酸或多核苷酸各自包括不同的序列并且附著于固體表面的不同區(qū)域。
103.權(quán)利要求101所述的方法，其中寡核苷酸或多核苷酸以微陣列的形式排列。
104.權(quán)利要求98所述的方法，其中所述一種或多種候選結(jié)合配偶體包括以陣列形式排列的蛋白。
105.權(quán)利要求98所述的方法，其中所述一種或多種候選結(jié)合配偶體是分子標(biāo)志類似物。
106.權(quán)利要求98所述的方法，其中所述一種或多種候選結(jié)合配偶體附著于一表面。
107.權(quán)利要求106所述的方法，其中所述表面是金屬表面，半導(dǎo)體表面，玻璃表面，乳膠表面，凝膠表面，纖維-光學(xué)表面，二氧化硅表面或珠子表面。
108.權(quán)利要求106所述的方法，其中所述表面是非平面表面。
109.權(quán)利要求106所述的方法，其中所述表面是化學(xué)衍生化的。
110.權(quán)利要求109所述的方法，其中所述表面是用自組裝的單層衍生化的。
111.權(quán)利要求109所述的方法，其中所述表面是用有機硅烷衍生化的。
112.一種檢測測試分子結(jié)合于結(jié)合配偶體時所述測試分子的構(gòu)象變化的方法，所述方法包括將所述測試分子與一種或多種候選結(jié)合配偶體接觸，其中測試分子或一種或多種候選結(jié)合配偶體用非線性活性部分標(biāo)記，所述部分分別對測試分子或一種或多種候選結(jié)合配偶體來說不是天然的；(a)用一種或多種基頻的一種或多種光束照射所述接觸的測試分子；和(b)測量從所述樣品發(fā)出的非線性光束的一種或多種物理性質(zhì)；其中步驟(b)中測量到的所述一種或多種物理性質(zhì)的值相對于不存在所述一種或多種候選結(jié)合配偶體時測量到的所述一種或多種物理性質(zhì)的值的變化，表明所述一種或多種候選結(jié)合配偶體中的至少一種結(jié)合于所述測試分子，并且所述結(jié)合誘導(dǎo)所述候選結(jié)合配偶體，所述測試分子，或所述候選結(jié)合配偶體和所述測試分子兩者的構(gòu)象變化。
113.權(quán)利要求112所述的方法，其中所述一種或多種物理性質(zhì)是強度。
114.權(quán)利要求112所述的方法，其中所述一種或多種物理性質(zhì)是偏振方向。
115.權(quán)利要求112所述的方法，其中在不存在結(jié)合于測試分子的外源非線性活性標(biāo)記的情況下，所述測試分子是非線性活性的。
116.權(quán)利要求112所述的方法，其中所述一種或多種光束的波長在10～10000毫微米范圍內(nèi)。
117.權(quán)利要求112所述的方法，其中還包括將步驟(b)中測量的所述物理性質(zhì)的值與不暴露于所述一種或多種候選結(jié)合配偶體時測量的物理性質(zhì)的值進行比較。
118.權(quán)利要求112所述的方法，其中所述測試分子或所述候選結(jié)合配偶體結(jié)合于至少兩個可區(qū)別的非線性活性標(biāo)記，其中所述一種或多種光束是多重光束，并且步驟(b)包括測量至少兩個從所述樣品發(fā)出的非線性光束的一種或多種物理性質(zhì)。
119.權(quán)利要求112所述的方法，其中所述測試分子是純化的。
120.權(quán)利要求112所述的方法，其中所述測試分子是G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)。
121.權(quán)利要求120所述的方法，其中所述GPCR結(jié)合于非線性活性標(biāo)記。
122.權(quán)利要求112所述的方法，其中所述非線性光束是第二諧波產(chǎn)生的光線。
123.權(quán)利要求112所述的方法，其中還包括將電場施加于所述樣品。
124.權(quán)利要求123所述的方法，其中電場是在時間上靜止的，根據(jù)時間變化的，或其組合。
125.權(quán)利要求112所述的方法，其中所述樣品還包括體相。
126.權(quán)利要求125所述的方法，其中將電場施加于所述體相。
127.權(quán)利要求126所述的方法，其中電場是在時間上靜止的，根據(jù)時間變化的，或其組合。
128.權(quán)利要求112所述的方法，其中所述一種或多種非線性光束是第二諧波，第三諧波，一種或多種基頻的和頻或差頻。
129.權(quán)利要求112所述的方法，其中所述一種或多種候選結(jié)合配偶體在一固體表面以陣列的形式排列。
130.權(quán)利要求129所述的方法，其中所述一種或多種候選結(jié)合配偶體包括許多不同寡核苷酸或多核苷酸，所述不同寡核苷酸或多核苷酸各自包括不同的序列并且附著于一固體表面的不同區(qū)域。
131.權(quán)利要求129所述的方法，其中寡核苷酸或多核苷酸以微陣列的形式排列。
132.權(quán)利要求112所述的方法，其中所述一種或多種候選結(jié)合配偶體包括以陣列形式排列的蛋白。
133.權(quán)利要求112所述的方法，其中照射步驟涉及反射，透射，損耗波，多重內(nèi)反射，近場光學(xué)技術(shù)，共焦，光學(xué)腔，平面波導(dǎo)管，纖維-光學(xué)器件或電介質(zhì)板波導(dǎo)管。
134.權(quán)利要求112所述的方法，其中測量步驟涉及反射，透射，損耗波，多重內(nèi)反射，近場光學(xué)技術(shù)，共焦，光學(xué)腔，平面波導(dǎo)管，纖維-光學(xué)器件或電介質(zhì)板波導(dǎo)管。
135.權(quán)利要求112所述的方法，其中所述一種或多種候選結(jié)合配偶體是分子標(biāo)志類似物。
136.權(quán)利要求112所述的方法，其中所述一種或多種候選結(jié)合配偶體附著于一表面。
137.權(quán)利要求136所述的方法，其中所述表面是金屬表面，半導(dǎo)體表面，玻璃表面，乳膠表面，凝膠表面，纖維-光學(xué)表面，二氧化硅表面或珠子表面。
138.權(quán)利要求136所述的方法，其中所述表面是非平面表面。
139.權(quán)利要求136所述的方法，其中所述表面是化學(xué)衍生化的。
140.權(quán)利要求139所述的方法，其中所述表面是用自組裝的單層衍生化的。
141.權(quán)利要求139所述的方法，其中所述表面是用有機硅烷衍生化的。
142.權(quán)利要求112所述的方法，其中測量步驟在不同時期重復(fù)進行。
143.權(quán)利要求112所述的方法，其中所述一種或多種候選結(jié)合配偶體附著于自組裝的單層。
144.權(quán)利要求143所述的方法，其中自組裝單層屬于硅烷或末端功能硅烷化學(xué)家族。
145.權(quán)利要求112所述的方法，其中測量到的非線性光束的一種或多種物理性質(zhì)表明所述結(jié)合的熱力學(xué)或動力學(xué)性質(zhì)。
146.權(quán)利要求112所述的方法，其中所述結(jié)合涉及化學(xué)建，靜電力，物理吸著，化學(xué)親和性，化學(xué)吸附，分子識別，物理-化學(xué)結(jié)合，氫鍵或雜交方法。
147.權(quán)利要求112所述的方法，其中樣品還包括一種或多種選自修飾分子，修飾粒子，增強劑，調(diào)節(jié)劑，抑制劑，分子標(biāo)志類似物和指示劑的物質(zhì)。
148.權(quán)利要求112所述的方法，其中非線性光束的產(chǎn)生，收集或檢測的模式是一種或多種選自反射，透射，損耗波，多重內(nèi)反射，近場光學(xué)技術(shù)，共焦，光學(xué)腔，平面波導(dǎo)管，纖維-光學(xué)器件和電介質(zhì)板波導(dǎo)管，和近場技術(shù)的模式。
149.權(quán)利要求112所述的方法，其中非線性活性標(biāo)記共價結(jié)合于所述測試分子或所述一種或多種候選結(jié)合配偶體。
150.權(quán)利要求112所述的方法，其中非線性活性標(biāo)記共價結(jié)合于一分子，所述分子非共價結(jié)合于所述測試分子或所述一種或多種候選結(jié)合配偶體。
151.權(quán)利要求112所述的方法，其中還包括將步驟(b)中測量的所述一種或多種物理性質(zhì)的值與不存在所述一種或多種候選結(jié)合配偶體時測量的一種或多種物理性質(zhì)的值進行比較。
152.一種檢測測試分子與一種或多種候選結(jié)合配偶體之間結(jié)合誘導(dǎo)的構(gòu)象變化的程度或范圍的方法，所述方法包括(a)將所述測試分子和一種或多種候選結(jié)合配偶體接觸，其中測試分子或一種或多種候選結(jié)合配偶體用非線性活性部分標(biāo)記，所述部分分別對測試分子或一種或多種候選結(jié)合配偶體來說不是天然的；(b)用一種或多種基頻的一種或多種光束照射所述接觸的測試分子；和(c)測量從所述樣品發(fā)出的非線性光束的一種或多種物理性質(zhì)；其中步驟(c)中測量到的所述一種或多種物理性質(zhì)的值相對于不存在所述一種或多種候選結(jié)合配偶體時測量到的所述一種或多種物理性質(zhì)的值的變化程度，表明所述結(jié)合誘導(dǎo)的構(gòu)象變化的程度或范圍。
153.權(quán)利要求152所述的方法，其中一種或多種物理性質(zhì)是強度。
154.權(quán)利要求152所述的方法，其中一種或多種物理性質(zhì)是偏振方向。
155.權(quán)利要求152所述的方法，其中測試分子在不存在結(jié)合于測試分子的外源非線性活性標(biāo)記的情況下，是非線性活性的。
156.權(quán)利要求152所述的方法，其中所述一種或多種光束的波長在10～10000毫微米范圍內(nèi)。
157.權(quán)利要求152所述的方法，其中還包括將步驟(b)中測量的所述物理性質(zhì)的值與不暴露于所述一種或多種候選結(jié)合配偶體時測量的物理性質(zhì)的值進行比較。
158.權(quán)利要求157所述的方法，其中所述測試分子或所述候選結(jié)合配偶體結(jié)合于至少兩個可區(qū)別的非線性活性標(biāo)記，其中所述一種或多種光束是多重光束，并且步驟(b)包括測量至少兩個從所述樣品發(fā)出的非線性光束的一種或多種物理性質(zhì)。
159.權(quán)利要求152所述的方法，其中所述測試分子是純化的。
160.權(quán)利要求152所述的方法，其中所述測試分子是G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)。
161.權(quán)利要求160所述的方法，其中所述GPCR結(jié)合于非線性活性標(biāo)記。
162.權(quán)利要求152所述的方法，其中所述非線性光束是第二諧波產(chǎn)生的光線。
163.權(quán)利要求152所述的方法，其中還包括將電場施加于所述樣品。
164.權(quán)利要求163所述的方法，其中電場是在時間上靜止的，根據(jù)時間變化的，或其組合。
165.權(quán)利要求152所述的方法，其中所述樣品還包括體相。
166.權(quán)利要求165所述的方法，其中將電場施加于所述體相。
167.權(quán)利要求166所述的方法，其中電場是在時間上靜止的，根據(jù)時間變化的，或其組合。
168.權(quán)利要求152所述的方法，其中所述一種或多種非線性光束是第二諧波，第三諧波，一種或多種基頻的和頻或差頻。
169.權(quán)利要求152所述的方法，其中所述一種或多種候選結(jié)合配偶體在一固體表面上以陣列的形式排列。
170.權(quán)利要求169所述的方法，其中所述一種或多種候選結(jié)合配偶體包括許多不同寡核苷酸或多核苷酸，所述不同寡核苷酸或多核苷酸各自包括不同的序列并且附著于一固體表面的不同區(qū)域。
171.權(quán)利要求169所述的方法，其中寡核苷酸或多核苷酸以微陣列的形式排列。
172.權(quán)利要求152所述的方法，其中所述一種或多種候選結(jié)合配偶體包括以陣列形式排列的蛋白。
173.權(quán)利要求152所述的方法，其中照射步驟涉及反射，透射，損耗波，多重內(nèi)反射，近場光學(xué)，共焦，光學(xué)腔，平面波導(dǎo)管，纖維-光學(xué)器件或電介質(zhì)板波導(dǎo)管。
174.權(quán)利要求152所述的方法，其中測量步驟涉及反射，透射，損耗波，多重內(nèi)反射，近場光學(xué)，共焦，光學(xué)腔，平面波導(dǎo)管，纖維-光學(xué)器件或電介質(zhì)板波導(dǎo)管。
175.權(quán)利要求152所述的方法，其中所述一種或多種候選結(jié)合配偶體是分子標(biāo)志類似物。
176.權(quán)利要求152所述的方法，其中所述一種或多種候選結(jié)合配偶體附著于一表面。
177.權(quán)利要求176所述的方法，其中所述表面是金屬表面，半導(dǎo)體表面，玻璃表面，乳膠表面，凝膠表面，纖維-光學(xué)表面，二氧化硅表面或珠子表面。
178.權(quán)利要求176所述的方法，其中所述表面是非平面表面。
179.權(quán)利要求176所述的方法，其中所述表面是化學(xué)衍生化的。
180.權(quán)利要求179所述的方法，其中所述表面是用自組裝的單層衍生化的。
181.權(quán)利要求179所述的方法，其中所述表面是用有機硅烷衍生化的。
182.權(quán)利要求152所述的方法，其中測量步驟在不同時期重復(fù)進行。
183.權(quán)利要求152所述的方法，其中所述一種或多種候選結(jié)合配偶體附著于一個自組裝的單層。
184.權(quán)利要求183所述的方法，其中所述自組裝的單層屬于硅烷或末端功能硅烷化學(xué)家族。
185.權(quán)利要求152所述的方法，其中測量到的非線性光束的一種或多種物理性質(zhì)表明所述結(jié)合的熱力學(xué)或動力學(xué)性質(zhì)。
186.權(quán)利要求152所述的方法，其中所述結(jié)合涉及化學(xué)建，靜電力，物理吸著，化學(xué)親和性，化學(xué)吸附，分子識別，物理-化學(xué)結(jié)合，氫鍵或雜交方法。
187.權(quán)利要求152所述的方法，其中樣品還包括一種或多種選自修飾分子，修飾粒子，增強劑，調(diào)節(jié)劑，抑制劑，分子標(biāo)志類似物和指示劑的物質(zhì)。
188.權(quán)利要求152所述的方法，其中非線性光束的產(chǎn)生，收集或檢測的模式是一種或多種選自反射，透射，損耗波，多重內(nèi)反射，近場光學(xué)技術(shù)，共焦，光學(xué)腔，平面波導(dǎo)管，纖維-光學(xué)器件和電介質(zhì)板波導(dǎo)管，和近場技術(shù)的模式。
189.權(quán)利要求152所述的方法，其中非線性活性標(biāo)記共價結(jié)合于所述測試分子或所述一種或多種候選結(jié)合配偶體。
190.權(quán)利要求152所述的方法，其中非線性活性標(biāo)記共價結(jié)合于一分子，所述分子非共價結(jié)合于所述測試分子或所述一種或多種候選結(jié)合配偶體。
191.權(quán)利要求152所述的方法，其中還包括將步驟(b)中測量的所述一種或多種物理性質(zhì)的值與不存在所述一種或多種候選結(jié)合配偶體時測量的一種或多種物理性質(zhì)的值進行比較。
192.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述一種或多種候選結(jié)合配偶體不附著于表面。
193.權(quán)利要求75所述的方法，其中所述一種或多種候選結(jié)合配偶體不附著于表面。
194.權(quán)利要求112所述的方法，其中所述一種或多種候選結(jié)合配偶體不附著于表面。
195.權(quán)利要求152所述的方法，其中所述一種或多種候選結(jié)合配偶體不附著于表面。
全文摘要
一種非線性光學(xué)技術(shù)，例如第二或第三諧波或和頻或差頻產(chǎn)生，被用于檢測包括構(gòu)象變化的結(jié)合相互作用，或結(jié)合的程度或范圍。在本發(fā)明的一個方面，非線性光學(xué)技術(shù)檢測探針中由于靶的結(jié)合產(chǎn)生的構(gòu)象變化。在本發(fā)明的另一個方面，非線性光學(xué)技術(shù)通過檢測由于探針－靶的相互作用產(chǎn)生的構(gòu)象變化，來篩選候選探針。在本發(fā)明的另一個方面，非線性光學(xué)技術(shù)通過檢測存在調(diào)節(jié)劑時的構(gòu)象變化，來篩選探針－靶相互作用的候選調(diào)節(jié)劑。
文檔編號G01N33/58GK1864066SQ03818983
公開日2006年11月15日 申請日期2003年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月6日
發(fā)明者喬舒亞·S·薩拉夫斯基 申請人:喬舒亞·S·薩拉夫斯基