專利名稱：一種使用免疫PCR技術(shù)的紅斑狼瘡抗Sm抗體的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于抗體的檢測方法。
系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是常見的自身免疫病。具有累及多臟器，威脅生命，發(fā)病率高等特點(diǎn)，但早期治療卻有較高的治愈率或得到有效的控制。
目前診斷SLE的指標(biāo)有抗dsDNA抗體和抗Sm抗體，抗dsDNA抗體，不僅與SLE的活動有關(guān)，而且其他疾病也可以檢出，抗Sm抗體可能是一種回憶性抗體，在SLE非活動期也可以檢出，是SLE的一種標(biāo)志性抗體，但檢出率低。
現(xiàn)有的抗體Sm抗體檢測方法有Western-blot法，CIE法和ELISA法，前兩種方法敏感性低，且操作復(fù)雜費(fèi)時(shí)，臨床應(yīng)用受到限制，ELISA法特異性強(qiáng)，但敏感性不高。
PCR技術(shù)是一種基因檢測技術(shù)，其原理是模擬DNA體內(nèi)復(fù)制一種體外核酸擴(kuò)增過程，這種檢測技術(shù)具有快速、靈敏、特異的特點(diǎn)。1992年P(guān)CR技術(shù)開始在免疫分析中應(yīng)用，免疫PCR將抗原抗體反應(yīng)的特異性與PCR擴(kuò)增結(jié)合在一起成為極為敏感的免疫測定技術(shù)。
本發(fā)明的目的是建立一種用免疫PCR技術(shù)檢測紅斑狼瘡抗Sm抗體的方法，以克服現(xiàn)有的抗Sm抗體檢測方法的不足之處。
本發(fā)明的技術(shù)方案是利用酶標(biāo)軟板，在每個(gè)孔中加入1∶1000～1∶2000(1000U/ml)稀釋的SmAg100μl在37℃溫度下1～2h，然后用洗滌液洗滌3次，每孔加50μl～200μl封閉液，在25～30℃溫度下封閉30min～1h取出后再用洗滌液洗滌3次，每孔加入100μl血清，37℃溫育40min，取出后再洗滌3次，之后加入1∶1500～1∶2500稀釋的SaHIgG-DNA探針100～200μl，37℃溫育45min，取出，再洗滌3～5次，最后加入PCR反應(yīng)混合物，覆蓋70μl石蠟油，在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為，預(yù)變性94℃2min再行94℃40sec，55℃40sec，72℃60sec共35個(gè)循環(huán)，繼續(xù)72℃延伸5min，擴(kuò)增后，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物20μl加入到2％瓊脂糖凝膠中電泳，經(jīng)EB染色，在紫外反射透射儀上觀察結(jié)果，照相，同時(shí)設(shè)PCR陽性對照，同上法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
使用本發(fā)明的積極效果是敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，免疫PCR方法檢測血清抗Sm抗體的敏感性是ELISA方法的107倍。用免疫PCR方法對抗Sm抗體的檢出率明顯高于ELISA方法(P＜0.05)。用免疫PCR方法檢測血清標(biāo)本抗Sm抗體結(jié)果表明，SLE患者血清Sm抗體陽性率為54.9％，而其它自身免疫病患者血清和正常對照血清未見此抗體。因此，免疫PCR方法檢測血清抗Sm抗體的特異性強(qiáng)。相關(guān)性試驗(yàn)結(jié)果表明，免疫PCR方法檢測血清抗Sm抗體與ELISA方法呈高度正相關(guān)(P＞0.001)。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果得到批內(nèi)和批間CV值分別為2.3～4.8％和3.7～6.95％，表明方法穩(wěn)定、可靠、重復(fù)性好。
具體實(shí)施例方式利用40孔酶標(biāo)軟板，在每個(gè)孔中加入1∶1500(1000U/ml)稀釋的SmAg100μl在37℃溫度下1.5h然后用洗滌液洗滌3次，每孔加100μl封閉液，在25℃溫度下封閉45min，取出后再用洗滌液洗滌3次，每孔加入100μl待檢血清37℃溫育40min，取出后再洗滌3次，之后加入1∶2000稀釋的SaHIGg DNA探針150μl，37℃溫育45min，取出，再洗滌5次，最后加入PCR反應(yīng)混合物，覆蓋70μl石蠟油，在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為預(yù)變性94℃2min再行94℃40sec，55℃40sec，72℃60sec共35個(gè)循環(huán)，繼續(xù)72℃延伸5min，擴(kuò)增后取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物20μl加入到2％瓊脂糖凝膠中電泳，經(jīng)EB染色，在紫外反射透射儀上觀察結(jié)果，照相，同時(shí)設(shè)PCR陽性對照，同上法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
本發(fā)明所使用的試劑與設(shè)備來源是，純化SmAg(1000U/ml)、抗Sm抗體陽性和陰性血清、SaHIgG-DNA探針、Taq DNA、引物(p21/p23)、瓊脂糖、溴化乙錠(EB)均為市場購買。
本發(fā)明試劑需經(jīng)以下配制。
包被緩沖液(PH9.6 0.1mo/L碳酸鹽緩沖液)Na2CO34.244gNaHCO35.04g蒸餾水加至 1000mlPH7.4 0.02mol/L PBSNaCL 8gKH2PO40.2gNa2HPO4·12H2O2.9gKCL 0.2g蒸餾水加至 1000ml封閉液、探針稀釋液、血清稀釋液小牛血清0.5g～1mlPH7.40.01～0,02mol/LpBs100ml洗滌液Tween20 0.5mlPH7.4 0.02mol/L pBs 100ml5×電泳緩沖液Tris 54gEDTA-Na20.38g硼酸 27.5g蒸餾水加至1000ml，用1mol/L NaOH調(diào)PH至8.0，2％瓊脂糖凝膠瓊脂糖0.6g1×電泳緩沖液30mlPCR反應(yīng)混合物10×Buffer 2.5μl2.5mmol/L dNTP 2.0μlP212.0μlP232.0μl1u/μlTaq DNA聚合酶1.0μl雙蒸水 15.5μl
權(quán)利要求
一種使用免疫PCR技術(shù)的紅斑狼瘡抗Sm抗體的檢測方法，其特征是利用酶標(biāo)軟板，在每個(gè)孔中加入1∶1000～1∶2000(1000U/ml)稀釋的SmAg100μl在37℃溫度下1～2h；然后用洗滌液洗滌3次，每孔加50μl～200μl封閉液，在25～30℃溫度下封閉30min～1h；取出后再用洗滌液洗滌3次，每孔加入100μl血清，37℃溫育40min；取出后再洗滌3次，之后加入1∶1500～1∶2500稀釋的SaHIgG-DNA探針100～200μl，37℃溫育45min；取出，再洗滌3～5次，最后加入PCR反應(yīng)混合物，覆蓋70μl石蠟油，在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為，預(yù)變性94℃2min再行94℃40sec，55℃40sec，72℃60sec共35個(gè)循環(huán)，繼續(xù)72℃延伸5min；擴(kuò)增后，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物20μl加入到2％瓊脂糖凝膠中電泳，經(jīng)EB染色，在紫外反射透射儀上觀察結(jié)果，照相；同時(shí)設(shè)PCR陽性對照，同上法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
全文摘要
一種使用免疫PCR技術(shù)的紅斑狼瘡抗Sm抗體的檢測方法。結(jié)合了抗原抗體反應(yīng)的特異性與PCR擴(kuò)增技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)。步驟是將SmAg抗原包被、封閉、加血清、加探針、加PCR混合物,在PCR擴(kuò)增儀上擴(kuò)增。再在水凝膠中電泳,經(jīng)EB柒色,在紫外線反射透射儀上觀察結(jié)果,照像。使用本發(fā)明的積極效果是不僅具有免疫反應(yīng)的特異性,而且有PCR的高靈敏性,大輔度的提高抗Sm抗體檢出率。
文檔編號G01N33/558GK1373364SQ01106288
公開日2002年10月9日 申請日期2001年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月7日
發(fā)明者晏舒, 曾常茜, 尹學(xué)念, 遲婉莉, 李乃奚, 欒瑩莉 申請人:吉化集團(tuán)公司總醫(yī)院